Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью ретровирусных векторов
Дан обзор работ по конструированию векторов для переноса генов в клетки млекопитающих на основе ретровирусного генома. Обсуждаются преимущества и недостатки таких систем при использовании в генной терапии человека....
Збережено в:
| Дата: | 1989 |
|---|---|
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154401 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью ретровирусных векторов / Н.В. Томплин, В.М. Кавсан // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 2. — С. 26-36. — Бібліогр.: 38 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-154401 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1544012019-06-16T01:31:29Z Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью ретровирусных векторов Томилин, Н.В. Кавсан, В.М. Дискуссии Дан обзор работ по конструированию векторов для переноса генов в клетки млекопитающих на основе ретровирусного генома. Обсуждаются преимущества и недостатки таких систем при использовании в генной терапии человека. Представлено огляд робіт з конструювання векторів для перенесення генів у клітини ссавців на основі ретровірусного геному. Обговорюються переваги і недоліки таких систем за використання в генній терапії людини. There are some reasons for the modern retrovirus vectors to be the most promising ones in genes transfer to mammalian cells. These vectors are intensively studied on different model animals. The first reports of tests of these vectors for the treatment of some hereditary human diseases are expected to appear in the near future. 1989 Article Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью ретровирусных векторов / Н.В. Томплин, В.М. Кавсан // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 2. — С. 26-36. — Бібліогр.: 38 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000A2 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154401 577.21+578.828 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Дискуссии Дискуссии |
| spellingShingle |
Дискуссии Дискуссии Томилин, Н.В. Кавсан, В.М. Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью ретровирусных векторов Биополимеры и клетка |
| description |
Дан обзор работ по конструированию векторов для переноса генов в клетки млекопитающих на основе ретровирусного генома. Обсуждаются преимущества и недостатки таких систем при использовании в генной терапии человека. |
| format |
Article |
| author |
Томилин, Н.В. Кавсан, В.М. |
| author_facet |
Томилин, Н.В. Кавсан, В.М. |
| author_sort |
Томилин, Н.В. |
| title |
Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью ретровирусных векторов |
| title_short |
Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью ретровирусных векторов |
| title_full |
Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью ретровирусных векторов |
| title_fullStr |
Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью ретровирусных векторов |
| title_full_unstemmed |
Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью ретровирусных векторов |
| title_sort |
перенос генов в клетки млекопитающих с помощью ретровирусных векторов |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1989 |
| topic_facet |
Дискуссии |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154401 |
| citation_txt |
Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью ретровирусных векторов / Н.В. Томплин, В.М. Кавсан // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 2. — С. 26-36. — Бібліогр.: 38 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT tomilinnv perenosgenovvkletkimlekopitaûŝihspomoŝʹûretrovirusnyhvektorov AT kavsanvm perenosgenovvkletkimlekopitaûŝihspomoŝʹûretrovirusnyhvektorov |
| first_indexed |
2025-07-14T06:33:35Z |
| last_indexed |
2025-07-14T06:33:35Z |
| _version_ |
1837603034045087744 |
| fulltext |
У Д К 577.21 + 578.828
ПЕРЕНОС ГЕНОВ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
С ПОМОЩЬЮ РЕТРОВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ
Н. В. Томплин, В. М. Кавсан
Идея лечения наследственных и ненаследственных заболеваний чело-
века, обусловленных недостаточным количеством в организме опреде-
ленных белков, с помощью введения нормальных генов в соматические
клетки (гемотерапия) достаточно очевидна, однако большие техничес-
кие трудности, связанные с ее осуществлением, многие годы тормозили
прогресс в этой области.
Существенный шаг вперед был сделан в 1977 году, когда была
принципиально доказана возможность переноса генов в соматические
клетки млекопитающих [1], что стимулировало работы по разработке
новых, более эффективных методов введения генов, в частности с по-
мощью вирусов.
В идеале генотерапия предполагает замещение дефектного гена в
его естественном окружении в хромосоме нормальным геном во всех
тех клетках, где проявляется дефект, приводящий к патологии. Хотя
такие операции принципиально осуществимы на клетках млекопитаю-
щих, культивируемых in vitro [2], их эффективность пока весьма мала
(около IO -8), тогда как для генотерапии желательна сайт-специфиче-
ская интеграция вводимого гена в большей части определенной кле-
точной популяции, т. е. генетическая трансформация с эффективностью
до единицы. Близкая к этой величине эффективность трансформации
была достигнута в настоящее время при переносе генов в клетки кост-
ного мозга только с помощью ретровирусных векторов [3, 4], однако
интеграция, по-видимому, происходила во многие различные сайты в
хромосомах клеток различных трансформантных клонов, и пока неяс-
но, каким образом можно повысить специфичность интеграции ретро-
вирусов. Клон соматических клеток с нужным сайтом интеграции мо-
жет быть отобран манипуляциями in vitro и затем трансплантирован
в организм, в котором дефектные клоны были уничтожены облучени-
ем или химиотерапией, однако процедура отбора клона с нужным сай-
том интеграции потребует длительного культивирования in vitro, что,
с одной стороны, может привести к истощению клоногенного потенци-
ала, а с другой — к злокачественной трансформации клеток. Это
препятствие было бы преодолено, если бы удалось вызывать иммортали-
зацию клеток без проявления других признаков злокачественной
трансформации [5].
Специфичность интеграции не является, однако, абсолютным тре-
бованием для генотерапии, поскольку при многих заболеваниях тера-
певтический эффект может быть достигнут просто появлением в орга-
низме (в кровотоке) достаточной концентрации нужного белка. Он
может синтезироваться и нормально созревать, даже если соответству-
ющий ген интегрирован в необычный для него хромосомный локус или
при введении гена не в тот тип клеток, где белок обычно синтезирует-
ся. Важно лишь, чтобы была достаточной концентрация этого белка
(замещающего дефектный) в ткани-мишени.
При введении генов в клетки млекопитающих с помощью ретрови-
русных векторов за счет различной специфичности интеграции в раз-
ных клонах наблюдается значительная гетерогенность экспрессии вво-
димого гена в клонах-потомках трансформированных стволовых кле-
ток [6], что может существенно понижать реальную эффективность
трансформации ретровирусами, поскольку стабильные субклоны обра-
зуются лишь с небольшой частотой. Это препятствие может быть от-
части преодолено за счет правильного конструирования вектора [6], а
также, вероятно, за счет предварительной селекции стабильных суб-
клонов-продуцентов вне организма.
