Моноклональные антитела для одностадийного получения высокоочищенной урокиназы
С помощью специально разработанной схемы скрининга получены высокоаффинные и специфичные моноклональные антитела к человеческой урокиназе. На их основе создан иммуносорбент для одностадийного выделения очищенной урокиназы из мочи....
Збережено в:
| Дата: | 1989 |
|---|---|
| Автори: | , , , , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154983 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Моноклональные антитела для одностадийного получения высокоочищенной урокиназы / Г.А. Кратасюк, Л.З. Якубов, В.В. Синицын, С.П. Домогатский, О.В. Рохлин, С.В. Кольцова, Н.А. Быняева, З.Д. Федорова, Г.В. Самсонов // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 95-101. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-154983 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1549832019-06-18T01:31:55Z Моноклональные антитела для одностадийного получения высокоочищенной урокиназы Кратасюк, Г.А. Якубов, Л.З. Синицын, В.В. Домогатский, С.П. Рохлин, О.В. Кольцова, С.В. Быняева, Н.А. Федорова, З.Д. Самсонов, Г.В. Структура и функции биополимеров С помощью специально разработанной схемы скрининга получены высокоаффинные и специфичные моноклональные антитела к человеческой урокиназе. На их основе создан иммуносорбент для одностадийного выделения очищенной урокиназы из мочи. За допомогою спеціально розробленої схеми скринінгу отримано високоафінні і специфічні моноклональні антитіла до урокінази людини. На їхній основі створено імуносорбент для одностадійного виділення очищеної урокінази з сечі. Five independent hybridom clones producing monoclonal antibodies with high affinity and specificity for human urokinase are isolated using specially adopted screening technique. Both inhibiting urokinase activity and noninhibiting antibodies are obtained. They do not crossreact with other serin proteases and some of them have dissociation constants lower than 10 pmol/1. Immunosorbents with these monoclonal antibodies are effective for isolation of urokinase from urine: 2 mg of antibodies attached to 1 ml of sepharose binds 0.5 mg of urokinase. 1989 Article Моноклональные антитела для одностадийного получения высокоочищенной урокиназы / Г.А. Кратасюк, Л.З. Якубов, В.В. Синицын, С.П. Домогатский, О.В. Рохлин, С.В. Кольцова, Н.А. Быняева, З.Д. Федорова, Г.В. Самсонов // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 95-101. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000C9 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154983 577.15—576.8.097.3 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров |
| spellingShingle |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Кратасюк, Г.А. Якубов, Л.З. Синицын, В.В. Домогатский, С.П. Рохлин, О.В. Кольцова, С.В. Быняева, Н.А. Федорова, З.Д. Самсонов, Г.В. Моноклональные антитела для одностадийного получения высокоочищенной урокиназы Биополимеры и клетка |
| description |
С помощью специально разработанной схемы скрининга получены высокоаффинные и специфичные моноклональные антитела к человеческой урокиназе. На их основе создан иммуносорбент для одностадийного выделения очищенной урокиназы из мочи. |
| format |
Article |
| author |
Кратасюк, Г.А. Якубов, Л.З. Синицын, В.В. Домогатский, С.П. Рохлин, О.В. Кольцова, С.В. Быняева, Н.А. Федорова, З.Д. Самсонов, Г.В. |
| author_facet |
Кратасюк, Г.А. Якубов, Л.З. Синицын, В.В. Домогатский, С.П. Рохлин, О.В. Кольцова, С.В. Быняева, Н.А. Федорова, З.Д. Самсонов, Г.В. |
| author_sort |
Кратасюк, Г.А. |
| title |
Моноклональные антитела для одностадийного получения высокоочищенной урокиназы |
| title_short |
Моноклональные антитела для одностадийного получения высокоочищенной урокиназы |
| title_full |
Моноклональные антитела для одностадийного получения высокоочищенной урокиназы |
| title_fullStr |
