Перебудови рослинного геному в культурі клітин in vitro

Перебудови рослинного геному в культурі клітин in vitro

Підсумовано результати багаторічних досліджень геному рослинних клітин у культурі in vitro — одного з напрямків наукової роботи відділу генетики клітинних популяцій ІМБіГ HAH України. Отримані результати свідчать про наявність спільних рис перебудов геному в рослинних клітинах in vitro та при еволюц...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Datum:2004
Hauptverfasser: Андреев, І.О., Спірідонова, К.В., Кунах, В.А.
Format: Artikel
Sprache:Ukrainian
Veröffentlicht: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2004
Schriftenreihe:Біополімери і клітина
Schlagworte:
Ювілеї
Online Zugang:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154909
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Перебудови рослинного геному в культурі клітин in vitro / І.О. Андреев, К.В. Спірідонова, В.А. Кунах // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 1-2. — С. 42-49. — Бібліогр.: 18 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-154909
record_format dspace
spelling irk-123456789-1549092019-06-17T01:25:53Z Перебудови рослинного геному в культурі клітин in vitro Андреев, І.О. Спірідонова, К.В. Кунах, В.А. Ювілеї Підсумовано результати багаторічних досліджень геному рослинних клітин у культурі in vitro — одного з напрямків наукової роботи відділу генетики клітинних популяцій ІМБіГ HAH України. Отримані результати свідчать про наявність спільних рис перебудов геному в рослинних клітинах in vitro та при еволюції рослин у природі при видоутворенні. Зокрема, геномна гетерогенність клітинних популяцій в культурі in vitro на цитологічному рівні визначається особливостями формування геному в процесі еволюції. З іншого боку, виявлено кореляцію між перебудовами окремих послідовностей ДНК в культурі клітин та їхньою міжвидовою варіа­бельністю в інтактних рослинах. Все це дозволяє припустити існування певних загальних закономірностей, які визначають характер і спрямованість перебудов рослинного геному в культурі клітин in vitro та в процесі видоутворення. Використання культури рослинних клітин, зважаючи на значні темпи мутацій у порівнянні з інтактними рослинами, відкриває нові перспективи для вивчення еволюції геному. The paper summarizes the results of long-term investigation in vitro on the plant cells genome, which is the focus of research in the Department of Cell Population Genetics of IMBG NASU. The data obtained evidence the common features in the genome rearrangement pattern exhibited by plant cells in vitro and during natural speciation. In particular, the genome heterogeneity of cell populations in culture at the cytological level seems to be determined by the peculiarities of genome formation in the course of evolution. On the other hand, the correlation between rearrangements of specific DNA sequences in cell culture and their interspecies variations in intact plants has been found. Altogether the data allow to suggest that there are common principles determining the pattern and trends of the plant genome rearrangements in cell culture in vitro and during speciation. Therefore, given considerable mutation rate as against the intact plants, plant cell culture open new vistas for genome evolution research. Подведены итоги многолетних исследований генома расти­тельных клеток in vitro — одного из направлений научной работы отдела генетики клеточных популяций ИМБиГ НАН Украины. Полученные результаты свидетельствуют о нали­чии общих черт в перестройках генома растительных клеток in vitro и при эволюции растений в природе при видообразова­нии, В частности, геномная гетерогенность клеточных попу­ляций в культуре in vitro на цитологическом уровне обусловле­на особенностями формирования генома в процессе эволюции, С другой стороны, обнаружена корреляция между перестройка­ми отдельных последовательностей ДНК в культуре клеток и их межвидовой вариабельностью в интактных растениях. Все это позволяет предположить существование определенных общих закономерностей, определяющих характер и направле­ность перестроек растительного генома в культуре клеток in vitro и в процессе видообразования. Использование культуры растительных клеток, учитывая значительные темпы мута­ций по сравнению с интактными растениями, открывает новые перспективы для изучения эволюции генома. 2004 Article Перебудови рослинного геному в культурі клітин in vitro / І.О. Андреев, К.В. Спірідонова, В.А. Кунах // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 1-2. — С. 42-49. — Бібліогр.: 18 назв. — укр. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.00068E http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154909 575.2 + 577.113:576.5 uk Біополімери і клітина Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Ukrainian
topic Ювілеї
Ювілеї
spellingShingle Ювілеї
Ювілеї
Андреев, І.О.
Спірідонова, К.В.
Кунах, В.А.
Перебудови рослинного геному в культурі клітин in vitro
Біополімери і клітина
description Підсумовано результати багаторічних досліджень геному рослинних клітин у культурі in vitro — одного з напрямків наукової роботи відділу генетики клітинних популяцій ІМБіГ HAH України. Отримані результати свідчать про наявність спільних рис перебудов геному в рослинних клітинах in vitro та при еволюції рослин у природі при видоутворенні. Зокрема, геномна гетерогенність клітинних популяцій в культурі in vitro на цитологічному рівні визначається особливостями формування геному в процесі еволюції. З іншого боку, виявлено кореляцію між перебудовами окремих послідовностей ДНК в культурі клітин та їхньою міжвидовою варіа­бельністю в інтактних рослинах. Все це дозволяє припустити існування певних загальних закономірностей, які визначають характер і спрямованість перебудов рослинного геному в культурі клітин in vitro та в процесі видоутворення. Використання культури рослинних клітин, зважаючи на значні темпи мутацій у порівнянні з інтактними рослинами, відкриває нові перспективи для вивчення еволюції геному.
format Article
author Андреев, І.О.
