Отбор чувствительных к бактериофагу λ клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli

A method of selection of the phage λ sensitive clones from the population of the bacteriophage λ resistant cells using the phage λcI857ApRTcR has been theoretically formulated and experimentally approved. The isolation was realized as follows. The phage λ resistant E. coli strain was infected by pha...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2001
Автор:	Славченко, И.Ю.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2001
Назва видання:	Біополімери і клітина
Теми:	Молекулярна та клітинна біотехнології
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154674
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Отбор чувствительных к бактериофагу λ клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli / И.Ю. Славченко // Біополімери і клітина. — 2001. — Т. 17, № 2. — С. 160-165. — Бібліогр.: 9 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-154674
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1546742019-07-05T23:34:43Z Отбор чувствительных к бактериофагу λ клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli Славченко, И.Ю. Молекулярна та клітинна біотехнології A method of selection of the phage λ sensitive clones from the population of the bacteriophage λ resistant cells using the phage λcI857ApRTcR has been theoretically formulated and experimentally approved. The isolation was realized as follows. The phage λ resistant E. coli strain was infected by phage λ, which introduces antibiotic-resistance markers into the cell. The sensitive to phage λ vir and lysing at 43 °C clones were isolated on the selective medium. The frequency of occurrence of such cells in the population was 10⁻⁶ . The presence of ts-mutation in the phage cI gene has allowed to cure the cells from phage λcI857ApRTcR during cultivation of these cells under non-selective conditions at increased temperature and to obtain the phage A sensitive clones originated from resistant E. coli strain. The method can also be used for the estimation of the E. coli populations heterogeneity by a given feature. Теоретично сформульовано та експериментально апробовано метод селекції чутливих до фага λ клонів із популяції кліринстійких до бактеріофага λ, за допомогою фага λcI857ApRTcR . Стійкий до фага λ штам Е. coli інфікували фагом λ, який привносить у клітину маркери антибіотикостійкості. На селективному середовищі було відібрано клони, чутливі до фага λ vir, які лізують при температурі 43 °C. Частота виникнення таких клітин у популяції складає 10⁻⁶ . Наявність ts-мутації в сI-гені фага дозволила при вирощуванні у неселективних умовах і при підвищеній температурі які несуть цей фаг, вилікувати клітини від фага λcI857ApRTcR та одержати чутливі до фага λ клони, що походять від вихідного нечутливого штаму Е. coli. Метод також може бути використаний для популяційних оцінок гетерогенності популяцій λ за даною ознакою. Теоретически сформулирован и экспериментально апробирован метод селекции чувствительных к фагу λ клонов из популяции клеток, устойчивых к бактериофагу λ с помощью фага λcI857ApRTcR Устойчивый к фагу λ штамм Е. coli инфицировали фагом λ, который привносит в клетку маркеры антибиотикоустойчивости. На селективной среде отобраны клоны, чувствительные к фагу λ vir и лизирующие при температуре 43 °С. Частота возникновения таких клеток в популяции составила 10⁻⁶. Наличие ts-мутации в cI-гене фага позволило при выращивании несущих его клеток в неселективных условиях при повышенной температуре излечить клетки от фага λcI857ApRTcR и получить чувствительные к фагу λ клоны, производные исходного нечувствительного штамма Е. coli Метод также может быть использован для популяционных оценок гетерогенности популяций Е. coli по данному признаку. 2001 Article Отбор чувствительных к бактериофагу λ клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli / И.Ю. Славченко // Біополімери і клітина. — 2001. — Т. 17, № 2. — С. 160-165. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0005A7 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154674 579.842.11:578.81].083.12 ru Біополімери і клітина Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Молекулярна та клітинна біотехнології Молекулярна та клітинна біотехнології
spellingShingle	Молекулярна та клітинна біотехнології Молекулярна та клітинна біотехнології Славченко, И.Ю. Отбор чувствительных к бактериофагу λ клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli Біополімери і клітина
description	A method of selection of the phage λ sensitive clones from the population of the bacteriophage λ resistant cells using the phage λcI857ApRTcR has been theoretically formulated and experimentally approved. The isolation was realized as follows. The phage λ resistant E. coli strain was infected by phage λ, which introduces antibiotic-resistance markers into the cell. The sensitive to phage λ vir and lysing at 43 °C clones were isolated on the selective medium. The frequency of occurrence of such cells in the population was 10⁻⁶ . The presence of ts-mutation in the phage cI gene has allowed to cure the cells from phage λcI857ApRTcR during cultivation of these cells under non-selective conditions at increased temperature and to obtain the phage A sensitive clones originated from resistant E. coli strain. The method can also be used for the estimation of the E. coli populations heterogeneity by a given feature.
