Влияние рН, ионной силы и ионного состава реакционной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом модели «головка молотка»

Рибозимы модели «головка молотка», как и другие типы рибозимов, являются метаяло энзимами, каталитическая активность которых зависит от наличия ионов двухвалентных металлов в среде. Но если влияние двухвалентных ионов металлов на реакцию расщепления субстрата рибозимом хорошо изучено, то влияние мон...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1997
1. Verfasser:	Бурьяновский, Л.Н.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1997
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Schlagworte:	Структура и функции биополимеров
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154653
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Влияние рН, ионной силы и ионного состава реакционной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом модели «головка молотка» / Л.Н. Бурьяновский // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 1. — С. 30-35. — Бібліогр.: 20 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-154653
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1546532019-06-16T01:31:23Z Влияние рН, ионной силы и ионного состава реакционной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом модели «головка молотка» Бурьяновский, Л.Н. Структура и функции биополимеров Рибозимы модели «головка молотка», как и другие типы рибозимов, являются метаяло энзимами, каталитическая активность которых зависит от наличия ионов двухвалентных металлов в среде. Но если влияние двухвалентных ионов металлов на реакцию расщепления субстрата рибозимом хорошо изучено, то влияние моновалентных катионов не исследовалось хоть сколько-нибудь систематически. В данной работе изучалось влияние моновалентных катионов (Н⁺, K⁺, Li⁺, NH₄⁺), а также ионов буферной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом типа «головка молотка». рН-зависимость эффективности реакции имела колоколообразную форму с оптимумом рН 7,0. Ионы K⁺ и Li⁺ в концентрации 0,1 М стимулировали, а в концентрациях выше 0,2 М – снижали эффективность расщепления. При 0,8 М реакция подавля¬лась практически полностью. Ионы NH₄⁺ оказывали ингибирующее действие при всех исследованных концентрациях. Представленные данные, на взгляд автора, свидетельствуют о специфичности взаимодействий моновалентных катионов с рибозимной РНК, способствующих, или, напротив, препятствующих предпочтительному бразованию активной конформации «головки молот¬ка». Рибозами типу «головка молотка», як і інші типи рибозимів, є металоензимами і їх активність залежить від присутності іонів двовалентних металів. Однак, якщо вплив іонів двовалентних металів на розщеплення субстрату рибозимом досліджено добре, то дія моновалентних катіонів досі не вивчалась систематично. В наведеній роботі проаналізовано вплив моновалентних катіонів (Н⁺ , k⁺ , Li⁺ , NH₄⁺ ) та іонів буферного середовища на ефективність розщеплення in vitro tat-PHK рибозимом типу «головка молотка». рН-залежність ефектив¬ності реакції мала дзвоноподібну форму з оптимумом при рН 7,0. Іони К і Li в концентрації 0,1 М стимулювали, а в концентраціях вище 0,2 М – зменшували ефективність роз¬щеплення. При концентрації солей близько 0,8 М реакція пригнічувалася практично повністю. Іони NH₄⁺ виявляли інгібуючу дію при всіх концентраціях, що вивчалися. Ці дані, на погляд автора, можуть свідчити про специфічність взаємодії моновалентних катіонів з рибозимною РНК, що може сприяти або, навпаки, перешкоджати утворенню активної конформації «головки молотка». The hammerhead ribozymes like other types of ribozymes are metalloenzymes, and their activity strongly depend on divalent metal ion presence. While influence of divalent metal ions on the cleavage of substrate by the hammerhead ribozymes was well characterised, effect of monovalent kations was not analyse systematically. In the present work influence of monovalent cations (H⁺, K⁺, Li⁺, NH₄⁺) and buffer ions on efficiency of the tat-RNA cleavage in vitro by hammerhead ribozyme was characterized. pH-dependence was shown to be bell-shaped with an optimum at pH 7.0. Both K⁺ and Li⁺ ions at concentration 0.1 M increased, and at concentrations higher 0.2 M decreased efficiency of cleavage. At concentration 0.8 M reaction seemed to be completely blocked. NH₄⁺ ions had inhibitory effect at all concentrations tested. The data presented here suggest specificity of interactions of monovalent cations with ribozyme RNA, that might promote, or vice versa, prevent forming active hammerhead conformation. 