26 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.—1989.—Т. 5, λ1" 2
Жизненный цикл ретровирусов и использование его особенностей
для переноса генов. Детали жизненного цикла ретровирусов и их
структуры описаны в книге Р. Б. Хесина [7], где можно найти ссылки
на оригинальные работы, однако некоторые ключевые моменты умест-
но рассмотреть в этом обзоре. Ретровирус представляет собой части-
цу, окруженную фосфолипидной мембраной, в которую встроены
белки. Внутри частицы упакована РНК, кодирующая несколько белков,
группоспецифический антиген и обратная транскриптаза (ревертаза).
Содержимое частицы попадает в клетку, когда поверхностный белок,
взаимодействуя со специфическим рецепторным белком клеток, вызы-
вает прилипание вируса к клетке. После проникновения вируса в
клетку ревертаза с вирусной Р Н К синтезирует обратный транскрипт,
который кольцуется и встраивается в клеточную Д Н К с помощью ин-
тегразы (также кодируемой вирусной Р Н К ) . Высокая эффективность
трансформации клеток ретровирусами обусловлена эффективным ре-
цепторным механизмом их проникновения в клетку, а также эффектив-
ным ферментным механизмом интеграции. Рассмотрим регуляцию син-
теза вирусных белков на примере вируса лейкемии Молони.
С интегрированной ДНК-копии ретровируса (провируса) начина-
ется синтез вирусной РНК, для чего требуется промотор и усилитель
транскрипции, расположенный в длинном 5'-концевом повторе (long
terminal repeat, LTR), а также терминатор транскрипции, расположен-
ный в правом конце провируса — З'-LTR. Важной составной частью
5'- и З ' -LTR является так называемая область U3, содержащая специ-
фический для каждого ретровируса и типа клеток усилитель транс-
крипции. РНК, синтезированная с провируса, может подвергаться
сплайсингу, что приводит к синтезу белка оболочки, кодирующая по-
следовательность которого расположена ближе к З'-LTR (env)> либо
транскрибироваться без сплайсинга, что приводит к образованию груп-
поспецифического антигена (gag-белка) и ревертазы с интегразой.
Для вырезания (сплайсинга) части транскрипта, соответствующей gag-
и ро/-генам, в геноме ретровирусов имеются две сигнальные последо-
вательности, одна из которых расположена ближе к 5'-LTR (5'-сайт
для сплайсинга — Sr-SS), другая — перед геном env (З'-ss). Эффектив-
ность сплайсинга определяется не только 5'- и З'-ээ-сигналами, но и
какими-то другими сигналами, не вполне ясными, что может сущест-
венно влиять на эффективность экспрессии чужеродных генов, встав-
ленных вместо gag-pol или вместо env-генов. Несплайсированная ви-
русная PLIK может паковаться внутри клетки, давая начало предшест-
венникам вирусных частиц, которые формируются при экструзии
предшественников через клеточную мембрану во внеклеточное прост-
ранство. Для упаковки Р Н К необходима специфическая короткая по-
следовательность, расположенная рядом с 5'-LTR, так называемый
Ψ-сайт. Благодаря особому механизму репликации и интеграции в по-
томстве ретровируса область U3 S7-LTR восстанавливается за счет U3
З'-LTR вируса предшествующего поколения, и это обстоятельство
иногда используется для инактивации вирусного промотора [8].
Эффективность экспрессии генов провируса существенно зависит
от структуры 5'-LTR, точнее говоря, от области U3, содержащей уси-
литель транскрипции, и сильно варьирует в разных типах клеток. Во
многих ретровирусных векторах поэтому введен другой, менее специ-
фичный промотор, который слабее подвержен регуляторным влияниям
со стороны клетки. Клетки, содержащие интегрированные недефект-
ные провирусы, становятся продуцентами ретровирусов, способных да-
лее инфицировать другие клеточные популяции.
В принципе возможны два подхода к переносу генов ретровируса-
ми. С помощью манипуляций на клонированной Д Н К ген можно вво-
дить в нормальный (недефектный) ретровирус, вставляя его в участки
генома (между 5'- и З '-LTR), несущественные для полного жизненно-
го цикла ретровируса. В этом подходе, поскольку трансформирован-
ные клетки будут далее продуцировать вирус, имеется опасность не-
27 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.—1989.—Т. 5, λ1" 2
контролируемого распространения гена в организме, в том числе его
интеграция в клетки зародышевого пути, а следовательно, неконтроли-
руемого распространения гена в популяции. Ясно, что для целей гено-
терапии недефектные ретровирусы, трансдуцирующие чужеродные ге-
ны, вряд ли смогут найти широкое применение.
Принципиально важной поэтому была разработка [9] второго
альтернативного подхода к ретровирусному переносу генов, когда геи
вводится в дефектный вирус, способный к интеграции в инфицирован-
ных клетках, но не способный к дальнейшей репликации и распростра-
нению. С помощью ко-трансформации, используя селективный ген гуа-
нинфосфорибозилтрансферазы (gpt) и обычный кальций-фосфатный
метод трансформации, в фибробласты мышей линии NIH ЗТЗ вводили
клонированный геном вируса лейкоза Молони с мутацией в сигналь-
ной последовательности (Ψ), необходимой для упаковки ретровирус-
ной РНК. Один из gpt+ трансформантных клонов, отобранный на среде
с микофенольной кислотой, не продуцировал инфекционного ретрови-
руса, но выделял в среду много обратной транскриптазы в составе
свободных от Р Н К вирусных частиц. Последующая трансфекция кле-
ток этого клона (Ψ2) плазмидой, содержащей 5'- и З'-LTR, Ψ-сайт и
селектируемый ген gpt, приводила через 20 ч к продукции этими клет-
ками довольно высокого титра инфекционного ретровируса, трансду-
цирующего ген gpt, что проверялось путем генетической трансформа-
ции клеток NIH ЗТЗ [9]. Таким образом, был получен клон культиви-
руемых клеток, способный к упаковке в вирусные частицы транскригі-
тов с чужеродного гена и не продуцирующий вирусов, способных к
дальнейшей репликации и распространению. В этой системе все необ-
ходимые для упаковки ретровируса белки синтезировались с Р Н К де-
фектного по Ψ-сайту интегрированного вируса, а в вирусные частицы
паковались только транскрипты с экзогенной плазмиды, содержащей
клонированный геном другого дефектного ретровируса с Ψ-сайтом [9].
