Применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц

Ретровирусные векторы успешно используются для переноса клонированных генов в птичьи геномы путем инфицирования их эмбрионов. Эффективность такого переноса составляет 0,01–0,2 % для эмбрионов и 1–8 % для взрослых животных. Рассматриваются способы увеличения эффективности экспрессии трансгена за счет...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1997
Hauptverfasser:	Кайда, И.В., Рындич, А.В.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1997
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Schlagworte:	Обзоры
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154661
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц / И.В. Кайда, А.В. Рындич // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 1. — С. 5-13. — Бібліогр.: 60 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-154661
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1546612019-06-16T01:31:15Z Применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц Кайда, И.В. Рындич, А.В. Обзоры Ретровирусные векторы успешно используются для переноса клонированных генов в птичьи геномы путем инфицирования их эмбрионов. Эффективность такого переноса составляет 0,01–0,2 % для эмбрионов и 1–8 % для взрослых животных. Рассматриваются способы увеличения эффективности экспрессии трансгена за счет усиления тканеспецифической транскрипции и включения тканеспецифических промоторов в состав ретровирусного вектора, а также транспортировки гена в специфические клетки-мишени посредством псевдотипированного вектора или вектора с модифицированной оболочкой. Ретровірусні вектори успішно використовують для перенесення клонованих генів у пташиний геном шляхом інфікування ембріонів. Ефективність такого перенесення становить 0,01–0,2 % для ембріонів і 2–8 % для дорослих тварин. Розглядаються способи підвишення ефективності експресії трансгена за раху нок підсилення тканиноспецифічної транскрипції та включення тканиноспецифічних промоторів до складу ретровірусного вектора, а також транспортування гена у специфічні клітини-мішені за допомогою псевдотипованого вектора Retroviral vectors are used for the transfer of new genes into the birds genome by infecting their embryos. However, the efficiency of such transfer is relatively not very high (0.01–0.2 % for embryos). The efficiency can be increased by including the tissue specific promoters into retroviral vectors. The matching GC-content of the vector and transporting gene should be taken into consideration as such matching might influence the transcription of integrated transporting gene. Another way of increasing the efficiency is connected with gene transportation into the specific target cells with pseudotiping vectors with modified envelope corresponding only to the certain type of cell receptors. 1997 Article Применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц / И.В. Кайда, А.В. Рындич // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 1. — С. 5-13. — Бібліогр.: 60 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00045F http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154661 517. 15:516.858 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Обзоры Обзоры
spellingShingle	Обзоры Обзоры Кайда, И.В. Рындич, А.В. Применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц Биополимеры и клетка
description	Ретровирусные векторы успешно используются для переноса клонированных генов в птичьи геномы путем инфицирования их эмбрионов. Эффективность такого переноса составляет 0,01–0,2 % для эмбрионов и 1–8 % для взрослых животных. Рассматриваются способы увеличения эффективности экспрессии трансгена за счет усиления тканеспецифической транскрипции и включения тканеспецифических промоторов в состав ретровирусного вектора, а также транспортировки гена в специфические клетки-мишени посредством псевдотипированного вектора или вектора с модифицированной оболочкой.
format	Article
author	Кайда, И.В. Рындич, А.В.
author_facet	Кайда, И.В. Рындич, А.В.
author_sort	Кайда, И.В.
title	Применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц
title_short	Применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц
title_full	Применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц
title_fullStr	Применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц
title_full_unstemmed	Применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц
title_sort	применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1997
topic_facet	Обзоры
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154661
citation_txt	Применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц / И.В. Кайда, А.В. Рындич // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 1. — С. 5-13. — Бібліогр.: 60 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT kajdaiv primenenieretrovirusnyhvektorovdlâcelenapravlennogoperenosagenovuptic AT ryndičav primenenieretrovirusnyhvektorovdlâcelenapravlennogoperenosagenovuptic
first_indexed	2025-07-14T06:41:46Z
last_indexed	2025-07-14T06:41:46Z
_version_	1837603547224473600