1997 Article Влияние рН, ионной силы и ионного состава реакционной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом модели «головка молотка» / Л.Н. Бурьяновский // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 1. — С. 30-35. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000463 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154653 577.214.3-577.113.4 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Бурьяновский, Л.Н. Влияние рН, ионной силы и ионного состава реакционной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом модели «головка молотка» Биополимеры и клетка
description	Рибозимы модели «головка молотка», как и другие типы рибозимов, являются метаяло энзимами, каталитическая активность которых зависит от наличия ионов двухвалентных металлов в среде. Но если влияние двухвалентных ионов металлов на реакцию расщепления субстрата рибозимом хорошо изучено, то влияние моновалентных катионов не исследовалось хоть сколько-нибудь систематически. В данной работе изучалось влияние моновалентных катионов (Н⁺, K⁺, Li⁺, NH₄⁺), а также ионов буферной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом типа «головка молотка». рН-зависимость эффективности реакции имела колоколообразную форму с оптимумом рН 7,0. Ионы K⁺ и Li⁺ в концентрации 0,1 М стимулировали, а в концентрациях выше 0,2 М – снижали эффективность расщепления. При 0,8 М реакция подавля¬лась практически полностью. Ионы NH₄⁺ оказывали ингибирующее действие при всех исследованных концентрациях. Представленные данные, на взгляд автора, свидетельствуют о специфичности взаимодействий моновалентных катионов с рибозимной РНК, способствующих, или, напротив, препятствующих предпочтительному бразованию активной конформации «головки молот¬ка».
format	Article
author	Бурьяновский, Л.Н.
author_facet	Бурьяновский, Л.Н.
author_sort	Бурьяновский, Л.Н.
title	Влияние рН, ионной силы и ионного состава реакционной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом модели «головка молотка»
title_short	Влияние рН, ионной силы и ионного состава реакционной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом модели «головка молотка»
title_full	Влияние рН, ионной силы и ионного состава реакционной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом модели «головка молотка»
title_fullStr	Влияние рН, ионной силы и ионного состава реакционной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом модели «головка молотка»
title_full_unstemmed	Влияние рН, ионной силы и ионного состава реакционной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом модели «головка молотка»
title_sort	влияние рн, ионной силы и ионного состава реакционной среды на эффективность расщепления in vitro tat-phk вич-1 рибозимом модели «головка молотка»
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1997
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154653
citation_txt	Влияние рН, ионной силы и ионного состава реакционной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом модели «головка молотка» / Л.Н. Бурьяновский // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 1. — С. 30-35. — Бібліогр.: 20 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT burʹânovskijln vliâniernionnojsilyiionnogosostavareakcionnojsredynaéffektivnostʹrasŝepleniâinvitrotatphkvič1ribozimommodeligolovkamolotka
first_indexed	2025-07-14T06:41:20Z
last_indexed	2025-07-14T06:41:20Z
_version_	1837603520227835904