format	Article
author	Славченко, И.Ю.
author_facet	Славченко, И.Ю.
author_sort	Славченко, И.Ю.
title	Отбор чувствительных к бактериофагу λ клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli
title_short	Отбор чувствительных к бактериофагу λ клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli
title_full	Отбор чувствительных к бактериофагу λ клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli
title_fullStr	Отбор чувствительных к бактериофагу λ клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli
title_full_unstemmed	Отбор чувствительных к бактериофагу λ клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli
title_sort	отбор чувствительных к бактериофагу λ клонов из устойчивого к нему штамма escherichia coli
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2001
topic_facet	Молекулярна та клітинна біотехнології
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154674
citation_txt	Отбор чувствительных к бактериофагу λ клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli / И.Ю. Славченко // Біополімери і клітина. — 2001. — Т. 17, № 2. — С. 160-165. — Бібліогр.: 9 назв. — рос.
series	Біополімери і клітина
work_keys_str_mv	AT slavčenkoiû otborčuvstvitelʹnyhkbakteriofagulklonovizustojčivogoknemuštammaescherichiacoli
first_indexed	2025-07-14T06:42:13Z
last_indexed	2025-07-14T06:42:13Z
_version_	1837603575391322112
fulltext	ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2001. Т. 17. № 2 МОЛЕКУЛЯРНА І КЛІТИННА БІОТЕХНОЛОГИ Отбор чувствительных к бактериофагу Я клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli И. Ю. Славченко Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143, Украина Теоретически сформулирован и экспериментально апробирован метод селекции чувствительных к фагу X клонов из популяции клеток, устойчивых к бактериофагу X с помощью фага ХсІйбІА^Тс. Устойчивый к фагу X штамм Е. coli инфицировали фагом X, который привносит в клетку маркеры антибиотикоустойчивости. На селективной среде отобраны клоны, чувствительные к фагу X vir и лизирующие при температуре 43 °С. Частота возникновения таких клеток в популяции составила 10~ь. Наличие ts-мутации в cJ-гене фага позволило при выращивании несущих его клеток в неселективных условиях при повышенной температуре излечить клетки от фага XcI857ApRTc и получить чувствительные к фагу X клоны, производные исходного нечувствительного штамма Е. coll Метод также может быть использован для популяционных оценок гетерогенности популяций Е. coli по данному признаку. Введение. Методы генетической инженерии позво ляют в настоящее время создавать микробные штаммы, способные продуцировать значительные количества целевого продукта. При создании су перпродуцентов на основе Е. coli для клонирования целевого гена обычно используют бактериофаг Я, а для его высокоэффективной экспрессии — векторы на основе мультикопийных плазмид. Однако изве стны примеры успешного применения векторов на основе бактериофага Я и для экспрессии привнесен ных генов. Например, выход продуктов триптофа- нового оперона , экспрессированных в составе трансдуцирующего фага Я, достиг 50 % от раство римых белков клетки [1 ], а амидазы Pseudomonas aeruginosa — 25 % от растворимых белков клетки [2] . Разработанная нами технология получения /?-галактозидазы с использованием бактериофага Я позволяет получать до 2 г /?-галактозидазы в і л культуральной жидкость [3 ]. При использовании в системах суперсинтеза биологически активных веществ бактериофага Я клетки штамма-продуцента разрушаются в резуль тате литического развития фага, и образующийся целевой продукт накапливается непосредственно в культуральной среде. Это имеет определенные пре- © И Ю. СЛАВЧЕНКО, 2001 имущества по сравнению с плазмидным способом получения биологически активных веществ, при котором целевой продукт накапливается внутри бактериальных клеток и для его выделения необхо дима их дезинтеграция. Уровень экспрессии целевого гена в бактери альных клетках как в случае применения плазмид- ных технологий, так и технологий с использовани ем бактериофага Я во многом определяется генети ческими свойствами штамма-продуцента. Извест