Моноклональные антитела для одностадийного получения высокоочищенной урокиназы |
| title_full_unstemmed |
Моноклональные антитела для одностадийного получения высокоочищенной урокиназы |
| title_sort |
моноклональные антитела для одностадийного получения высокоочищенной урокиназы |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1989 |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154983 |
| citation_txt |
Моноклональные антитела для одностадийного получения высокоочищенной урокиназы / Г.А. Кратасюк, Л.З. Якубов, В.В. Синицын, С.П. Домогатский, О.В. Рохлин, С.В. Кольцова, Н.А. Быняева, З.Д. Федорова, Г.В. Самсонов // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 95-101. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT kratasûkga monoklonalʹnyeantiteladlâodnostadijnogopolučeniâvysokoočiŝennojurokinazy AT âkubovlz monoklonalʹnyeantiteladlâodnostadijnogopolučeniâvysokoočiŝennojurokinazy AT sinicynvv monoklonalʹnyeantiteladlâodnostadijnogopolučeniâvysokoočiŝennojurokinazy AT domogatskijsp monoklonalʹnyeantiteladlâodnostadijnogopolučeniâvysokoočiŝennojurokinazy AT rohlinov monoklonalʹnyeantiteladlâodnostadijnogopolučeniâvysokoočiŝennojurokinazy AT kolʹcovasv monoklonalʹnyeantiteladlâodnostadijnogopolučeniâvysokoočiŝennojurokinazy AT bynâevana monoklonalʹnyeantiteladlâodnostadijnogopolučeniâvysokoočiŝennojurokinazy AT fedorovazd monoklonalʹnyeantiteladlâodnostadijnogopolučeniâvysokoočiŝennojurokinazy AT samsonovgv monoklonalʹnyeantiteladlâodnostadijnogopolučeniâvysokoočiŝennojurokinazy |
| first_indexed |
2025-07-14T07:01:05Z |
| last_indexed |
2025-07-14T07:01:05Z |
| _version_ |
1837604763113357312 |
| fulltext |
У Д К 577.15—576.8.097.3
Г. А. Кратасюк, Л. З. Якубов, В. В. Синицын, С. П. Домогатский,
О. В. Рохлин, С. В. Кольцова, Н. А. Быняева, З. Д. Федорова,
Г. В. Самсонов
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ДЛЯ ОДНОСТАДИЙНОГО
ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОЙ УРОКИНАЗЫ
С помощью специально разработанной схемы скрининга получены высокоаффинные и
специфичные моноклональные антитела к человеческой урокиназе. На их основе создан
иммуносорбент для одностадийного выделения очищенной урокиназы из мочи.
Введение. Важную роль в фибринолитическом механизме удаления
тромбов играют активаторы плазминогена •— специфические сериновые
протеазы, — превращающие плазминоген (широко распространенный в
крови и тканях зимоген) в плазмин. Плазмин — протеаза с широкой
трипсиноподобной субстратной специфичностью, которая и осуществля-
ет фибринолизис. Одним из активаторов плазминогена человека явля-
ется урокиназа [1]. Клинические испытания показали, что урокиназа
успешно стимулирует рассасывание тромбов in vivo, в связи с чем она
применяется при лечении тромбоэмболий [2]. Однако широкому ее ис-
пользованию в клинической практике препятствует высокая стоимость
препарата, связанная со сложностью промышленной процедуры выде-
ления и очистки фермента. Основным источником урокиназы сейчас яв-
ляется человеческая моча, где фермент содержится в низкой концент-
рации (1 нмоль/л). Его выделяют с помощью серии ионообменных и
гидрофобных хроматографий и гель-филоьтрации [3—6]. При этом про-
цедура является достаточно сложной и не позволяет получать фермент
с высоким выходом. Исследования последних лет показали, что в це-
лом ряде случаев для выделения и очистки белков можно использовать
сорбенты с иммобилизованными антителами. В связи с этим представ-
ляется весьма перспективной и актуальной разработка метода и тех-
нологии выделения высокоочищенной урокиназы на иммуносорбентах с
моноклональными антителами к ферменту. Следует отметить, что низ-
кое содержание антигена в исходном материале (урокиназы в моче) и
высокая концентрация других органических веществ, способных блоки-
ровать биоспецифические сорбенты, делает задачу их получения не-
тривиальной.