fulltext	I S S N 0233-7657 . Б и о п о л и м е р ы и клетка . 1997. Т . 13 . № 1 ОБЗОРЫ Применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц И. В. Кайда, А. В. Рындич Институт молекулярной биологии и генетики Н А Н Украины 252143 , Киев, ул. Академика Заболотного, 150 Ретровирусные векторы успешно используются для переноса клонированных генов в птичьи геномы путем инфицирования их эмбрионов. Эффективность такого переноса составляет 0,01—0,2 % для эмбрионов и 1—8 % для взрослых животных. Рассматриваются способы увеличения эффективности экспрессии трансгена за счет усиления тканеспецифической транс крипции и включения тканеспеиифических промоторов в состав ретровирусного вектора, а также транспортировки гена в специфические клетки-мишени посредством псевдотипированного векто ра или вектора с модифицированной оболочкой. Ретровирусы представляют собой РНК-вирусы, имеющие в цикле репликации стадию ДНК, интег рированной в хозяйскую хромосому как провирус. Геном большинства репликативно-компетентных ретровирусов содержит три кодирующих района, выполняющих транс-функцию [1]: gag—опреде ляет внутреннюю структуру вируса, процессирую- щиеся белки сердцевины вириона; рої — кодирует обратную транскриптазу, обеспечивающую синтез вирусной ДНК; env—кодирует гликопротеины оболочки вириона, ответственные за проникнове ние в клетку и отделение от нее (рис. 1, а). Жизненный цикл ретровируса начинается, ког да при инфекции вирус адсорбируется на мембране клетки, взаимодействует с поверхностными рецеп торами клетки, узнающими гликопротеины оболоч ки вириона, затем происходит обратная транскрип ция вирусной РНК с образованием ДНК, которая в дальнейшем специфически интегрируется в хозяй ский геном и включает в себя следующие цис-ак- тивные последовательности (рис. 1, а): РВ-эле- мент — праймер-связывающий сайт; R — термина льный повтор в длинных концевых повторах (LTR); ppt — полипуриновый тракт; att — терми нальный сайт прикрепления, участвующий в про цессе интеграции вирусной ДНК в хозяйскую хро мосому. Провирусный промотор, находящийся в пределах 3'-уникального участка (U3) 5'LTR, уп- © И. В КАЙДА, А. В. Р Ы Н Д И Ч . 1997 равляет транскрипцией, и все вирусные транскрип ты инициируются в первом нуклеотиде R-региона. U3 область содержит последовательности энхансера — усилителя транскрипции. Полноразмерный транскрипт может быть упакован в вирусную час тицу или использован для трансляции в белок Gag-Pol ИЛИ после сплайсинга — в £пу-белок. Для вырезания (сплайсинга) части транскрипта, соот ветствующей генам gag и рої, в провирусе имеются две сигнальные последовательности — sa, sd. Ге номная РНК упаковывается вирусными белками при участии цис-активных упаковочных последова тельностей (40, находящихся между уникальным Ш-участком и началом gag [2—9 ]. Процесс упаковки РНК в вирионы пока еще до конца не изучен. Согласно современным представ лениям, в сборке ретровирусной частицы участвует белковый продукт гена gag и две копии РНК вирусного генома. В процессе упаковки происходит созревание предшественника Gag полипротеина в несколько зрелых вирусных белков, из которых формируется высококонденсированная оболочка вириона. РНК геном ретровирусов содержит 4 х - упаковочные последовательности в 5'-нетранслиру- емой области с собственной вторичной структурой [7]. Предполагают, что в результате белково-нук- леинового узнавания происходит взаимодействие Gag-белка с молекулой РНК, имеющей определен ную вторичную структуру в Ч'-упаковочной обла сти, после чего такая РНК упаковывается в вирион 5 КАЙДА И В. . Р Ы Н Д И Ч А. В. allR attl. ppt Рис . 1. Строение SNV (вирус некроза селезенки) и ретровирус- ных векторов, созданных на его основе: а — строение ретрови русов на примере SNV [ 5 ] ; б — сплайсирующийся вектор pjD216 NeoHy [ 5 ] ; в — вектор с внутренним промотором рМЕ 111 [16 ] ; г — бицистронный вектор с IRES-последовательностя ми pjD214HyBi [5]; gag, рої, env— гены, кодирующие вирус ные белки; LTR — д л и н н ы е концевые повторы; U3 — уникаль ный участок LTR; R — терминальный повтор; attR-attL — тер минальный сайт прикрепления (правый и л е в ы й ) ; pbs — прай- мер-связывающий сайт; sd — донорный и sa — акцепторный сайты сплайсинга; ppt — полипуриновый тракт; — сигналы упаковки; У — ген неомицинфосфотрансферазы; 2 — ген гигро- м и ц и н ф о с ф о т р а н с ф е р а з ы ; 3 — т и м и д и н к и н а з н ы й ген H S V ; Promoter — внутренний промотор; IRES — внутренний рибосом- ный повторяющийся сайт [2, 10]. Делегирование ^-упаковочных последова тельностей и точечные мутации в gag-гене наруша ют процесс узнавания Ga^-белком специфической вирусной РНК. В этом случае происходит сборка вириона нормальной структуры, в который упако вывается клеточная РНК или РНК другого вируса, имеющего сигналы упаковки и находящегося в клетке наряду с дефектным по упаковочным после довательностям вирусом [2, 10]. Делетирование кодирующих участков вирус ных геномов, часто происходящее в вирусной попу ляции в природе, не вредит способности вируса упаковываться, обратнотранскрибироваться и ин тегрировать в хозяйский геном. Поэтому возможно вместо вирусных кодирующих последовательно стей, используя генно-инженерные манипуляции, вставлять гены интересующих нас белков. Такой рекомбинантный вирус способен инфицировать клетки-мишени, интегрироваться и экспрессиро- вать вставленные гены под контролем промотора из 5'-LTR [11 ] (рис 1,6). Однако вследствие отсутст вия тех или иных генов или участков генов, кодирующих собственные белки, такой вирус не способен реплицироваться. Для этого ему нужен вирус-помощник, имеющий кодирующую область и предоставляющий собственные вирусные белки для упаковки РНК рекомбинантного вектора (рис. 2), несущего интересующие нас гены. Рекомбинант ный вирус, в котором вместо кодирующей области вставлены гены нужных нам белков, способный эффективно инфицировать клетки в культуре, в эмбрионе, во взрослом животном, — называют век тором [12]. Клетки, несущие в себе рекомбинант ный провирус вируса-помощника, в который внесе ны делеции, исключающие упаковку собственной РНК вируса-помощника, но не нарушающие синте за вирусных белков, называются упаковочными клетками [12]. В репликативно-дефектном векторе кодирую щая область заменена на «транспортируемую» ДНК, маркерные гены и гены устойчивости к антибиотикам для селекции в культуре клеток. В качестве «транспортируемой» ДНК используют как небольшие фрагменты генома (ген a-актина ске летных мышц курицы [13, 14]), так и кДНК последовательности [15, 16]. Преимуществом по следних является их небольшой размер, способ ность транскрибироваться с промотора в 5-LTR Рис . 