но, что более высокий выход целевого продукта наблюдается в штаммах, в которых рекомбинант- ные молекулы Д Н К и м Р Н К чужеродных белков стабильнее, а также менее активен протеолиз. При использовании бактериофага Я для получения био логически активных веществ штамм-продуцент должен обладать еще одним свойством — чувстви тельностью к фагу Я. Однако, как показывает практический опыт, штаммы Е. coli часто являются нечувствительными к фагу Я и не могут быть использованы в системах синтеза целевых продук тов с использованием фага Я. В этой связи с целью расширения круга штам мов Е. coli, пригодных для системы получения биологически активных веществ, основными ком понентами которой являются бактериальная клетка и бактериофаг Я, разработан описанный в данной 160 ОТБОР ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ К БАКТЕРИОФАГУ ЛЯМБДА КЛОНОВ работе метод селекции чувствительных к фагу Я клонов из устойчивых к нему штаммов Е. coli. Материалы и методы. Штаммы Е. coli и бактериофага Я, используемые в работе, представ лены ниже: Фаги Я clear и Я vir любезно были предоставле ны В. Н. Рыбчиным, (Ленинградский политехниче ский институт им. М. И. Калинина, Россия), а штамм Е. coli SG20050 — В. Г. Коробко (Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина, Рос сия). Остальные штаммы получены из коллекции культур отдела регуляторных механизмов клетки Института молекулярной биологии и генетики НАН Украины. Среды. Для выращивания бактериальных куль тур использовали жидкую питательную среду ами- нопептид производства Армавирского мясокомби ната (Россия), представляющую собой фермента тивный гидролизат белка, а также минимальную среду М9 с добавлением мальтозы [4 ]. Агаризован- ную среду готовили на основе аминопептида, кон центрация агара составляла 1,5 %. При необходи мости в среду добавляли антибиотики до конечной концентрации ампициллина 20 м к г / м л , а тетра циклина — 12 м к г / м л . При высеве фага двухслой ным методом для верхнего слоя использовали 0,6 % - ю агаризованную среду. Стандартные разве дения фаголизатов и бактериальных культур осу ществляли в 0,14 М NaCl . Получение фаголизатов. Фаг Яс1857Ар кТс к по л у ч а л и термоиндукцией лизогенной культуры К802 (Яс1857АрТс к). Д л я этого культуру К802 (Яс1857Ар кТс к) выращивали в аминопептиде при температуре 28 °С в условиях интенсивной аэрации до плотности ~2-108 к л / м л . Затем ее выдерживали при температуре 43 °С в течение 20 мин, после чего культуру помещали в условия интенсивной аэрации (37 °С). Через 60—80 мин клетки лизиру- ются и фаг выходит в культуральную среду. Далее фаголизат обрабатывали хлороформом. Титр опре деляли общепринятым двухслойным методом. В качестве индикаторной культуры использовали штамм Е. coli RLM1. Как правило, получали (1,5— 3,0) • 10 1 0 Б О Е / м л лизата . Размножение фагов Я vir и Я clear осуществля ли путем инфицирования с множественностью 0,1 копрускулы на клетку культуры R L M 1 , выращен ной в аминопептиде при температуре 37 °С в условиях интенсивной а э р а ц и и до плотности - 2 - Ю 8 к л / м л . Через 5 ч инкубирования заражен ной культуры в условиях интенсивной аэрации (при 37 °С) клетки лизируются. Полученный фаго лизат также обрабатывали хлороформом. Титр оп ределяли общепринятым двухслойным методом. Индикаторной культурой служил штамм Е. coli R L M 1 . К а к правило , получали (3,0—5,0) 10 1 0 Б О Е / м л лизата . Чувствительность клонов к этим фагам определяли по наличию зоны лизиса в месте нанесения на свежепосеянные штрихом клоны на чашки с твердой питательной средой. Чашки инку бировали в термостате при температуре 37 °С в течение 15 ч. В настоящей работе под чувствитель ными клетками Е. coli к фагу Я (далее обозначены, как «&») подразумеваются такие реципиентные клетки, которые фаг способен не только заразить, но и при определенных условиях литически в них развиваться. Под устойчивыми клетками Е. coli к фагу Я (далее обозначены, как «Як») подразумева ются клетки, в которых нарушен хотя бы один из этапов, приводящих к литическому развитию фага, в том числе этапы адсорбции фага и инъекции фаговой Д Н К . Результаты и