Избирательное введение флюорофоров на концы РНК для исследования ее макромолекулярной структуры в растворе

статье описано мечение концевых остатков полирибонуклеотидов флюоресцентными метками. Реакции идут в водной среде с высокими выходами (90–100 %) и не сопровождаются модификацией внутренних нуклеотидов. В работе приведены спектроскопические характеристики флюорофоров, ковалентно связанных с РНК. Мето...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1989
Hauptverfasser:	Бакин, А.В., Шатский, И.Н.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1989
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Schlagworte:	Структура и функции биополимеров
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154968
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Избирательное введение флюорофоров на концы РНК для исследования ее макромолекулярной структуры в растворе / А.В. Бакин, И.Η. Шатский // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 71-76. — Бібліогр.: 14 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-154968
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1549682019-06-17T01:30:35Z Избирательное введение флюорофоров на концы РНК для исследования ее макромолекулярной структуры в растворе Бакин, А.В. Шатский, И.Н. Структура и функции биополимеров статье описано мечение концевых остатков полирибонуклеотидов флюоресцентными метками. Реакции идут в водной среде с высокими выходами (90–100 %) и не сопровождаются модификацией внутренних нуклеотидов. В работе приведены спектроскопические характеристики флюорофоров, ковалентно связанных с РНК. Методом синглет-синглетного переноса энергии определены расстояния между концами олигоуридилатов различной длины в дуплексе поли (U)·поли (А). Описано мічення кінцевих залишків полірибонуклеотидів флуоресцентними мітками. Реакції проходять у водному середовищі з високими виходами (90–100 %) і не супроводжуються модифікацією внутрішніх нуклеотидів. Наведено спектроскопічні характеристики флуорофоров, ковалентно пов’язаних з РНК. Методом синглет-синглетного перенесення енергії визначено відстані між кінцями олігоуридилатів різної довжини в дуплексі полі (U)·полі (А). The method por selective fluorescent labelling of the polynucleotides ends is described. Reactions are performed in water with high yields (90–100 %) followed by no modification of the RNA bases. The distances between the ends of oligouridylates of different length in duplex of poly(U)-poly(A) is determined by the singlet-singlet energy transfer method. 1989 Article Избирательное введение флюорофоров на концы РНК для исследования ее макромолекулярной структуры в растворе / А.В. Бакин, И.Η. Шатский // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 71-76. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000C4 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154968 577.113.4:547.455 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Бакин, А.В. Шатский, И.Н. Избирательное введение флюорофоров на концы РНК для исследования ее макромолекулярной структуры в растворе Биополимеры и клетка
description	статье описано мечение концевых остатков полирибонуклеотидов флюоресцентными метками. Реакции идут в водной среде с высокими выходами (90–100 %) и не сопровождаются модификацией внутренних нуклеотидов. В работе приведены спектроскопические характеристики флюорофоров, ковалентно связанных с РНК. Методом синглет-синглетного переноса энергии определены расстояния между концами олигоуридилатов различной длины в дуплексе поли (U)·поли (А).
format	Article
author	Бакин, А.В. Шатский, И.Н.
author_facet	Бакин, А.В. Шатский, И.Н.
author_sort	Бакин, А.В.
