Выделение и кристаллизация рибосомного белка TS9
Описан метод выделения и кристаллизации рибосомного белка TS9 из экстремально термофильной бактерии Thermus thermophilus. Кристаллы имеют ромбическую форму и максимальный размер 0,5 мм....
Gespeichert in:
| Datum: | 1989 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Schriftenreihe: | Биополимеры и клетка |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154969 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Выделение и кристаллизация рибосомного белка TS9 / С.Ч. Агаларов, И.А. Елисейкина // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 77-79. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-154969 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1549692019-06-17T01:31:17Z Выделение и кристаллизация рибосомного белка TS9 Агаларов, С.Ч. Елисейкина, И.А. Структура и функции биополимеров Описан метод выделения и кристаллизации рибосомного белка TS9 из экстремально термофильной бактерии Thermus thermophilus. Кристаллы имеют ромбическую форму и максимальный размер 0,5 мм. Описано метод виділення і кристалізації рибосомного білка TS9 з екстремально термофільної бактерії Thermus thermophilus. Кристали мають ромбічну форму і максимальний розмір 0,5 мм. A method is suggested to isolate ribosomal protein TS9 from SOS subparticles of ribosomes from extremal-thermophilic bacterium Thermus thermophilus. Rhomb-shaped crystals of this protein with maximal dimensions of 0.5 mm have been obtained. A method of vapour diffusion in a «hanging» drop with 2-methyl-2.4-pentanediol (MPD) as a precipitant has been used for crystallization. 1989 Article Выделение и кристаллизация рибосомного белка TS9 / С.Ч. Агаларов, И.А. Елисейкина // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 77-79. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000C5 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154969 577.963.3 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров |
| spellingShingle |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Агаларов, С.Ч. Елисейкина, И.А. Выделение и кристаллизация рибосомного белка TS9 Биополимеры и клетка |
| description |
Описан метод выделения и кристаллизации рибосомного белка TS9 из экстремально термофильной бактерии Thermus thermophilus. Кристаллы имеют ромбическую форму и максимальный размер 0,5 мм. |
| format |
Article |
| author |
Агаларов, С.Ч. Елисейкина, И.А. |
| author_facet |
Агаларов, С.Ч. Елисейкина, И.А. |
| author_sort |
Агаларов, С.Ч. |
| title |
Выделение и кристаллизация рибосомного белка TS9 |
| title_short |
Выделение и кристаллизация рибосомного белка TS9 |
| title_full |
Выделение и кристаллизация рибосомного белка TS9 |
| title_fullStr |
Выделение и кристаллизация рибосомного белка TS9 |
| title_full_unstemmed |
Выделение и кристаллизация рибосомного белка TS9 |
| title_sort |
выделение и кристаллизация рибосомного белка ts9 |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1989 |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154969 |
| citation_txt |
Выделение и кристаллизация рибосомного белка TS9 / С.Ч. Агаларов, И.А. Елисейкина // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 77-79. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT agalarovsč vydelenieikristallizaciâribosomnogobelkats9 AT elisejkinaia vydelenieikristallizaciâribosomnogobelkats9 |
| first_indexed |
2025-07-14T07:00:24Z |
| last_indexed |
2025-07-14T07:00:24Z |
| _version_ |
1837604719644639232 |
| fulltext |
УДК 577.963.3
С. Ч. Агаларов, И. А. Елисейкина
ВЫДЕЛЕНИЕ И КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ РИБОСОМНОГО БЕЛКА TS9
Описан метод выделения и кристаллизации рибосомного белка TS9 из экстремально
термофильной бактерии Thermus thermophilus. Кристаллы имеют ромбическую форму
и максимальный размер 0,5 мм.
Введение. Выяснение деталей пространственного строения рибосомы
невозможно без применения метода рентгеноструктурного анализа и,
следовательно, без выращивания монокристаллов рибосом как первого
этапа кристаллографического исследования. Путь, дополняющий иссле-
дования структуры целых рибосом, заключается в разборке рибосом и
кристаллизации компонентов, их составляющих, например рибосомных
белков. В последнее время достигнут некоторый прогресс в этой обла-
сти исследований, чему во многом способствовало внедрение в практи-
ку термофильных микроорганизмов в качестве источника для получе-
ния препаратов. К настоящему моменту получены кристаллы ряда ри-
босомных белков, в основном, из термофильных бактерий [1—4]. Для
одного из них — белка L30 из большой рибосомной 50S субчастицы
Bacillus st ear other mophilus — была определена структура с высоким
разрешением [5]. В то же время пока нет никаких структурных данных
(даже низкого разрешения) для белков из малой рибосомной 30S суб-
частицы.