fulltext	ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1997. Т. 13. N© 1 Влияние рН, ионной силы и ионного состава реакционной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом модели «головка молотка» Л . Н. Бурьяновский Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины 252143, Киев, ул. Академика Заболотного, 150 Рибозимы модели «головка молотка», как и другие типы рибозимов, являются ме таяло энзимами, каталитическая активность которых зависит от наличия ионов двухвалентных металлов в среде. Но если влияние двухвалентных ионов металлов на реакцию расщепления субстрата рибозимом хорошо изучено, то влияние моновалентных катионов не исследовалось хоть сколько- нибудь систематически. В данной работе изучалось влияние моновалентных катионов (Н , К , Li+, NH<C), а также ионов буферной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-I рибозимом типа «головка молотка». рН-зависимость эффективности реакции имела колоколооб- разную форму с оптимумом рН 7,0. Ионы iC и Li в концентрации 0,1 М стимулировали, а в концентрациях выше 0,2 М — снижали эффективность расщепления. При 0,8 М реакция подавля лась практически полностью. Ионы NH* оказывали ингибирующее действие при всех исследован ных концентрациях. Представленные данные, на взгляд автора, свидетельствуют о специфично сти взаимодействий моновалентных катионов с рибозимной РНК, способствующих, или, напро тив, препятствующих предпочтительному образованию активной конформации «головки молот ка». Введение. Рибозимы модели «головка молотка» ха рактеризуются тремя основными структурными особенностями: наличием, во-первых, трех двух- цепочечных стеблей; во-вторых, внутреннего одно- цепочечного участка и, наконец, в-третьих, 13 консервативных нуклеотидных остатков в составе указанных элементов [1 ]. Эти детали в совокупно сти образуют высокоспецифичную структуру, слу жащую каталитическим центром, способным, подо бно каталитическим центрам белковых ферментов, снижать энергию активации в реакции гидролити ческого расщепления фосфодиэфирной связи в мо лекуле РНК-субстрата. Полианионная природа мо лекул Р Н К , имеющих к тому же в составе основа ний множество групп, способных к ионизации, резко отличает РНК-опосредованный катализ от белкового (ферментативного в традиционном зна чении) . К настоящему времени кинетика расщеп ления субстратной Р Н К рибозимом типа «головка © Л. Н. БУРЬЯНОВСКИЙ, 1997 молотка» детально исследована [2—4 ]. Однако в этих работах кинетический анализ проводили с использованием очень коротких РНК-субстратов, тогда как известно, что эффективность расщепле ния сильно зависит от размера субстрата [5, 6 ]. Принимая во внимание важное значение ионов одновалентных металлов как в поддержании той или иной конформации, так и в модуляции силы комплементарного взаимодействия нуклеиновых кислот, предпринята попытка качественно охарак теризовать зависимость эффективности расщепле ния tat-PHK рибозимом, описанным ранее [7, 8 ], от ионной силы и ионного состава раствора. Опре делена также зависимость каталитической актив ности от рН. Материалы и методы. Клонирование Д Н К - фрагментов tat-rena и рибозима, получение tat- РНК-субстрата и рибозима в реакции транскрип ции in vitro, а также РНК-полимеразы фага Т7 описаны нами ранее [7 ] . Р еакц и ю расщепления tat-PHK рибозимом проводили в 10 мкл реакцион- 30 ВЛИЯНИЕ рН, ИОННОЙ СИЛЫ И ИОННОГО СОСТАВА СРЕДЫ Выход 5'- продукта Рис. 1. Зависимость эффективности расщепления tat-PHK рибо зимом in vitro от рН: 7 — 33 мМ Na-цитратный буфер, рН 5,0; 2 — 50 мМ имидазол-HCl, рН 6,6; 3 — 50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,0 и 7,4; 4 — 50 мМ трис-HCl, рН 7,4, 8,0 и 8,5. Реакцию проводили в течение 100 мин при 34 °С ной смеси, содержавшей: 50 мМ трис-HCl, рН 7,4 (при 20 °С), 10 мМ уксуснокислый магний, 2 мМ спермидин, 100 мМ КС1, 0,5 мкМ РНК-субстрат и 22 мкМ рибозим. Концентрацию образцов Р Н К определяли спектрофотометрически по поглоще нию при 260 нм. Дополнительные компоненты вносили в реакционную смесь в концентрациях, указанных в подписях к рисункам. Реакцию прово дили в течение 2 или 3 ч при температуре 25 °С либо как указано в подписях к рисункам. По истечении этого времени к пробам добавляли по 5 мкл смеси, содержавшей 92 % - й формамид, 40 мМ ЭДТА, 0,02 % - й ксилолцианол и 0,02 %-й бромфеноловый синий. Аликвоты по 5 мкл после прогрева при 80 °С (1 мин) наносили на 5 % - й полиакриламидный гель, содержащий 7 М мочеви ну, 20 % - й формамид и 40 мМ трис-боратный буфер, рН 8,3. По окончании электрофореза гель переносили на бумагу ватман ЗМ, сушили и прово дили авторадиографию на рентгеновскую пленку Р М - 1 . Об эффективности реакции судили по на коплению 5'-продукта расщепления tat-PHK (фраг мент 280 нуклеотидов), количество которого опре деляли сканированием авторадиограмм на лазер ном денситометре UltroScan XL («LKB», Швеция) . 