Связывание бромистого этидия с полирибогуаниловой кислотой
Исследовано связывание бромистого этидия (БЭ) с полирибогуаниловой кислотой по характеру изменения спектров поглощения. Расчеты показали, что стехиометрия насыщения составляет одну молекулу БЭ на пять гуанинов с константой связывания (5,2±0,8) -10⁴M⁻¹ при 0,1 M NaCl и комнатной температуре....
Збережено в:
| Дата: | 1989 |
|---|---|
| Автор: | |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154973 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Связывание бромистого этидия с полирибогуаниловой кислотой / Ю.С. Бабаян // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 79-82. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-154973 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1549732019-06-17T01:30:42Z Связывание бромистого этидия с полирибогуаниловой кислотой Бабаян, Ю.С. Структура и функции биополимеров Исследовано связывание бромистого этидия (БЭ) с полирибогуаниловой кислотой по характеру изменения спектров поглощения. Расчеты показали, что стехиометрия насыщения составляет одну молекулу БЭ на пять гуанинов с константой связывания (5,2±0,8) -10⁴M⁻¹ при 0,1 M NaCl и комнатной температуре. Досліджено зв’язування бромистого етидію (БЕ) з полірибогуаніловою кислотою за характером зміни спектрів поглинання. Розрахунки показали, що стехіометрія насичення становить одну молекулу БЕ на п’ять гуанінів з константою зв’язування (5,2 ± 0,8)·10⁴ M⁻¹ при 0,1 M NaCl і кімнатній температурі. The binding of ethidium bromide to polyriboguanylic acid has been investigated according to the character of changes in absorption spectra. The calculations have shown that the saturation stoichiometry at binding makes up one ethidium bromide molecule per 5 guanine bases with binding constant (5.2±0.8) -10⁴ M⁻¹ in the presence of 0.1 M NaCl and at room temperature. 1989 Article Связывание бромистого этидия с полирибогуаниловой кислотой / Ю.С. Бабаян // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 79-82. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000C6 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154973 577.323 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров |
| spellingShingle |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Бабаян, Ю.С. Связывание бромистого этидия с полирибогуаниловой кислотой Биополимеры и клетка |
| description |
Исследовано связывание бромистого этидия (БЭ) с полирибогуаниловой кислотой по характеру изменения спектров поглощения. Расчеты показали, что стехиометрия насыщения составляет одну молекулу БЭ на пять гуанинов с константой связывания (5,2±0,8) -10⁴M⁻¹ при 0,1 M NaCl и комнатной температуре. |
| format |
Article |
| author |
Бабаян, Ю.С. |
| author_facet |
Бабаян, Ю.С. |
| author_sort |
Бабаян, Ю.С. |
| title |
Связывание бромистого этидия с полирибогуаниловой кислотой |
| title_short |
Связывание бромистого этидия с полирибогуаниловой кислотой |
| title_full |
Связывание бромистого этидия с полирибогуаниловой кислотой |
| title_fullStr |
Связывание бромистого этидия с полирибогуаниловой кислотой |
| title_full_unstemmed |
Связывание бромистого этидия с полирибогуаниловой кислотой |
| title_sort |
связывание бромистого этидия с полирибогуаниловой кислотой |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1989 |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154973 |
| citation_txt |
Связывание бромистого этидия с полирибогуаниловой кислотой / Ю.С. Бабаян // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 79-82. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT babaânûs svâzyvaniebromistogoétidiâspoliriboguanilovojkislotoj |
| first_indexed |
2025-07-14T07:00:36Z |
| last_indexed |
2025-07-14T07:00:36Z |
| _version_ |
1837604732024127488 |
| fulltext |
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. The crystallization of ribosomal proteins from the 50S subunit of the Escherichia coll
and Bacillus stearothermophilus ribosome / K. Appelt, J. Dijk, R. Reinhardt et a l . / /
J. Biol. Chem.— 1981.—256, N 22.—P. 11787—11790.
2 Appelt KWhite S. W., Wilson K- S. Proteins of the Bacillus stearothermophilus ribo-
some. Crystallization of proteins L30 and S 5 / / I b i d . — 1983.—258, N 21.—P. 13328—
13330.
3. Liljas A., Mewcower Μ. E. Purification and crystallization of a protein complex
from Bacillus stearothermophilus ribosomes / / J. Мої. Biol.—1981 .—153, N 2 -
P. 393—398.
4. Седельникова С. Э. Выделение индивидуальных белков из 50S субчастицы рибосом
Thermus thermophilus. Кристаллизация белка TL7. / / Биополимеры и клетка.—
1987,—3, № 3.—С. 163—166.