2. Этапы продукции ретровирусного вектора в упаковоч ных клетках 6 П Р И М Е Н Е Н И Е Р Е Т Р О В И Р У С Н Ы Х В Е К Т О Р О В Д Л Я П Е Р Е Н О С А ГЕНОВ ретровирусного вектора, тогда как геномным фраг ментам часто необходим внутренний промотор, а также то, что кДНК не сплайсируются. Размеры клонированных в составе ретровирусного вектора последовательностей варьируют от 2 до 10 тыс. п. н. Ретровирусный вектор может иметь один [17] или два вставленных гена [18], транскрибирую щихся с промотора из 5'-LTR и эффективно сплай- сирующихся. Такие векторы называют сплайсиру- ющимися (рис. 1, б) [17—22]. Недостатком ретровирусных векторов такого типа является то, что при экспрессии двух встав ленных генов, направляемой LTR, один из генов нередко экспрессируется нестабильно [23, 24]. Чтобы усилить транскрипцию второго гена, его помещают под собственным внутренним промото ром. В качестве внутреннего промотора чаще всего используют Simian virus 40 (SV40) и тимидинки- назный промотор вируса герпеса (HSV) [16, 25— 28 ]. Вектор этого типа М 111 (рис. 1, в) на базе вируса ретикулоэндотелиоза (REV) показал экс прессию белка неомицинфосфотрансферазы II (пео), кодирующегося геном, внесенным в клетки куриного эмбриона указанным вектором, в 16 раз превышающую экспрессию этого белка в контроль ных, не имеющих вектора, эмбрионах [25 ]. Однако уровень экспрессии гена, находящегося под внут ренним промотором, в некоторых случаях бывает значительно ниже, чем таковой 5'-контролируемой экспрессии [25—27]. Подобная супрессия имеет эпигенетический характер и не до конца изучен ный механизм. При селекции гена, имеющего 5'- контролируемую транскрипцию, наблюдают суп рессию гена, находящегося под контролем внутрен него промотора, и наоборот, при селекции гена, транскрибирующегося с внутреннего промотора, снижается уровень экспрессии гена, находящегося под контролем промотора из 5'-LTR. Таким обра зом, совместная стабильная экспрессия обоих генов сплайсирующегося вектора даже при наличии вну треннего промотора весьма проблематична [5 ]. Новый подход к экспрессии нескольких генов в составе ретровирусного вектора позаимствован у пикорнавирусов (цит. по [5 ]). Пикорнавирусы экс- прессируют отдельные белки с полицистронной мРНК. 5-конец этой РНК заканчивается pUpU вместо типично эукариотического m7HGpppN-K3- па, транскрипт содержит длинный 5'-нетранслиру- емый район (UTRs) и повторяющиеся AUG-кодо- ны. UTRs представляют собой цыс-активные после довательности , содействующие кэп-независимой трансляции, инициирующейся с внутреннего ини циирующегося кодона. Они названы внутренними рибосомными повторяющимися сайтами — IRESs. Последние клонированы из пикорнавирусов и ис пользуются в ретровирусных векторах для трансля ции LTR-контролируемой полицистронной РНК. Активность созданного на базе вируса саркомы Рауса (RSV) вектора с IRES-последовательностями LTR-/acZ-EMSV-IRES-v-src-LTR проверяли, инфи цируя куриные эмбрионы. Уже через 3—6 дней регистрировали экспрессию бактериального гена /3- галактозидазы (lacZ). Таким образом была получе на быстрая продукция белков in vivo посредством вектора с IRES-последовательностями [29]. Бици- стронный ретровирусный вектор создан также на базе вируса птичьего эритробластоза (AEV) [23]. Уровень экспрессии v-erbA, v-myby клонированных в составе IRES-вектора in vivo (в цыплятах), был более высоким, чем таковой экспрессии этих онко генов, клонированных в составе сплайсирующегося вектора. Дицистронный вектор на базе вируса некроза селезенки (SNV) pJD214 НуВі (рис. 1, г) имеет два селективных маркерных гена пео и hygro (ген гигромицинфосфотрансферазы) между последова тельностями SNV LTR, оба гена показывают оди наковый уровень экспрессии в клетке, что невоз можно получить для сплайсирующегося вектора и вектора с внутренним промотором (цит. по [5 ]). На мышиных моделях показана возможность инсерционного мутагенеза в хозяйском геноме в результате интеграции провируса. Это чревато во зобновлением трансформирующей активности у векторного вируса и распространением его в тканях животного. На примере формирования новых штаммов птичьих ретровирусов было показано, что при пассировании вируса в культуре клеток возоб новление трансформирующей активности вируса трансдукцией клеточного онкогена может произой ти даже в том случае, когда вирус не содержит последовательностей вирусных онкогенов [30, 31 ]. Чтобы предотвратить этот процесс, в З'-LTR век торной ДНК инактивируют промоторно-энхансер- ную область посредством делетирования или на правленного мутагенеза. В процессе обратной транскрипции в упаковочных клетках 113-область 5'-LTR восстанавливается за счет дефектного U3 З'-LTR. Полученный таким образом вектор имеет видоизмененные LTR, которые уже не могут вызы вать инсерционный мутагенез. Вставленные гены экспрессируются только с внутреннего промотора, а транскрипты не могут паковаться вообще. Такие векторы созданы на базе вируса птичьего лейкоза (ALV) и SNV [32—34]. Создание векторов сложной конструкции, име ющих в своем составе несколько внутренних про моторов, может приводить к нестабильной транс- 7 КАЙДА И В. , Р Ы Н Д И Ч А. В. крипции этого вектора в культуре клеток. Это может быть связано с тем, что ретровирусы птиц принадлежат к GC-богатому классу вирусов [35], и эффективная транскрипция, а также стабиль ность интеграции провируса зависят от встраива ния их в GC-богатые участки клеточного генома [36, 37 ]. Кроме того, ретровирусный геном гомоге нен по GC-составу, поэтому для эффективной транскрипции создаваемой векторной конструкции необходимо, чтобы GC-состав вектора отвечал та ковому вставленного гена. Приоритетным направлением решения пробле мы высокоспецифического переноса генов является создание векторов, имеющих высокую специфич ность узнавания рецепторов, характерных для дан ных клеток-мишеней. Этого можно достичь, присо единяя к вирусному Яму-белку особый лиганд, повышающий сродство к данному типу рецепторов [38—41 ]). Авторы [41 ] описали биологические сво йства ALV подгруппы А мутантного протеина обо лочки, в который вставили небольшой пептид FLA 16, являющийся лигандом для клеточных рецепто ров интегринового семейства. Как было показано, Рис . 