3'-продукт (фрагмент НО нуклеотидов) не учиты вали, поскольку в отсутствие надежного маркера и из-за слабого сигнала не всегда представлялось возможным идентифицировать соответствующую полосу на радиоавтографе. Результаты и обсуждение. Концентрация ио нов водорода существенно влияет на каталитиче скую активность множества ферментов. А так как структурные основы строения белков-ферментов и нуклеиновых кислот сильно различаются, пред ставляло интерес определить характер рН-зависи- мости эффективности расщепления tat-PHK, доста точно протяженного субстрата, рибозимом модели «головка молотка». Зависимость каталитической активности рибо зима от концентрации ионов водорода, рН, пред ставлена на р и с 1. Как видно, максимальная э ф фективность реакции наблюдалась при нейтраль ных значениях рН 7 ,0—7,2 . При увеличении значения рН на одну единицу эффективность реак ции снижалась вдвое. Дальнейшее увеличение рН до значения 9,0 еще несколько снижало эффектив ность реакции и, кроме того, субстратная РНК становилась более подверженной неспецифическо му гидролизу. Такое снижение эффективности ре акции находится в противоречии с хорошо установ ленным фактом линейного увеличения скорости реакции расщепления субстрата рибозимом типа «головка молотка» в интервале рН от 5,5 до 9,0 [9, 10] . Поскольку мы не проводили анализа кинетики расщепления ta t -PHK и не располагаем значения ми соответствующих коэффициентов , трудно ска зать, какая именно из стадий реакции — ассоциа ция/диссоциация субстрата, рибозима и продуктов или же стадия химического расщепления — обус ловливает указанное противоречие. Исходя из того, что мы проводили реакцию в условиях значитель ного избытка рибозима над субстратной Р Н К (при близительно 4 0 / 1 ) , т. е. по однооборотному меха низму, можно допустить, что стадии ассоциа ции/диссоциации не могли быть лимитирующими скорость факто р ам и . Т а к и м образом, остается предположить, что снижение эффективности реак ции при слабощелочных значениях рН могло быть связано с конформационными перестройками Р Н К - субстрата. Это отчасти подтверждается тем обстоя тельством, что в работах [9, 10] были использова ны очень короткие — 24 и 12 нуклеотидов — суб страты, не способные к образовыванию вторичных структур, тогда как в данном случае субстратная Р Н К имела размер 390 нуклеотидов и, естественно, сложную трехмерную структуру. Конформацион- ные и з м е н е н и я п р о т я ж е н н о г о Р Н К - с у б с т р а т а , обусловленные дефицитом протонов с ростом рН, возможно, могли бы быть причиной снижения э ф фективности реакции. Понижение рН ниже нейтрального значения не так резко сказывалось на эффективности реакции. При рН 5,0 эффективность реакции была вдвое ниже по сравнению с уровнем эффективности при 31 БУРЬЯНОВСКИЙ Л н рН 7,0. Если же принять во внимание ощутимую хелатирующую способность использованного в дан ном случае цитратного буфера и связанное с этим неизбежное снижение концентрации Mg 2 + , которое мы никак не компенсировали, можно предполо жить, что реальная каталитическая активность ри бозима при рН 5,0 могла быть даже выше установ ленного значения. Примечательными являются ре зультаты реакций, проводившихся при рН 6,6 и 7,0. В первом случае в качестве буферного раствора использовали 50 мМ имидазол-HCl , рН 6,6. Изве стно, что имидазольные кольца гистидина-12 и гистидина-119 играют ключевую роль в гидролизе Р Н К рибонуклеазой А [11] . Показано также, что имидазольный буфер катализирует расщепление Р Н К , в частности, полиуридиловой кислоты [12] . Действительно, как видно из рис. 1, эффективность расщепления субстрата в данном буфере несколько выше ожидаемой для данного значения рН. Воз можно, это как раз и объясняется некоторым вли янием природы буфера. Отсутствие же следов не специфической деградации субстратной Р Н К сви детельствует о том, что