В дальнейшем система была усовершенствована теми же авторами
[10] за счет введения в плазмиду с Ψ-сайтом и 5'- и З '-LTR другого
селективного гена (пео), кодирующего неомицинфосфотрансферазу и
обеспечивающего устойчивость клеток к антибиотику G418 [10]. Такие
плазмиды и получили название векторных плазмид для ретровирусно-
го переноса генов. Это позволило получать трансформантные субкло-
ны Ψ2, стабильно продуцирующие высокий титр (IO5—IO6 частиц в
1 мл) рекомбинантного ретровируса, трансдуцирующего ген пео.
Клон Ψ2 был использован во многих работах по ретровирусному
переносу генов в клетки мышей [11 —13]. После трансфекции в него
различных плазмидных конструкций с пео-геном и селекции продуцен-
тов рекомбинантного ретровируса были обнаружены значительные
вариации титра ретровируса в разных субклонах [6, 10], а выход высо-
копродуктивных клонов зависел от структуры плазмидного вектора.
Различия, в частности, были выявлены для векторных плазмид, содер-
жащих (класс II) или не содержащих (класс I) внутренних промото-
ров для экспрессии селективного или неселективного гена и располо-
женных между 5'- и З '-LTR [6].
Дефектный вирус Молони, интегрированный в клоне Ψ2, является
экотропным ретровирусом с узкой специфичностью и способностью
инфицировать только клетки мышей. Для получения ретровирусов, спо-
собных переносить гены в клетки других видов млекопитающих и чело-
века, сделаны пакующие клоны (ΨΑΜ, РА12), содержащие дефектный
амфотропный провирус с широкой специфичностью [14, 15].
Основные плазмидные конструкции для ретровирусного переноса
генов. Рассмотрим два класса векторных плазмид, используемых для
введения генов в пакующие клетки и получения субклонов — проду-
центов ретровирусов. Как уже отмечалось, векторы первого класса со-
держат единственный промотор, расположенный в 5'-LTR, под контро-
лем которого транскрибируются все гены, расположенные между 5'- и
З'-LTR, и внутренних промоторов не имеется либо они несущественны
28 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА--1989 — Т. 5, M- 2
для экспрессии. Наиболее известный вектор первого класса —
pZip(neo)SV(X)I [10] содержит нормальные 5'- и З'-LTR вируса лей-
коза Молони, пео-ген без промотора в ориентации 5 '—3' и уникальный
сайт для ретриктазы BamHIy расположенный между 5'- и З'-ss, в ко-
торый можно встраивать интронированные или кДНК гены. Показано,
что в этом векторе нитроны эффективно вырезаются из генов, клони-
рованных в BatnHI-сайте, и транскрипты, упакованные в рекомбинант-
иый ретровирус, их не содержат, что может служить эффективным
методом получения безынтронных генов [10]. Продукт пео-гена синтези-
руется со сплайсированной РНК, так как он расположен между З'-ss
и З'-LTR в зоне, соответствующей env-гену. При помещении в BamHI-
сайт некоторых генов экспрессия пео-гена может нарушаться, вероят-
но, из-за нарушения сплайсинга (пока неясно, какие свойства встав-
ляемого гена приводят к таким последствиям), и тогда титр ретрови-
руса, трансдуцирующего пео-ген, после временной трансфекции соот-
ветствующей плазмиды в клетки Ψ2 резко падает. Обычно же титр
составляет IO3 трансдуцируемых единиц (те) в 1 мл среды, но за счет
введения в вектор точки начала репликации вируса полиомы титр мо-
жет быть повышен до 105 те/мл. Стабильные Ψ2 трансформанты про-
дуцируют 104—106 те/мл, однако получение хорошего продуцента яв-
ляется непростой задачей.
Для возможности «спасения» интегрированной плазмиды из Ψ2
продуцентов в вектор SK(X) между пео-геном и З'-LTR введена точка
начала репликации вируса SV40 и pBR322: при слиянии с клетками
COS плазмида вырезается из хромосомы и может быть выделена после
ее введения в клетки кишечной палочки. Это позволяет легко выделить
и анализировать фланкирующие последовательности хромосомной
Д Н К и изучать специфичность интеграции.
Одновременно был создан другой вариант этого вектора
ρΖΐρ (пео) SV (B)I, в котором сплайсингу за счет вирусных сигналов
подвергаются последовательности, считанные с неомицинового гена, а
со сплайсированной РНК считываются кДНК-последовательности,
вводимые в уникальный сайт для рестриктазы XhoI, расположенный
между З'-ss и З'-LTR [10]. Иногда в векторы I класса добавляют ка-
кой-нибудь усилитель транскрипции, например генов тяжелых цепей
иммуноглобулинов [6], который должен усиливать экспрессию в лим-
фоидных клетках. Правда, принципиального улучшения процедуры при
этом не наблюдалось.
Векторы 1 класса были использованы для успешного переноса
ряда генов: кДНК интерлейкипа 2 в Т-лимфоидные клетки мышей
[13], человеческого гена аденозиндезаминазы (АДА) (кДНК) в клетки
костного мозга [16], онкогена с-тус в клетки мышей (кДНК) [17], од-
нако стабильного продуцента рекомбинантного ретровируса после вве-
дения в клетки Ψ2 вектора со вставкой интронированного гена пока не
получено.