3 . Структура провирусов вирусов-помощников, использо ванных для создания птичьих упаковочных клеточных линий (пояснения в тексте, табл. 1): а — Q4dh ; б —Iso lde ; в — DSN. gag, рої, env — гены, кодирующие вирусные белки; LTR — длинные концевые повторы; 7 — последовательности AEV; 2 — последовательности CMV (цитомегаловируса) ; 3 — последова тельности RSV; 4 — сигналы полиаделирования SV40; 5 — по следовательности SNV; 6 — последовательности R A V - 1 ; 7 — ген гигромицинфосфотрансферазы; 8 — ген ф л е о м и ц и н ф о с ф о т р а н - сферазы вирусные частицы, имеющие видоизмененные обо лочки с FLA 16, специфически используют интег- риновые рецепторы для инициации инфекции кле ток млекопитающих. Последовательности, опреде ляющие хозяйскую специфичность ALV, находятся в центральной части env — вариабельные участки hrl-hr2. Для создания плазмид с химерным env участки hrl-hr2 частично заменили на фрагмент, кодирующий FLA 16-лиганд. Гораздо труднее ока залось доказать прохождение инфекции через ин- тегриновые рецепторы, поскольку эффективность инфекции через такие рецепторы вирусом с химер ной оболочкой очень мала: на три — четыре поряд ка ниже относительно рецепторов подгруппы А. Изменить хозяйскую специфичность вектора можно также посредством сборки псевдотипичного вируса, РНК геном которого «одет» в оболочку другого вируса с помощью упаковочных клеток (см. рис. 2). Для этого используют упаковочные клеточные линии с различной подгрупповой специ фичностью. В работе [42] получены векторы на основе ALV, имеющие env-ген А, В, С, Е-подгруп- повой специфичности. Для этого в упаковочных плазмидах env-ген был заменен на env-ген соответ ствующих подгрупп ALV: А — из Раус-ассоцииро- ванного вируса, тип 1 (RAV-1) (рис. З, б), В — из Раус-ассоциированного вируса, тип 2 (RAV-2), С — из Пражского штамма RSV (PR-RSV-C), Е — из Раус-ассоцированного вируса, тип О (RAV-0). В ходе интерференционного теста подгрупповой век торный вирус демонстрировал устойчивость к су перинфекции вирусом той же подгруппы и инфи цировал клетки соответствующего типа. Была показана также тканеспецифическая экс прессия векторов подгрупп А и В в курином эмбри оне: А-подгруппа инфицировала покровные ткани и сердечную мышцу, В-подгруппа инфицировала только сердечную ткань. Инфекционность этих векторов проверяли на различных птичьих клет ках — перепелиных, куриных, утиных. Упаковоч ные клетки А-, В-, Е-подгрупповой специфичности показали титр 10 4—10 5 lacZ колониеобразующих единиц в 1 мл культуральной среды (CFU/ml), а упаковочные клетки С-подгрупповой специфично сти — в 50—100 раз меньший титр [42 ]. Ранние упаковочные клеточные линии пред ставляли собой провирус вируса-помощника, в ко тором делетировали упаковочный сигнал. Однако рекомбинации между гомологичными последова тельностями вектора и упаковочного генома как в процессе обратной транскрипции, так и при совме стной упаковке последовательностей вектора и упаковочного мутанта в вирион [12] приводят к восстановлению репликативной компетентности 8 П Р И М Е Н Е Н И Е Р Е Т Р О В И Р У С Н Ы Х В Е К Т О Р О В Д Л Я П Е Р Е Н О С А ГЕНОВ Таблица 1 Ретровирусные упаковочные клеточные линии птиц Гигромицинфосфотрансфераза ; *неомицинфосфотрансфераза; флеомицинфосфотрансфераза . вируса-помощника. Так, упаковочная линия Q4dh была создана на базе RAV-1, экспрессирующегося в перепелиных клетках QT6, продуцировала век тор в количестве 2-Ю 5 CFU/ml [44], а также репликативно-компетентный вирус в количестве 1—3 вириона в 1 мл [45]. Наличие репликативно- компетентного вируса в векторном пуле увеличи вает вероятность рекомбинаций и возможность не контролируемого распространения вируса. Поэтому при создании клеточных линий Isolde (рис 3, б), Haydee, Senta [42, 46—48] в геноме RAV-1 произвели следующие изменения: ^-упако вочный сигнал делетировали, З'-LTR заменили на сигналы полиаделирования; gag-pol- и env-гены экспрессируются в различных плазмидах. Таким образом, для восстановления репликативной ком петентности вируса-помощника необходим не один раунд рекомбинации с последовательностями ре тровирусного вектора, как в случае Q4dh упако вочной клеточной линии, а три раунда рекомбина ции, что маловероятно. Haydee — клеточная ли ния, экспрессирующая gag-pol-rtnu в отсутствие репликативно-компетентного вируса (продуктив ность 103 CFU/ml). Упаковочная линия, продуци рующая gag-pol-гспы и env-ген А-подгрупповой специфичности, названа Isolde и продуцирует век торный вирус в количестве 106 CFU/ml. Senta экспрессирует гены gag-pol и env Е-подгруппы, продуктивность 104 CFU/ml (табл. 1). Каждая упаковочная линия продуцирует дан ный Env-белок определенной специфичности и яв ляется устойчивой к инфекции вирусом, «одетым» в эту оболочку [47 ]. Повторные раунды инфекции и амплификация продуцируемого ретровирусного вектора затруднены из-за блокирования клеточных рецепторов, перегруженных £лу-белком. Повтор ные раунды инфекции возможны через другие клеточные рецепторы, доступные для псевдоча стиц, «одетых» в оболочку другой подгруппы. На мышиных моделях показано, что совместное куль тивирование упаковочных линий, продуцирующих Env-белок различной специфичности, повышает титр продуцируемого вектора в 10—100 раз [43], однако наряду с этим наблюдается появление ре пликативно-компетентного вируса. Совместное культивирование упаковочных клеточных линий с различной хозяйской специ фичностью Isolde (A), Senta (Е) позволило повы сить титр продуцируемого вектора в 10 раз в присутствии репликативно-компетентного вируса, появление которого является результатом рекомби нации между кодирующими последовательностями вируса-помощника, экспрессирующегося в упако вочных клетках, и цис-активными последователь ностями ретровирусного вектора [47 ]. Чтобы уменьшить вероятность рекомбинаций между