Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27

Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27

Aim. To gain insight into structural and functional properties of alanyl-tRNA,synthetase (AlaRS), we genetically engineered constructs for expression and purification of full-length AlaRS and checked its activity in aminoacylation assays. Methods. The genomic DNA for the AlaS gene from the T. thermo...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Datum:2018
Hauptverfasser: Rybak, M.Yu., Priss, A.E., Gudzera, O.I., Kovalchuk, A.O., Kryklyvyi, I.A., Tukalo, M.A.
Format: Artikel
Sprache:English
Veröffentlicht: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2018
Schriftenreihe:Вiopolymers and Cell
Schlagworte:
Structure and Function of Biopolymers
Online Zugang:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154370
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 / M.Yu. Rybak, A.E. Priss, O.I. Gudzera, A.O. Kovalchuk, I.A. Kryklyvyi, M.A. Tukalo // Вiopolymers and Cell. — 2018. — Т. 34, № 6. — С. 435-444. — Бібліогр.: 29 назв. — англ.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-154370
record_format dspace
fulltext
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language English
topic Structure and Function of Biopolymers
Structure and Function of Biopolymers
spellingShingle Structure and Function of Biopolymers
Structure and Function of Biopolymers
Rybak, M.Yu.
Priss, A.E.
Gudzera, O.I.
Kovalchuk, A.O.
Kryklyvyi, I.A.
Tukalo, M.A.
Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27
Вiopolymers and Cell
description Aim. To gain insight into structural and functional properties of alanyl-tRNA,synthetase (AlaRS), we genetically engineered constructs for expression and purification of full-length AlaRS and checked its activity in aminoacylation assays. Methods. The genomic DNA for the AlaS gene from the T. thermophilus (HB 27 strain) was amplified by PCR and cloned into vectors with and without a histidine tag. To optimize conditions for the protein expression in E. coli and to develop efficient purification procedure, the molecular biology techniques were applied. AlaRS was purified by affinity and size-exclusion chromatography. The molecular weight of enzyme was determined by gel filtration. Results. The expression and purification conditions for recombinant AlaRS were optimized. Approximately 1.5 mg of the pure active recombinant enzyme can be obtained from 1 L of bacterial culture. AlaRS from T. thermophilus is a dimer in solution with an experimental MW of 204 kDa. Conclusions. The purified recombinant enzyme will be used for further studies on the functional kinetics and structure of the crystal complex with tRNA.
format Article
author Rybak, M.Yu.
Priss, A.E.
Gudzera, O.I.
Kovalchuk, A.O.
Kryklyvyi, I.A.
Tukalo, M.A.
author_facet Rybak, M.Yu.
Priss, A.E.
Gudzera, O.I.
Kovalchuk, A.O.
Kryklyvyi, I.A.
Tukalo, M.A.
author_sort Rybak, M.Yu.
title Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27
title_short Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27
title_full Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27
title_fullStr Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27
title_full_unstemmed Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27
title_sort expression and purification of full-length alanyl-trna-synthetase from thermus thermophilus hb27
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate 2018
topic_facet Structure and Function of Biopolymers
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154370
citation_txt Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 / M.Yu. Rybak, A.E. Priss, O.I. Gudzera, A.O. Kovalchuk, I.A. Kryklyvyi, M.A. Tukalo // Вiopolymers and Cell. — 2018. — Т. 34, № 6. — С. 435-444. — Бібліогр.: 29 назв. — англ.
series Вiopolymers and Cell
work_keys_str_mv AT rybakmyu expressionandpurificationoffulllengthalanyltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27
AT prissae expressionandpurificationoffulllengthalanyltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27
AT gudzeraoi expressionandpurificationoffulllengthalanyltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27
AT kovalchukao expressionandpurificationoffulllengthalanyltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27
AT kryklyvyiia expressionandpurificationoffulllengthalanyltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27