Вариантным вектором I класса является вектор N2, не содержа-
щий (в обычном варианте) внутренних промоторов, в котором пео-ген
не содержит собственного инициирующего кодона и слит с начальной
частью вирусного гена gag [18]. По непонятным причинам вектор N2
после стабильной трансформации пакующих клеток Ψ2 или РА12 дает
весьма высокий титр вируса, трансдуцирующего неомициновый ген
(5-105 — 106 те/мл в 50 % клонов), что, вероятно, связано с присутстви-
ем в нем начальной части gag-гена. Вектор N2 может быть превращен
в вектор II класса путем введения в него транскрипционной единицы
со своим промотором. В работе [19] в N2 была введена кДНК АДА
с промотором SV40, причем титр трансдуцирующего ретровируса после
упаковки РНК в отобранных на G418 субклонах РА12 был (2—5) X
XlO 6 те/мл, и эти субклоны не продуцировали инфекционного (спо-
собного к репликации) вируса-помощника. С исходным вектором N2
при упаковке в РА12 иногда получаются клоны, продуцирующие и ви-
рус-помощник [20].
29 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.—1989.—Т. 5, λ1" 2
Главная проблема в работе с векторами I класса — ограничения
в спектре клеток, в которых трансдуцируемый ген может экспрессиро-
ваться, зависящие от специфичности промотора, расположенного в ви-
русном 5'-LTR. Это обстоятельство было основной причиной, побудив-
шей исследователей к разработке векторов II класса (содержащих
внутренний промотор для селективного или неселективного гена или
для того и другого). Основное их преимущество состоит в том, что
внутренний промотор для интересующего нас гена может быть подоб-
ран так, чтобы этот ген работал или во всех клетках, или только в тех,
где это нужно (за счет тканеспецифического усилителя). Например, в
векторе II класса (MMCV-neo) экспрессия неомицинового гена под
контролем промотора тимидинкиназного (tk) гена вируса герпеса на-
блюдалась во всех тканях трансгенных мышей, полученных после об-
работки ретровирусом эмбрионов [21].
Похожий вектор II класса с tk-промотором (MoTN) давал на клет-
ках Ψ2 весьма высокий титр вируса (5· 106 те/мл) , что существенно
повышало эффективность трансформации стволовых клеток костного
мозга и уменьшало гетерогенность экспрессии неомицинового гена в
потомстве стволовых клеток [6]. Причины существенного повышения
титра трансдуцирующего вируса в указанных системах с внутренним
//г-промотором не совсем ясны, так как транскрипты с этого промотора
не должны перекрывать Ψ-сигнал для упаковки и, следовательно, не
должны паковаться в вирусные частицы. Возможно, что в этих систе-
мах имеет место какой-то цис-эффект, повышающий интенсивность
транскрипции с промотора в 5'-LTR.
В опытах с другим вектором (MLV ΝΕΟ. I), содержащим внутрен-
ний промотор вируса SV40, вставленный перед неомициновым геном
в обратной по отношению к 5'-LTR ориентации, титр трансдуцирую-
щего ретровируса был на порядок ниже, чем с вектором MoTN [6]. Это
может быть связано с интерференцией промоторов 5'-LTR и SV40, сти-
мулирующих встречную транскрипцию или с ограниченной эффектив-
ностью промотора SV40 в клетках костного мозга мышей. Тем не ме-
нее на векторе с внутренним промотором SV40 удалось получить хоро-
шую экспрессию гена АДА в культивируемых T- и В-лимфоидных
линиях человека [19].
Индуцибельный дексаметазоном внутренний промотор гена гормо-
на роста крысы, подшитый к кДНК-последовательности того же гена,
был вставлен в вектор [22], где селективный ген гипоксантиигуашш-
фосфорибозилтрансферазы (ГФРТ) транскибировался с 5'-LTR. С ис-
пользованием в качестве вируса-помощника вируса лейкоза Молони
при повторных пассажах достигнут титр трансдуцирующего ретрови-
руса IO6 те/мл, однако и титр вируса-помощника был весьма высоким.
Главная проблема с векторами второго класса состоит в супрессии не-
селектируемого гена при селективном давлении в отношении второго
гена [23]. Эта супрессия имеет эпигенетический характер, зависит от
относительной силы промоторов в данном типе клеток и от их поло-
жения в векторе [23].
Другая серьезная проблема, общая для векторов обоих классов,
состоит в том, что пакующие штаммы после введения в них некоторых
векторов, начинают продуцировать не только дефектный рекомбинант-
пый ретровирус, но и недефектный ретровирус, способный к реплика-
ции и распространению, что, вероятно, обусловлено рекомбинацией с
интегрированным провирусом и восстановлением Ψ-сайта. Один из пу-
тей преодоления этой проблемы состоит в конструировании самоинак-
тивирующихся векторов, не способных к распространению без вируса-
помощника ни при каких обстоятельствах. Идея такого вектора осно-
вана на том, что область U3 З'-LTR передается и в 3'- и в 5'-LTR
ретровирусов следующей генерации (см. выше). Если в ретровирус
вводится дефектный З'-LTR, то вирусы следующего поколения не будут
способны ни к экспрессии, ии к распространению. На этой основе соз-
даны векторы с нормальным 5'-LTR, нормальным внутренним промо-
30 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.—1989.—Т. 5, λ1" 2
тором и дефектным З'-LTR [8]. С этими векторами можно получить
продуцент рекомбинантного ретровируса, но за счет дефекта его
5'-LTR гены, которые он переносит, могут экспрессироваться только
с внутреннего промотора, и транскрипты не могут паковаться вообще.
Обратные транскрипты с этих транскриптов не могут за счет рекомби-
нации восстановить Ψ-сайт в каком-либо дефектном провирусе, нахо-
дящемся в реципиентных клетках. Поэтому, если на пакующем штамме
получена продукция только дефектного рекомбинантного вируса, по-
следний при дальнейшей инфекции не может активировать какой-ни-
будь латентный дефектный провирус или активировать онкоген за счет
своего промотора в 5'-LTR. Рекомбинационное восстановление нор-
мальных З'-LTR при введении векторной плазмиды в пакующие клет-
ки, в принципе, возможно. Однако это очень редкое событие и легко
можно отобрать клон, продуцирующий только дефектный ретровирус.
Полученные к настоящему времени самоинактивирующиеся векторы, к
сожалению, дают весьма небольшой титр рекомбинантного ретровиру-
са (IO4 те/мл) и пока не могут быть использованы для переноса генов
с целью компенсации дефекта какого-либо гена в организме. Эта труд-
ность, по-видимому, будет преодолена.
