Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 1 . Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот

Для розширення сфери застосування карбоціанінових барвників для гомогенної флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот (НК) запропоновано використовувати барвники, заміщені у поліметиновому ланцюзі. Синтезовано низку алкіл-заміщених похідних тіакарбоціаніну; досліджено їхні спектрально-люмінесцентні...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2001
Автори:	Лукашов, С.С., Лосицький, М.Ю., Сломінський, Ю.Л., Ярмолюк, С.М.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2001
Назва видання:	Біополімери і клітина
Теми:	Методи
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154675
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 1 . Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот / С.С. Лукашов, М.Ю. Лосицький, Ю.Л. Сломінський, С.М. Ярмолюк // Біополімери і клітина. — 2001. — Т. 17, № 2. — С. 169-177. — Бібліогр.: 21 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-154675
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1546752019-06-16T01:30:27Z Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 1 . Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот Лукашов, С.С. Лосицький, М.Ю. Сломінський, Ю.Л. Ярмолюк, С.М. Методи Для розширення сфери застосування карбоціанінових барвників для гомогенної флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот (НК) запропоновано використовувати барвники, заміщені у поліметиновому ланцюзі. Синтезовано низку алкіл-заміщених похідних тіакарбоціаніну; досліджено їхні спектрально-люмінесцентні властивості в присутності дволанцюгової ДНК, РНК та бичачого сироваткового альбуміну (БСА). Всі отримані похідні мають нижчий рівень власної флюоресценції, ніж у вихідного барвника В присутності НК спостерігається підвищення інтенсивності випромінювання в 1,75–76 разів. Менше підвищення (1,75–16,9 разу) має місце в присутності великого надлишку БСА. Максимальна інтенсивність, яка більше, ніж удвічі, перевищує інтенсивність флюоресценції тіакарбоціаніну, спостерагається для НК-комплексів β-метил-заміщеного барвника. Замісники розмірів, більших за метальну групу, викликають занадто великі порушення плоскої будови флюорофору тіакарбоціаніну, що призводить до зменшення інтенсивності випромінювання НК-комплексів відповідних барвників. В целях расширения использования карбоцианиновых красителей для гомогенного флюоресцентного обнаружения нуклеиновых кислот (НК) предложено использование красителей с заместителями в полиметиновой цепи. Синтезирован ряд алкил-замещенных производных тиакарбоцианина; исследованы их спектрально-люминесцентные характеристики в присутствии двухцепочечной ДНК, РНК и бычьего сывороточного альбумина (БСА). Уровень собственной флюоресценции у всех полученных производных ниже, чем у исходного красителя. В присутствии НК наблюдается увеличение интенсивности из лучения в 1,75–76 раз, в то время как уровень излучения незамещенного красителя повышается незначительно (1,08– 1,94 раза). Меньшее увеличение флюоресценции (1,75–16,9 раза) имеет место в присутствии большого избытка БСА. Максимальная интенсивность, вдвое превышающая таковую тиакарбоцианина, наблюдается для НК-комплексов (β-метил-замещенного красителя. Заместители больших, чем метильная группа, размеров вызывают избыточные нарушения планарности тиакарбоцианинового флюорофора, что приводит к уменьшению интенсивности излучения НК-комплексов соответствующих красителей. To extend the application of carbocyanine dyes in fluorescent nucleic acid detection, the use of dyes substituted in a polymethine cliain is proposed. A series of thiacarbocyanine derivatives with alkyl substituents in a polymethine chain have been synthesized, and the spectral luminescent properties of dyes in the presence of double-stranded DNA, RNA and bovine serum albumin (BSA) have been examined. The intrinsic fluorescence of all derivatives prepared is lower than that of unsubstituted thiacarbocyanine. The dyes show 1.75–76-fold fluorescence enhancement in the presence of nucleic acids. Lower enhancement (1.75–16.9 times) takes place in the presence of large excess of BSA. The highest fluorescence intensity for dye-nucleic acid complexes is observed for the i-methyl-substituted dye that is more than two times higher as compared to thiacarbocyanine. The substituents larger than methyl group disturb the planarity of thiacarbocyanine fluorophore excessively, and the fluorescence intensities of nucleic acid complexes of corresponding dyes are lower. 2001 Article Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 1 . Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот / С.С. Лукашов, М.Ю. Лосицький, Ю.Л. Сломінський, С.М. Ярмолюк // Біополімери і клітина. — 2001. — Т. 17, № 2. — С. 169-177. — Бібліогр.: 21 назв. — укр. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0005A9 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154675 535.372 uk Біополімери і клітина Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Методи Методи
spellingShingle	Методи Методи Лукашов, С.С. Лосицький, М.Ю. Сломінський, Ю.Л. Ярмолюк, С.М. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 1 . Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот Біополімери і клітина
description	Для розширення сфери застосування карбоціанінових барвників для гомогенної флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот (НК) запропоновано використовувати барвники, заміщені у поліметиновому ланцюзі. Синтезовано низку алкіл-заміщених похідних тіакарбоціаніну; досліджено їхні спектрально-люмінесцентні властивості в присутності дволанцюгової ДНК, РНК та бичачого сироваткового альбуміну (БСА). Всі отримані похідні мають нижчий рівень власної флюоресценції, ніж у вихідного барвника В присутності НК спостерігається підвищення інтенсивності випромінювання в 1,75–76 разів. Менше підвищення (1,75–16,9 разу) має місце в присутності великого надлишку БСА. Максимальна інтенсивність, яка більше, ніж удвічі, перевищує інтенсивність флюоресценції тіакарбоціаніну, спостерагається для НК-комплексів β-метил-заміщеного барвника. Замісники розмірів, більших за метальну групу, викликають занадто великі порушення плоскої будови флюорофору тіакарбоціаніну, що призводить до зменшення інтенсивності випромінювання НК-комплексів відповідних барвників.