5. Cryslall structure of a prokaryotic ribosomal protein / К- S. Wilson, К. Appelt, S. Bad-
ger et al. / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1986.—83, N 19.—P. 7251—7255.
6. Кристаллизация 30S субчастиц рибосом Thermus thermophilus / Μ. Μ. Юсупов,
С. Д. Траханов, В. В. "Барынин и д р . / / Д о к л . АН СССР.— 1987,—292, .Nb 5.—
С. 1271 — 1274.
7. Гогия 3. В., Юсупов М. M., Спирина Т. Н. Структура рибосом Thermus thermophilus.
1. Метод выделения и очистки рибосом/ /Молекуляр . биология.— 1986.—20, № 2.—•
С. 519—526.
8. Kenny GLambert G. AL, Traut R. R. Cross-linking of ribosomes using 2-iminothiola-
ne(methyl-4-mercaptobutyrimidate) and identification of cross-linked proteins by di-
agonal polyacrylamide sodium dodecyl sulphate gel e lec t rophores i s / /Meth . Enzy-
mol.— 1979,—59,—P. 534—550.
9. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacte-
riophage T4 U Nature.— 1970.—227, N 5259.— P. 680—685.
Ин-т белка АН СССР, Пущино Получено 09.06.88
ISOLATION AND CRYSTALLIZATION OF RIBOSOMAL PROTEIN TS9
S. Ch. Agalarου, I. A. Eliseikina
Institute of Protein Research,
Academy of Sciences of the USSR, Pushchino, Moscow Region
S u m m a г у
A method is suggested to isolate ribosomal protein TS9 from 30S subparticles of ribo-
somes from extremal-thermophilic bacterium Thermus thermophilus. Rhomb-shaped cry-
stals of this protein with maximal dimensions of 0.5 mm have been obtained. A method
of vapour diffusion in a «hanging» drop with 2-inethyl-2.4-pentanediol (MPD) as a pre-
cipitant has been used for crystallization.
УДК 577.323
Ю. С. Бабаян
СВЯЗЫВАНИЕ БРОМИСТОГО ЭТИДИЯ
С ПОЛИРИБОГУАНИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ
Исследовано связывание бромистого этидия (БЭ) с полирибогуаниловой кислотой по
характеру изменения спектров поглощения. Расчеты показали, что стехиометрия насы-
щения составляет одну молекулу БЭ на пять гуанинов с константой связывания (5,2+
±0,8) -IO4 Ai-1 при 0,1 M NaCl и комнатной температуре.
Введение. Взаимодействие бромистого этидия (БЭ) с нуклеиновыми
кислотами исследовано довольно хорошо [1—6]. В частности, было по-
казано, что в физиологических условиях взаимодействие носит интер-
калирующий характер [1—3], причем стехиометрия насыщения состав-
ляет одну молекулу БЭ на две пары оснований [1, 2, 4, 6]. Характер
связывания слабо зависит от GC-содержания для Д Н К [1] и очень
сильно — для двуспиральных РНК [6].
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 6 — 9-92 1
Структура поли (G) в растворе исследована недостаточно. Следует
отметить, что в отличие от других гомополимеров поли (G) не находит-
ся в одноцепочечной форме [1, 7]. Точная структура поли (G) до кон-
ца не установлена. Известно, однако, что молекулы поли (G) могут об-
разовывать как двуспиральные, так и четырехспиральные струк-
туры [7].
В данной работе изучено взаимодействие БЭ с поли (G) и опреде-
лены термодинамические параметры связывания.
Материалы и методы. В работе использован поли(G) («Pharmacia», Швеция) ,
БЭ («Sigma», США), NaCl и трис («Serva», Ф Р Г ) . Поли(G) применяли без дополни-
тельной очистки. Концентрацию использованных соединений определяли с помощью
следующих коэффициентов экстинкции: поли(О)—ε 2 6ο(ρ) = 9 9 0 0 M - 1 см" 1 и БЭ —
Рис. 1. Изменение спектров поглоще-
ния БЭ при связывании с поли (G) в
буфере при комнатной температуре.
Концентрация поли (G) в растворе
составляла: С р = 8,65-10~5 ( / ) ;
2,3· Ю - 4 (2); 4 ,1 - IO- 4 (3); 6,1 · 1 0 - 4
(4) и 1 ,2 · IO - 3 M (5). В процессе тит-
рования концентрация БЭ остается
постоянной (Со = 1,4· 1 0 - 4 М) . Сплош-
ная линия — спектр поглощения БЭ в
отсутствие поли (G)
Fig. 1. The change in absorpt ion
spectra of ethidium bromide bound to
poly (G) in the buffer at room tempe-
rature. The concentrat ion of poly(G)
in the solution equals: 8.65· IO - 5 ( / ) ,
2 .3-IO" 4 (2), 4.1 · 1 0 " 4 M / p (3).