Спірідонова, К.В.
Кунах, В.А.
author_facet Андреев, І.О.
Спірідонова, К.В.
Кунах, В.А.
author_sort Андреев, І.О.
title Перебудови рослинного геному в культурі клітин in vitro
title_short Перебудови рослинного геному в культурі клітин in vitro
title_full Перебудови рослинного геному в культурі клітин in vitro
title_fullStr Перебудови рослинного геному в культурі клітин in vitro
title_full_unstemmed Перебудови рослинного геному в культурі клітин in vitro
title_sort перебудови рослинного геному в культурі клітин in vitro
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate 2004
topic_facet Ювілеї
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154909
citation_txt Перебудови рослинного геному в культурі клітин in vitro / І.О. Андреев, К.В. Спірідонова, В.А. Кунах // Біополімери і клітина. — 2004. — Т. 20, № 1-2. — С. 42-49. — Бібліогр.: 18 назв. — укр.
series Біополімери і клітина
work_keys_str_mv AT andreevío perebudoviroslinnogogenomuvkulʹturíklítininvitro
AT spírídonovakv perebudoviroslinnogogenomuvkulʹturíklítininvitro
AT kunahva perebudoviroslinnogogenomuvkulʹturíklítininvitro
first_indexed 2025-07-14T06:58:08Z
last_indexed 2025-07-14T06:58:08Z
_version_ 1837604577017331712
fulltext ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2004. Т. 20. № 1-2 Перебудови рослинного геному в культурі клітин in vitro І. О. Андреев, К. В. Спірідонова, В. А. Кунах Інститут молекулярної біології і генетики HAH України Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, 03143, Україна Підсумовано результати багаторічних досліджень геному рослинних клітин у культурі in vitro — одного з напрямків наукової роботи відділу генетики клітинних популяцій ІМБіГ HAH України. Отримані результати свідчать про наявність спільних рис перебудов геному в рослинних клітинах in vitro та при еволюції рослин у природі при видоутворенні. Зокрема, геномна гетерогенність клітинних популяцій в культурі in vitro на цитологічному рівні визначається особливостями формування геному в процесі еволюції. З іншого боку, виявлено кореляцію між перебудовами окремих послідовностей ДНК в культурі клітин та їхньою міжвидовою варіа­ бельністю в інтактних рослинах. Все це дозволяє припустити існування певних загальних закономірностей, які визначають характер і спрямованість перебудов рослинного геному в культурі клітин in vitro та в процесі видоутворення. Використання культури рослинних клітин, зважаючи на значні темпи мутацій у порівнянні з інтактними рослинами, відкриває нові перспективи для вивчення еволюції геному. Ще наприкінці XIX століття вчені робили спроби штучно вирощувати окремі частини рослин. Але сплинуло чимало часу, поки було відпрацьовано умови для ізольованого росту рослинних тканин та окремих клітин in vitro. Лише в 30-х роках XX ст. Філіп Уайт у США [1 ] та Роже Готре у Франції [2 ] довели можливість необмеженого в часі культи­ вування ізольованих рослинних тканин на штуч­ них живильних середовищах. Цим дослідникам на­ лежить пальма першості в розробці живильних середовищ (класичних), придатних для тривалого культивування (деякі з них використовуються ще й нині), та в отриманні пасивованих культур. Саме з того часу почався стрімкий розвиток нового на­ прямку в експериментальній біології — культури ізольованих тканин і клітин рослин. Подібні дослідження спочатку були спрямовані переважно на розробку оптимального складу жи­ вильних середовищ та умов культивування, пошук речовин — регуляторів росту і розвитку. З іншого боку, розвиток методів культури ізольованих ор­ ганів, тканин та клітин поступово відкривав нові можливості використання цих об'єктів для фунда­ ментальних досліджень, зокрема, моделювання © І- О АНДР€:€В, К, В. СПІРІДОНОВА, В. А. КУНАХ, 2004 процесів, що відбуваються в інтактних рослинах, а також для створення нових біотехнологій. На да­ ний час культуру клітин та тканин рослин вивча­ ють у трьох напрямках: для визначення особливо­ стей розвитку культури як унікального біологіч­ ного об'єкта; як модель у фізіології і біохімії рослин та як інструмент для різноманітних біотех­ нологій. Історія розвитку досліджень у нашому відді­ лі — відділі генетики клітинних популяцій — зде­ більшого відбиває особливості розвитку напряму в цілому. Зацікавленість культурою тканин була обумовлена, в першу чергу, новими можливостями, які відкривав цей новий унікальний об'єкт, прин­ ципово відмінний від інтактної рослини. Ізоляція клітин і перенесення в умови in vitro призводить до їхнього виходу з-під контролю організму, до складу якого вони входили раніше. Умови і характер живлення клітин також зазнають істотних змін. Ці впливи є стресовими і спричинюють кардинальні перебудови функцій і метаболізму клітин, значне підвищення рівня геномної мінливості. Таким чи­ ном, в результаті введення клітин вищих рослин в умови in vitro утворюється нова біологічна система, її особливостями є часткова або повна відсутність контролю організму за ростом і розвитком клітин. 