title	Избирательное введение флюорофоров на концы РНК для исследования ее макромолекулярной структуры в растворе
title_short	Избирательное введение флюорофоров на концы РНК для исследования ее макромолекулярной структуры в растворе
title_full	Избирательное введение флюорофоров на концы РНК для исследования ее макромолекулярной структуры в растворе
title_fullStr	Избирательное введение флюорофоров на концы РНК для исследования ее макромолекулярной структуры в растворе
title_full_unstemmed	Избирательное введение флюорофоров на концы РНК для исследования ее макромолекулярной структуры в растворе
title_sort	избирательное введение флюорофоров на концы рнк для исследования ее макромолекулярной структуры в растворе
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1989
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154968
citation_txt	Избирательное введение флюорофоров на концы РНК для исследования ее макромолекулярной структуры в растворе / А.В. Бакин, И.Η. Шатский // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 71-76. — Бібліогр.: 14 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT bakinav izbiratelʹnoevvedenieflûoroforovnakoncyrnkdlâissledovaniâeemakromolekulârnojstrukturyvrastvore AT šatskijin izbiratelʹnoevvedenieflûoroforovnakoncyrnkdlâissledovaniâeemakromolekulârnojstrukturyvrastvore
first_indexed	2025-07-14T07:00:21Z
last_indexed	2025-07-14T07:00:21Z
_version_	1837604716926730240
fulltext	У Д К 577.113.4:547.455 А. В. Бакин, И. Η. Шатский ИЗБИРАТЕЛЬНОЕ ВВЕДЕНИЕ ФЛЮОРОФОРОВ НА КОНЦЫ РНК ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЕЕ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ В РАСТВОРЕ В статье описано мечение концевых остатков полирибонуклеотидов флюоресцентными метками. Реакции идут в водной среде с высокими выходами (90—100 %) и не сопро- вождаются модификацией внутренних нуклеотидов. В работе приведены спектроскопи- ческие характеристики флюорофоров, ковалентно связанных с РНК. Методом синглет- синглетного переноса энергии определены расстояния между концами олигоуридилатов различной длины в дуплексе поли (U) -поли (А). Введение. Различные флюоресцентные методы используются при струк- турных исследованиях РНК, РНП-комплексов, изучении РНК-РНК и РНК-белковых взаимодействий, а также в других случаях. В последнее время широкое распространение получили флюоресцентные олигонук- леотидные зонды для решения разнообразных проблем. При этом всег- да требуются простые и эффективные методы направленного введения меток в РНК и ДНК. В данной работе предлагается высокоэффектив- ный способ введения флюорофора на 5'-конец рибонуклеотидов, а так- же показана возможность получения двух меток на концевых звеньях полимера. Способы введения флюорофоров по З'-концевому остатку рибозы хорошо отработаны [1, 2]. В то же время известные методы модифика- ции РНК по 5'-концевому фосфату обладают теми или иными недос- татками. Например, введение метки посредством окислительно-восста- новительной конденсации [3] хотя и происходит с высокой эффектив- ностью, но требует либо предварительного переведения РНК в форму, растворимую в органических растворителях, либо использования ре- агентов, обладающих солюбилизирующим действием [4], что не всегда возможно, как в случае флюоресцентных красителей. Присоединение через пирофосфатную группу [5] идет с невысоким выходом (15—20 %). Недавно Готтих и др. [6] был предложен метод синтеза 5'-фосфа- мидов олигонуклеотидов с помощью водорастворимого карбодиимида. Реакция протекает исключительно по фосфомоноэфирной группе оли- гонуклеотидов, не затрагивая межнуклеотидных фосфатных групп [6]. Ограничением метода является необходимость использования высоких концентраций амина (до З М), что предполагает применение только хорошо растворимых в воде аминов. Поэтому прямое присоединение труднорастворимых в воде аминокомпонент, какими обычно являются производные