обсуждение . Устойчивость кле ток к бактериофагу Я может быть обусловлена различными факторами. Клетки могут содержать в своем геноме профаг Я и быть иммунными к повторному заражению аналогичным фагом. Для селекции нелизогенных клеток из лизогенных по фагу Я штаммов Е. coli нами предложен способ, описанный в работе [5 ] . Известно, что мутации в гене Lam В, продукт которого является рецептором бактериофага Я, приводят к потере клетками чув ствительности к этому бактериофагу. Если клетки содержат мутации в гене Lam В, то получить чувствительные к фагу Я производные таких штам мов можно путем введения в клетку функциональ ного гена Lam В в составе плазмидного вектора. Это может привести к положительному результату не только в случае штаммов Е. coli, утративших чувствительность к фагу в результате мутаций в гене рецептора, но и в случае бактериальных культур, которые в природе не являются хозяевами для бактериофага Д. Например, Agrobacterium и Rhizobium [6 ]. Однако устойчивость клеток Е. coli 161 СЛАВЧЕНКО И. Ю. к фагу Я могут обусловливать не только мутации в Lam 2?-гене. И если она появилась в результате единичной мутации в гене бактериальной клетки, продукт которого необходим для логического раз вития бактериофага Я, то с низкой вероятностью в популяции таких клеток могут возникать особи, восстановившие свою чувствительность к фагу. И з - за очень низкой вероятности такого события слу чайный поиск соответствующих особей требует проверки огромного количества бактериальных ко лоний и, как следствие, много времени Поэтому требуются такие методы выявления, которые по зволили бы на фоне основной массы идентифици ровать измененную особь, частота возникновения которой, как правило, не превышает 10~\ Для отбора чувствительных к фагу Я ревертан- тов из популяции устойчивых к нему клеток нами разработан метод селекции при помощи бактерио фага Я, несущего гены, определяющие устойчи вость к антибиотикам. Принцип предлагаемого спо соба заключается в следующем. В популяции ус тойчивых к фагу Я клеток в результате спонтанной мутации с очень низкой частотой может возник нуть ревертант, чувствительный к фагу Я. При инфицировании такой культуры фагом Я, в отли чие от основной массы нечувствительных клеток, фаг может лизогенизировать только особи, чувст вительные к фагу Я. Если фаг привносит в клетку селективный маркер, то лизогенизированные им клетки легко отбираются на селективной среде. При этом необходимо использовать такой маркиро ванный фаг, от которого можно легко излечить к л е т к и . Э т и м т р е б о в а н и я м о т в е ч а е т ф а г Яс1857Ар к Тс к ранее сконструированный в нашей лаборатории [7 ], несущий гены Ыа и teU детерми нирующие устойчивость к ампициллину и тетра циклину, а также te-мутацию в с/-гене, что позво ляет при выращивании лизогенов при повышенной температуре в неселективных условиях излечить клетки от этого профага. Это не составляет трудно сти, так как при выращивании клеток, лизогенных по фагу Яс1857Ар к Тс к при температуре 37 °С, большинство из них в результате абортивной ин дукции освобождается от фага с термолабильным репрессором, и становятся нелизогенными. Перед нами стояла задача получить из штамма Е. coli SG20050 изогенные производные, чувстви тельные к фагу Я. Этот штамм являлся перспектив ным продуцентом в системах биосинтеза биологи чески активных веществ с использованием бакте риофага Я, поскольку он с успехом был применен для плазмидных технологий. На основе штамма Е. coli SG20050 созданы продуценты интерферона че ловека [8] и гранулоцит-колониестимулирующего фактора человека [9] . Однако устойчивость этого штамма к фагу Я делала его непригодным для фагозависимых технологий получения биологиче ски активных веществ. Было установлено, что штамм Е. coli SG20050 является устойчивым как к фагу Я clear, так и к вирулентному фагу Я vir, который, как известно, нечувствителен к репрессору и способен размно жаться в клетках, лизогенных по фагу Я. Это свидетельствует о том, что устойчивость к фагу Я штамма Е. coli SG20050 не обусловлена специфи ческим иммунитетом к повторному инфицирова нию фагом и не связана с наличием