42 ПЕРЕБУДОВИ РОСЛИННОГО ГЕНОМУ В КУЛЬТУРІ КЛІТИН IN VITRO Крім того, певна частина генетичного матеріалу внаслідок зміни умов існування виявляється неза- лученою і перебудови, які в ній відбуваються, можуть накопичуватися в геномах культивованих клітин, оскільки вони не впливають на їхню життє­ здатність in vitro. Дослідження особливостей розвитку клітин та тканин в умовах ізольованого росту на штучних живильних середовищах і стало основним напрям­ ком наукової діяльності відділу. Крім того, продов­ жувалася активна робота, спрямована на пошук оптимальних умов для введення клітин у культуру in vitro, отримання пасивованих калюсних культур та регенерації з них рослин. Поряд з цим у відділі розвивався і біотехнологічний аспект використання культивованих рослинних клітин — проведено до­ сліди із створення на основі калюсних тканин лікарських рослин високопродуктивних штамів — продуцентів цінних біологічних речовин. Особливості геномної мінливості культивова­ них клітин на хромосомному рівні вивчали із залученням широкого спектра видів вищих рос­ лин — представників різних родин. Серед об'єктів вивчення були, зокрема, гаплопапус, скереда, тю­ тюн, томат, горох, кукурудза, а також лікарські рослини: раувольфія зміїна, женьшень, родіола ро­ жева, мак приквітниковий, рута запашна, унгернія Віктора, арнебія барвна та ін. Крім того, на моле­ кулярному рівні досліджували перебудови ДНК у різних клітинних штамах скереди (Crépis capillaris) та раувольфії (Rauwolfia serpentina та R. verti- cillata). Узагальнення, зроблені на основі отрима­ них результатів, дозволили виявити головні риси адаптації рослинних тканин та клітин до умов ізольованого росту in vitro. При введенні рослинних клітин у культуру in vitro на перших етапах культивування експланта на штучних живильних середовищах відбувається індукція первинного калюсу, для клітин якого не характерні ознаки диференціації та риси тканинної організації, властиві вихідній тканині. Первинний калюс вирізняється неорганізованим типом росту. Гетерогенність клітин у культурі, яка виявляється в цей час, обумовлена переважно варіабельністю вихідних клітин експлантата за гістологічними, генетичними (наприклад, за рівнем плоїдності) та фізіологічними (фаза клітинного циклу) показни­ ками, її можна пояснити характером диференціації кожної окремої клітини, а також її взаємодією з довкіллям, включаючи інші клітини та компоненти живильного середовища [3 ]. У процесі тривалого культивування клітин в умовах in vitro формується клонова популяція, у якій роль організмів виконують окремі клітини [4 ]. Вихідні клітини інтактних багатоклітинних орга­ нізмів не запрограмовані на виконання цих функ­ цій. Таким чином, культивовані клітини вищих рослин є штучно створеними популяціями, голо­ вною особливістю яких є висока гетерогенність та мінливість на анатомогістологічному, цитоморфо- логічному, цитогенетичному, біохімічному рівнях. Конкретні чинники, механізми, рівень та особли­ вості цієї мінливості досить різноманітні. Геномні реорганізації, які спостерігаються у сформованих (культивованих більше року) клітинних штамах, часто мають переважно каналізований характер, що може свідчити про певну спільність механізмів еволюції геному рослин у природі в процесі видо­ утворення і в культурі in vitro протягом адаптації клітин до умов ізольованого росту [5 ]. Наприклад, у родині Solanaceae багато видів родів Nicotiana, Solanum, Lycopersicon та інших виникли в результаті поліплоїдії. І в культурі клітин цих видів геномна мінливість — це пере­ важно мінливість числа хромосом, яка має широ­ кий розмах і сягає високих рівнів плоїдності (рис 1). Якщо ж взяти види роду Crépis, то вони відрізняються переважно морфологією хромосом, а поліплоїдія тут зустрічається рідше. Проведений у відділі аналіз каріотипічної мінливості культивова­ них in vitro біля 10 років