флюорофоров, не представляется возможным. Взяв за основу данный метод, мы разработали двустадийный спо- соб избирательного введения флюорофора на 5'-конец полирибонуклео- тидов, а также нашли оптимальные условия модификации З'-концевого остатка рибозы РНК, несущей метку на 5'-конце. В настоящей работе представлены результаты измерений расстояний между концами поли- уридиловой кислоты различной длины в составе дуплексов поли (U)- •поли (А) методом синглет-синглетного переноса энергии. Материалы и методы. В работе использовали (pU)i0 производства НИКТИ БАВ (Бсрдск), pU, рА — «Chemapol» (ЧССР), 1 -этил-3- (З'-диметиламинопропил) -кар- бодиимид (ЭДК) («Мегск», ФРГ), флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) и эозинтиосеми- карбазид (ЭТСК) фирмы «Calbiochem» (Швейцария). Полинуклеотиды (pU)29, (pU)5s, (pU)no выделяли фракционированием гидролизата поли(и) в 12 %-ном полиакриламид- ном геле (ГТААГ), содержащем 7 M мочевину. Длина поли (U) более 200 нуклеотидов («Reanal», Венглия). Гидролиз осуществляли нуклеазой Sl (НПО «Биолар», Олайне) при 37 0C в течение 30 мин. Электрофорез карбодигидразида проводили на бумаге FN-15 (ГДР) в 2 н. AcOH при напряжении 600 В в течение 2 ч; электрофорез мононуклеотидов — на бумаге ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 71 FN-I (ГДР) в приборе «Labor» (Венгрия) при 900—1000 В в 0,05 M ТАЕВ, рН 8,5, 1,5 ч. Спектры поглощения снимали на приборе «Весктап» (США) в буфере А: 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 140 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА. Микроколоночную хроматографию (MKX) выполняли на колонке (1X50 мм) с лихросорбом-КтН2 в линейном градиенте концентрации натрий-фосфатного буфера, рН 7,5, в 7 M мочевине с использованием жидкостного хроматографа МКСФП-4 (Ин-т орг. химии Сиб. отд-ния АН СССР, Новосибирск). К а р б о д и г и д р а з и д . В толсто- стенную ампулу (1X10 см) из молибде- нового стекла помещали 3 мл (60 ммо- лей) гидразингидрата и 3 мл (15,5 ммо- ля) дибутилового эфира угольной кис- лоты. Запаянную ампулу нагревали 48 ч на водяной бане в стальном кожухе. После вскрытия ампулы наблюдается быстрая кристаллизация образовавшего- ся карбодигидразида. Осадок перекрис- таллизовывали из этанола, сушили в ва- куумном эксикаторе над CaCl2 15 ч. На электрофореграмме обнаружено одно пятно, дающее положительную реакцию с нингидрином, с электрофоретической подвижностью катиона с зарядом -}-2. Температура плавления 150—152 °С, что совпадает с данными [7]. Выход 75 %. П р и с о е д и н е н и е к а р б о д и г и д р а з и д а к 5'-к о н ц е в о й ф о с ф а т - н о й г р у п п е РНК. К водному раствору Р Н К (100 мкл, 1—0,01 мМ) добавляли 16 мг (0,2 ммоля) карбодигидразида. Титровали 6 н. HCl до рН 4,6—4,8 и затем при- бавляли 10 мг (50 мкмолей) ЭДК. Смесь инкубировали при 20 °С (время реакции см. в табл. 1). Мононуклеотиды анализировали методом электрофореза на бумаге; олигонуклеотиды (после очистки на биогеле Р2) — методом МКХ. Полинуклеотиды очищали на биогеле Р4. Выход модифицированного продукта оценивали для олиго- нуклеотидов по отношению площадей пиков исходного и конечного продуктов, а в слу- чае полинуклеотидов — по поглощению после присоединения флюоресцеина. П р и с о е д и н е н и е ф л ю о р е с ц е и н а к φ о с φ о к а ρ б о д и г и д ρ а з и д у РНК. К 80 мкл (1—0,01 мМ) раствора поли(U) в 0,1 M HEPES-КОН, рН 7,0, добав- ляли 20 мкл 50 мМ раствора ФИТЦ в диметилформамиде (ДМФ). Инкубировали в темноте 2 ч при 20 °С и 1 ч при 37 °С. Р Н К осаждали тремя объемами этанола, осадок растворяли в 0,2 M AcONa (рН 5,6) и экстрагировали непрореагировавший краситель фенолом. Р Н К три раза переосаждали этанолом. Выход 100% (по поглощению). Г и д р о л и з ф о с ф о г и д р а з и д н о й с в я з и и о п р е д е л е н и е м о л я р - н о й э к с т и н к ц и и ф л ю о р е с ц е и н а , к о в а л е н т н о с в я з а н н о г