в клетке аналогичного профага. Исходя из описанных выше теоретических предпосылок можно было рассчиты вать на то, что, используя предлагаемый метод, удастся отобрать чувствительные к фагу Я клоны из устойчивого к нему штамма Е. coli SG20050. При этом мы не располагали информацией о том, мута ция в каком именно гене делает этот штамм устойчивым к вирусной инфекции. Поскольку фаг Яс1857Ар к Тс к привносит в клет ку маркеры антибиотикоустойчивости к ампицил лину и тетрациклину, было необходимо предвари тельно проверить, не обладает ли штамм Е. coli SG20050, из которого необходимо отобрать воспри имчивые к фагу Я клоны, устойчивостью к данным антибиотикам. В результате проверки выяснилось, что штамм Е. coli SG20050 не способен расти на среде с ампициллином, но является устойчивым к тетрациклину. Поэтому, к сожалению, для отбора искомых особей для данного штамма Е. coli прово дить селекцию можно только на среде с ампицил лином, что имеет определенные недостатки, кото рые будут обсуждены ниже. Однако это не делает невозможным использование фага Яс1857Ар кТс к для отбора чувствительных к фагу Я клонов из устойчивого к нему штамма Е. coli SG20050. Анализ клонов на наличие или отсутствие в них фагов Я, а также чувствительности к фагу Я в ходе работы проводили по нескольким параметрам, представленным в табл. 1. Первый этап работы заключался в лизогениза- ции фагом Яс1857Ар к Тс к тех единичных ревертан- тов в популяции Я к клеток, у которых восстанови лась чувствительность к фагу Я. Источником фага служил лизоген К802 (Яс1857Ар к Тс к ). Фаг получа ли предварительно, как описано в «Материалах и методах». После обработки фаголизата хлорофор мом его проверяли на наличие жизнеспособных клеток, высевая шпателем 0,1 мл фаголизата на чашки со средой без антибиотиков с последующей инкубацией чашек при температуре 28 °С в тече ние 15—24 ч. Фаг использовали только в том 162 ОТБОР ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ К БАКТЕРИОФАГУ ЛЯМБДА КЛОНОВ Таблица J Анализ клонов Е. coli SG20050 на наличие или отсутствие в них фагов X, а также чувствительности клонов к фагу лямбда Плюс — культура растет в этих условиях, минус — не растет; *плюс — культура чувствительна к фагу, минус — нечувствительна. случае, если на чашках не выросло ни одной колонии. Поскольку вероятность появления A s ревертан- тов может быть очень низкой, лизогенизацию не обходимо проводить в условиях, при которых э ф фективность заражения близка к 100 % . Этого можно достичь путем индукции мальтозного оперо- на, в состав которого входит ген Lam В. Для этого культуру Е. coli SG20050 выращивали на среде М9 с мальтозой при 37 °С в условиях интенсивной аэрации и инфицировали фагом AcI857Ap R Tc R . В табл. 2 представлены протоколы двух эксперимен тов, отличающихся плотностью культуры в момент заражения и множественностью инфекции. Инфицированную культуру в течение 20 мин инкубировали при температуре 20 °С, а затем по 0,1 мл из разведений 10"1 и 10~2 высевали шпателем на чашки с агаризованной средой, содержащей ампициллин. Одновременно из разведений 10~4 и 10~5 по 0,1 мл культуры высевали на чашки с агаризованной средой без антибиотиков для опре деления общего количества клеток. Чашки инкуби ровали в термостате при температуре 28 °С. На следующий день на среде с антибиотиком наблюдался рост отдельных колоний. Частота появ ления A p R клонов после инфицирования штамма Е. coli SG20050 фагом AcI857Ap R Tc R была близкой в обоих экспериментах и составила 2,47 - 1 0 4 и 2,96-Ю" 4 (см. табл. 2) . Колонии, выросшие на среде с ампициллином, были отколоты на четыре чашки с агаризованной средой, а именно: первая чашка со средой без антибиотиков, инкубация при 28 °С; вторая — без антибиотиков, 42 °С; третья — со средой с ампи циллином, 28 °С; четвертая — с ампициллином, 42 ° С Параллельно все эти клоны были проверены на чувствительность к фагу A vir. Необходимо отметить, что все A p R клоны про веряли на чувствительность к фагу A vir, поскольку для селекции был использован фаг AcI857Ap R Tc R с амбер-мутациями в ЛГ-гене. Такой фаг в Su клет ках не может литически развиваться даже при 42 °С и находится в клетке в виде плазмиды. Было неизвестно, содержит ли штамм Е. coli SG20050 супрессор, исправляющий амбер-мутации. И если все выросшие на ампициллине клоны будут чувст вительными к фагу A vir, то это будет показателем того, что штамм Е. coli SG20050 является Su. Анализ переколов и теста на чувствительность к фагу A vir показал следующее. Часть клонов вообще не выросла на среде с ампициллином при температуре как 42 °С, так и 28 °С. Это оказалось неожиданным, поскольку мы вынуждены были ис пользовать для селекции только ампициллин. А во время роста Ap R клонов они продуцируют и секре- тируют /?-лактамазу, которая разрушает ампицил лин, давая возможность расти не только Ap R , но и A p s клеткам. Подавляющее большинство клонов дало рост на ампициллине при температурах 28 °С и 42 °С. И все они оказались устойчивыми к фагу A vir. Это могут быть различные мутанты, несущие мутации в бактериальном геноме, блокирующие литическое развитие фага в клетке-хозяине. Ожи дать же , что все выросшие на среде с ампицилли ном клоны будут иметь только интересующие нас свойства, нет оснований даже теоретически. Среди выросших на среде с ампициллином клонов были отобраны и интересующие нас особи. 163 СЛАВЧЕНКО И. Ю. Таблица 2 Сравнительная характеристика различных показателей в процессе отбора A s клонов из A R штамма Е. coli SG20050 Они были чувствительными к фагу A vir, устойчи выми к фагу A clear, росли на среде с антибиотика ми при температуре 28 °С и показали полное отсутствие роста на среде без антибиотиков при 42 °С (см. табл. 1). Частота их появления в попу ляции клеток составила величину порядка 10"6. Результаты эксперимента представлены в табл. 2. Поскольку все чувствительные клоны к фагу A vir не росли при температуре 42 °С мы пришли к выводу, что штамм Е. coli SG20050 содержит суп- рессор, исправляющий амбер-мутации в TV-гене фага AcI857Ap RTc R . На следующем этапе работы было необходимо излечить от фага AcI857Ap R Tc R отобранные лизоге- ны SG20050. Для этого клоны SG20050, несущие маркированный фаг с te-мутацией в гене-репрессо- ре с/, были посеяны петлей по секторам на чашки с агаризованной средой без антибиотиков и инку бированы при температуре 37 °С в течение 15 ч. Затем выросшую культуру вновь посеяли на чашки с агаризованной средой без антибиотиков для полу чения отдельных колоний, которые также инкуби ровали в аналогичных условиях. Количество кло нов, утративших фаг AcI857Ap R Tc R при втором посеве на неселективную среду при повышенной температуре, составило более 90 % . Отбор таких клонов проводили по потере маркера устойчивости к ампициллину, способности расти при температу ре 43 °С и наличию чувствительности к фагу А clear (см. табл. 1). Чувствительные к фагу А клоны, отобранные из популяции AR клеток SG20050, сохранили устой чивость к тетрациклину и имели генотип 1ас~, как и исходный штамм Е. coli, что дает основание предположить, что нами получены изогенные As производные штамма Е. coli SG20050. На отобран ных клонах фаг А образует более мелкие бляшки, а также дает титр в несколько раз ниже, чем на индикаторной культуре R L M 1 , что характерно и для многих других штаммов Е. colt Однако это не является препятствием для использования отобран ных A s производных штамма Е. coli SG20050 в системах суперсинтеза биологически активных ве ществ с использованием бактериофага А. Таким образом, в результате описанного экс перимента нами показана возможность отбора чув ствительных к фагу А клонов из устойчивого к нему штамма Е. coli с помощью фага AcI857Ap RTc R . Кроме того, при соответствующих условиях метод позволяет определять и количество таких особей в популяции, оценивать равновесность популяции по данному признаку, ее изменения и т. д. Так , было установлено, что частота появления A s клеток в устойчивой к фагу А популяции клеток штамма Е. coli SG20050 составляет величину порядка 10"6. Поэтому данный метод может быть использован для решения задач как прикладного, так и научно го характера. Автор выражает благодарность В. А. Кордюму за ценные советы и замечания, сделанные им при чтении рукописи, а также В. Г. Коробко — за предоставление штамма Е. coli SG20050. 