AT tukaloma expressionandpurificationoffulllengthalanyltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27
first_indexed 2025-07-14T06:01:07Z
last_indexed 2025-07-14T06:01:07Z
_version_ 1837600990344249344
spelling irk-123456789-1543702019-07-07T12:43:59Z Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 Rybak, M.Yu. Priss, A.E. Gudzera, O.I. Kovalchuk, A.O. Kryklyvyi, I.A. Tukalo, M.A. Structure and Function of Biopolymers Aim. To gain insight into structural and functional properties of alanyl-tRNA,synthetase (AlaRS), we genetically engineered constructs for expression and purification of full-length AlaRS and checked its activity in aminoacylation assays. Methods. The genomic DNA for the AlaS gene from the T. thermophilus (HB 27 strain) was amplified by PCR and cloned into vectors with and without a histidine tag. To optimize conditions for the protein expression in E. coli and to develop efficient purification procedure, the molecular biology techniques were applied. AlaRS was purified by affinity and size-exclusion chromatography. The molecular weight of enzyme was determined by gel filtration. Results. The expression and purification conditions for recombinant AlaRS were optimized. Approximately 1.5 mg of the pure active recombinant enzyme can be obtained from 1 L of bacterial culture. AlaRS from T. thermophilus is a dimer in solution with an experimental MW of 204 kDa. Conclusions. The purified recombinant enzyme will be used for further studies on the functional kinetics and structure of the crystal complex with tRNA. Мета. Для детального вивчення структурних та функціональних властивостей аланіл-тРНК-синтетази (АлаРС) було створено генно-інженерну конструкцію для експресії та очищення повнорозмірної синтетази та перевірено її активність у реакції аміноацилювання. Методи. Ген AlaS з T. thermophilus (штам HB27) геномної ДНК ампліфікували за допомогою ПЛР з відповідними праймерами та клонували у вектор з та без гістидинової послідовності. Для оптимізації умов експресії білка в E.coli та розробки ефективної процедури очищення були застосовані сучасні методи молекулярної біології. AлаРС очищали методами афінної хроматографії та гель-фільтрації. Молекулярна маса ферменту визначалася на гель-фільтраційній колонці. Результати. Умови експресії та очистки рекомбінантної АлаРС були оптимізовані. Близько 1,5 мг чистого рекомбінантного активного ферменту можна одержати з 1 л бактеріальної культури. АлаРС з T. thermophilus є димером у розчині з експериментальною масою 204 кДа. Висновки. Отриманий рекомбінантний фермент буде використовуватися для подальших експериментів з функціональної кінетики та структурних досліджень кристалічного комплексу з тРНК. Цель. Для детального изучения структурных и функциональных свойств аланил-тРНК-синтетазы (АлаРС) было создано генно-инженерную конструкцию для экспрессии и очистки полноразмерной синтетазы и проверено ее активность в реакции аминоацилирования. Методы. Ген аlaS из геномной ДНК T. thermophilus (штамм HB27) амплифицировали с помощью ПЦР с соответствующими праймерами и клонировали в вектор с и без гистидиновой последовательностью. Для оптимизации условий экспрессии белка в E. coli и разработки эффективной процедуры очистки были применены современные методы молекулярной биологии. AлаРС очищали методами аффинной хроматографии и гель-фильтрации. Молекулярная масса фермента определялась на гель-фильтрационной колонке. Результаты. Условия экспрессии и очистки рекомбинантной АлаРС были оптимизированы. Около 1,5 мг чистого рекомбинантного активного фермента можно получить с 1 л бактериальной культуры. АлаРС с T. thermophilus является димером в растворе с экспериментальной массой 204 кДа. Выводы. Полученный рекомбинантный фермент будет использован для дальнейших экспериментов с функциональной кинетики и структурных исследований кристаллического комплекса с тРНК 2018 Article Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 / M.Yu. Rybak, A.E. Priss, O.I. Gudzera, A.O. Kovalchuk, I.A. Kryklyvyi, M.A. Tukalo // Вiopolymers and Cell. — 2018. — Т. 34, № 6. — С. 435-444. — Бібліогр.: 29 назв. — англ. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00098E http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154370 577.217.32 en Вiopolymers and Cell Інститут молекулярної біології і генетики НАН України

Ähnliche Einträge