Таким образом, суммируя, можно считать, что в настоящее время
ретровирусы по ряду причин, изложенных ниже, представляют собой
наиболее перспективные векторы для переноса генов в соматические
клетки: 1) ретровирусы могут эффективно переносить гены в большое
количество клеток в популяции; 2) стоки многих сотен миллилитров,
содержащие 106—107 частиц в 1 мл, могут быть наработаны для полу-
чения огромного количества векторов для переноса; 3) клетки, инфи-
цированные ретровирусами, повреждаются незначительно; 4) органи-
зация вирусного генома сохраняется при интеграции в хозяйскую ДНК,
даже несмотря на то, что ретровирусы интегрируют в случайные
сайты; 5) однажды интегрировав, ретровирусы становятся интеграль-
ной частью генома и ведут себя как клеточные гены; 6) чужеродная
Д Н К может быть упакована в ретровирусный вектор в больших вари-
ациях по размерам (любая Д Н К от около 1000 до 7000 н. п.); 7) реп-
ликативно дефектные ретровирусные векторы могут быть введены в
клетки в отсутствие вируса-помощника; в этом случае они интегриру-
ют и не двигаются с места. Таким образом, если клетки в культуре
обработать ретровирусными векторами и затем вернуть обратно паци-
енту, очень невелика вероятность распространения вектора в другие
ткани; 8) ретровирусы могут инфицировать широкий круг видов жи-
вотных и типов тканей. Ретровирусные векторы могут также быть
сконструированы для инфицирования клеток мышей, крыс, кошек, со-
бак, обезьян, человека. Эти векторы можно изучать на животных мо-
делях, а затем прямо использовать на людях; 9) можно сконструиро-
вать линии клеток, стабильно продуцирующих вектор с высоким тит-
ром, и хранить эти клетки замороженными, размораживая по мере
надобности, т. е. такие линии могут быть созданы однажды и нет не-
обходимости конструировать их каждый раз заново [24].
Перспективы использования в генной терапии человека. Костный
мозг является идеальной мишенью для терапевтического переноса ге-
нов ввиду легкого получения и реимплантации обратно этой ткани,
присутствия плюрипотентных самообновляющихся стволовых клеток в
костном мозгу, а также наличия большого количества наследственных
нарушений, поражающих клетки гемопоэтического происхождения [25].
Эксперименты на мышах показали, что ретровирусы могут быть
использованы для экспрессии перенесенных генов в гемопоэтических
тканях [11, 14, 18, 26—28] и что плюрипотентные гемопоэтические
стволовые клетки действительно могут быть инфицированы этими ви-
русами [11, 18]. Однако появляется целый ряд пока нерешенных вопро-
сов при попытке использования этой техники для человека. Инженерия
гемопоэтических клеток мышей была продемонстрирована, глав-
ным образом, с использованием векторов, содержащих элементы мы-
31 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.—1989.—Т. 5, λ1" 2
шиных вирусов, способных заражать только грызунов. Амфотрофные
векторы могут инфицировать клетки человека, но способность эффек-
тивно инфицировать гемопоэтические клетки человека для них пока
не показана. Для решения подобных вопросов в качестве предклини-
ческой модели генной терапии человека предлагается введение генети-
ческой информации в гемопоэтические прогениторные клетки большо-
му аутобредному животному, например собаке. Таким образом был
осуществлен перенос и получена экспрессия пео и дигидрофолатредук-
тазных генов [29]. Поскольку собака является традиционной предкли-
нической моделью трансплантации костного мозга у человека [30], в
дальнейшем предполагается аутологичная имплантация таким образом
инфицированного костного мозга.
Тем не менее многие вопросы не могут быть решены на модельных
животных и только при использовании этой техники для человека
можно будет коррелировать те или иные ее недостатки. Несколько ис-
следовательных групп США близки к составлению протоколов клини-
ческих испытаний. Это—группа Т. Фридмана в Калифорн. ун-те (Сан-
Диего); лаборатория В. Ф. Андерсона в Нац. ин-те сердца, легких и
крови; лаборатория Р. Муллигана в Ин-те биомед. исследований
(Кэмбридж); группа Д. Мартина в Генентеке (Сан-Франциско); а так-
же группы А. Д . Миллер в Центре исследований рака (Сиэтл); И Вер-
ма в Ин-те Солка (Сан-Диего); С. Т. Каски в Бэймервекском мед. кол-
ледже (Хаустон) [31]. Работают над этим вопросом в Канаде (Госпи-
таль Маунт Синай и Госпиталь детских заболеваний в Торонто) [32].
Выбор наследственного заболевания, для лечения которого пред-
полагается в первую очередь применить генную терапию, определяется
несколькими факторами: во-первых, необходимо знать в достаточной
степени молекулярные механизмы развития данной болезни; во-вто-
рых, уметь определять генетические дефекты, приводящие к этому за-
болеванию в каждом конкретном случае; в-третьих, пока не созданы
тканеспецифические векторы, нужно уметь культивировать клетки, в
которые собираемся вводить нужный ген; в-четвертых, патогенез забо-
левания должен быть таким, чтобы была возможность вернуть орга-
низм в нормальное состояние; в-пятых, заболевание должно быть на-
столько серьезным, чтобы оправдать неизбежный в той или иной сте-
пени риск, связанный с обычным несовершенством новой методологии
лечения. Для начальных исследований не обязательно, чтобы это было
широко распространенное заболевание. Затраты, которые пойдут на
исследования, в любом случае полностью будут компенсированы полу-
ченными результатами.
Легче, конечно, начать лечение рецессивного заболевания, в осно-
ве которого лежит, например, дефект какого-нибудь фермента, т. е.
когда дефектный ген не продуцирует функциональный фермент. Введе-
ние нормальной аллели дефектного гена, позволяющее хотя бы био-
химически ввести какую-то корреляцию в лечение доминантных болез-
ней, в результате присутствия ненормального гена, доминирующего над
нормальным, для генной терапии значительно более трудная задача.
Здесь должна быть прервана экспрессия ненормального гена, что под-
разумевает развитие технологии сайт-специфической интеграции. И хо-
тя в последнее время достигнут некоторый прогресс в понимании, ка-
ким образом интегрировать генетический материал в специфические
хромосомные сайты в клетках млекопитающих, пока нет падежных ме-
тодов прекращения экспрессии дефектного гена.