164 ОТБОР ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ К БАКТЕРИОФАГУ ЛЯМБДА КЛОНОВ Л Yiu Slavchenko Isolation of clones sensitive to bacteriophage X from the phage resistant Escherichia coli strain Summary A method of selection of the phage X sensitive clones from the population^ ofR the bacteriophage X resistant cells using the phage XcI857Ap Tc has been theoretically formulated and experimentally approved. The isolation was realized as follows. The phage X resistant E. coli strain was infected by phage X, which introduces antibiotic-resistance markers into the cell. The sensitive to phage X vir and lysing at 43 °С clones were isolated on the selective mediurr^ The frequency of occurrence of such cells in the population was 10 . The presence of ts-mutation in£he ghage cl gene has allowed to cure the cells from phage XcI857Ap Tc during cultivation of these cells under non-selective conditions at increased temperature and to obtain the phage X sensitive clones originated from resistant E. coli strain. The method can also be used for the estimation of the E. coli populations heterogeneity by a given feature. І. Ю. Славченко Відбір чутливих до бактеріофага X клонів із стійкого до нього штаму Escherichia coli Резюме Теоретично сформульовано та експериментально апробовано метод селекції чутливих до фага X клонів із популяції клірин^ стійких до бактеріофага X, за допомогою фага ХсІ857Ар Тс . Стійкий до фага X штам Е. coli інфікували фагом X, який привносить у клітину маркери антибіотикостійкості. На селективному середовищі було відібрано клони, чутливі до фага X vir, які лізують при температурі 43 °р. Частота виникнення таких клітин у популяції складає 10 . Наявність ts-мутації в сі-гені фага дозволила при вирощуванні у неселек- тивних умовах і при підвищеній температурі mitmiH,R які несуть цей фаг, вилікувати клітини від фага Хс1857Ар Тс та одержати чутливі до фага X клони, що походять від вихідного нечутливого штаму Е. coli. Метод також може бути викори станий для популяційних оцінок гетерогенності популяцій Е. coli за даною ознакою. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Moir A., Brammar W. J. The use of specialized transducing phages in the amplification of enzyme production / / Мої. and Gen. Genet.—1976.—149.—P. 87—99. 2. Drew R. E., Clarke P. H, Brammar W. J. The construction in vitro of derivatives of bacteriophage lambda carrying the amidase genes of Pseudomonas aeruginosa II Мої. and Gen. Genet.—1980.—177, N 2.—P. 311—320. 3. А. с. СССР № 1593232. Способ получения /?-галактозидазы / Кордюм В. А., Черных С. И., Славченко И. Ю., Коробко В. Г.—Опубл. 15.05.1990. 4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное кло нирование.—М.: Мир, 1984.—479 с. 5. Славченко И. Ю., Черных С. И., Кордюм В. А. Исполь зование мутантного фага AcI857ApRTcRN~ для получения клеток, лишенных профага Я / / Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология.—1985.—№ 11.—С. 42—44. 6. Pat. USA 4,784,952. Conferred susceptibility to lambda phage in non-coliform prokaryotic hosts / Robert A. Ludwig, Gert E. de Vries.—Publ. 15.11.88. 7. Черных С. И., Стельмашенко Л. Н, Кордюм В. А. Особенности экспрессии Ар- и Тс-генов плазмидного про исхождения в лямбдовых векторах / / Генетика.—1984.— 20, № 3.—С. 382—388. 8. Кравченко В. В., Гилева Н. П., Шамин В. В., Куличков В, А., Добрынин В. Н., Филиппов С. А., Чу впило С. А., Каробко В. Г. Дупликация синтетического гена лейкоци тарного интерферона человека и его экспрессия в составе полицистронных мРНК с сопряженной системой транс ляции / / Биоорг. химия.—1987.—13, № 9.—С. 1186— 1193. 9. Кашьяп С. К., Быстрое Н. С, Болдырева Е. Ф., Полякова И. А., Северцова И. В., Коробко В. Г. Химико-фермен тативный синтез и клонирование в Escherichia coli гена, кодирующего гранулоцит-колониестимулирующий фактор человека / / Биоорг. химия.—1992.—18, № 1.—С. 11—11. УДК 579.842.11:578.81].083.12 Надійшла до редакції 29.01.2001 165

Отбор чувствительных к бактериофагу λ клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli

Репозитарії

Схожі ресурси