о с 5'-к о н- ц о м п о л и ( и ) . Инкубировали 60 мкл (0,25 мг/мл) раствора Р-поли(и) в 0,1 н. HCl 1 ч при 37 °С. Титровали до рН 7,5, разбавляли до 1 мл буфером А. Сравнивали спект- ры поглощения Р-поли(и) до и после гидролиза со спектром поглощения конъюгата ФИТЦ и карбодигидразидом. Анализ спектров показал, что молярный коэффициент экстинкции при 493 нм (максимум поглощения флюоресцеина) не меняется после гид- ролиза HCl и составляет Е 4 9 з = (52±3) · IO3 M" 1 см"1, E 2 6 0 = (45±3) · IO3 M" 1 см-1 . П р и с о е д и н е н и е к З ' - к о н ц у Р - п о л и ( и ) ЭТСК. К 50 мкл (1 мг/мл) ра- створа F-поли (U) в буфере (25 мМ H E P E S - КОН, рН 7,1, 1 мМ MgCl2) добавляли 5 мкл раствора NaIO4 (25 мг/мл). Инкубировали 20 мин при 0°С. Р Н К осаждали этанолом. Растворяли в 50 мкл 0,1 M AcONa, рН 5,6 и инкубировали с 3 мкл этилен- гликоля 20 мин при 0°С. Переосаждали этанолом. Растворяли в 0,1 M AcONa, рН 5,6, добавляли 7 мкл раствора ЭТСК (32 мг/мл) в диметилсульфоксиде и инкубировали 3 ч при 20 °С. Р Н К очищали от красителя, как и в случае мечения флюоресцеином. Выход 80—90 % (по поглощению). М о д и ф и к а ц и я 16S Р Н К и 5S РНК. К раствору рРНК (100 мкл, 1—2 мг/мл), содержащему 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl, добавляли 16 мг (0,2 ммоля) карбодигидра- Т а б л и ц а 1 Получение карбодигидразид о в моно-, олиго- и полинуклеотидов с помощью ЭДК в воде. Концентрация карбодигидразида 1 Λί, ЭДК — 0,5 М; T=20 °С, рН 4,8 Synthesis of carbodihydrazide of mono-, oligo- and polynucleotides with EDC in water. Concentration of carbodihydrazide 1 M, EDC-0,5 Μ, T = 20 °С, pH 4,8 РНК Концент- рация нуклеоти- да , мМ Время реакции Выход, % рА 10 10 мин 60 pU 20 мин 100 (pU),o 10 20 мин 100 1 1,5 ч 80 З ч 100 (PU)2 9 0,1 2,5 ч 80 ( P U ) 1 1 O 0,05 6 ч 100 72 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 72 зида. Титровали 6 н. HCl до рН 4,6—4,8 и затем к полученной смеси добавляли 10 мг (50 мкмолей) ЭДК. Инкубировали при 10°С в течение 8 ч. рРНК 3—4 раза переосаж- дали этанолом, осадок растворяли в 100 мкл буфера, содержащего 70 мМ H E P E S X X К О Н , рН 7,0, 0,5 мМ MgCl2, 30 мМ NaCL К раствору добавляли 25 мкл 0,05 M раствора ФИТЦ в ДМФ, инкубировали в темноте 3 ч при 20 °С. Р Н К очищали от красителя, как описано выше. Степень модификации 90—100 % (по поглощению). Ф л ю о р е с ц е н т н ы е и з м е р е н и я проводили на поляризационном спектро- флюориметре «AMINCO SPF-1000 CS» при 10°С в буфере А. Концентрация поли(U) 2 - Ю - 7 М, поли (А) — 1 ·10- 6 М. О п р е д е л е н и е к р и т и ч е с к о г о р а с с т о я н и я R. Величину критического расстояния рассчитывали по формуле: Ro- (8,79· 10-5-&2-tt~4-/da'<7d)1/6, где η — опти- ческая плотность среды равна 1,4 [1]; qa— квантовый выход донора (qd = 0,55); k2 — ориентационный множитель, характеризующий взаимную ориентацию диполей перехо- дов донора и акцептора, принимали равным 2/3 [8]. Интеграл перекрывания {ha = OO OO — / Fd (λ) -Ea (λ) -λΑά/ J Fd (λ) ·άλ) спектра флюоресценции донора Fd (λ) и спектра о о поглощения акцептора £ α ( λ ) определяли численным интегрированием по методу Симп- сона на мини-ЭВМ «Искра-226» (Ida = 2,47· 10~13 M - 1 см3). Результаты и обсуждение. На первой стадии мы синтезировали 5'-фосфокарбодигидразид РНК конденсацией карбодигидразида и по- лирибонуклеотидов в присутствии ЭДК (рис. 1). Вместо амина был ис- пользован карбодигидразид, так как он хорошо растворим в воде и имеет рК около 5,5, что позволяет проводить реакции с ЫН2-реагента- ми, например ФИТЦ, при рН около 7,0. Условия реакции конденсации отрабатывали последовательно сна- чала на мононуклеотидах, а затем на олиго- и полинуклеотидах. В слу- чае мононуклеотидов реакци- t онную смесь анализировали 5-конец: методом электрофореза на бу- S маге, как описано в [6]. Фос- -О'Р-о--пола(U) фокарбодигидразиды олиго- и полинуклеотидов очищали на биогелях Р2 