клітин С. capillaris показав, що їхня геномна мінливість — це, перш за все, зміна морфології хромосом. В результаті, за­ вдяки головним чином перманентному існуванню циклу мостів, каріотип переважаючої кількості клі­ тин невпізнанно змінюється. Однак серед перебудо­ ваних каріотипів переважали такі, що нагадували за морфологією окремі хромосоми і навіть каріо­ типи інших видів роду Crépis, а саме — С. pulchra, С. parviflora, С. alpina, С. rhoeadifolia, С. kots- chyana та ін. (рис 2) [5 ]. Крім того, певний внесок у гетерогенність по­ пуляцій культивованих клітин на цитологічному рівні роблять тип і рівень диференціації тканини, використаної в ролі експлантата: від особливостей диференціації протягом онтогенезу рослини зале­ жать рівень та спектр геномних перебудов у кліти­ нах вихідного експлантата [6, 7 ]. Дослідження ДНК, виділеної з культури рос­ линних клітин, дозволили виявити, які саме ділян­ ки геному в першу чергу піддаються перебудовам in vitro на молекулярному рівні. Суттєві результати отримано при вивченні ДНК штамів культивова­ них клітин і інтактних рослин R. serpentina та С. capillaris [8, 9] . При дослідженні кінетики ре- асоціації ДНК калюсів і рослини R. serpentina виявлено, що в геномах клітинних штамів, культи­ вованих in vitro близько 20 років, має місце зміна 43 АНДРЄЄВ І О., СПІРЩОНОВА К В., КУНАХ В. А. 16п=192 Рис. 1. Клітини з різними числами хромосом у культурі тканин томата Ьусорегзісоп езсиїепіит (2/і - 24). Незалежно від рівня плоїдності клітин вихідного експлантата (використовували гаплоїдні, диплоїдні та тетраплоїдні форми рослин) у популяції культивованих клітин розмах мінливості за числом хромосом був у межах від < п до > 32« Рис. 2. Культивовані клітини скереди Crépis capillaris з нормальним (а) та перебудованими каріотипами (б—е) 44 ПЕРЕБУДОВИ РОСЛИННОГО ГЕНОМУ В КУЛЬТУРІ КЛІТИН IN VITRO г г <0,02 0,02-0,1 0,1-0,5 0,5-30 30-300 300-1000 1000-3000 >3000 Рис. 3. Зміни різних фракцій повторюваних послідовностей у клітинах R. serpentina іп vitro: а — розподіл ДНК інтактної рослини та культивованих клітин по фракціях залежно від швидкості реасоціації (С 0 0 (1 — інтактна рослина; 2 — культивовані клітини); б — блот-гібридизація ДНК інтактних рослин R. verticillata (У); R. serpentina (2); R. caffra (4); R. vomitoria (5); R. canescens (6); R. chinensis (7) та тривало культивованих клітин R. serpentina (3), гідролізованих HindIII, з 3 2Р-міченою фракцією ДНК, яка миттєво реасоціює, культивованих іп vitro близько 20 років клітин R. serpentina. Кількість ДНК, нанесеної на доріжку, становить 10 мкг 1 2 3 4 1 2 9б±3 100 83+2 33+2 % 14+3 100% а б Рис. 4. Перебудови фракції помірних повторів у культивованих клітинах R. serpentina: а — дот-гібридизація ДНК інтактних рослин R. verticillata (У); R. serpentina (2) та культивованих клітин R. serpentina (первинний (3) і культивований понад 20 років {4) калюси) з фракцією 3 2Р-мічених повторів інтактної рослини R. serpentina; б — дот-гібридизація ДНК інтактної рос­ лини та культивованих понад 7 років клітин Crépis capillaris з фракцією 3 2Р-мічених повторів культивованих клітин С. ca­ pillaris копійності окремих фракцій повторюваних послі­ довностей, зокрема, збільшення частки повторів, які швидко реасоціюють ( С 0 ґ < 0 , 1 ) (рис. З, а). Блот-гібридизація фракції повторів, які мит­ тєво реасоціюють (С 0 г< 0,001) , виділених з трива­ ло культивованого штаму клітин R. serpentina, з ДНК інтактних рослин різних видів роду Rauwolfia виявила суттєві перебудови, які виражаються у появі якісно нових, відмінних від наявних у геномі інтактних рослин, повторюваних послідовностей [8] (рис. З, б). Отримані дані можна пояснити ампліфікацією в культурі in vitro певної частини послідовностей, наявних в інтактній рослині в не­ значній кількості, хоча не виключаються й інші типи перебудов. Порівняльний аналіз повторюваних послідов­ ностей (фракція помірних повторів C0t < 100) мето­ дом дот-гібридизації у клітинних штамах R. ser­ pentina, відмінних за тривалістю культивування іп vitro, і інтактних рослинах двох видів R. serpentina і R. verticillata показав зміни у складі цього класу повторів in vitro [8, 9 ] . Ступінь виявлених змін корелював із тривалістю культивування (рис. 4, а) . Слід відмітити, що спорідненість між повторами у 45 АНДРЄЄВ І О., СПІР1ДОНОВА K В., КУНАХ В. А. Рис. 5. Перебудови анонімних послідовностей ДНК, виділених з інтактних