последовательностями вектора и вируса-по мощника, в СЗ-упаковочной клеточной линии, со зданной на базе SNV, помимо делетирования Ч7- упаковочных последовательностей, gag-pol-гены и env-ген экспрессируют в различных плазмидах [49]. Титр продуцируемого клетками вектора со ставил около 105 инфекционных частиц в 1 мл, репликативно-компетентный вирус детектировался при длительном пассировании в культуре. DSN-упаковочная линия [50] создавалась с учетом недостатков, выявленных в линии СЗ. Клетки DSN (рис. 3, в) содержат gag-pol-гены SNV, экспрессирующиеся с 5'-LTR цитомегаловируса, З'- LTR заменен на сигналы полиаделирования SV40; env-ген SNV экспрессируется в другой конструк ции, содержащей 5'-LTR RSV и сигналы полиаде лирования SV40 вместо З'-LTR. Использование по следовательностей различных вирусов для создания конструкции вируса-помощника позволило решить проблему гомологической рекомбинации с последо вательностями вектора — вирус-помощник не де тектировался, продуктивность линии 7-Ю 5 инфек ционных частиц в 1 мл. До сих пор речь шла о том, что для размноже ния репликативно-дефектного вектора необходимы особым образом созданные и отобранные упаковоч ные клетки. Существует альтернативный подход, заключающийся в котрансфекции клеток двумя плазмидами: первая представляет собой геном ре пликативно-дефектного вектора, а вторая несет геном вируса-помощника и экспрессирует вирус ные gag-, рої-, env-последовательности. Это приво дит к стабильной интеграции в хромосому и долго временной экспрессии генов репликативно-дефект- 9 КАЙДА И. В. , Р Ы Н Д И Ч А. В. ного вектора [20 ]. Указанный подход использовали для получения векторов на базе RSV [20, 21, 511, ALV [20 ]. В обоих случаях зарегистрирован доста точно высокий уровень продукции вектора (около 104 CFU/ml). Для ALV-экспрессирующих клеток показано отсутствие репликативно-компетентного вируса [20]. Существующий уровень развития биотехноло гии позволяет решить проблемы, связанные с со зданием ретровирусного вектора, прогнозировани ем его транскрипции и экспрессии клонированных в его составе генов in vitro — в культуре клеток. Это помогло исследовать механизмы упаковки ви русной РНК в вирионы [1, 10, 45], процессы восстановления трансформирующей активности у трансформационно-дефектных ретровирусов [52 ], мобилизации клеточных протоонкогенов, а также генетической дивергенции в ходе вирусной репли кации и многие другие проблемы, связанные с ретровирусной репликацией [5]. Сейчас на повестке дня стоят вопросы, связан ные с эффективной экспрессией ретровирусных систем in vivo. Проблема состоит в том, что высо кий уровень экспрессии генов ретровирусного век тора в культуре клеток, регистрируемый в течение длительного времени (от нескольких месяцев до года и более), еще не является гарантией эффек тивной экспрессии их в тканях эмбриона и взрос лого животного [5 ]. Это связанно с наличием иных по сравнению с культурой клеток механизмов ре гуляции ретровирусной экспрессии in vivo [53 ]. Для большинства мышиных лейкозных вирусов Молони показано, что экспрессия вирусных транс генов блокируется торможением LTR-направлен- ной транскрипции в мышином зародыше, инфици рованном вектором на ранних стадиях эмбриогене за [53]. Объясняют это наличием специфических эмбриональных факторов, ингибирующих 5'-зави- симую транскрипцию, а также отсутствием специ фических активных факторов, стимулирующих транскрипцию на определенных стадиях эмбриоге неза [53 ]. Косвенным подтверждением этого явля ются данные, полученные для векторов, созданных на базе RSV, RAV-1, RAV-2: экспрессия lacZ мар керного гена обусловлена стадией развития кури ного эмбриона [17, 21, 24, 25, 53, 54]. Для SNV- репликативно-дефектного вектора показано [54], что экспрессия ZacZ-гена зависит от того, на какой стадии развития куриного эмбриона проводили ин фекцию векторным вирусом: в инфицированном в первый день после оплодотворения (Е0-Е1) наблю дали окрашенные фокусы в производных эктодер мы — покровных тканях и нервной ткани; инфи цированные на стадии Е2 показывали /acZ-экс- Таблица 2 Эффективность экспрессии птичьих ретровирусных векторных систем П р и м е ч а н и е . Уровень экспрессии - (количество ф о к у с о в / и н ф е к ц и о н н а я доза вируса) 100 % . прессию преимущественно в сердечной мышце и покровных тканях; окрашенные фокусы регистри ровали в эмбриональных тканях сердца, печени, желудка и покровных тканях, не наблюдали lacZ- экспрессии в эмбрионах, инфицированных после Е11 [54]. Тканеспецифическая экспрессия ретро вирусных векторов позволяет использовать их как маркеры в исследовании эмбриогенеза ([17], под робно см. обзор [55 ]). Существуют данные, свидетельствующие в пользу предположения о том, что тканеспецифич- ность экспрессии гена, клонированного в составе ретровирусного вектора, зависит от природы LTR [24]: векторы, содержащие LTR RAV-2 экспресси- руются более всего в клетках нервной трубки [53 ], RAV-1—в клетках эмбрионального сердца [53], RSV — в клетках нервной ткани [21 ] и эндотелии [22]. Тканеспецифическая экспрессия ретровирус ных векторов позволяет использовать их как мар керы в исследовании эмбриогенеза (подробно см. обзор [55]). Из описанных в табл. 2 ретровирусных систем стабильная экспрессия в культуре клеток, тканях эмбриона и тканях взрослых животных описана для векторов МЕНІ , SW272. Так, репликативно- дефектный вектор МЕНІ переносит функциональ ный LTR-зависимый ген неомицинфосфотрансфе- разы II в клетки куриного эмбриона. Этот ген 10 детектируется в тканях потомков первого и второго поколений [25]. Аналогичный уровень экспрессии и наследуемости гена куриного гормона роста, клонированного в составе SW272, описан в работах [15, 16 \|. Однако повышение эффективности экспрессии in vivo генов, внесенных ретровирусным вектором, остается задачей первостепенной важности, по скольку известные ретровирусные системы показы вают эффективность экспрессии до 10 % в культу ре клеток, 0,06—0,2 % в курином эмбрионе и 2—8 % во взрослом животном. В то время как аденовирусные векторные системы в состоянии да вать 30—60 % экспрессии in vivo [58 ]. Одно из направлений решения этой проблемы — создание ретровирусных векторов с внутренним тканеспеци- фическим промотором, обеспечивающим устойчи вую транскрипцию в определенной ткани эмбриона и взрослого животного [14]. Реп л и к а т и в н о - к о м п е т е н т н ы й вектор RCANBP/ask CAT/F [13,. 