format	Article
author	Лукашов, С.С. Лосицький, М.Ю. Сломінський, Ю.Л. Ярмолюк, С.М.
author_facet	Лукашов, С.С. Лосицький, М.Ю. Сломінський, Ю.Л. Ярмолюк, С.М.
author_sort	Лукашов, С.С.
title	Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 1 . Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот
title_short	Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 1 . Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот
title_full	Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 1 . Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот
title_fullStr	Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 1 . Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот
title_full_unstemmed	Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 1 . Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот
title_sort	взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 1 . карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2001
topic_facet	Методи
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154675
citation_txt	Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 1 . Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот / С.С. Лукашов, М.Ю. Лосицький, Ю.Л. Сломінський, С.М. Ярмолюк // Біополімери і клітина. — 2001. — Т. 17, № 2. — С. 169-177. — Бібліогр.: 21 назв. — укр.
series	Біополімери і клітина
work_keys_str_mv	AT lukašovss vzaêmodíâcíanínovihbarvnikívznukleínovimikislotami1karbocíanínovíbarvnikizamíŝenívpolímetinovomulancûzíâkmožlivízondidlâflûorescentnoídetekcíínukleínovihkislot AT losicʹkijmû vzaêmodíâcíanínovihbarvnikívznukleínovimikislotami1karbocíanínovíbarvnikizamíŝenívpolímetinovomulancûzíâkmožlivízondidlâflûorescentnoídetekcíínukleínovihkislot AT slomínsʹkijûl vzaêmodíâcíanínovihbarvnikívznukleínovimikislotami1karbocíanínovíbarvnikizamíŝenívpolímetinovomulancûzíâkmožlivízondidlâflûorescentnoídetekcíínukleínovihkislot AT ârmolûksm vzaêmodíâcíanínovihbarvnikívznukleínovimikislotami1karbocíanínovíbarvnikizamíŝenívpolímetinovomulancûzíâkmožlivízondidlâflûorescentnoídetekcíínukleínovihkislot
first_indexed	2025-07-14T06:42:15Z
last_indexed	2025-07-14T06:42:15Z
_version_	1837603578315800576
fulltext	ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2001. Т. 17. № 2 МЕТОДИ Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. 1 . Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот С- С Лукашов, М- Ю. Лосицький, Ю. JL Сломінський1, С M. Ярмолюк Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, 03143, Україна Інститут органічної хімії НАН України Вул. Мурманська, 5, Київ, 02094, Україна Для розширення сфери застосування карбоціанінових барвників для гомогенної флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот (НК) запропоновано використовувати барвники, заміщені у поліме тиновому ланцюзі. Синтезовано низку алкіл-заміщених похідних тіакарбоціаніну; досліджено їхні спектрально-люмінесцентні властивості в присутності дволанцюгової ДНК, РНК та бичачого сироваткового альбуміну (БСА). Всі отримані похідні мають нижчий рівень власної флюорес- ценції, ніж у вихідного барвника В присутності НК спостерігається підвищення інтенсивності випромінювання в 1,75—76 разів. Менше підвищення (1,75—16,9 разу) має місце в присутності великого надлишку БСА. Максимальна інтенсивність, яка більше, ніж удвічі, перевищує інтен сивність флюоресценції тіакарбоціаніну, спостерагається для НК-комплексів р-метил-заміщеного барвника. Замісники розмірів, більших за метальну групу, викликають занадто великі порушення плоскої будови флюорофору тіакарбоціаніну, що призводить до зменшення інтенсивності вип ромінювання НК-комплексів відповідних барвників. Вступ. Протягом останнього часу ціанінові барвни ки широко використовують для флюоресцентної детекції нуклеїнових кислот (НК) [1 ]. Запропоно вано низку ціанінів, які у вільному стані мають майже нульове значення квантового виходу, проте при зв'язуванні з НК підвищують його на два—три порядки до значень 0,2—0,9 [2]. Важливо, що присутність інших біомолекул не заважає детекції НК, оскільки не викликає значного підвищення інтенсивності випромінювання. Використання зон дів на основі ціанінів дозволяє здійснювали де- текцію НК у гомогенних системах, де відсутня процедура видалення надлишку зонда [3 ]. © С. С. Л У К А Ш О В , М. ю. лосицький, ю. л. сломшський, С. М. Я Р М О Л Ю К , 2001 Частіше за все як зонди використовують похід ні монометинових ціанінів, у молекулах яких від