рослин, у культивованих іп vitro близько 20 років калюсних клітин: а, б — блот-гібридизація ДНК інтактних рослин видів роду Rauwolfia та культивованих клітин R. serpentina, гідролізованих АІиІ рестриктазою, з 2Р-міченими «родоспецифічним» (а) та «видоспецифічним» (б) АІиІ фрагментами з інтактної рослини R. caffra; в — блот-гібридизація ДНК інтактних рослин видів роду Rauwolfia та культивованих клітин R. serpentina, гідролізованих ВатНІ рестриктазою, з 3 Р-міченою анонімною послідовністю з бібліотеки ВатНІ фрагментів геномної ДНК інтактної рослини R. serpentina (7 — R. verticillata; 2 — R. serpentina; З — культивовані клітини; 4 — R. caffra; 5 — R. vomitoria). Стрілками позначено перебудовані фрагменти ДНК представників двох видів становить 96 % і переви­ щує таку між кал юсами і інтактною рослиною вихідного виду (ступінь гомології повторів тривало культивованих клітин дорівнює 3 3 %, первинного калюсу — значно вищий і сягає 8 3 % ) . Подібні дані було отримано і для культивованих клітин скереди (С. capillaris ralr.) [ 1 0 ] (рис. 4, б) . Відмін­ ності між рослиною і тривало культивованими клітинами за складом фракції помірних повторюва­ них послідовностей можна порівняти з розбіж­ ностями між віддаленими видами однієї родини (наприклад, між пшеницею і вівсом у злакових, див. [ 1 1 , 1 2 ] ) . Поряд з аналізом ДНК інтактних рослин та штамів їхніх культивованих клітин вивчали полі­ морфізм послідовностей ДНК серед споріднених видів. Дослідження з використанням як зондів для гібридизації клонованих фрагментів ДНК, виді­ лених з культури клітин та інтактних рослин роду Rauwolfia, дозволили виявити деякі особливості перебудов рослинного геному в культурі in vitro [ 1 3 — 1 5 ] . Оскільки повторювані послідовності ДНК є найваріабельнішою фракцією геному, яка до того ж становить суттєву його частку, об'єктами для до­ слідження ми обрали рестрикційні фрагменти ДНК, які виразно представлені на електрофоретич­ них профілях, що з великою вірогідністю свідчить про їхню приналежність до повторюваних послі­ довностей. На електрофоретичних профілях продуктів гід­ ролізу АІиІ рестриктазою ДНК інтактних рослин різних видів раувольфії та тривало культивованих клітин (штам М) /?. serpentina виявлено два типи фрагментів. Один з них характеризувався однако­ вим розміром ( — 5 , 2 тис. п. н.) в інтактних росли­ нах усіх досліджуваних видів раувольфії і не спо­ стерігався в культивованих клітинах. Він отримав умовну назву «родоспецифічного». Другий, роз­ міром - 3 , 0 тис. п. н. — виявляв міжвидову варіа­ бельність за довжиною і тому був названий «видо- специфічним». Ці Л/и/-фрагменти, виділені з ін­ тактної рослини R. caffra, і використано як зонди для гібридизації. В культивованих клітинах JR. serpentina спостерігали зміни розміру «родоспеци­ фічного» фрагмента, поряд з тим міжвидового полі­ морфізму виявлено не було (рис. 5 , а). «Видоспе- цифічний» фрагмент виявився варіабельним як у культурі in vitro, так і в інтактних рослинах різних видів [ 1 5 ] (рис 5 , б). Інший тип перебудов знайдено при викори­ станні в ролі зонда для блот-гібридизації анонімної послідовності із сконструйованої нами бібліотеки ВатНІ фрагментів геномної ДНК інтактної росли- 46 ПЕРЕБУДОВИ РОСЛИННОГО ГЕНОМУ В КУЛЬТУРІ КЛІТИН IN VITRO Рис. 6. Невипадковий характер змін анонімної лабільної послідовності, виділеної з культивованих іп vitro понад 20 років клітин R. serpentina. Блот-гібридизація 2Р-міченого £соЛ/-фрагмента культивованих клітин R. serpentina з ДНК інтактних рослин роду Rauwolfia та тривало культивованих клітин R. serpentina, гідролізованих EcoRJ (а: 1 — R. canescens; 2 — R. vomitoria; 3 — R. caffra;4 — R. verticillata;5 — R. serpentina;^ — культивовані клітини); HindIII (6: 1 — R. caffra; 2 — R. canescens; 3 — R. vomi­ toria^ — R. serpentina^ — культивовані клітини) та Тоді (в: 1 — R. vomitoria;2 — R. canescens; 3 — R. caffra; 4 — R. verticillata; 5 — R. serpentina; 6 — культивовані клітини) рестриктазами. Стрілками позначено перебудовані фрагменти ДНК ни R. serpentina. Незважаючи на те, що довжина досліджуваного фрагмента залишається незмінною в усіх вивчених геномах, у культивованих клітинах R. serpentina відбувається зменшення копійності цієї послідовності. Поряд з цим вона характери­ зується міжвидовою варіабельністю за кількістю копій [14, 15] (рис. 5, в). При аналізі спектрів EcoRI фрагментів у ДНК трьох різних штамів клітин