этот процесс протекает весьма слабо при низкой концентрации имидазола и не может интерферировать с каталитической активностью рибозима. Использование калий-фосфатного буфера для реакций, проводившихся при рН 7,0 и 7,4, также имело целью помимо определения уровня катали тической активности при указанных значениях рН еще и выявление возможного влияния ионов самой буферной системы на протекание реакции. Тради ционно используемый трис-буфер содержит пер вичный амин, являющийся нуклеофилом, который теоретически мог бы участвовать в реакции гидро лиза фосфодиэфирной связи и, таким образом, влиять на каталитическую активность рибозима. С использованием фосфатного буфера из реакцион ной среды устранялось основное количество амин- ных групп (остававшийся полиамин спермидин не мог быть удален без потери активности рибозима, но его концентрация была существенно ниже кон центрации буфера) . С другой стороны, в 50 мМ фосфатном буфере все ионы Mg 2 + должны перехо дить в нерастворимую форму и, следовательно, исключаться из реакции расщепления. В любом случае ожидалось увидеть более или менее значи тельное падение каталитической активности рибо зима. К нашему удивлению, эффективность реак ции в фосфатном буфере при рН 7,0 не отличалась от эффективности реакции, проводимой в трис-бу- фере (см. р и с 1). Данный результат свидетельству ет о том, что, во-первых, аминные группы трис-бу- фера не участвуют в катализе расщепления рибо зимом фосфодиэфирной связи (к настоящему вре мени считается, что реакции, катализируемые ри- бозимами типа «головка молотка», осуществляются через «внутренний» нуклеофил — 2 -ОН группу, прилегающую к отщепляемому фосфату, коорди нированному ионом Mg 2 + ; но в начале наших экс периментов это еще было предметом дискуссии). Во-вторых, этот результат указывает на то, что в реакции участвуют, по-видимому, только весьма тесно контактирующие с Р Н К ионы Mg 2 + , не до ступные для остатков фосфорной кислоты буфера. В целом, зависимость активности рибозима от рН имеет колоколообразный характер, типичный для реакций, осуществляемых ферментами-белками. Парадоксальность же приведенных результатов состоит в следующем. Такой характер зависимости означает, что фермент содержит по крайней мере две ионогенные группы, протонирование или де- протонирование которых изменяет его активность. В случае белкового фермента это объясняется на личием в белке аминокислотных остатков, содер жащих ионогенные группы, способные к ионизации в пределах рН 5—8. Так , карбоксильные группы ионизируются в области рН 3,5—5,0, остатки гис- тидина — при рН 5,5—7,0, остатки цистеина —- при рН 7,5—9,0. В то же время известно, что ионизация оснований в нуклеиновых кислотах имеет место при рН ниже 3,5 и выше 9,0 [13] . Поэтому отсутствие, как в работе [9 ], или снижение, как в нашем случае, каталитической активности рибозима при рН 5,0, на первый взгляд, вряд ли правомерно объяснять протониро- ванием остатков аденина и цитозина, по аналогии с [9] . Очевидно, что колебания значений рН в пределах 5,0—9,0 еще не могут повлиять на ста бильность комплекса субстрат — рибозим и тем самым повлечь снижение эффективности реакции. Однако не исключено, что по крайней мере неко торые основания в цепи Р Н К , к тому же находя щиеся в конформационной близости с другими основаниями, могут иметь такой сдвиг кажущегося значения рКг, который будет обусловливать их ионизацию уже при значениях рН, близких к нейтральному. В таком случае, действительно, от клонения рН на одну — две единицы в ту или иную сторону приводили бы к протонированию/де- протонированию таких принципиальных для под держания конформации оснований, что в свою очередь, вызывало бы нарушение каталитически активной конформации рибозима. Если протониро вание оснований цитозина или аденина при рН 5,0 действительно имеет место, то из соотношения к о н ц е н т р а ц и й в р е а к ц и о н н о й смеси рибозима (22 мкМ) и протонов (приблизительно 10 мкМ) 32 ВЛИЯНИЕ рН, ИОННОЙ СИЛЫ И ИОННОГО СОСТАВА СРЕДЫ можно ожидать, что даже в случае 100 %-го связывания протонов с единственным титрующим ся основанием эффективность реакции не могла уменьшиться более чем вдвое. В случае же двух и