бувається просторова взаємодія гетерозалишків, через що внаслідок неплоскої геометрії флюорофо- ра у незв'язаному стані такі барвники мають зани жені значення молярного коефіцієнта екстинкції та квантового виходу флюоресценції. Інтеркаляція між основами НК або зв'язування малою борозен кою подвійної спіралі НК призводить до фіксації молекули барвника у площині, що і є основною причиною значного зростання квантового виходу. Інші класи ціанінових барвників, зокрема, кар- боціаніни (КЦ), незважаючи на ряд переваг перед монометинами, мають обмежене застосування в детекції НК. Довжини хвиль максимумів поглинання КЦ, як правило, більші за 500 нм, що дозволяє викори- 169 Л У К А Ш О В С С ТА IH. стовувати для збудження флюоресценції цих барв ників дешеві напівпровідникові лазери. Заміни кін цевих гетерозалишків у молекулах КЦ, порівняно з монометинами, значно менше позначаються на випромінюючій здатності барвників. Таким чином, підбираючи гетерозалишки, легко отримати набір подібних барвників із заданими максимумами по глинання та випромінювання для багатоканальної детекції НК. У рядах барвників з різною довжиною по- ліметинового ланцюга (ПЛ) найбільшою випро мінюючою здатністю володіють карбо- та дикар- боціаніни [4], у зв'язку з чим як флюоресцентні мітки в аналізі НК переважно застосовуються КЦ [5—7]. Разом з тим ця обставина є причиною обмеженого використання КЦ для флюоресцентно го детектування в гомогенних системах [1, 8, 9] , оскільки барвники мають високий рівень випро мінювання у незв'язаному з НК стані. КЦ викори стовували також як акцепторні хромофори у ди- мерних флюоресцентних НК-зондах з переносом енергії [10—12]. Відомо, що заміщення в ПЛ карбоціанінів у багатьох випадках призводить до падіння значень молярного коефіцієнта екстинкції та квантового виходу [4, 13]. Отже, в такий спосіб можливо понизити небажано високий рівень випромінюван ня КЦ у вільному стані. Раніше нами вперше було показано, що для /?-метил-заміщеного тіакарбоціа- ніна в присутності НК спостерігається підвищення інтенсивності власного випромінювання на два по рядки [14]. З метою більш детального дослідження впливу характеру замісників у ПЛ на флюоресцентні вла стивості комплексів тіакарбоціаніну з НК нами синтезовано низку похідних з різними алкільними замісниками в ПЛ та досліджено їхні спектрально- люмінесцентні властивості у вільному стані та в присутності ДНК, РНК, а також білка БСА. Матеріали і методи. Барвники. Тіакарбоціа- ніни синтезовано згідно з [15]. Барвники Cyan 45, Cyan /?Et та Cyan CPent отримано за допомогою ортоестерного методу (схема 1). Решту барвників синтезували, використовуючи йодметилати відповідних солей алкілтіопохідних 3-метил-бензотіазолу (схема 2). Будову та індивідуальність сполук підтвердже но за допомогою електронної та ЯМР-Н 1-спектро скопії. При описанні спектрів ЯМР-Н 1 використано наступні скорочення: с. — синглет, д. — дублет, д. д. — дублет дублетів, т. — триплет, к. — квартет, м. — мультиплет, уш. с — уширений синглет. Cyan 45 З-метил-2- [3- (З-метил-2,3-дигідро- 1,3-бензотіазол-2-іліден) -1 -пропеніл ]-1,3-бензоті- азол-3-ій йодид. Вихід 75 %. Т г о п л 275 °С. ЯМР-Н 1: с. 3,81 (6Н), д. 6,41 (2Н, 12,6 Гц), д. д. 7,39 (2Н, 6,3 Гц, 8,4 Гц), д. д. 7,55 (2Н, 6,3 Гц, 9 Гц), м. 7,74 (ЗН), д. 7,98 (2Н, 8,4 Гц). Cyan 2 З-метил-2-[2-метил-З-(З-метил-2,3-ди- гідро-1,3-бензотіазол-2-іліден) -1 -пропеніл ]-1,3- бензотіазол-3-ій йодид. Вихід 94 %. Т т о п л 289 °С. ЯМР-Н 1: с 2,58 (ЗН), с. 3,91 (6Н), с 6,48 (2Н), д. д. 7,41 (2Н, 6,75 Гц, 7,8 Гц), д. д. 7,59 (2Н, 6,75 Гц, 8,1 Гц), д. 7,79 (2Н, 8,1 Гц), д. 8,04 (2Н, 7,8 Гц). Cyan /3Et З-метил-2-[2-(З-метил-2,3-дигідро- 1,3-бензотіазол-2-іліден) -1 -бутеніл ]-1,3-бензотіа- зол-3-ій йодид. Вихід 67 % [16]. Т т о п л 286 °С ЯМР-Н 1: т. 1,35 (ЗН, 7,95 Гц), к. 2,94 (2Н, 7,95 Гц), с 3,94 (6Н), с 6,44 (2Н), д. д. 7,44 (2Н, 6,9 Гц, 7,2 Гц), д. д. 7,63 (2Н, 7,2 Гц, 8,4 Гц), д. 7,84 (2Н, 8,4 Гц), д. 8,07 (2Н, 6,9 Гц). Cyan fiPr З-метил-2- [2- (З-метил-2,3-дигідро- 1,3-бензотіазол-2-іліденметил) -1 -пентеніл ]-1,3- бензотіазол-3-ій йодид. Вихід 83 %. Т т о п л 273 °С ЯМР-Н 1: м. 1,19 (ЗН), м. 1,69 (2Н), м. 2,83 (2Н), с 3,91 (6Н), с 6,41 (2Н), д. д. 7,40 (2Н, 6,6 Гц, 7,8 Гц), д. д. 7,58 (2Н, 6,6 Гц, 7,8 Гц), д. 7,79 (2Н, 7.8 Гц), д. 8,06 (2Н, 7,8 Гц). Cyan j3iPr З-метил-2- [З-метил-2-(З-метил-2,3- дигідро-1,3-бензотіазол2-іліден) -1 -бутеніл ]-1,3- бензотіазол-3-ій йодид. Вихід ЗО %. Т т о п л 274 °С. ЯМР-Н 1: м. 1,36 (6Н), с. 3,98 (6Н), уш. с 4,42 (1Н), с 6,32 (2Н), м. 7,44 (2Н), м. 7,63 (2Н), д. 7,87 (2Н, 7 Гц), д. 8,05 (2Н, 8 Гц). Cyan fitBu 2- [3,3-диметил-2-(З-метил-2,3- дигідро-1,3-бензотіазол-2-іліденметил)-1-бутеніл ]- З-метил-1,3-бензотіазол-З-ій йодид. Вихід 42 %. ТТ О Ш 1 243 °С ЯМР-Н 1: с. 1,34 (9Н), с 3,97 (6Н), с. 6,27 (2Н), д. д. 7,32 (2Н, 7,2 Гц, 7,8 Гц), д. д. 7,52 (2Н, 7,2 Гц, 8,1 Гц), д. 7,74 (2Н, 8,1 Гц), д. 7,88 (2Н, 7,8 Гц). Cyan pPh З-метил-2-[3-(З-метил-2,3-дигідро- 1,3-бензотіазол-2-іліден) -2-феніл-1 -пропеніл ]-1,3- бензотіазол-З-ій йодид. Вихід 23 %. Т т о п л 278 °С. ЯМР-Н 1: уш. с. 3,90 (6Н), м. 6,94 (2Н), уш. с. 7,29 (2Н), м. 7,47 (4Н), м. 7,70—7,79 (7Н). Cyan CPent З-метил-2- [3- (З-метил-2,3-дигідро- 1,3-бензотіазол-2-іліден) -1 -циклопентеніл ]-1,3- бензотіазолій йодид. Вихід 34 %. Т т о п л 258 °С [17]. ЯМР-Н 1: с. 2,28 (ЗН), с. 2,97 (4Н), с. 4,08 (6Н), д. 7.09 (2Н, 7,95 Гц), д. д. 7,40 (2Н, 7,5 Гц, 7,8 Гц), д. 7,47 (2Н, 7,95 Гц), д. д. 7,59 (2Н, 7,5 Гц, 8,4 Гц), д. 7,79 (2Н, 8,4 Гц), д. 7,99 (2Н, 7,8 Гц), с 8,12 (1Н). Використані речовини. Повну ДНК («Sigma», США) очищено згідно з [18], отриманий зразок містив дволанцюгові фрагменти довжиною до 103 пар основ. РНК та БСА («Sigma») використовували без додаткового очищення. Для приготування всіх водних розчинів вико ристовували 0,05 М трис-НСІ-буфер, рН 7,5. Диме- тилформамід (ДМФА) перегнано під зниженим ти ском [19]. Розчини для спектральних досліджень. Вико ристовували стокові розчини барвників у ДМФА концентрації 2-Ю' 3 М, розчини НК у буфері кон центрацій 6* 1 0 3 М пар основ для ДНК і 1,2-10~2 М основ для РНК. В усіх робочих розчинах концентрація барв ників становила 10~5 М. Для отримання комплексів барвників з НК стокові розчини барвників додава ли до розчинів НК у буфері концентрацій 6-Ю"5 В З А Є М О Д І Я Ц І А Н І Н О В И Х Б А Р В Н И К І В З Н У К Л Е Ї Н О В И М И КИСЛОТАМИ Схема 2. Синтез Cyan 2 ( R - - С Н 3 ) , Cyan 0Pr ( R - - С Н 2 С Н 2 С Н 3 ) , Cyan /йРг < R - C H ( C H 3 ) 2 ) , Cyan /Sffiu <R-C(CH 3 ) 3 ) і Cyan 0Ph (R - C 6 H 5 ) моль пар основ/л ДНК та 1,2-10"4 моль основ/л РНК. В отриманих розчинах співвідношення кон центрації пар основ ДНК до концентрації барвника (п. о./б.) становило 6:1, а основ РНК до барвника (о./б.) —12:1. Робочі розчини барвників у присутності білка отримували додаванням стокових розчинів барв ників до щойно приготованого розчину БСА кон центрації 1 мг/мл. Спектроскопічні виміри. Спектри поглинання реєстрували за допомогою спектрофотометра Spe- cord М 40 (Німеччина). Спектри флюоресценції записували на спектрофлюориметрі Hitachi 850 (Японія). Довжину хвилі збудження флюоресценції брали рівною довжині хвилі максимуму смуги по глинання мономерів барвника в даному розчині. Всі вимірювання проводили в кварцовій кюветі 1 с м * х 1 см одразу після приготування розчину при кімнатній температурі. Спектри ЯМР-Н 1 отримува ли на приладі «Уагіап VXR-ЗОО», 300 МГц (США) з внутрішнім стандартом ТМС. Результати і обговорення. Спектри поглинан ня барвників. Характеристики спектрів поглинання вільних барвників, а також барвників у присутності НК та білка подано в табл. 1. Вільні барвники. Спектри поглинання розчинів вільних барвників у ДМФА у видимій області складаються з однієї смуги, довжина хвилі макси муму якої Я Д М Ф А знаходиться в інтервалі від 542 до 595 нм. Значення молярного коефіцієнта екстинк ції е Д М ф А лежать у діапазоні від 0,82-10 5 М !см 1 до 1,64-10 М^см"1, лише для Cyan р\Ви воно стано вить 0,16 • 105 М^см"1. Крім того, спектри Cyan 45, Cyan /?Ph і Cyan CPent містять на короткохвильо вому боці смуги плече, що відповідає першому коливальному максимуму [4]. При переході до водного середовища (рис. 1) спектри поглинання всіх барвників, крім Cyan /?tBu, змінюються, причому ця зміна має певні спільні риси для всіх барвників. По-перше, довжи на хвилі поглинання мономерів А0 зміщується на 7—14 нм у короткохвильовий бік відносно Я Д М Ф А , а молярний коефіцієнт екстинкції в максимумі моно- мерної смуги £0 зменшується на 30—50 % по рівняно з едМФА і становить для різних барвників від 0,57 105 до 0,94 105 M ' W 1 . По-друге, в спектрах 171 Л У К А Ш О В С. С. ТА Ш . Таблиця 1 Характеристики спектрів поглинання бортиків у вільному стані та в присутності ДНК, РНК і БСА 172 В З А Є М О Д І Я Ц І А Н І Н О В И Х Б А Р В Н И К І В З Н У К Л Е Ї Н О В И М И КИСЛОТАМИ Рис. 