R. serpentina, культи­ вованих in vitro близько 20 років, виявлено мажор­ ний яскраво виражений фрагмент, нехарактерний для інтактних рослин роду Rauwolfia Визначено, що послідовність даного фрагмента ДНК зазнає змін у культурі клітин R. serpentina, а також характеризується міжвидовим поліморфізмом до­ вжин рестрикційних фрагментів (ПДРФ) за сайта­ ми впізнавання EcoRI, Hindi 11 і ТадІ ендонуклеаз (рис 6). При цьому не спостерігали відмінностей за даною послідовністю між молодими культурами (тривалість культивування 2—3 місяці) R. serpen­ tina і R. verticillata та інтактними рослинами ви­ хідних видів [15] . Крім перебудов повторюваних послідовностей, знайдено також зміни в ділянках геному, які міс­ тять кодуючі послідовності (гени). Так, для гена СохІ (ген ферменту основного дихального шляху — окисно-відновлювального циклу Кребса) в культурі in vitro спостерігали зміни Hindlll рестрикційних фрагментів, поряд з цим відмічено і міжвидовий поліморфізм [14] (рис 7, а). В умовах in vitro зареєстровано зменшення копійності послідовностей рДНК та гена малої субодиниці Rubisco (ген темнової фази фотосинте­ зу) [16] . Крім того, виявлено ПДРФ 18S—25S рДНК: окремі ділянки послідовності рДНК є варіа­ бельними у різних видів, а також зазнають змін в культурі in vitro R. serpentina (рис 1,6). Таким чином нами визначено, що культиву­ вання рослинних клітин в умовах in vitro супровод­ жується помітними реорганізаціями геному різно­ манітного характеру, які зачіпають різні його ді­ лянки. На цитологічному рівні клітинні популяції в культурі in vitro характеризуються геномною гетерогенністю, зокрема, за плоїдністю, кількістю та морфологією хромосом. Характер мінливості ку­ льтивованих клітин за цитогенетичними показни­ ками, очевидно, обумовлений особливостями фор­ мування геному в процесі еволюції. Так, у видів родів Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, які виникли шляхом полішюїдизації, в культурі клітин у біль­ шості випадків спостерігається мінливість числа хромосом, яка має широкий розмах і сягає високих рівнів плоїдності. З іншого боку, в культивованих клітинах С. capillaris — представника роду, види якого різняться переважно за морфологією хромо­ сом, — геномна мінливість проявляється, перш за все, у вигляді змін морфології хромосом. На молекулярному рівні перебудови рослинно­ го геному в культурі in vitro виявляються як зміни якісного складу різних фракцій повторюваних по­ слідовностей, зміни послідовностей окремих по­ вторів (мова йде про клоновані нами анонімні послідовності), а також деяких генів. Масштабність перебудов зростає із збільшенням тривалості куль- 47 АНДРЄЄВ І. О , СПІРІДОНОВА К В., КУНАХ В А. а б Рис. 7. Особливості змін послідовностей деяких генів е культи­ вованих іп vitro понад 20 років клітинах R. serpentina. Блот- гібридизація 3 2Р-мічених послідовностей генів СохІ (а: 1 — R. serpentina; 2 — культивовані клітини; З — R. caffra; 4 — R. vomitoria) та 18S—25S рРНК (б: 1 — R. caffra; 2 — R. serpen­ tina; 3 — культивовані клітини) з ДНК інтактних рослин роду Rauwolfia та культивованих клітин R. serpentina, гідролізованих HindIII (а) та MspI (б) рестриктазами. Кількість ДНК, нанесе­ ної на доріжку, становить 10 мкг. Стрілками позначено перебу­ довані фрагменти ДНК тивування. В окремих випадках відмінності між калюсною тканиною та інтактною рослиною вихід­ ного виду перевищували такі між різними видами одного роду. Характер згаданих перебудов свідчить про різноманітні механізми, що лежать в їхній основі. Це можуть бути делеції, ампліфікації, мік- ромутації. Цілком можливо, що частина перебудов пов'язана з активацією в умовах ізольованого рос­ ту мобільних елементів, наявність яких є характер­ ною ознакою будь-якого рослинного геному. Ві­ домо, що стрес індукує їхню активність [17, 18] . Аналіз отриманих даних дозволив встановити деякі риси геномних перебудов у культурі. Зокре­ ма, було виявлено, що іп vitro перебудовуються, як правило, ті послідовності, які характеризуються міжвидовим поліморфізмом (наприклад, «видоспе- цифічний» ЛІиІ фрагмент). У той же час імо­ вірність перебудов у культивованих клітинах від­ носно стабільних повторюваних послідовностей, які не мають міжвидового ПДРФ, набагато нижча (наприклад, ВатНІ фрагмент), хоча у випадку «родоспецифічного» ЛІиІ фрагмента в культурі іп vitro перебудови за своїм розмахом перевищують міжвидову мінливість. З іншого