В настоящей работе, исполіьзуя специально разработанный метод
скрининга гибридомных клонов, были получены высокоаффинные и спе-
цифичные моноклональные антитела к урокиназе человека. На основе
иммуносорбентов с данными антителами предложен метод одностадий-
ного получения высокоочищенной урокиназы из мочи.
Материалы и методы. Урокиназа человека («Calbiochem», США; «Sigma», США),
плазминоген человека («Sigma»), фибриноген бычий (СССР, Каунас, предприятие по
производству бактерийных препаратов), тромбин человека («Sigma»), трипсин бычий
(«Мегск», ФРГ), химотрипсин человека («Sigma»), эластаза свиньи («Sigma»), хро-
могенный субстрат для плазмина D-Val-Leu-Lys-pNa-2HCl («Serva», ФРГ), хромоген-
ний субстрат для урокиназы Glu-Gly-Arg-pNa-2НС1 («Serva»), сефароза CL-4B
(«Pharmacia», Швеция). Прочие реактивы имели квалификацию не ниже «химически
чистый».
П о л у ч е н и е ч а с т и ч н о о ч и щ е н н о г о п р е п а р а т а у р о к и н а з ы .
Частично очищенный препарат урокиназы с активностью 20000 ед. Плоуга на 1 мг
белка был получен последовательной гель-хроматографической очисткой на ультраге-
лях АсА-44 и АсА-54 и сефадексе G-25 препарата урокиназы, выделенного из депигмен-
тированной мочи по методу [6] с использованием высокопроницаемого катионита био-
карб-Т. Полученный препарат урокиназы использован в данной работе для иммуниза-
ции мышей.
И м м у н и з а ц и я и с л и я н и е . Мышам линии Balb/с были проведены три
еженедельные подкожные инъекции урокиназы из расчета 30 мкг фермента на мышь.
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 7 — 9-92 95
Первую иммунизацию осуществляли в полном адъюванте Фрейнда, вторую и тре-
тью— в неполном. Четвертую иммунизацию проводили внутрибрюшинным введением
50 мкг урокиназы в физиологическом растворе за трое суток до гибридизации. Для гиб-
ридизации брали селезенки двух мышей. Слияние и клонирование проводили, как опи-
сано ранее [7], с использованием предварительной очистки спленоцитов в перколе [8].
Из посеянных 600 ячеек гибридные клоны были идентифицированы в 490 ячейках, куль-
туральные среды из которых и были проверены на наличие специфических антител
к урокиназе.
О т б о р к л о н о в , п р о и з в о д я щ и х а н т и т е л а к у р о к и н а з е . Для вы-
явления антител к урокиназе в культуральных средах проводили двухэтапный скри-
нинг: 1) радиоиммунный анализ и 2) «функциональный» тест.
1. Препарат урокиназы ((«Sigma», 10 мкг/мл) сорбировали на полистирол в
ячейках планшетов Microtest («Linbro», США). Затем планшеты промывали 10 мМ
фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 150 мМ NaCl и 0,05%-ный твин-20 (раст-
вор А), после чего заполняли тем же буфером и выдерживали в течение 30 мин при
комнатной температуре для блокирования свободных мест адсорбционного связывания
на пластике. В ячейки с сорбированной урокиназой вносили по 0,1 мл исследуемого
образца и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Несвязавшийся белок отмы-
вали раствором А. Специфично связавшиеся антитела выявляли с помощью меченных
радиоактивным иодом-125 кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши.