более титрующихся оснований падение эффектив ности реакции должно быть еще меньше. Анало гично, в работе [9] Уленбек использовал рибозим в концентрации 2 пМ и в этом случае, согласно вышеизложенному, следовало бы ожидать практи чески 100 %-го ингибирования реакции при рН 5,0, что и отмечено автором [9 ]. Принимая во внимание результаты рентгено- структурного анализа [14] , можно предположить, что цитозины С 3 и С , 7 и / и л и аденины А 1 3 и А, 4 (по нумерации [15]) могут быть такими «критически ми» основаниями. С другой стороны, учитывая важную роль водной среды в стабилизации упоря доченных конформаций нуклеиновых кислот [16] , все же нельзя исключать и возможности того, что не столько протонирование/депротонирование ос нований, сколько глобальные изменения свойств воды как растворителя при изменении рН ответст венны за эффективность катализа рибозимом. Об этом может, на наш взгляд, свидетельствовать колоколообразная, хотя и не совсем симметричная, форма рН-зависимости: любые отклонения в ту или иную сторону от нейтрального значения, когда концентрация Н + равна концентрации ОН", ведут к снижению эффективности реакции. Какое из этих предположений верно, еще предстоит установить. Ионы таких металлов, как M g + , Na + , К + , содержатся в клетке в миллимолярных концентра циях, поэтому нуклеиновые кислоты обычно при сутствуют в виде комплексов с ионами металлов. Физико-химические характеристики ионов щелоч ных металлов и иона аммония, такие как энергия ионизации, сродство к электрону, ионная и элек трическая проводимости, коэффициенты диффузии в водных растворах, поверхностное натяжение вод ных растворов и др. , имеют весьма близкие значе ния. В то же время хорошо известно, что многие белковые ферменты обладают достаточно строгой селективностью по отношению к определенному катиону (или аниону) . В связи с этим следующей задачей было определение зависимости эффектив ности реакции от концентрации и вида солей моновалентных металлов. Как следует из рис. 2, наибольшим стимулирующим эффектом в концен трации 0,1 М характеризовались соли КС1 и LiCl, которые наполовину увеличивали выход продукта по сравнению с реакцией, проводившейся в отсут ствие соли. Однако в концентрациях выше 0,12— 0,15 М отмечалось снижение эффективности реак ции. При концентрации этих солей 0,4 М КС1 Рис. 2. Зависимость эффективности расщепления taf-PHK рибо зимом в реакции in vitro от концентрации солей: / — КС1; 2 — LiCl; 3 — LiC10 4 ; 4 — ЇЧН 4-ацетат; 5 — КС1 в присутствии 25 % формамида. Реакцию проводили в течение 120 мин при 34 °С снижал эффективность реакции на 30 %, a LiCl — на 50 % от эффективности реакции в отсутствие соли. Стимулирующее влияние ионов Li + полно стью устранялось, если в качестве аниона исполь зовали С10 4" (рис. 2, кривая 5 ) . Как известно, перхлорат-ионы обладают хаотропным эффектом, нарушающим структуру воды. Поэтому приведен ный результат можно считать подтверждением из ложенному выше предположению о возможном влиянии структуры водного окружения на катали тическую активность рибо зима. Ионы аммония также оказались скорее «ингибирующими», во вся ком случае, в концентрациях выше 0,1 М (рис. 2, кривая 4). Это был несколько неожиданный ре зультат, так как было показано, что ионы аммо ния, наряду с ионами калия , специфично участву ют в поддержании некоторых третичных структур в Р Н К [17] . И поскольку ионы калия увеличивали эффективность расщепления tat-PHK рибозимом, ожидалось получить аналогичный эффект в случае ионов аммония. Возможно, именно негативным влиянием ионов аммония были обусловлены неуда чи в экспериментах, когда в реакции расщепления использовали РНК-транскрипты, очищенные дву- 33 БУРЬЯНОВСКИЙ л. н. кратным переосаждением из 2 М ацетата аммония (результаты не приведены). В целом, при концен трации соли выше 0,6—0,8 М реакция практически не шла. Ингибирование реакции можно было бы объяс нить либо ингибированием этапа химического рас щепления, либо, опять-таки, конформационными перестройками субстратной Р Н К и / и л и рибозима. Ранее нами было показано, что присутствие в реакционной смеси 25 % формамида не угнетает каталитическую активность рибозима [8 ]. Из рис. 2 видно, что при