боку, повторювані послідовності, виявлені завдяки їхнім перебудовам у культурі (EcoRI фрагмент), характеризувалися міжвидовим поліморфізмом. Отже, можна припу­ стити, що геном іп vitro перебудовується невипад- ковим чином, а саме — змінюються ті варіабельні ділянки, які зазнали змін у процесі видоутворення. Невипадковість виявлених перебудов прояв­ ляється також у подібності за розміром рестрик- ційних фрагментів перебудованих послідовностей геномів культивованих клітин і інтактних рослин, що належать до різних видів. Наприклад, у випад­ ку «видоспецифічного» ЛІиІ фрагмента за характе­ ром гібридизації (розподілом і довжиною рестрик- ційних фрагментів) культивовані клітини R. ser­ pentina подібні до інтактної рослини R. verticillata. При блот-гібридизації послідовності EcoRI фраг­ мента виявилося, що за характером розподілу про­ дуктів EcoRI гідролізу культивовані клітини R. serpentina подібні до інтактної рослини R. canes- cens, HindIII гідролізу — до рослини іншого ви­ ду — R. caffra, у випадку Taql рестриктази в культивованих клітинах спостерігали низькомоле­ кулярні фрагменти, аналогічні до таких у R. vomi­ toria, R. canescens, та більш високомолекулярний, наявний в інтактній рослині R. caffra. Невипад­ ковість перебудов характерна і для послідовностей досліджених генів. У культивованих клітинах R. serpentina з'являється додатковий фрагмент СохІ гена розміром 2,5 тис. п. н., характерний для інтактних рослин R. caffra та R. vomitoria. При дослідженні генів 18S—25S рРНК у культивованих клітинах були виявлені низькомолекулярні MspI фрагменти, подібні за розміром до таких в ін­ тактній рослині іншого виду, R. caffra. Таким чином, отримані результати свідчать про наявність спільних рис перебудов геному в рослинних клітинах іп vitro та при еволюції рослин у природі при видоутворенні. Зокрема, геномна гетерогенність клітинних популяцій в культурі іп vitro на цитологічному рівні визначається особли­ востями формування геному в процесі еволюції. З іншого боку, знайдено певний взаємозв'язок між перебудовами окремих послідовностей ДНК у культурі клітин та їхньою міжвидовою варіабель­ ністю в інтактних рослинах. По-перше, ділянки геному, які зазнали перебудов іп vitro, характери­ зуються також міжвидовим поліморфізмом, у той же час існують консервативні ділянки, що не вияв­ ляють міжвидової варіабельності і стабільні в куль­ турі клітин. По-друге, виявлено невипадковість у характері перебудов варіабельних ділянок геному: для змінених іп vitro фрагментів ДНК можна знай­ ти подібні за розміром фрагменти в геномах ін­ тактних рослин іншого виду. Все це дозволяє припустити існування певних загальних закономірностей, які визначають харак­ тер і спрямованість перебудов рослинного геному в 48 ПЕРЕБУДОВИ РОСЛИННОГО ГЕНОМУ В КУЛЬТУРІ КЛІТИН IN VITRO культурі клітин in vitro та в процесі видоутворення. Отже, досліди з культурою рослинних клітин, зва­ жаючи на значні темпи мутацій в порівнянні з інтактними рослинами, відкривають нові перспек­ тиви для вивчення еволюції геному. Це надає нові можливості для використання культивованих клі­ тин рослин у фундаментальних дослідженнях по­ ряд із вже традиційними напрямками застосування їх як моделі для фізіологічних досліджень, а також як інструмента при вирішенні різноманітних біо- технологічних завдань. /. О. Andreev, К. V. Spiridonova, V. A. Kunakh Plant genome rearrangements in cell culture in vitro Summary The paper summarizes the results of long-term investigation in vitro on the plant cells genome, which is the focus of research in the Department of Cell Population Genetics of 1MBG NASU. The data obtained evidence the common features in the genome rear­ rangement pattern exhibited by plant cells in vitro and during natural speciation. In particular, the genome heterogeneity of cell populations in culture at the cytological level seems to be determined by the peculiarities of genome formation in the course of evolution. On the other hand, the correlation between rearrangements of specific DNA sequences in cell culture and their interspecies variations in intact plants has been found. Altogether the data allow to suggest that there are common principles determining the pattern and trends of the plant genome rearrangements in cell culture in vitro and during speciation. Therefore, given considerable mutation rate as against the intact plants, plant cell culture open new