Недавно в нашей группе были получены кристаллы 30S субчасти-
цы из экстремально термофильного микроорганизма Thermus thermo-
philus [6]. Это стимулировало нас к работе по выделению и кристалли-
зации индивидуальных рибосомных белков из этого же объекта. Дан-
ная статья посвящена выделению и кристаллизации рибосомного бел-
ка TS9 (по номенклатуре, приведенной в работе [7]) из рибосомной
30S субчастицы Th. thermophilus.
Материалы и методы. Выращивание бактериальной массы, выделение рибосом и
рибосомных 30S субчастиц проводили, как описано в работе [7]. Производные 30S
субчастиц — так называемые «коровые» частицы (содержащие около половины рибо-
сомных белков) — получали инкубацией исходных 30S субчастиц в 0,02 M трис-НС1-
буфере, рН20оС 7,5, 3,5 M LiCl и 0,1 M MgCl2 в течение 20 ч на холоду. Коровые части-
цы отделяли от экстрагированного белка центрифугированием при 45000 об/мин в те-
чение 6 ч, осадок растворяли в 0,02 M трис-НС1-буфере, содержащем 0,05 M MgCl2 и
0,15 M NH4Cl, а затем добавляли концентрированные растворы LiCl и MgCl2 до ко-
нечной концентрации 6 и 0,1 M соответственно и дальнейшую экстракцию белка про-
водили в течение 20 ч на холоду. Выпавший при этом осадок Р Н К отделяли от экстра-
гированного белка центрифугированием при 16000 об/мин в течение часа. Полученную
белковую смесь переводили в буфер, содержащий 0,05 M Ыа-ацетат, рН 5,6, и
0,05 M NaCl, с помощью хроматографии на сефадексе G-25 и наносили на колонку с
CM-Toyopearl 650S («Toyo-Soda», Япония), уравновешенную этим же буфером. Инте-
ресующий нас белок TS9 оказался в «проскоке», в то время как остальные белки
задерживались на колонке. От единственной примеси — полипептида с молекулярной
массой порядка 60000 (по данным DS-Na-электрофореза), возможно, нерибосомной
породы — белок TS9 отделяли пропусканием через колонку с ДЭАЭ-Toyopearl 650S
(«Toyo-Soda»), уравновешенную тем же буфером. Как и в первом случае, белок TS9
не адсорбировался на колонке. «Проскок» с колонки собирали, концентрировали и ис-
пользовали в экспериментах по кристаллизации.
Кристаллизацию проводили методом диффузии паров в «висящей» капле, исполь-
зуя в качестве осадителя 2-метил-2,4-пентандиол (МПД).
Идентификацию белка проводили двухмерным электрофорезом [8], чистоту оце-
нивали с помощью DS-Na-электрофореза в 15 %-ном полиакриламидном геле [9].
Результаты и обсуждение. Описанная выше процедура выделения
белка TS9 является составным звеном общей методики выделения ин-
дивидуальных рибосомных белков из 30S субчастиц Th. thermophilus,
iSSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 7 7
разрабатываемой в данное время. Экстракцию белков проводили в два
этапа. Первый — обработка 30S субчастиц 3,5 M LiCl, второй — обра-
ботка полученных после первого этапа коровых частиц 6 M LiCl. Та-
ким образом получали две фракции рибосомных белков, примерно рав-
ные по количеству входящих в них индивидуальных белков. Далее каж-
дая фракция подвергалась хроматографическому разделению на
Рис. 1. Электрофоретический анализ растворенных кристаллов белка TS9 (справа).
Слева — стандарты молекулярной массы
Fig. 1. Electrophoretic analysis of dissolved protein TS9 crystals (right). Markers are
shown on the left
Рис. 2. Микрофотография кристаллов белка TS9
Fig. 2. Microphotographs of protein TS9 crystals
CM-Toyopearl 650S. Следует отметить отсутствие денатурирующих аген-
тов на всех этапах выделения белков, что может играть немаловажную
роль в экспериментах по кристаллизации.
Один из полученных белков TS9 удалось закристаллизовать. Это
кислый белок (по оценке его местоположения на двухмерной электро-
фореграмме [7]) с молекулярной массой примерно 9000—11 ООО по дан-
ным DS-Na-электрофореза (рис. 1). Исходя только из имеющихся ха-
рактеристик, весьма трудно предположить, аналогом какого белка из
рибосом Escherichia coli он является. Лишь с большой осторожностью
можно допустить, что белок TS9 — аналог белка S6 Е. coli.