и Р4 соответст- ft ВЄННО. Степень модификации HzN-NH-C-NH-NH-P-O- - поли(U) олигонуклеотидов определяли -Θ методом МКХ. Присоединение карбодигидразида к мононук- леотидам проходило на 100 % за 20 мин, к олигонуклеоти- Рис. 1. Схема модификации 5'- и 3'- концевых звеньев полиуридиловой кислоты Fig. 1. A scheme of modification of 5'- and S'-terminal chains of polyuri- dylic acid дам — за 3—4 ч и к полинуклеотидам ·—за 6—8 ч (табл. 1). Следует отметить, что в процессе реакции модификации гетероциклических ос- нований не происходит [6]. На следующем этапе фосфогидразид РНК вводили в реакцию с ФИТЦ. Взаимодействие протекало количественно за 3 ч (2 ч, 20 °С и 1 ч, 37 °С при рН 7,0). Конечная концентрация ФИТЦ должна быть 4—5 мг/мл, так как более высокая концентрация реагента может при- водить к понижению рН из-за его гидролиза [9]. В специальных кон- трольных опытах было установлено, что в условиях реакции ФИТЦ не модифицирует гетероциклических оснований. Для введения акцептора на З'-конец РНК мы использовали широ- ко применяющийся метод присоединения гидразидов к З'-концевому остатку рибозы после окисления его периодатом натрия. Нами было ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 73 чае мононуклеотидов реакци- онную смесь анализировали методом электрофореза на бу- маге, как описано в [6]. Фос- обнаружено, что при обработке Е-поли(и) периодатом натрия проис- ходит отщепление метки от РНК, При этом флюорофор не разрушается. Отщепление метки связано, по-видимому, с окислением замещенного карбодигидразида, так как известен факт окисления периодатом натрия незамещенных гидразидов кислот в условиях реакции окисления цис- дипольной группы рибозы [10]. Изучив зависимости скоростей окис- ления остатка рибозы и отщепления 5'-концевой метки от температуры Рис. 2. ни я 3'- 1, 3, 5, 2, 4, 6 Fig. 2. the 3'- Iy(U) vely: 2, Степень присоединения эозина к Р-поли(ІІ) в зависимости от условий окисле- концевого остатка рибозы и уровень отщепления флюоресцеина от Р-поли(и) : 7 — концентрация NaIO4 20 мг/мл, температура 20, 0, 0, 20 °С соответственно; — концентрация NaIO4 20, 5, 40 мг/мл соответственно при O0C Extent of eosin binding to F-poly(U) under different conditions of oxidation of terminal ribose residue (a) and the level of fluorescein splitting-out from F-po- (6): 1, 3, 5, 7 —concentrat ion of N a I O 4 - 2 0 mg/ml , 1 = 20, 0, 0; 20 °С, respecti- 4, 6 — concentration of NaIO4 — 20, 5, 40 mg/ml , respectively, at 0°C Рис. 3. Изотермы адсорбции олиго(и) на поли(А). Концентрация олиго(ІІ) 2 - Ю " 7 M Fig. 3. Adsorption isotherms of oligo (U) · poly (A). Concentration of oligo(U) 2 - Ю - 7 M и концентрации периодата натрия (рис. 2), мы нашли условия, при ко- торых остаток рибозы окисляется количественно, в то время как отщеп- ление метки составляет только 30—35 % (рис. 2, точка А на кривой 3). Конечная степень модификации 5'-концевого флюорофора (60—65 %) удовлетворяет требованиям, предъявляемым к донору для проведения экспериментов по миграции энергии. Р-поли(и) с окисленным З'-концевым остатком рибозы обрабаты- вали ЭТСК при рН 5,3. В результате реакции к диалъдегидной группе присоединяется одна молекула ЭТСК с образованием структуры II (рис. 1) [11]. Степень модификации PITK флюоресцеином и эозином определяли из спектров поглощения, учитывая вклады меток в поглощение при 260 нм и перекрывание спектров поглощения флюорофоров. Были исследованы спектроскопические характеристики ковалентно связанных флюорофоров. Определены коэффициенты молярной экс- тинкции в максимумах поглощения флюоресцеина E 4 9 3 = (52 + 3) X XlO3 M - 1 см - 1 и эозина E 5 i 8 = (55+3) · IO3 M - 1 см -1 . Квантовый выход флюоресценции флюоресцеина составляет q = 0,55 относительно раство- ра хинин-сульфата в 0,05 н. H2SO4, для которого q = 0J [12]. Для данной пары флюорофоров было определено критическое расстояние Roy на котором вероятность миграции