14], созданный с этой целью на базе полного провируса RSV, в котором вместо src-гена вставлен ген CAT (хлорамфенико- лацетилтрансферазный) под контролем тканеспе- цифического промотора а-актина скелетных мышц курицы. Вектор показал высокую экспрессию САТ- гена в мышечных тканях цыплят (70 %) по срав нению с 0—8 % экспрессией этого гена в других тканях [14]. Если авторам удастся показать ста бильную экспрессию САТ-гена во взрослых живо тных и наследуемость тканеспецифической экс прессии, то можно будет говорить о том, что тканеспецифические промоторы способны обеспе чить устойчивую экспрессию векторных генов у трансгенных птиц. Репликативно-компетентные системы позволя ют эффективно вводить клонированные гены в куриные эмбрионы: репликативно-компетентный вектор хорошо распространяется в различных тка нях развивающегося эмбриона; встроившись при инфекции в геном животного, передается потомкам 2—3-го поколения трансгенных животных. Для наработки репликативно-компетентного вектора не нужны упаковочные клетки, что значительно уде шевляет эксперимент и сокращает время получе ния трансгенного животного. Главным недостатком репликативно-компетен- тных систем является наличие репликативно-ком петентного вируса в организме животного, что может привести в конечном итоге к развитию опухоли. При длительном пассировании векторного вируса в организме трансгенного животного возни кает опасность возобновления трансформирующей способности у векторного вируса из-за включения П Р И М Е Н Е Н И Е Р Е Т Р О В И Р У С Н Ы Х В Е К Т О Р О В Д Л Я П Е Р Е Н О С А ГЕНОВ последовательностей клеточных протоонкогенов в геном ретровируса [30, 31 ]. Один из подходов к решению этой проблемы — использование эндогенных вирусов птиц в качестве векторов. Эндогенные ретровирусные последова тельности — это последовательности ретровирус ных провирусов, которые спонтанно интегрирова лись в клетки эмбриона в процессе эволюции и экспрессируются под контролем хозяйских факто ров. Куры, имеющие в своем геноме как полный, так и частично делетированный провирус эндоген ного вируса, являются генетически устойчивыми к инфекции лейкозными вирусами. Это явление на звано интерференцией: клетки, несущие в своем геноме интегрированный ретровирус, экспрессиру- ют оболочечный гликопротеин, кодирующийся про- вирусным геном env, и устойчивы к инфекции ретровирусом этой же подгруппы (имеющим такой же белок вирусной оболочки) вследствие ингибиро- вания адсорбции вируса на поверхности рецептора и сложности проникновения его в клетку. Данное явление использовали для получения линии кур, устойчивых к инфекции вирусом ALV А-подгрупповой специфичности [52, 57, 59]. Для этого в клетки куриного зародыша линейных кур, свободных от эндогенных последовательностей (0 линия), вносили ген А-подгрупповой специфично сти, инфицируя эмбрион вирусами RAV-1, RAV-0. Лучшие результаты оказались при использовании RAV-0-вируса в качестве вектора. В первом поко лении получены животные, несущие 1 —10 копий провируса RAV-0 в своем геноме. Второе поколение получили при скрещивании мозаичных кур первого поколения с 0-линией. Яйца животных этого поко ления повторно инфицировали RAV-0-вирусом и получили животных, несущих 10—30 копий прови руса в своем геноме. Поскольку авторы решали задачу выведения линии кур, устойчивой к инфек ции вирусом птичьего лейкоза, то более всего их интересовала экспрессия env-гена у трансгенных животных, которую определяли интерференцион ным тестом. Оказалось, что наивысший уровень продукции Env-белка дают куры линии alv6, несу щие дефектный по gag-гену провирус и не проду цирующие вируса [57, 59]. Показана стабильная устойчивость кур этой линии к инфекции лейкоз ными вирусами. При инфицировании таких кур RSV не образуются опухоли [52, 57, 59]. Для создания животных, устойчивых к инфек ции ALV и образованию опухолей, позднее исполь зовали репликативно-дефектный вектор pNE-A, несущий пео-ген под контролем LTR птичьего эритробластоза и env-ген ALV А-подгрупповой спе цифичности [60]. Цыплята, инфицированные этим 11 КАЙДА И В. , Р Ы Н Д И Ч А. В. вектором, продуцировали антитела к ALV и были устойчивы к образованию опухолей. Такой подход интересен с точки зрения получения животных, стабильно продуцирующих антитела, что необхо димо как для биотехнологии, так и в производстве вакцин. /. В. Кайда, А. В. Риндич Застосування ретровірусних векторів для цілеспрямованого переносу генів у птахів Резюме Ретровірусні вектори успішно використовують для переносу клонованих генів у пташиний геном шляхом інфікування ембріонів. Ефективність такого переносу складає 0 , 0 / — 0,2 % для ембріонів і 2—8 % для дорослих тварин. Розглядаються способи підвищення ефективності експресії трансгена за раху нок підсилення тканиноспецифічної транскрипції та включен ня тканиноспецифічних промоторів до складу ретровірусного вектора, а також транспортування гена у специфічні клі- тини-мішені за допомогою псевдотипованого вектора. I. V. Kaida, А. V. Rynditch Usage of retrovirus vectors for gene transfer into birds Summary Retroviral vectors are used for the transfer of new genes into the birds genome by infecting their embryos. However, the efficiency of such transfer is relatively not very high (0.0J—0.2 % for embryos). The efficiency can be increased by including the tissue specific promoters into retroviral vectors. The matching GC-content of the vector and transporting gene should be taken into consideration as such matching might influence the transcription of integrated transporting gene. Another way of increasing the efficiency is connected with gene transportation into the specific target cells with pseudotiping vectors with modified envelope corresponding only to the certain type of cell receptors. С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы 1. Coffin J. M. Structure of the retroviral genome / / The molecular biology of RNA tumor virus / / E d s R. Weiss et a l .