In the process of t i t rat ion the ethidi-
um bromide concentrat ion remains
constant ( C 0 = 1.4· IO-4 M) . A conti-
nuous line — an absorpt ion spectrum
of ethidium bromide without poly(G)
Подставляя в уравнение (1) значения C0 и KD, получаем, что CM= 1,47· 10~4 М. Сле-
довательно, всего 0,2 % всех молекул БЭ образуют димеры и поэтому в условиях
данного эксперимента процессом димеризации вполне можно пренебречь.
Результаты и обсуждение. Взаимодействие БЭ с поли(G) исследо-
вали по характеру изменения спектров поглощения БЭ в видимой об-
ласти спектра при связывании с поли (G). На рис. 1 показаны спектры
поглощения свободного БЭ и в комплексе с поли (G). Как следует из
рисунка, при постоянной концентрации БЭ с увеличением содержания
поли (G) в растворе наблюдается гипохромизм и смещение максимума
поглощения (при 480 нм) в длинноволновую область. При этом появ-
ляются две четко выраженные изобестические точки при 396 и 518 нм,
расположение которых не меняется с увеличением концентрации по-
80 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3
6480 = 5850. Взаимодействие поли (G) с БЭ исследовали в буфере, содержащем 0,1 M
NaCl, 0,01 M трис, рН 7,5, при комнатной температуре.
Спектры поглощения получены на спектрофотометре «Сагу-219» (США). Кон-
центрация БЭ при титровании оставалась постоянной ( C 0 ^ 10~4 М) . Молекулы БЭ в
растворе могут образовывать димеры, тримеры и т. д. Исследуя связывание БЭ с по-
ли (G), необходимо работать с такими его концентрациями, при которых можно пре-
небречь процессом димеризации. Учитывая максимальную концентрацию БЭ в дан-
ной работе (C0 = 1,5· IO - 4 М) , можно определить концентрацию мономеров в раство-
ре, зная, что константа димеризации при 0,1 M NaCl и 25 °С равна KD = 70 M " 1 [2].
Процесс димеризации характеризуется уравнением 2CM+±CD или CD = KDC2
m, где
См и CD — концентрации мономеров и димеров соответственно. С другой стороны,
ли(G) . Следовательно, в данных условиях образуется лишь одна спек-
трофотометрическая форма поли (G)-связанного БЭ. При некоторых
значениях Cp/C0, где Cp — молярная концентрация фосфатов поли (G),
C0 — молярная концентрация БЭ в растворе, дальнейшее изменение
спектров поглощения прекращается — все молекулы БЭ находятся в
связанном состоянии. Из спектров поглощения (рис. 1) построена за-
висимость поглощения при 480 нм (А48о) от концентрации поли (G)
(рис. 2). Для сравнения на рис. 2 приведена также указанная зависи-
мость при связывании БЭ с двуспиральным синтетическим полирибо-
нуклеотидом поли(G)-поли(С), который рассмотрен в работе [6]. Как
следует из этого рисунка, связывание БЭ гораздо сильнее с поли (G),
чем с поли(G)-поли(С), причем если для комплексов с относительной
Рис. 2. Характер изменения поглощения БЭ при 480 нм при связывании с поли(G)-по-
ли (С) ( / ) и поли(G) (2) в буфере при комнатной температуре
Fig. 2. The pattern of changes in ethidium bromide absorption at 480 nm, at binding to
poly(G)-poly (C) (1) and poly(G) (2) in the buffer at room temperature
Рис. 3. Изотерма связывания, построенная с помощью спектрофотометрического тит-
рования БЭ с поли (G) в буфере при комнатной температуре
Fig. 3. Binding isotherm plotted by spectrophotometric titration of ethidium bromide
with poly(G) in the buffer at room temperature
концентрацией Cp/C^ 10 БЭ находится в практически полностью свя-
занном состоянии для поли (G), то этого не наблюдается для поли (G) X
Хполи(С) .
Для расчета константы связывания и стехиометрии комплекса по-
ли (G) -БЭ при насыщении из кривых спектрофотометрического титро-
вания (рис. 1) определяли концентрации свободного (Cf) и связанно-
го (Cb) БЭ по формуле (2) и анализировали изотермы адсорбции в ко-
ординатах Скэтчарда (зависимость r/Cf от г)
где г =Cb/Cp, К — константа связывания БЭ с поли (G), η — параметр
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 6 — 9-92 81
где A0 и AOO — поглощение БЭ при 480 нм свободного и связанного с
поли (G), А — поглощение при промежуточных концентрациях БЭ. A00
определяли линейной экстраполяцией зависимости А от 1/Cp при
1/Ср->0.