Кристаллизацию проводили при комнатной температуре из раство-
ра белка с концентрацией 8—12 мг/мл, содержащего 0,05 M трис-НС1,
рН 7,5, и 0,15 M NaCl. В качестве осадителя использовали 20—25 %-
ный МИД. Кристаллы, имеющие ромбическую форму, образовывались
в течение 2—3 сут, достигая при этом максимального размера 0,5 мм
(рис. 2). В настоящее время проводится предварительное кристалло-
графическое исследование.
Авторы благодарят М. Б. Гарбер, С. Д. Траханова, Μ. М. Юсупо-
ва за полезные советы и помощь при выполнении работы.
iSSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 77
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. The crystallization of ribosomal proteins from the 50S subunit of the Escherichia coll
and Bacillus stearothermophilus ribosome / K. Appelt, J. Dijk, R. Reinhardt et a l . / /
J. Biol. Chem.— 1981.—256, N 22.—P. 11787—11790.
2 Appelt K, White S. W., Wilson K- S. Proteins of the Bacillus stearothermophilus ribo-
some. Crystallization of proteins L30 and S5 / / Ibid.— 1983.—258, N 21.—P. 13328—
13330.
3. Liljas A., Mewcower Μ. E. Purification and crystallization of a protein complex
from Bacillus stearothermophilus ribosomes / / J. Мої. Biol.— 1981 .—153, N 2 -
P. 393—398.
4. Седельникова С. Э. Выделение индивидуальных белков из 50S субчастицы рибосом
Thermus thermophilus. Кристаллизация белка TL7. / / Биополимеры и клетка.—
1987,—3, № 3.—С. 163—166.
5. Crystall structure of a prokaryotic ribosomal protein / К- S. Wilson, К. Appelt, S. Bad-
ger et al. / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1986.—83, N 19.—P. 7251—7255.
6. Кристаллизация 30S субчастиц рибосом Thermus thermophilus / Μ. Μ. Юсупов,
С. Д. Траханов, В. В. "Барынин и д р . / / Д о к л . АН СССР.— 1987,—292, .Nb 5.—
С. 1271 — 1274.
7. Гогия 3. В., Юсупов М. M., Спирина Т. Н. Структура рибосом Thermus thermophilus.
1. Метод выделения и очистки рибосом//Молекуляр. биология.— 1986.—20, № 2.—•
С. 519—526.
8. Kenny GLambert G. AL, Traut R. R. Cross-linking of ribosomes using 2-iminothiola-
ne(methyl-4-mercaptobutyrimidate) and identification of cross-linked proteins by di-
agonal polyacrylamide sodium dodecyl sulphate gel e lectrophoresis / /Meth. Enzy-
mol.— 1979,—59,—P. 534—550.
9. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacte-
riophage T4 U Nature.— 1970.—227, N 5259.— P. 680—685.
Иіі-т белка АН СССР, Пущино Получено 09.06.88
ISOLATION AND CRYSTALLIZATION OF RIBOSOMAL PROTEIN TS9
S. Ch. Agalarου, I. A. Eliseikina
Institute of Protein Research,
Academy of Sciences of the USSR, Pushchino, Moscow Region
S u m m a r у
A method is suggested to isolate ribosomal protein TS9 from 30S subparticles of ribo-
somes from extremal-thermophilic bacterium Thermus thermophilus. Rhomb-shaped cry-
stals of this protein with maximal dimensions of 0.5 mm have been obtained. A method
of vapour diffusion in a «hanging» drop with 2-inethyl-2.4-pentanediol (MPD) as a pre-
cipitant has been used for crystallization.
УДК 577.323
Ю. С. Бабаян
СВЯЗЫВАНИЕ БРОМИСТОГО ЭТИДИЯ
С ПОЛИРИБОГУАНИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ
Исследовано связывание бромистого этидия (БЭ) с полирибогуаниловой кислотой по
характеру изменения спектров поглощения. Расчеты показали, что стехиометрия насы-
щения составляет одну молекулу БЭ на пять гуанинов с константой связывания (5,2+
±0,8) -IO4 Ai-1 при 0,1 M NaCl и комнатной температуре.
Введение. Взаимодействие бромистого этидия (БЭ) с нуклеиновыми
кислотами исследовано довольно хорошо [1—6]. В частности, было по-
казано, что в физиологических условиях взаимодействие носит интер-
калирующий характер [1—3], причем стехиометрия насыщения состав-
ляет одну молекулу БЭ на две пары оснований [1, 2, 4, 6]. Характер
связывания слабо зависит от GC-содержания для Д Н К [1] и очень
сильно — для двуспиральных РНК [6].
iSSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 77
|