Исходя из приведенных критериев, сейчас имеется несколько кан-
дидатов на генную терапию. Это моногенные наследственные заболе-
вания, в первую очередь, синдром комбинированного иммунного дефи-
цита (СКИД) , обусловленный мутацией в одном рецессивном гене
АДА. В норме этот ген в Т-клетках всегда во «включенном» состоянии.
Если Т-клетки не синтезируют АДА, они погибают вскоре после обра-
зования, а без Т-клеток и В-клетки иммунной системы не могут рабо-
тать соответствующим образом. С К И Д поражает всего от 40 до 50 че-
32 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1 9 8 9 . - Т . 5, № 2
ловек в год во всем мире, но отличается крайне тяжелым протеканием.
Иммунная система у больных СКИД практически не функционирует, и
потому активация продукции АДА даже в небольшом числе плюри-
потентных стволовых клеток гематопоэза смогла бы обеспечить хотя
бы какую-то резистентность пациента к заболеваниям. Больных с этим
синдромом сейчас поддерживают трансплантацией костного мозга от
компетентного донора. Однако далеко не всегда такой донор имеется
в нужную минуту, а пересадка костного мозга от некомпетентного до-
пора часто приводит к смертельному исходу [24].
Недостаточность пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ), так же как
и предыдущее заболевание, относится к аутосомным рецессивным
болезням, т. е. поврежденные гены находятся на аутосомах. У нор-
мальных людей эти ферменты имеются во всех тканях. Недоста-
точность ПНФ, проявляющаяся в виде иммунного дефицита, обнару-
живается в год примерно у девяти пациентов из всего населения зем-
ного шара.
Эти болезни легко распознаются по своему уникальному фенотипу
матерью и, поскольку имеются легкие тесты на соответствующие фер-
менты, они всесторонне изучались длительное время, соответствующие
гены выделены и исследованы.
Синдром Леш-Найхэна имеет место каждый год примерно у 200
новорожденных мужского пола. Он возникает в результате мутации
единственного рецессивного гена, находящегося на Х-хромосоме. Этот
геи все время «включен» в норме и кодирует фермент ГФРТ. Это за-
болевание, кроме целого ряда других тяжелых симптомов, вызывает у
пациентов мучительное стремление к самоувечью (больные обкусыва-
ют пальцы, губы, вплоть до кровотечений). И хотя артрит снимается
пересадкой костного мозга или переливанием крови, продуцирующей
ГФРТ, тем не менее неврологические нарушения не исправляются. Од-
нако облегчение течения заболевания все же может быть получено и,
кроме того, если ГФРТ даже в небольшом количестве будет проникать
через гематоэнцефальный барьер, это может сказаться и на снятии
более жестких симптомов. Более того, ген ГФРТ представляет собой
прекрасный маркер, с помощью которого можно отбирать соответству-
ющие клетки костного мозга. Таким образом, наличие этого гена в
клетках дает удобную модель для изучения судьбы введеного гена, ре-
версий, селекции для эпигенетического контроля и т. д. [24].
Моногенные заболевания в результате недостаточности продукции
аргининосукцинатсинтетазы (53 случая) и орнитинкарбамоилтрансфе-
разы (110 случаев) также являются объектами, на которые сейчас на-
правлены усилия генных терапевтов [31].
Лечение всех этих болезней включает взятие костного мозга у па-
циентов, «инфицирование» их ретровирусной конструкцией с инсерци-
рованным в нее соответствующим геном и затем возвращение клеток
костного мозга обратно тому же больному. Конечно, такое манипули-
рование с клетками-реципиентами in vitro значительно легче, безопас-
ней и, кроме того, позволяет механически сузить круг клеток-мишеней.
Пока клетки костного мозга и клетки кожи •— единственные клетки
человека, которые удается культивировать вне огранизма в течение от-
носительно длительного промежутка времени.
Основные приемы получения вектора, переносящего соответству-
ющий ген в эритроидные клетки с большим титром, высокой эффектив-
ностью заражения клеток-мишеней, безопасного для больного и окру-
жающих, рассматривались в предыдущих разделах. Стабильная инте-
грация нового гена в ретровирусном векторе в клеточный геном может
быть большой проблемой. Однако, хотя показано, что в некоторых слу-
чаях интегрированные проретровирусы могут исчезать из генома клет-
ки [33—35], фактов, указывающих на подвижность инсерцированных
ретровирусных последовательностей, описано довольно немного. Таким
образом, провирус, однажды инсерцированный в геном клетки, обычно
остается там навсегда.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА — 1989.— Т. 5, № 2 3 — 8-930 33
Целый ряд других дефектных генов являются кандидатами на
исправление генноинженерным способом, однако их очередь, по-види-
мому, несколько позже. Сюда относятся гены, связанные с возникно-
вением мышечной дистрофии Дюшенна [36], ретинобластомы [37], ве-
дется интенсивный поиск гена, нарушения в котором вызывают фиброз
мочевого пузыря [38] и др. Однако предварительно нужно ответить на
многие пока нерешенные вопросы. Например, если ген нормально экс-
прессируется в данном типе клеток, то что произойдет при введении
его в составе ретровирусного вектора в сто различных мест ста ство-
ловых клеток? Будут ли, к примеру, Т-лимфоциты экспрессировать
β-глобин или он все-таки будет экспрессироваться только в эритроид-
ных клетках? Генная терапия заболеваний с поражением генов гло-
бинов, хотя вначале считавшаяся делом сегодняшнего дня, оказалась
значительно сложнее в связи с обнаружением целых ансамблей после-
довательностей, регулирующих координированную их экспрессию. По-
этому генному терапевту необходимо иметь всю систему, прежде чем
приступить к лечению гемоглобинопатий.
На очереди объектами генной терапии стоят заболевания печени
и поджелудочной железы. Затем, возможно, наступит черед фенилке-
тонурии, семейной гиперхолистеринемии. Конструирование тканеспеци-
фических векторов позволит инъецирование нужных генов прямо паци-
ентам, а не в реимплантирующиеся культивируемые in vitro клетки.
Таким образом, откроется возможность для генной терапии в амбула-
торных условиях [31].