1. Спектри поглинання вільних барвників у буфері: У Cyan 45; 2 — Cyan CPent; З •— Cyan £tBu; 4 — Cyan 2 з являється смуга поглинання агрегатів з максиму мом, гіпсохромно зсунутим на 35—46 нм від мак симуму мономерної смуги. Для агрегатних смуг різних барвників значення е0 знаходяться в ін тервалі від 0,29-10 5 М~ W 1 до 0,7-10 5 M ' W 1 (табл. 1). У спектрі поглинання Cyan CPent, окрім того, з'являється третя смуга при 712 нм (рис. 1), пов'язана, ймовірно, з утворенням у розчині / -аг регатів барвника. Про це свідчить, зокрема, довго хвильовий зсув цієї смуги відносно мономерної та її вузький контур. Барвники в присутності нуклеїнових кислот та білка. В присутності ДНК, РНК та БСА спект ри поглинання досліджуваних барвників зазнають змін порівняно із спектрами вільних барвників, за винятком Cyan /?tBu, спектри якого в присутності НК та білка ідентичні спектрові вільного барвника. Загальною рисою спектрів досліджуваних барв ників у присутності ДНК (рис 2) та РНК є батохромний зсув максимумів поглинання (від повідно £ д н к та £ Р Н К ) відносно е0. Цей зсув має місце як для мономерних, так і для агрегатних максимумів, не перевищує 15 нм і, очевидно, є наслідком зменшення нуклеофільності близького оточення хромофорів в утворених НК-комплексах [4]. При цьому коефіцієнти екстинкції максимумів агрегатних та мономерних смуг у спектрах погли нання змінюються по-різному. В спектрах Cyan 45, Cyan 2, Cyan / Ш , Cyan pPr і Cyan CPent еРЖ мономерної та агрегатної смуг зменшуються по рівняно з є0 (рис 2). В спектрах Cyan £іРг і Cyan /?Ph £ Р Н К мономерної смуги зменшується, а е Р Н К агрегатної — зростає. Значення £ д н к мономерної смуги збільшується, а агрегатної — спадає в спект рах Cyan 2, Cyan £Et і Cyan £Рг. Для Cyan £iPr і Cyan /?Ph спостерігається зворотна картина, а в спектрі поглинання Cyan CPent є д н к мономерної та агрегатної смуг зростає. В спектрі Cyan CPent, крім того, в присутності НК зникає /-агрегатна смуга (рис. 2). У Cyan 45 £ д н к мономерної та агрегатної смуг зменшуються порівняно з £ 0, і в короткох вильовій частині спектрів поглинання цього барв ника в присутності ДНК і РНК з'являється третя смуга (відповідно на 453 і 485 нм, тобто зсунуті відповідно на 104 та 74 нм у короткохвильовий бік відносно мономерної смуги). У спектрах Cyan /?Et і Cyan /?іРг у присутності ДНК з'являється смуга («588 нм), яка зсунута в довгохвильовий бік відносно мономерної (на 41 нм для Cyan /їіРг і на 48 нм для Cyan /?Et) та відсутня як у спектрах цих барвників у присутності РНК і БСА, так і в спектрах вільних барвників (рис 3). Значення е д н к цієї смуги у випадку Cyan /?Et невелике (1,3 104 МҐсм"1, що в 7 разів менше за £ д н к мономерної смуги), а для Cyan /?іРг коефі цієнти екстинкції мономерної та «довгохвильової» смуг є порівнянними за величиною (відповідно 4,8-10 4 та 3,5-10 4 M"W). Спектри поглинання барвників у присутності БСА подібні до спектрів вільних барвників і від різняються лише невеликими (до 2 нм) зсувами максимумів смуг та незначними (±15 %) коливан- ,2' 400 500 600 700 X, нм Рис 2. Спектри поглинання вільних барвників у буфері (У—І) та барвників у присутності ДНК (/'—і'): У, / ' — Cyan /ЙРг; 2, 2' — Cyan CPent; 5, 3' — Cyan 2 173 ЛУКАШОВ С. С. ТА Ш. £ 10'5 М1 СМ Іфя, В . 0 . Рис. 3. Спектри поглинання та випромінювання барвника Cyan /?іРг: / , / ' — вільний барвник у буфері; 2, 2' — барвник у присутності ДНК; 7, 2 — спектри поглинання (ліва вісь); /', 2' — спектри флюоресценції (права вісь; інтенсивність у від носних одиницях; спектр 2' зменшено в 20 разів) нями значення молярного коефіцієнта екстинкції £ Б С А ВІДНОСНО £ 0 . Флюоресцентні властивості барвників. Ха рактеристики спектрів флюоресценції барвників у вільному стані та в присутності НК та білка пред ставлено в табл. 2. Вільні барвники. Водні розчини досліджуваних барвників мають близькі значення довжин хвиль максимумів випромінювання (Я0) в інтервалі від 568 до 581 нм. Виняток становлять Cyan CPent, для якого Я0 дорівнює 622 нм, і Cyan /?tBu, який взагалі не має чітко виділеного максимуму флюо ресценції. Інтенсивність випромінювання вільних замі щених барвників / 0 невисока (0,04—2,2 відносних одиниць (в. о.)) і значно менша за інтенсивність випромінювання незаміщеного Cyan 45 (70 = 8,1 в. о.). Значення стоксового зсуву лежить у межах від 28 до 36 нм, а для барвника Cyan 45 стоксів зсув рівний 18 нм. Барвники в присутності НК. Загальною рисою спектрів