добавлении 25 % формамида эффективность реакции при 0,1 и 0,2 М КС1 падает вдвое по сравнению со значениями эффективности в отсутствие формамида. Но при концентрациях КС1 выше 0,4 М эффективность реакции в отсутст вие и в присутствии формамида выравнивалась, а при 0,8 М КС1 — была даже несколько выше для реакционной смеси, содержавшей формамид. Этот результат свидетельствует о том, что ингибирова ние реакции высокой концентрацией соли было обусловлено большей «структурированностью» суб стратной Р Н К , затруднявшей стадию связывания субстрата с рибозимом, а не ингибированием собст венно расщепления. Такой вывод согласуется с данными работ других авторов, где показана актив ность рибозима модели «головка молотка» в среде с 1 М NaCl [9] и даже с 1,6 М L i 2 S 0 4 [14] . Субстратные Р Н К в этих случаях были очень короткими. В целом же, влияние моновалентных катионов было достаточно монотонным, хотя и характеризо валось определенной специфичностью. На основа нии представленных данных трудно заключить, на какую из Р Н К — субстрата или рибозима, — ока зывали влияние катионы металлов и аммония. Не исключено, что умеренные концентрации КС1 и LiCl активировали рибозим. Показано, что 0,1 М NaCl способствует образованию конформации «го ловки молотка», идентичной той, которая образу ется в присутствии M g 2 + [18] . С другой стороны, имеются косвенные данные о том, что NaCl в концентрациях больше 0,2 М может способствовать образовыванию большего количества конформеров рибозима [19] . Мы полагаем, что выявленная нами избирательность каталитической активности рибо зима по отношению к моновалентным катионам отражает специфичность взаимодействий этих ка тионов с рибозимной Р Н К , что, в свою очередь, выражается в изменении количества активной кон формации «головки молотка». Не исключено, одна ко, что повышение эффективности расщепления tat-PHK рибозимом в присутствии физиологиче ских концентраций таких солей, как КС1 и LiCl, обусловлено у в е л и ч е н и е м полярности молекул РНК-субстрата, т. е. увеличением площади повер хности фосфатных групп, в результате чего рас щепляемая связь становится более доступной для атаки. Известно, что образование двойных спира лей в составе Д Н К или Р Н К может приводить к значительному увеличению площади поверхности фосфатных групп [20] . Ингибирующее влияние высоких концентра ций (больше 0,8 М) солей обусловлено конформа ционными изменениями субстратной Р Н К , затруд няющими доступность сайта расщепления. Л. М. Бур'яновський Вплив рН, іонної сили та іонного складу реакційного середови ща на ефективність розщеплення in vitro tat-PHK ВІЛ-1 рибози мом моделі «головка молотка» Резюме Рибозами типу «головка молотка», як і інші типи рибозимів, є металоензимами і їх активність залежить від присутності іонів двовалентних металів. Однак, якщо вплив іонів двова лентних металів на розщеплення субстрату рибозимом до сліджено добре, то дія моновалентних катіонів досі не вивча лась систематично. В наведені^ роботі проаналізовано вплив моновалентних катіонів (Н , К , Li , NH4 ) та іонів буферно го середовища на ефективність розщеплення in vitro tat-PHK рибозимом типу «головка молотка». рН-залежність ефектив ності реакції мала дзвоноподібну форму з оптимумом при рН 7,0. Іони К і Li в концентрації 0,1 М стимулювали, а в концентраціях вище 0,2 М — зменшували ефективність роз щеплення. При концентрації солей близько 0,8 М реакція пригнічувалася практично повністю. Іони NH4 виявляли інгі буючу дію при всіх концентраціях, що вивчалися. Ці дані, на погляд автора, можуть свідчити про специфічність взаємодії моновалентних катіонів з рибозимною РНК, що може сприя ти або, навпаки, перешкоджати утворенню активної конфор мації «головки молотка». L N. Buryanovsky Effect of рН, ionic strength, and ionic composition on efficiency of hammerhead ribozyme-mediated cleavage of the tat-RNA HIV-I in vitro Summary The hammerhead ribozymes like other types of ribozymes are metalloenzymes, and their activity strongly depend on divalent metal ion presence. While influence of divalent metal ions on the cleavage of substrate by the hammerhead ribozymes was well characterised, effect of monovalent kations