По целому ряду соображений значительно менее понятна перспек-
тива вмешательства в зародышевые клетки человека. Замещение де-
фектных генов при доминантных наследственных заболеваниях или
когда родители, гомозиготные по рецессивному признаку, хотят иметь
детей без этого дефекта, представляет собой специальный случай тка-
неспецифической терапии. Однако ввиду необозримых проблем, свя-
занных с возможными изменениями во всей системе и ее регуляции,
никто из исследователей пока не может взять на себя ответственность
за неизбежные последствия, к которым может привести подобное вме-
шательство.
GENES TRANSFER ТО MAMMALIAN CELLS BY RETROVIRUS VECTORS
Ν. V. Tomilin, V. Μ. Kavsan
Institute of Cytology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad
Institute of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
S u m m a r y
There are some reasons for the modern retrovirus vectors to be the most promising ones
in genes transfer to mammalian cells. These vectors are intensively studied on different
model animals. The first reports of tests of these vectors for the treatment of some he-
reditary human diseases are expected to appear in the near future.
1. Transformation of mammalian cells with genes from prokaryotes and eukaryotes /
M. Wiglerf R. Sweet, G. K. Sim et a l . / /Ce l l .— 1979.—16, N 4.—P. 777—785.
2. Томилин Η. В. Новые системы генетической трансформации соматических клеток
млекопитающих / / Биотехнология.— 1987.—3, № 3.—С. 343—351.
3. Parkman R. The application of bone marrow transplantation to the treatment of
genetic diseases / /Science.— 1986.—232, N 4756.— P. 1373—1378.
4. Retroviral vector mediated gene transfer into human hematopoietic progenitor cells /
H. E. Gruber, K. D. Fin ley, R. M. Hershberg et al. / / Ibid.— 1985.—230, N 4729 —
P. 1057—1061.
5. Perturbed hemopoiesis and the generation of multipotential stem cell clones in src-
infected bone marrow cultures is an indirect of transient effect of the oncogene /
J. A. Wyke, A. W. Stoker, S. Searle et a l . / / M o l . and Cell. Biol.— 1986.—6 N 3 —
P. 953—963.
6. Modulation of gene expression in multiple haematopoietic cell lineages following
34 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.—1989.—Т. 5, λ1" 2
retroviral vector gene transfer / M.-C. Magli, J. E. Dick, D. Huszar et al. / / Proc. Nat.
Acad. Sci. USA.— 1987.—84, N 3,—P. 789—793.
7. Хесин P. Б. Непостоянство генома —Μ. : Наука, 1984. -472 с.
8 Self-inactivating retroviral vectors designed for transfer of whole genes into mamma-
lian ce l l s /S . -F . Yu., T. von Ruden, P. W- Kantoff et a l . / / P r o c . Nat. Acad. Sci.
USA.— 1986.—83, N 10.—P. 3194—3198.
9. Mann RMulligan R. C., Baltimore D. Construction of retrovirus packaging mutant
and its use to "produce helper-free defective retrovirus / /Cel l— 1983—33, N 1.—
ρ ]53 159
10. Cepko C. L., Roberts Β. EMulligan R. C. Construction and application of a highly
transmissible murine retrovirus shuttle v e c t o r / / I b i d — 1984,—37, N 3.—P. 1053—
1062.
11 Introduction of a selectable gene into primitive stem cells capable of long-term re-
construction of the hemopoietic system W / W v m i c e / J . E. Dick, M. C. Magli, D. Hus-
zar et al. / / Ibid.— 1985.—42, N 1.— P. 71—79.
12. Tissue-specific expression of functionally rearranged lambda 1 Ig gene through a
retrovirus vector / R. D. Conf, E. B. Reilly, H. N. Eisen, R. C. Mulligan / / Science.—
1987.-236, N 4804.—P. 954—957.
13. Retroviral expression of the human IL-2 gene in a murine T cell line results in cell
growth autonomy and tumorigenicitv / G. Yamada, Y. Kitamura, H. Sonoda et a l . / /
EMBO J.— 1987.—6, N 9.— P. 2705—2709-
14 Expression of a retrovirus encoding human HPRT in mice / A. D. Miller, R. J. Eck-
ner, D. J. Jolley et al. / / Science.— 1984.—225, N 4662.— P. 630—632.
15. Hock R. A., Miller A. D. Retrovirus-mediated transfer and expression of drug-resistan-
ce genes in human haematopoietic progenitor ce l l s / /Nature .— 1986.—320, N 6059.—
P. 275—277.
16. Belmont J. W., Henkel-Tigges J., Chang S. M. W. Expression of human adenosine
deaminase in murine haematopoietic progenitor cells following retroviral gene tran-
s fer / / Ib id .—322, N 6077.—P. 385—387.
17. Potentiation of growth factor activity by exogeneous c-myc expression / V. Sorren-
tino, V. Drosdoff, M. D. McKinney, L. Zeitz / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1986.—
83, N 21,—P. 8167—8171.
18. Expression of a foreighn gene in myeloid and lymphoid cells derived from multipo-
tent haematopoietic precursors / G. Keller, C. Paige, E. Gilboa, E. F. W a g n e r / / N a -
ture.—1985.—318, N 6042,—P. 149—154.
19. Correction of adenosine deaminase deficiency in cultured T and B cells by retrovi-
rus-mediated gene transfer / P. W1. Kantoff, D. B. Kohn, H. Mitsuya et al. / / Proc.
Nat. Acad. Sci. USA.— 1986.—83, N 17.—P. 6563—6567.
20. Expression of retrovirally transduced genes in primary cultures of adult rat hepa-
tocytes /J . A. Wolff, J.-K. Yee, H. F. Skelly et a l . / / Ib id .— 1987.—84, N 10.—
P. 3344—3348.
21. Expression of retroviral vectors in transgenic mice obtained by embryo infection /
C. L. Stewart, S. Schultze, M. Vanek, E. F. W a g n e r / / E M B O J.— 1987,—6, N 2.—
P. 387—388.
22. Infectious and selectable retrovirus containing an inducible rat growth hormone mi-
n i g e n e / D . A. Miller, E. S. Ong, M. G. Rosenfeld et a l . / /Sc ience .— 1984.—225,
N 4666.—P. 993—997.