флюоресценції досліджуваних барвників у присутності ДНК і РНК є невеликий зсув макси муму мономерної смуги випромінювання в довго хвильовий бік (значення довжин хвиль максимумів Я Д Н І С і Я р н к на 2—13 нм змінюється порівняно з Я 0). Винятком є лише Cyan /їіРг, для якого Я д н к зсу вається в короткохвильовий бік на 4 нм, та Cyan jStBu, який у присутності НК та білка, як і у вільному вигляді, не має чітко виділеного максиму му випромінювання. Присутність НК помітно збільшує інтенсив ність випромінювання всіх заміщених барвників, окрім Cyan /StBu. Відношення інтенсивності моно мерної смуги флюоресценції барвника в присут ності ДНК і РНК до інтенсивності флюоресценції вільного барвника (відповідно Ітк/І0 та ІРНК/І0) має різні значення. Так, для Cyan 2 спостеріга ється високе значення співвідношення / д н к / ^ 0 (65,0), тоді як рівень флюоресценції Cyan 45 і Cyan /?tBu практично не змінюється (Ітк/І0 рівне відповідно 1,06 та 1,75). Для решти барвників співвідношення /днк/^о м а є значення від 6,0 до 16,7. Значення IFliK/I0 досить високе для Cyan 2 (76,0) і Cyan /?іРг (48,7), для Cyan 45 і Cyan £tBu воно низьке (1,94 та 1,75 відповідно), а для решти барвників лежить в інтервалі від 6,5 до 28,0. Слід зазначити, що для Cyan 2 і Cyan CPent / д н к та / Р Н І С приблизно рівні, а для Cyan /?Et, Cyan /?Рг, Cyan >SiPr і Cyan /?Ph / Р Н К перевищує / д н к у 2—3 рази. У спектрах флюоресценції Cyan /?Et, Cyan /?Рг і Cyan piPr у присутності ДНК зафіксовано другу смугу, зсунуту на 23—35 нм у довгохвильовий бік відносно мономерної (рис 3). Відношення інтен сивності цієї смуги до мономерної становить 1,2 для Cyan /?іРг, 1,1 — для Cyan £Рг та 0,9 —- для Cyan / Ш . За допомогою спектрів збудження флюорес ценції встановлено, що для Cyan /?іРг і Cyan /?Et ця довгохвильова смуга флюоресценції відповідає сму зі поглинання при 588 нм. Для Cyan /?Рг спектр збудження також вказує на існування подібної смуги поглинання, але в спектрі поглинання вона чітко не виділяється. Можливо, до появи цих смуг призводить утворення /-агрегатних комплексів барвника з подвійною спіраллю ДНК, на зразок тих, що спостерігалися для ДНК-комплексу псев- доізоціаніну [20]. Іншою причиною може бути одночасна фіксація у ДНК-комплексах окремих конформерів цих барвників у співвідношенні, від мінному від того, що існує в рівновазі у розчинах вільних барвників [13]. Випромінювання барвників у присутності біл ка. В присутності БСА для всіх барвників (крім Cyan /?tBu) спостерігається зсув положення макси мумів флюоресценції (ЯБ С А) на 5-—13 нм у довго хвильовий бік відносно Я0. Зростання інтенсивності флюоресценції порівняно з І0 ( / Б С А / Л > ) ДОСИТЬ висо ке для Cyan /?Ph — 16,9 і менше для решти барв ників — 1,75—6,9. При цьому слід зазначити, що для Cyan CPent / Б С А приблизно рівне / д н к та / Р Н К , а для Cyan /?Ph / Б С А за значенням близьке до / Р Н К і майже втричі перевищує / д н к . Досліджувані барвники як можливі флюорес центні зонди для визначення ДНК. КЦ виявляють 174 В З А Є М О Д І Я Ц І А Н І Н О В И Х Б А Р В Н И К І В З Н У К Л Е Ї Н О В И М И КИСЛОТАМИ Таблиця 2 Характеристики спектрів флюоресценції барвників у присутності нуклеїнових кислот і білка певну спорідненість до НК. Про це свідчать на ступні явища. По-перше, в спектрах поглинання представлених барвників у присутності НК спо стерігається батохромний зсув максимумів погли нання до 15 нм (табл. 1), що, як правило, від бувається при збільшенні гідрофобності близького оточення барвника [4 ]. По-друге, в спектрах біль шості з барвників відбувається зменшення інтен сивності агрегатних смуг поглинання (рис. 3). От же, для барвників у водному розчині взаємодія з НК є не менш вигідною, ніж агрегування. По- третє, в присутності НК рівень флюоресценції всіх барвників, за винятком Cyan 45 і Cyan /?tBu, значно збільшується, що є наслідком фіксації флю- орофорів у НК-комплексах, утворених з достатнім виграшем енергії (табл. 2). Як уже зазначалося, основною перешкодою для застосування КЦ у гомогенній детекції НК є висока інтенсивність їхнього випромінювання у не зв'язаному з НК стані. Заміщення в ПЛ значно зменшило рівень власного випромінювання тіа карбоціаніну (табл. 2). В комплексі з НК інтен сивність випромінювання заміщених барвників зро стає і не лише досягає, а й перевищує інтенсивність випромінювання незаміщеного Cyan 45. При цьому розмір замісника має дуже важливе значення, що випливає з порівняння / д н к серії ^в-заміщених тіа- карбоціанінів. Так, метильна група не тільки не заважає, а, навпаки, сприяє жорсткій фіксації пло скої конформації флюорофора в ДНК-комплексі, про що свідчать високі значення та ІРНК/І0 (відповідно 65 та 76). Для барвників з первинними замісниками біль ших розмірів етил- та я-пропіл- спостерігаються вдвічі менші значення / д н к та / Р Н к і менші значення ^днк/Л) т а L?nJh (табл. 2). Приблизно такі ж значення Іж та Іж/І0 (табл. 2) спостерігаються і для /?