энергии равна вероятности эмис- сии [8]. Величина R0 равна 5,4 нм для k2 = 2/3. Для отработки методики измерения расстояний по методу мигра- ции энергии и оценки надежности метода при использовании пары флю- орофоров флюоресцеин — эозин мы избрали модельную систему — дуплекс поли (U) · поли (А). Длина поли (А) была около 200 нуклеоти- дов, а поли (U) брали длиной 17—18 и 40—42 нуклеотида. Данная сис- тема хороша тем, что для нее из рентгеноструктурных измерений из- вестно расстояние между нуклеотидами — 0,31 нм [13]. Отсюда можно 74 I S S N 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 оценить расстояние между флюорофорами на концах поли (U), кото- рое для ( p U ) i s с учетом вклада меток составляет 5,6—6,0 нм, а для ( P U ) 4 2 — около 13,5 нм. Согласно теории Ферстера следует ожидать эффективности переноса энергии при /г2 = 2 /3 около 50 и менее 5 % соответственно. С тем чтобы подобрать условия образования дуплекса в отсутствие кооперативного связывания нескольких молекул олиго(и) с одной мо- лекулой поли (А), были исследованы изотермы адсорбции меченного по 5'-концу олиго(и) на поли (А) (рис. 3). Как и следовало ожидать, комплексообразование сопровождается возрастанием поляризации флю- оресценции метки. Оказалось, что если титровать поли(U) малыми порциями поли (А) (рис. 3, кривая / ) , происходит кооперативная сбор- ка дуплекса, что проявляется в снижении конечной поляризации флю- оресценции метки вследствие миграции энергии между молекулами флюорофоров. И наоборот, если сразу добавлять значительное коли- чество поли (А), то данного эффекта не наблюдается, а поляризация флюоресценции возрастает до максимального значения в данной сис- теме (рис. 3, кривая 2). Поэтому при проведении экспериментов по пе- реносу энергии, чтобы заведомо исключить кооперативную сборку, комплексообразование проводили сразу, добавляя к поли(U) 10-крат- пый избыток поли (А). Для определения эффективности переноса энергии (Еэф) оценива- ли квантовый выход донора без (qa) и в присутствии акцептора энер- гии (qda). Мы снимали поляризованные спектры флюоресценции трех образцов дуплексов поли (U) · поли (А), в которых полиуридиловая кис- лота была мечена: а) по 5'-концу флюоресцеином (донор энергии) для учета влияния поли (А) на qa\ б) по З'-концу эозином (акцептор энер- гии) и в) донором и акцептором. Поглощение флюорофоров состав- ляло < 0 , 1 единицы оптической плотности при длине волны возбуж- дения. Эффективность миграции энергии рассчитывали двумя независимы- ми методами — по тушению флюоресценции донора (Ed), учитывая степень модификации акцептора, и по разгоранию интенсивности ак- цептора (Ea)1 учитывая степень модификации донора и акцептора. По- лученные значения E усредняли и использовали для расчета расстоя- ния (R) между донором и акцептором по формуле: £ Э ф = 1/(1 + /?//?о)6 [8]. Неопределенность в Iz2 учитывали, как в [14]. Экспериментальные значения хорошо согласуются с теоретически рассчитанными (табл. 2), что говорит о надежности метода при использовании избранной пары флюорофоров. Нами также была проверена методика введения флюорофоров на 5'-конец РНК на рибосомных 5S и 16S РНК. Степень модификации рРНК, оцененная спектрофотометрически, составляла 90—100 %. Мече- ные рРНК не изменяли своей подвижности в 8 %-ном ПААГ, что сви- детельствовало о сохранении целостности молекул. Таким образом, предложенный способ введения меток на 5'-конец РНК позволяет в мягких условиях с высоким выходом и избиратель- T а б л и ц а 2 Эффективность миграции энергии и расстояния между концами полиуридиловой кислоты в дуплексе поли (U) · поли (А) Efficiency of energy transfer and distances between the ends of polyuridylic acids in the poly (U) · poly (A) duplex Длима пол H(U) Ech % Еа> % R, нм (теорет.) R, нм (эксперим. ) га r d 17—18 40—45 58 5 53 0 5,2—5,8 13,5 5,0—5,8 9,0 0,21 0,22 0,12 0,11 П р и м е ч а н и е . rdy ra — анизотропии поляризованной флюоресценции донора и ак- цептора (в отсутствие донора) соответственно. 