23. Emerman M., Temin Η. M. Genes with promoters in retrovirus vectors can be inde-
pendently supressed by an epigenetic mechanism//Cel l .— 1984.—39, N 3.— P. 459—
467.
24. Milewski E. A. Discussion on human gene therapy//Recombinant DNA technical
bulletin.— 1986.—9, N 2.—P. 88—130.
25. The metabolic basis of inherited disease.— New York: McGrow Hill, 1983.—450 p.
26. Retrovirus-mediated transfer of a bacterial gene into mouse haematopoietic progeni-
t o r / A . Jovner, G. Keller, R. A. Phillips, A. Bernstein / / Nature.— 1983.—305,
N 5934.— P. 556—558.
27. Introduction of new genetic material into pluripotent haematopoietic stem cells of
the m o u s e / D . A. Williams, J. K. Lemischka, D. G. Nathan, К. C. Mul l igan/ / Ib id .—
1984,—310, N 5977.—P. 476—480.
28. Narayanan R., Jastreboff Μ. MBertino J. R. Development of an amphotropic, high-
titer retrovirus ,vector expressing the dihydrofolate reductase gene and conferring
methotrexate resistance/ /Gene.— 1986.—48, N 1.— P. 71—80.
29. Retroviral transfer of genes into canine hemopoietic progenitor cells in culture: a
model for human gene therapy / W . W. Kwok, F. Schuening, R. B. Stead, A. D. Mil-
l e r / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA.— 1986,—83, N 12.—P. 4552—4556.
30. Deeg H. /., Storb R., Thomas E. D. Recent advances in bone morrow transplantati-
on.—New York: Alan R. Liss, 1983.—546 p.
31. McComick D. Human gene therapy: the first round / / Biotechnology.— 1985 —3
N 8,— P. 689—693.
32. Engineering in humans/ /Biotechnology Can Res.— 1986.—19, N 6.—P. 6.
33. Loss of viral gene expression and retention of tumorigenicity by Abelson lymphoma
c e l l s / D . J. Grunwald, B. Dale, J. Dudley et a l . / / J . Virol.— 1982.—43, N 1 —
P. 9 2 - 1 0 3 .
34. Отсутствие генов вирусов саркомы птиц в трансформированных ими клетках мле-
копитающих/А. В. Рындич, Б. А. Ядула, И. Герик и др./ /Биополимеры и клет-
ка.— 1985.—1, № 2.—С. 92—99.
БИОПОЛИМЕРЫ И К Л Е Т К А , - 1 9 8 9 . - Т . 5, JVq 2 35
35. Instability of ASV genomes structure in mammalian and duck ce l l s /A . Rynditch,
B. Yatsula, I. Hlozanck, J. Svoboda/ /17th FEBS meeting: Abstr.—Berlin, 1986.—
Vol. 367.—P. 226.
36. Robertson M. Mapping the disease phenotype / / Nature.— 1986—327 — P. 372—373.
37. Human retinoblastoma succeptibility gene: cloning, identification and seguence /
V. H. Lee, R. Bookstein, F. Hong et al. / / Science.— 1987.—235, N 4794.—P. 1394—
1399.
38. White R. The search for the cystic fibrosis gene/ /Ibid .— 1986—234, N 4780—
P. 1054—1055.
Ин-т Ц И Т О Л О Г И И АН СССР, Ленинград Получено 01.03.88
Нн-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев
У Д К 575.155:575.224.46
ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВЕКТОРОВ
НА ОСНОВЕ ДНК SV40 ДЛЯ ГЕНОТЕРАПИИ
С. М. Ландау
Благодаря развитию генной инженерии и использованию эукариотиче-
ских векторов и, в частности, векторов на основе генома вакуолизиру-
ющего вируса SV40 появилась возможность подойти к изучению экс-
прессии генов в организме животных и даже, в перспективе, в организ-
ме человека. Хотя эти исследования еще далеки от использования их
результатов на практике, однако, несомненно, они относятся к первым
попыткам в развитии нового направления — генной терапии.
Чтобы оценить реальные возможности SV40 как вектора для ген-
ной терапии, необходимо рассмотреть молекулярные основы вирусной
инфекции. В связи с этим представляет интерес изучение некоторых
основных свойств вируса SV40 и его ДНК.
Общие свойства вируса и его ДНК. Обезьяний вирус 40, относя-
щийся к семейству Papovaviridae и роду Polyomavirus, впервые обнару-
жен Суитом и Хиллеманом в 1960 г. в клетках почки обезьян, исполь-
зуемых для производства вакцины против полиомиэлита.
Геном вируса SV40 состоит из 5224 пар оснований (п. о.). В на-
стоящее время определена полная нуклеотидная последовательность
Д Н К SV40. На рис. 1 показана генетическая карта SV40 [1]. Д Н К
SV40 имеет раннюю и позднюю области и регуляторный район, состоя-
щий из «ориджина» репликации, раннего и позднего промоторов и
усилителей. В состав контролирующих элементов SV40 входит блок
палиндромов 17, 15 и 27 п. о., ТАТА-бокс (АТ-обогащенная область
17 п. о.), три копии повторов по 21 п. о. и две копии повторов по 72 п. о.
(рис. 2) [2]. «Ориджин» Д Н К SV40 разделен на две области с опреде-
ленными границами: первая включает 17, 15 и 27 п. о. палиндромы и
АТ-обогащенную последовательность, необходимые для репликации;
другая — несет вспомогательные функции и включает повторы 21 п. о.,
повышающие эффективность репликации.
Ранний промотор SV40 перекрывается с поздним и с «ориджином»
репликации. Ранний промотор эффективнее позднего. Два повтора по
72 п. о. являются энхансерами (усилителями) транскрипции. В регу-
ляторном районе SV40 имеются I, II и III сайты для связывания с ран-
ним белком Г-антигеном.
Ранняя область 5V40 несет информацию о двух белках. Это боль-
шой (T) и малый (t) антигены. Основные функции Г-антигена заклю-
чаются в его необходимости для: 1) усиления репликации клеточной
ДНК; 2) инициации репликации вирусной ДНК; 3) авторегуляции ран-
ней транскрипции; 4) индукции поздней транскрипции; 5) детермина-
ции круга хозяев; 6) неопластической трансформации клеток. При
3 0 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.—1989.—Т. 5, λ1" 2
|