-феніл-заміщеного барвника, що обумовлено 175 Л У К А Ш О В С. С. ТА IH. плоскою будовою фенільного залишку, який зай має менший об'єм, ніж вторинні алкільні замі сники. Вторинна /?і-гзо-пропільна група створює вже надмірні просторові перешкоди, так що навіть висока спорідненість до НК, яка проявляється у високих значеннях Ітк/І0 (16,0—20,7) та ІРШ/І0 (48,7), недостатня для фіксації плоскої конфор мації, і такий барвник має низький рівень вип ромінювання і в комплексах з НК (/Днк = 2,5—3,1, а / р н к ^ ^ З ) . Розмір mpem-бутильного замісника вже настільки великий, що з сильно ускладненої ди-цис-(EZZE) -конформації [13] його не здатні вивести ні присутність у розчині білка, ні взаємодія з НК, оскільки форма смуги поглинання та ін тенсивність флюоресценції залишаються практично незмінними (табл. 1 і 2). КЦ порівняно з монометиновими ціанінами мають дещо більшу схильність до неспецифічної взаємодії з біомолекулами, а також є чутливішими до в'язкості середовища. Для досліджених КЦ зна чення IBCJIQ В середньому більше тих, що спо стерігалися в аналогічному білковому розчині для більшості монометинів [21 ], а для Cyan /?Ph і Cyan CPent воно взагалі перевищує приріст інтенсив ності випромінювання в присутності НК (табл. 2). Проте для решти барвників, зважаючи на високу концентрацію білка, рівень випромінювааня КЦ у присутності білка можна вважати допустимим. Так, для Cyan 2 / д н к та / Р Н К на порядок перевищу ють / Б С А . Висока інтенсивність флюоресценції ДНК- та РНК-комплексів, її приріст майже на два порядки при зв'язуванні, максимум поглинання понад 500 нм роблять барвник Cyan 2 перспективним для використання у флюоресцентній детекції НК. Вве дення замісників до ПЛ ціанінів відкриває шлях до отримання цілої низки нових флюоресцентних НК- зондів з максимумами поглинання в більше 500 нм. S. S. Lukashov, М. Yu. Losytskyy, Yu. L Slominskii, S. M. Yarmoluk Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. 7. Carbocyanine dyes, substituted in polymethine chain, as possible probes for fluorescent nucleic acid detection Summary To extend the application of carbocyanine dyes in fluorescent nucleic acid detection, the use of dyes substituted in a polymethine clmin is proposed. A series of thiacarbocyanine derivatives with alky I substituents in a polymethine chain have been synthesized, and the spectral luminescent properties of dyes in the presence of double- stranded DNA, RNA and bovine serum albumin (BSA) have been examined. The intrinsic fluorescence of all derivatives prepared is lower than that of unsubstituted thiacarbocyanine. The dyes show 1.75-76-fold fluorescence enhancement in the presence of nucleic acids. Lower enhancement (1.75-16.9 times) takes place in the presence of large excess of BSA. The highest fluorescence intensity for dye-nucleic acid complexes is observed for the i-methyl- substituted dye that is more than two times higher as compared to thiacarbocyanine. The substituents larger than methyl group disturb the planarity of thiacarbocyanine fluorophore excessively, and the fluorescence intensities of nucleic acid complexes of corresponding dyes are lower. С. С. Лукаиюв, M. Ю. Лосщкий, Ю. Л. Сломинский, С. М. Ярмолюк Взаимодействие цианиновых красителей с нуклеиновыми кислотами. 