was not analyse sys tematically. In the present work influence of monovalent cations (H+, K*, Li , NH4 +) and buffer ions on efficiency of the tat-RNA cleavage in vitro by hammerhead ribozyme was characterized. pH-dependence was shown to be bell-shaped with an optimum at pH 7.0. Both K+ and LC ions at concentration 0.1 M increased, and at concentrations higher 0.2 M decreased efficiency of cleavage. At concentration 0.8 M reaction seemed to be completely blocked. NH4 ions had inhibitory effect at all concentrations tested. The data presented here suggest specificity of interactions of monovalent cations with ribozyme RNA, that might promote, or vice versa, prevent forming active hammerhead conformation. 34 ВЛИЯНИЕ рН, ИОННОЙ СИЛЫ И ИОННОГО СОСТАВА СРЕДЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Sheldon С. С , Jeffries А. С , Davies С , Symons R. Н. RNA self-cleavage by the hammerhead structure / Nucl. Acids and Мої. B io l .—1990 .—4.—P. 227—242 . 2. Fedor M. J., Uhlenbeck О. C. Substrate sequence effects on «hammerhead» RNA catalytic efficiency / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1990 .—87, N 5.—P. 1668—1672. 3. Fedor M. J., Uhlenbeck О. C. Kinetics of intermolecular cleavage by hammerhead ribozymes / / Biochemistry.— 1992 .—31, N 48 .—P. 12042—12054. 4. Hertel K. J., Uhlenbeck О. C. The internal equilibrium of the hammerhead ribozyme reaction / / Ibid.—1995.—34, N 5 .— P. 1744—1749. 5. Heidenreich O., Eckstein F. Hammerhead ribozyme-mediated cleavage of the long terminal repeat RNA of human im munodeficiency virus type I / / J. Biol. Chem.—1992.—267, N 3 .—P. 1904—1909. 6. Ellis J., Rogers J. Design and specificity of hammerhead ribozymes against calretinin mRNA / / Nucl. Acids Res.— 1993 .—21, N 22 .—P. 5 1 7 1 — 5 1 7 8 . 7. Бурьяновский Л. Швед А. Д Специфическая дест рукция ta/-PHK ВИЧ-І in vitro с помощью каталитически активного полирибонуклеотида (рибозима) / / Биополи меры и клетка.—1996.—12, № 2 .—С. 20—23 . 8. Бурьяновский Л. И., Швед А. Д. Характеристика катали тической активности рибозима, специфичного к tatPHK вируса иммунодефицита человека типа I / / Там же .— № 6.—С. 6 9 — 7 3 . 9. Uhlenbeck О. С. A small catalytic oligoribonucleotide / / Nature.—1987.—328, N 6131 .—P. 596—600 . 10. Dahm S. C , Derrick W. В., Uhlenbeck О. C. Evidence for the role of solvated metal hydroxide in the hammerhead cleavage mechanism / / Biochemistry.—1993.—32, N 4 8 . — P . 13040— 13045. 11. Breslow R., Xu R. Recognition and catalysis in nucleic acid chemistry / / Proc. Nat. Acad. Sci. U S A . — 1 9 9 3 . — 9 0 , N 4 .— P. 1201 — 1207. 12. Breslow R., Labelle M. Sequential general base-acid catalysis in the hydrolysis of RNA by imidasole / / J. Amer. Chem. S o c — 1 9 8 6 . — 1 0 8 , N 10 .—P. 2 6 5 5 — 2 6 5 9 . 13. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеи новых кислот.— M.: Мир, 1987 .—С. 124—129. 14. Pley Н. W., Flaherty К. М., McKay D. В. Three-dimensional structure of a hammerhead ribozyme / / Nature .—1994.—372, N 6501 .—P. 68—74 . 15. Hertel K. J., Pardi A., Uhlenbeck О. C. et ai Numbering system for the hammerhead / / Nucl. Acids Res .—1992 .—20 , N 12.—P. 3252. 16. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия.—М.: Мир, 1985.—Т. 1.—С. 309. 17. Draper D. Е., Xing Y., Laing L. G. Thermodynamics of RNA unfolding: Stabilization of a ribosomal RNA tertiary structure by thiostrepton and ammonium ion / / J. Мої. Biol .—1995.— 249, N 2 .—P. 231—238 . 18. Heus H. A., Uhlenbeck О. C , Pardi A. Sequence-dependent structural variations of hammerhead RNA enzymes / / Nucl. Acids Res .—1990 .—18, N 5 .—P. 1103—1108 . 19. Woisard A., Fourrey J.-L., Favre A. Multiple folded conforma tions of a hammerhead ribozyme domain under cleavage conditions / / J. Мої. B io l .—1994 .—239 , N 3 .—P. 366—370 . 20. Alden C. J., Kim S.-H. Solvent-accessible surfaces of nucleic acids / / Ib id .—1979 .—132.—P. 4 1 1 — 4 3 4 . УДК 577 .214 .3 -577 .113 .4 Поступила в редакцию 14.11.96. 35

Влияние рН, ионной силы и ионного состава реакционной среды на эффективность расщепления in vitro tat-PHK ВИЧ-1 рибозимом модели «головка молотка»

Institution

Ähnliche Einträge