75 I S S N 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 ностью получать производные как синтетических гомополимеров, так и природных РНК. Авторы благодарят О. Ф. Борисову за постоянное внимание при проведении экспериментов по миграции энергии; А. Г. Евстафьеву, А. Н. Муравьеву — за помощъ в работе, М. Б. Готтих и М. Г. Иванов- скую — за ценные советы. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Distances between 3' ends of rRNAs reassembled into E. coli ribosomes / 0 . W. Odom, D. I. Robbins, J. Lynch et al. / / Biochemistry.— 1980.—19, N 24.—P. 5947—5954. 2. Distance measurement by energy transfer: the 3' ends of 16S RNA and proteins S4 and S17 of ribosomes of E. coli/B. Epe, P. Wooley, K. G. Steinhauser, J. Little- c h i l d / / E u r . J. Biochem.— 1982.—129, N 1.—P. 211—219. 3. Мишенина Г. Φ., Самуков В. В., Шубина Т. Н. Селективная модификация моноза- мещенных фосфатных групп в 5'-моно- и полифосфатных нуклеозидах и олигонук- леотидах / / Биоорг. химия — 1979,—5, № 6.—С. 886—894. 4. Мочалова JI. В., Шатский И. H., Богданов А. А. Избирательная модификация 5'-концевых фосфатных групп транспортных и р Р Н К / / Т а м же.— 1982.—8, № 2.— С. 239—242. 5. fang С. H., Soil D. Covalent attachment of fluorescent groups to the 5' ends of tRNA / / Arch. Biochem. and Biophys.— 1973.—155, N 1.—P. 70—81. 6. Готтих Μ. Б., Ивановская Μ. Г., Шабарова 3. А. Получение фосфамидов моно- и олигонуклеотидов в водной с р е д е / / Б и о о р г . химия.— 1983.—9, № 8.— С. 1063— 1067. 7 . S t o l l e R., Hojmann К· Ueber hydrazincarbonsaure / / Berichte.— 1904.—37.— S. 4523—4524. 8. Forster Th. Intermolecular energy transfer migration and f luo rescence / /Ann . P h y s . - 1948.—2.— P. 55—75. 9. Reines S. A., Shulman L. H. A new method for attachment of fluorescent probes to tRNA / / Meth. Enzymol.— 1979.—49.— P. 146—156. 10. Органическая химия нуклеиновых кислот / Η. К. Кочетков, Э. И. Будовский, E. Д. Свердлов и др. / Под ред. Н. К. Кочеткова.— М. : Химия, 1970.—718 с. 11. Hansske F., Sprinzl M., Cramer F. Reaction of the ribose moety of adenozine and AMP with periodate and carboxylic acid h y d r a z i d e s / / B i o o r g . Chem.— 1974.—3, N 2,— P. 367—372. 12. Emission properties of NADH. Studies of fluorescent lifetimes and quantum effi- ciencies of NADH, AcPyADH, and simplified syntheticmodels / T. G. Scott, R. D. Spenser, N. J. Leonard, G. W e b e r / / J . Amer. Chem. S o c . - 1970.—92, N 3.— P. 687—695. 13. Sasisekharan A. B., Sigler G. J. An X-ray diffraction study of poly(A-U) / / J . Мої. Biol.— 1965.—12, N 2 .—P. 296—298. 14. Haas E., Katchalski-Katzir E., Steinberg L Z. Effect of the orientation of donor and acceptor on the probability of energy transfer involving electronic transitions of mi- xed polar iza t ion/ /Biochemis t ry .— 1978.—17, N 23.—P. 5064—5070. Межфакультет, пробл. н.-и. лаб. молекуляр. биологии Получено 11.12.88 и биоорг. химии им. А. Н. Белозерского, МГУ им. М. В. Ломоносова SELECTIVE FLUORESCENT LABELLING OF THE RNA ENDS TO STUDY ITS MACROMOLECULE STRUCTURE IN THE SOLUTION Α. V. Bakin, I. N. Shatsky A. N. Belozersky Laboratory of Molecular Biology and Bioorganic Chemistry; Μ. V. Lomonosov State University, Moscow S u m m a r y The method por selective fluorescent labelling of the polynucleotides ends is described. Reactions are performed in water with high yields (90-100 %) followed by no modifi- cation of the RNA bases. The distances between the ends of oligouridylates of different length in duplex of poly(U)-poly(A) is determined by the singlet-singlet energy transfer method. 76 I S S N 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3

Избирательное введение флюорофоров на концы РНК для исследования ее макромолекулярной структуры в растворе

Institution

Ähnliche Einträge