vistas for genome evolution research. И. О. Андреев, E. В. Спиридонова, В. А. Кунах Перестройки растительного генома в культуре клеток in vitro Резюме Подведены итоги многолетних исследований генома расти­ тельных клеток in vitro — одного из направлений научной работы отдела генетики клеточных популяций ИМБиГ НАН Украины. Полученные результаты свидетельствуют о нали­ чии общих черт в перестройках генома растительных клеток in vitro и при эволюции растений в природе при видообразова­ нии, В частности, геномная гетерогенность клеточных попу­ ляций в культуре in vitro на цитологическом уровне обусловле­ на особенностями формирования генома в процессе эволюции, С другой стороны, обнаружена корреляция между перестройка­ ми отдельных последовательностей ДНК в культуре клеток и их межвидовой вариабельностью в интактных растениях. Все это позволяет предположить существование определенных общих закономерностей, определяющих характер и направлен­ ность перестроек растительного генома в культуре клеток in vitro и в процессе видообразования. Использование культуры растительных клеток, учитывая значительные темпы мута­ ций по сравнению с интактными растениями, открывает новые перспективы для изучения эволюции генома. ПЕРЕЛІК ЛІТЕРАТУРИ 1. White P. R. Potentially unlimited growth of excised plant callus in an artificial nutrient / / Amer. J. Bot.—1939.—26.—P. 59— 64. 2. Gautheret R. J. Sur la possibilité de réaliser la culture indéfinie des tissus de tubercules de carote / / C. r. Acad. Sci.—1939.— 208.—P. 218—220. 3. Terzi M., Sung R. S. Somatic cell genetics of plants / / Crit. Rev. Biotechnol.—1986.—3, N 4.—P. 303—330. 4. Кунах В. А. Геномна мінливість соматичних клітин рослин. 7. Мінливість популяційно-генетичних параметрів у куль­ турі in vitro II Біополімери і клітина.—2002.—18, № 5.— С. 377—393. 5. Кунах В. А. Еволюція геному рослин в культурі клітин in vitro. Особливості, причини, механізми, наслідки / / Гене­ тика і селекція в Україні на межі тисячоліть.—К.: Логос, 2001.—Т. 1.—С. 53—67. 6. Кунах В. А. Геномная изменчивость соматических клеток растений. 1. Изменчивость в онтогенезе / / Биополимеры и клетка.—1994.—10, № 6.—С. 5—35. 7. Кунах В. А. Изменчивость растительного генома в процессе дедифференцировки и каллусообразования in vitro II Фи­ зиология растений.—1999.—46, № 6.—С. 919—930. 8. Соловьян В. Т., Костенюк И. А., Кунах В. А. Изменения генома культивируемых in vitro клеток раувольфии змеи­ ной / / Генетика.—1987.—23, № 7.—С. 1200—1207. 9. Соловьян В. Т., Кунах В. А., Вершинин А. В., Шумный В. К. Сравнение степени гомологии и количества повторяю­ щихся последовательностей у интактного растения и ку­ льтивируемых клеток раувольфии змеиной / / ДАН СССР.—1986.—278, № 4.—С. 998—1000. 10. Соловьян В. Т., Попович В. А., Кунах В. А. Пере­ устройство генома культивируемых клеток Crépis capillaris L. (Wallr.) / / Генетика.—1989.—25, № 6.—С. 1768—1775. U.Flawell R., О*Dell M., Smith D. Repeated sequence DNA comparisons between Triticum and Aegilops species / / Here­ dity.—1979.—42.—P. 309—322. 12. Salina E. A., Timofeeva L. L., Vershinin A. V. Interspecies variability in the organization of repeated sequenced of the genus Hordeum II Genética.—1989.—25, N 4.—P. 595— 604. 13. Соловьян В. Т., Спиридонова Е. В., Кунах В. А. Геномные перестройки в культивируемых клетках Rauwolfia serpen­ tina. I. Множественный характер геномных изменений / / Генетика.—1994.—30, № 2.—С. 250—254. 14. Соловьян В. Т., Спиридонова Е. В., Кунах В. А. Геномные перестройки в культивируемых клетках Rauwolfia serpen­ tina. II. Связь с межвидовой изменчивостью / / Генетика.— 1994.—30, N 3.—С. 399—403. 15. Соловьян В. Т., Спиридонова Е. В., Кунах В. А. Осо­ бенности геномной изменчивости культивируемых клеток Rauwolfia serpentina II Цитология и генетика.—1994.—28, № 5.—С. 21—25. 16. Спірідонова К. В., Андреев L О., Солов"ян В. Т., Кунах В. А. Особливості перебудови деяких генів в культурі клітин in vitro раувольфії зміїної R. serpentina Benth. / / Доповіді НАН України.—2000.—№ 2 — С. 165—170. 17. Bennetzen J. L. Transposable element contributions to plant gene and genome evolution / / Plant Mol. Biol.—2000.— N 42.—P. 251—269. 18. Grandbastien M.-A. Activation of plant retrotransposons under stress conditions / / Trends Plant Sci.—1998.—3, N 5.— P. 181 — 187. УДК 575.2 + 577.113:576.5 Надійшла до редакції 24.11.03 49

Ähnliche Einträge