Как следует из рис. 3, связывание БЭ с поли (G) характеризуется
нелинейной изотермой адсорбции, которая хорошо описывается теоре-
тической зависимостью (3) для некооперативного связывания лигандов
на гомополимере [8, 9]:
характеризующий стехиометрию комплекса поли (G) -BS при насыще-
нии и равный числу оснований полимера, занимаемых одной связан-
ной молекулой БЭ. Расчеты, проведенные согласно уравнению (3), по-
казали, что при 25 °С K= (5,2+0,8) · IO4 M - 1 и п=5, т. е. одна моле-
кула БЭ при насыщении связывается с пятью азотистыми основания-
ми. Для сравнения отметим, что стехиометрия насыщения комплекса
БЭ с комплементарными двуспиральными нуклеиновыми кислотами со-
ставляет п = 4 . Как было показано в работе [6], для связывания БЭ
с поли(G)-поли(С) в аналогичных условиях получено значение K=
= (0 ,8+0,2) . IO3 M - 1 , что приблизительно на порядок меньше значе-
ния, полученного для комплексов поли(G)-БЭ. Зная константу связы-
вания, можно определить изменение свободной энергии Гиббса (AG)
при связывании по формуле (4):
ΔG = - R T In К, (4)
что составляет A G = — ( 6 , 5 + 0 , 2 ) ккал/моль. Отметим, что при связы-
вании БЭ с двуспиральным поли(О)-поли(С) для изменения свобод-
ной энергии в работе [6] получено значение —(4,0+0,3) ккал/моль.
Следовательно, параметры, характеризующие связывание БЭ с мо-
лекулами поли (G), отличаются от таковых для комплексов БЭ с дву-
спиральным полирибонуклеотидом поли(G)-поли(С). Эти отличия,
должно быть, обусловлены особенностью организации вторичной струк-
туры поли (G) в растворе.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия.— М. : Мир, 1985.— Т. 3.—534 с.
2. Nelson J. W., Tinoco I., Jr. Intercalation of ethidium ion into DNA and RNA oligo-
nucleotides / / B iopo lymer s . - 1984.—23, N 2 .—P. 213—233.
3. Aktipis S., Kindelis A. Optical properties of the deoxyribonucleic acid — ethidium bro-
mide complex. Effect of sal t / /Biochemistry .—1973.—12, N 6 .—P. 1213—1221.
4. Bresloff J. L., Crothers D. M. Equilibrium studies of ethidium — polynucleotide inter-
ac t ions / / Ib id .—1981.—20, N 12.—P. 3547—3553.
5. Waring M. J. DNA modification and c a n c e r / / A n n u . Rev. Biochem.— 1981.—50.—
P. 159—192.
6. Base specificity in the interaction of ethidium with synthetic polyribonucleotides /
Yu. Babayan, G. Manzini, L. E. Xodo, F. Q u a d r i f o g l i o / / N u c l . Acids Res.— 1987.—15,
N 14.—P. 5803—5812.
7. Saenger W. Principles of nucleic acid structure.— New York: Springer, 1984.—540 p.
8. Заседателев А. С., Гурский Г. В., Волькенштейн Μ. В. Теория одномерной адсорб-
ции. 1. Адсорбция малых молекул на гомополимере/ /Молекуляр. биология.—
1971.—5, № 2.—С. 245—252.
9. McGhee J. D., von Hippel Р. Н. Theoretical aspects of DNA-protein interactions: co-
operative and non-co-operative binding of large ligands to a one-dimensional homo-
geneous l a t t i c e / / J . Мої. Biol— 1974.—86, N 3 .—P. 469—489.
Ереван, гос. ун-т Получено 16.12.87
ETHIDIUM BROMIDE BINDING TO POLYRIBOGUANYLIC ACID
Yu. S. Babayan
State University, Department of Molecular Physics and Biophysics, Yerevan
S u m m a r y
The binding of ethidium bromide to polyriboguanylic acid has been investigated accor-
ding to the character of changes in absorption spectra. The calculations have shown that
the saturation stoichiometry at binding makes up one ethidium bromide molecule per 5
guanine bases with binding constant (5.2±0.8) · 104 M - 1 in the presence of 0.1 M NaCl
and at room temperature.
82 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 6 — 9-92 82
|