7. Карбоцианиновые красители с заместителями в полиметиновой цепи как потенциальные зонды для флюоресцентной детекции нуклеиновых кислот Резюме В целях расширения использования карбоцианиновых красите лей для гомогенного флюоресцентного обнаружения нуклеино вых кислот (НК) предложено использование красителей с заместителями в полиметиновой цепи. Синтезирован ряд алкил-замещенных производных тиакарбоцианина; исследова ны их спектрально-люминесцентные характеристики в при сутствии двухцепочечной ДНК, РНК и бычьего сывороточного альбумина (БСА). Уровень собственной флюоресценции у всех полученных производных ниже, чем у исходного красителя. В присутствии НК наблюдается увеличение интенсивности из лучения в 1,75—76 раз, в то время как уровень излучения незамещенного красителя повышается незначительно (1,08— 1,94 раза). Меньшее увеличение флюоресценции (1,75—16,9 раза) имеет место в присутствии большого избытка БСА. Максимальная интенсивность, вдвое превышающая таковую тиакарбоцианина, наблюдается для НК-комплексов ($-метил- замещенного красителя. Заместители больших, чем металь ная группа, размеров вызывают избыточные нарушения пла- нарности тиакарбоцианинового флюорофора, что приводит к уменьшению интенсивности излучения НК-комплексов соот ветствующих красителей. ПЕРЕЛІК ЛІТЕРАТУРИ 1. Haugland R. P. Handbook of fluorescent probes and research chemicals.—Eugene: OR, 1996.—680 p. 2. Deligeorgiev T. G. Molecular probes based on cyanine dyes for nucleic acid research / / Near-Infrared Dyes for High Technol ogy Applications. NATO ASI / Eds S. Daehne, U. Resch- Genger, O. S. Wolfbeis.—Kluwer: Acad, publ., 1998.— P. 125—139. 3. Mayer A., Neuenhofer S. Luminescent labels — more than just an alternative to radioisotopes! / / Angew. Chem. Int.—1994.— 33.—P. 1044—1072. 4. Ищенко А. А. Строение и спектрально-люминесцентные свойства полиметиновых красителей.—Киев: Наук, думка, 1994.—232 с. 5. Mujumdar R. В., Ernst L. A., Mujumdar S. R., Lewis С. J., Waggoner A. S. Cyanine dye labeling reagents: sulfoindocar- bocyanine succinimidyl esters / / Bioconjugate Chem.— 1993.—4, N 2.—P. 105—111. 6. Yu H, Chao J., Patek D., Mujumdar R., Waggoner A. Cyanine dye dUTP analogs for enzymatic labeling of DNA probes / / Nucl. Acids Res.—1994.—22, N 15.—P. 3226— 3232. 7. Zhu Z., Chao J., Yu H., Waggoner A. S. Directly labeled DNA probes using fluorescent nucleotides with different lenght linkers / / Nucl. Acids Res.—1994.—22, N 16.—P. 3418— 3422. 8. Van Hooijdonk С. A. E. M., Glade C. P., Van Erp P. E. J. 176 В З А Є М О Д І Я ЦІАНІНОВИХ Б А Р В Н И К І В З Н У К Л Е Ї Н О В И М И КИСЛОТАМИ TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for Propidium iodide in multiparameter flow cytometry / / Cytometry.—1994.—17.—P. 185—189. 9. Milanovich N., Sun M.y Jankowiak R. Binding of TO-PRO-3 and TOTO-3 to DNA: Fluorescence and hole-burning studies / / J. Phys. Chem.—1996.—100, N 21.—P. 9181—9186. 10. Glazer A. N., Mathies R. A. Energy-transfer fluorescent reagents for DNA analyses / / Current Opin. Biotechnol.— 1997.—8, N 1.—P. 94—102. W.Benson S. C , Mathies R. A., Glazer A. N Heterodimeric DNA-binding dyes designed for energy transfer: Stability and application of the DNA complexes / / Nucl. Acids Res.— 1993.—21, N 24.—P. 5720—5726. 12. Benson S. C, Singh P., Glazer A. N. Heterodimeric DNA- binding dyes designed for energy transfer: Synthesis and spectroscopic properties / / Nucl. Acids Res.—1993.—21, N 24.—P. 5727—5735. 13. Tyutyulkov N., Fabian /., Mehlhorn A., Dietz F., Tadjer A. Polymethine dyes. Structure and properties.—Sofia: St. Kli- ment Ohridsky Univ. press, 1991.—250 p. 14. Yarmoluk S. M., Kovalska V. В., Lukashov S. S., Slominskii Y. L Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. XII. ^-substituted carbocyanines as possible fluorescent probes for nucleic acid detection / / Biol, and Med. Chem. Lett.—1999.— 9, N 12.—P. 1677—1678. 15. Hamer F. M. The cyanine dyes and related compounds / / The chemistry of heterocyclic compounds. XVIII.—New York; Lon don: J. Willey, 1964.—790 p. 16. Brooker L. G. S., White F. L. Studies in the cyanine dye series. II. Carbocyanines with substituents in the three carbon chain / / J. Amer. Chem. Soc—1935.—57.—P. 2480—2488. 17. Уиіенко И. К. а, у-полиметилентиакарбоцианины / / Укр. хим. журн.—1948.—14, № 1.—С. 50—72. 18. Maniatis Т., Fritsch Е. F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual.—New York: Cold Spring Harbor Lab. publ., 1982.—458 p. 19. Органикум / Пер. с нем.—M.: Мир, 1992.—Т. 2 . - 4 7 4 с. 20. Norden В., Tjerneld F. Optical studies on complexes between DNA and pseudoisocyanine / / Biophys. Chem.—1977.—6.— P. 31—45. 21. Лукаишв С. С , Лосицький М. Ю., Ярмолюк С. М., Сломінський Ю. Л. Взаємодія ціанінових барвників з нук леїновими кислотами. 12. Нові монометинові ціаніни на основі 5,6-метилендіоксибензотіазолу та спектрально-люмі несцентні властивості їхніх комплексів з нуклеїновими кислотами / / Биополимеры и клетка.—2000.—16, № 6.— С. 562—572. УДК 535.372 Надійшла до редакції 17.06.99 177

Репозитарії

Схожі ресурси