— New York: Cold Spring Harbo r Lab. , 1985 .—P.261-368 . 2. Anderson D. J., Lee P., Levine K. L et al. Molecular cloning and characterization of the RNA packaging defective retrovirus SE 210 1 Q16 / / J. V i ro l .—1992 .—66 .—P. 204—216 . 3. Aronoff R., Linial M. Specificity of retroviral RNA packaging / / I b i d . — 1 9 9 1 . — 6 5 . — P . 7 1 — 8 0 . 4. Aronoff R., Hajjar A. M., Linial M. Avian retroviral RNA encapsidation: reexamination of functional 5 ' RNA sequences and the role of nucleocapsid Cys-His motifs / / I b id .—1993 .— 6 7 . — P . 178—188 . 5. Boris-Lavrie K. A., Temin H. M. Recent advances in retrovirus vector technology / / Curr . Opinion Genet , and Develop.— 1 9 9 3 . — 3 . — P . 1 0 2 — 1 0 9 . 6. Katz R., Terry R., Skalka A. A conserved c/s-acting sequnce in the 5 ' leader of Avian Sarcoma Virus RNA is required for packaging / / J. Vi ro l .—1986 .—59, N 1.—P. 163—167. 7. Knigt J., Zhi Hai Si, Stoltzfus M. A base-pai red structure in the avian sarcoma virus 5 ' leader is required for efficient encapsidation of RNA / / I b i d . — 1 9 9 4 . — 6 8 , N 7 . — P . 4493 . . 8. Pugatsch Т., Stacey D. Identification of sequence likely to be required for avian retroviral packaging / / Vi ro logy .—1983.— 1 2 8 . - P . 5 0 5 - 5 1 1 . 9. Sorge J., Ricci W., Hugnes S. H. C/s-acting RNA packaging locus in the 115-nucleotide direct repeat of RSV virus / / J. Vi ro l .—1983.—48, N 3 .—P. 6 6 7 — 6 7 5 . 10. Sakalian M.f Wills J. W., Vogt V. Efficiency and selectivity of RNA packaging by RSV gag deletion mutant / / Ib id .—1994.— 68, N 9 .—P. 3388—3394 . 11. Прасолов В. С. Ретровирусные векторы — эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в кле тках млекопитающих / / Молекуляр. биология .—1989.— 2 3 . — С . 3 4 8 — 3 5 5 . 12. Miller A. D. Retrovirus packaging cells / / Human Gene T h e r a p y . — 1 9 9 0 . — 1 . — P . 5—14. 13. Petropoulos C. G., Rosenberg M. R., Jenkins N. A. et al. The chicken skeletal muscle a-act in promoter is tissue specific in t r ansgen ic mice / / Мої. a n d Cel l . Biol. — 1 9 8 9 . — 9 . — P . 3785—3792 . 14. Petropoulos C. J., Payne W., Salter D. V., Hughes S. H. Using appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer / / J. Virol.— 1992 .—66 .—P. 3 3 9 1 — 3 3 9 7 . 15. Bosselman R. A., Hsu R.-Y., Boggs T. et al. Germeline transmission exogenous genes in the chicken / / Science.— 1990 .—243 .—P. 5 3 3 — 5 3 5 . 16. Bosselman R. A., Hsu R.-Y., Boggs T. et al. Replication-defec tive vectors of reticuloendoteliosis virus t ransduce exogenous genes into somatic stem cells of the unincubated chicken embryo / / J. V i ro l .—1989 .—63 .—P. 2680—2689 . 17. Reddy S. Т., Stoker A. W., Bissel M. J. Expression of RSV-derived retroviral vectors in the avian blastoderm: poten tial as stable genetic markers / / P roc . Nat. Acad. Sci. U S A . — 1 9 9 1 . — 8 8 . — P . 10505—10509 . 18. Cosset F.-L, Legras C, Thomas J.-L. et al. Improvement of Avian Leukosis Virus (ALV) — based retrovirus vectors by using different c/s-acting sequences from ALVs III. Virol.— 1994 .—65 .—P. 3 3 8 8 — 3 3 9 4 . 19. Benchaibi M., Mallet F., Thoraval P. et al. Avian retroviral vectors derived from avian defective leukemia virus: role of the translational context of the inserted gene on efficiency of the vectors / / V i ro logy .—1989 .—169 .—P. 15—26. 20. Flamant F., Samarut J. Virofection: A one-s tep procedure for using replication-defective retrovirus vectors / / Ib id .—1995 .— 2 1 1 . — P . 234—240 . 2 1 . Galileo D. S., Gray G. E., Owens G. C. et al. Neurons and glia arise from a common progenitor in chicken optic tectrum demonstration with two retroviruses and cell type-specific antibodies / / Proc . Nat. Acad. Sci. USA.—1990 .—87 .— P. 458—462 . 22. Storker A., Hatier C, Bissel M. J. T h e embryonic environment strongly at tenuates v-src oncogenesis in mesenchymal and epithelial tissues, but not in endothel ia III. Cell. Biol.— 1990 .—111 .—P . 217—228 23 . Casini Т., Graf Т. Bicistronic retroviral vector reveals capacity of v-erbA to induce erythroleukemia and to co-operate with v-myb II O n c o g e n e . — 1 9 9 5 . — 1 1 . — P . 1019—1026. 24. Molina R. M., Chebloune Y., Verdier G., Legras C. Influence of expression and c/s-acting sequences from avian leukosis viruses (ALVs) on stability of (ALV)-based retrovirus vectors / / Life Sc i .—1995 .—318 .—P. 5 4 1 — 5 5 1 . 25 . Briskin M. J., Hsu R.-Y, Boggs T. et al. Heri table retroviral transgenes a re highly expressed in chikens / / Proc . Nat. Acad. Sci. U S A . — 1 9 9 1 . — 8 8 . — P . 1736—1740 . 26. Emerman M., Temin H. M. Genes with promoters in retrovirus vectors can be i ndependen t l y supp re s sed by epigenetic mechanism / / C e l l . — 1 9 8 4 . — 3 9 . — P . 4 5 9 — 4 6 7 . 12 П Р И М Е Н Е Н И Е Р Е Т Р О В И Р У С Н Ы Х В Е К Т О Р О В Д Л Я П Е Р Е Н О С А ГЕНОВ 27. Emerman М., Тетіп Н. Quantitative analysis of gene suppres sion in integrated retrovirus vectors / / Мої. and Cell. Biol.— 1986 .—6.—P. 7 9 2 — 8 0 0 . 28. Southern P. J., Berg P. Transformation of mammalian cells to antibiotic resistence with a bacterial gene under control of the SV 40 early region promoter / / J . Мої. and Appl. G e n e t — 1982.—982, N 1.—P. 3 2 7 — 3 4 1 . 29. Gnats I. R., Sanes J. R., Majors J. E. T h e encephalocardiatis virus internal ribosome entry site allows efficient coexpression of two genes from a recombinant provirus in cultural cell and in embryo / / Мої. and Cell. B io l .—1991 .—11 .—P. 5 8 4 8 — 5859. 30. Dezelee P., Barnier J., Geryk J. et al. New case of c-src gene transduction; the generation of virus PR 2257 / / Folia Biol. — 1 9 9 4 . — 4 0 . — P . 2 1 1 — 2 2 3 . 3 1 . Felder M.-P., Euchene A., Laygier D. et al. Steps and mechanisms of oncogene transduction by retroviruses / / Ibid.— P . 2 2 5 — 2 3 5 . 32. Dougerty J., Temin # . A promoterless retroviral vector indi cates that there are sequenses in U3 required for 3 ' RNA processing / / Proc . Nat. Acad. Sci. USA.—1987 .—84.— P. 1197—1201 . 33 . Flamand F., Aubert D., Legrand C. et al. Importance of 3 ' non-coding sequences for efficient retrovirus-mediated gene transfer in avian cells revealed by self-inactivating vectors / / J . Gen. Vi ro l .—1993 .—74.—P. 3 9 — 4 6 . 34. Soriano P., Friedrich G., Lawinger P. Promoter interactions in retrovirus vectors introduced into fibroblasts and embryonic stem cells / / J. V i ro l .—1991 .—65.—P. 2314—2319 . 35. Zoubak S., Rynditch A., Bernardi G. Compositional bimodality and evolution of retroviral genomes / / G e n e . — 1 9 9 2 . — 1 1 9 . — P . 207—213 36. Rynditch. A., Kadi F., Geryk J. et al. T h e isopicnic, com partmentalised integration of RSV sequences / / I b i d . — 1 9 9 1 . — 1 0 6 — P . 165—172. 37. Rynditch A.t Zoubak S., Bernardi G. Targeted integration of viral sequences into human genome / / Int. Symp. on Human Gene The rapy .—Inuyama—Nagoya , 1995. 38. Kashara N., Dozy A. M., Kan Y. W. Tissue-specific targeting of retroviral vectors through l igand-receptor interactions / / Sc ience .—1994 .—266 .—P. 1373—1375 . 39. Neda H., Wu C, Wu G. Y. Chemical modification of an ecotropic murine leukemia virus results in redirections of its target cell specificity / / J. Biol. Chem.—1991 .—266 .— P. 14143—14146. 40. Somia N., Zoppe M., Verma I. M. Generat ion of targeted retroviral vectors for using single-chain variable fragment: an approach to in vivo gene delivery / / Proc . Nat. Acad. Sci. U S A . — 1 9 9 5 . — 9 2 . — P . 7 5 7 0 — 7 5 7 4 . 4 1 . Valsesia-Wittmann S., Drynda A., Deleage G. et al. Modifica tions in the binding domain of avian retrovirus envelope protein to redirect the host range of retroviral vectors III. Virol.— 1994 — 6 8 . — P . 4609—4619 42. Cosset F.-L., Ronfort C, Molina R.M. et al. Packaging cells for avian leukosis virus-based vectors with various host ranges / / I b i d . — 1 9 9 1 . — 6 6 . — P . 5 6 7 1 — 5 6 7 6 . 43 . Lynch C, Miller A. D. Prodact ion of higt-titer helper virus- free retroviral vectors by cocultivation of packaging cells with different host ranges / / Ib id .—P. 3887—3890 . 44. Stoker A., Bissell M. Development of avian sarcoma and leukosis virus-based vector-packaging cell lines / / Ibid.— 1988 .—62 .—P. 1008—1015 . 45 . Mitrani E., Coffing J., Boedtker M., Doty P. Rous Sarcoma Virus is integrated bu t not expressed in chicken early embryonic cells / / Proc . Nat. Acad. Sci. U S A . — 1 9 8 7 . — 8 4 . — P . 2781—2784 . 46 . Cosset F.-L, Legras C, Savatier P. et al. A new avian leukosis virus-based packaging cell line that uses two separa te t rans- complement in helper genomes / / J. Vi ro l .—1990.—64.— P . 1070—1078. 47. Cosset F.-L., Girod A., Flamant F. et al. Use of helper cells with two host ranges to genera te high-t i ter retroviral vectors / / Virology.—1993.—N 193 .— P. 3 8 5 — 3 9 5 . 48. Savatier P., Bagnis C, Thoraval P. et al. Generat ion of a helper cell line for packaging avian leukosis virus-based vectors / / J. V i ro l .—1989 .—63.—P. 5 1 3 — 5 2 2 . 49. Ни S., Bruszewski J., Nicolson M. Generat ion of competent virus in the REV helper cell line C 3 / / Virology.—1987.— 159 .—P. 446—449 . 50. Dougherty J., Wisniewski R., Yang S. et al. New retrovirus helper cell line with almost no nucleotide sequence homology to retrovirus vectors / / J. V i r o l .— 1989 .— 63 .— P. 3209—3212 . 5 1 . Bishop J. M. II I b i d . — 1 9 8 0 . — 3 6 . — P . 5 0 — 6 1 . 52 . Crittenden L. В., Salter D. W. G e n e insertion; current progress and long-term goals / / Avian Diseases .—1986 .—30, N 1.— P . 4 3 — 4 6 . 5 3 . Thomas J. L, Afanassieff M., Cosset F.-L. et al. In situ expression of helper-free avian leukosis virus (ALV)-based retrovirus vectors in early chick embryos / / Int. J. Develop. Biol .—1992.—N 3 6 . — P . 2 1 5 — 2 2 7 54 . Hlozanek I., Luton D., Dieterlenlievre F., Jaffredo T. Hear t targeting of retroviral expression in avian embryos: a species- independent phenomenon / / Rouxs Arch. Dev. Bio l .—1995.— 2 0 4 . — P . 212—218 . 5 5 . Lemischka I. R. Retroviral l ineage studies: some principals and applications / / Curr . Opinion Genet , and Deve lop .—1993 .— 3 .—P. 155—118. 56 . Souza L. M., Boone Т. C , Murdock A. Application of recombinant DNA technologies to studies on chicken grouth hormone / / J. Exp . Z o o l . — 1 9 8 4 . — 2 3 2 . — P . 4 6 5 — 4 7 3 . 57 . Crittenden L. В., Salter D. V., Federspiel M. J. Segregation viral phenotype, and proviral s t ructure of 23 avian leukosis virus inserts in the germ line of chickens / / Theor . and Appl. G e n e t . — 1 9 8 9 . — 7 7 . — P . 5 0 5 — 5 1 5 . 58 . Yeh P., Dedieu J.-F., Orsini C. et al. Improving adenovirus- mediated gene transfer / / Int. Symp. on Human Gene Therapy Inuyama—Nagoya, 1995. 59 . Salter D. V., Grittenden L. B. Artifitial insertion of a dominant gene for resistance to avian leukosis virus into germ line of the chicken / / Theor . and Appl. G e n e t . — 1 9 8 9 . — 7 7 . — P . 457— 4 6 1 . 60. Chebloune Y., Rulka J., Cosset F.-L. et al. Immune responce and resistance to RSV chal lenge of chickens immunized with cell-associated glycoproteins provided with a recombinant ALV / / J. V i ro l .—1991 .—65.—P. 5 3 7 4 — 5 3 8 0 . У Д К 517 . 15:516.858 Поступила в р е д а к ц и ю 22.07.96 13

Применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц

Institution

Ähnliche Einträge