2. Положительные по радиоиммунному тесту культуральные среды испытывали
на способность содержащихся в них антител связывать урокиназу из мочи. Для этого
по 0,3 мл культуральных сред пропускали через микроколонки с иммобилизованными
кроличьими антителами против иммуноглобулинов мыши (0,025 мл сефарозы с 0,1 мг
антител). Затем колонки промывали раствором А, пропускали через них 3 мл мочи
10 ед. Плоуга/мл) и определяли активность урокиназы в моче, прошедшей через
колонку. Ответ считали положительным, если в моче на выходе из колонки оставалось
не более 20 % исходной урокиназной активности. Образцы, пропущенные через сорбен-
ты с суммарной фракцией иммуноглобулинов мыши (отрицательный контроль), содер-
жали не менее 90 % исходной урокиназной активности.
К л а с с ы и п о д к л а с с ы а н т и у р о к и н а з н ы х и м м у н о г л о б у л и н о в
определяли в реакции торможения иммуносорбции с помощью радиоактивно меченных
подкласс-специфичных поликлональных кроличьих антител [7].
О п р е д е л е н и е а к т и в н о с т и у р о к и н а з ы . Используя в качестве стан-
дарта урокиназу «Calbiochem», активность исследуемых образцов определяли с по-
мощью а) фибриновых пластинок, содержащих плазминоген [9]; б) хромогенного суб-
страта плазмина D-Val-Leu-Lys-pNa [10]; в) хромогенного субстрата урокиназы
Glu-Gly-Arg-pNa [11]. Ингибирование активности урокиназы моноклональными анти-
телами изучали как на фибриновых пластинках, так и с использованием хромогенных
субстратов. В первом случае антитела добавляли в раствор фибриногена до полимери-
зации, во-втором— в реакционную смесь.
Э л е к т р о ф о р е з и и з о э л е к т р о ф о к у с и р о в а н и е . Электрофорез в
присутствии DS-Na проводили в пластинках градиентного (от 5 до 10%) полиакрил-
амидного геля (ПААГ) в буферной системе Лаемли [12]. Гели либо окрашивали ку-
масси бриллиантовым R-250, либо после отмывки DS-Na фосфатным буферным раство-
ром с 0,1 % тритона Х-100 использовали для получения зимограмм по методу [13].
Аналитическое изоэлектрофокусирование проводили в 4 %-ном ПААГ в присутст-
вии 6 M мочевины и 0,1 % тритона Х-100 в интервале рН 3—10 на установке Мульти-
фор («LKB», Швеция). Гели окрашивали кумасси бриллиантовым R-250 после отмыв-
ки амфолинов, согласно инструкции фирмы.
П р о ч и е п р о ц е д у р ы . Определение концентрации белка проводили спектро-
фотометрически, считая, что 1 %-ные растворы иммуноглобулинов и урокиназы при
280 нм имеют коэффициент экстинкции E = 14.
О д н о с т а д и й н о е в ы д е л е н и е у р о к и н а з ы и з ч е л о в е ч е с к о й
м о ч и н а и м м у н о с о р б е н т а х . В свежеполученной моче рН доводили до 8,6, до-
бавляя 5 M NaOH, образовавшийся осадок отстаивали в течение 30 мин. Супернатант
титровали до рН 7,0 1 M соляной кислотой и пропускали через иммуносорбент — се-
фароза CL-4B с ковалентно пришитыми моноклональными антителами против урокина-
зы (2 мг антител на 1 мл геля). Сорбент промывали 10 мМ фосфатным буферным ра-
створом, рН 7,4, содержащим 0,5 M NaCl и 0,1 % тритона Х-100. Элюцию урокиназы
проводили 0,2 M раствором глицина, рН 2,5.
96 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 7 — 9-92 96
Результаты и обсуждение. Иммунизацию мышей урокиназой и гиб-
ридизацию проводили по обычно применяющейся схеме (см. «Материа-
лы и методы»). Полученные гибридные клетки рассевали в ячейки
планшета Microtest («Linbro»). Всего было засеяно 600 ячеек, рост
гибридомных клеток наблюдался в 490 ячейках. Свойства моноклональ-
ных антител во многом зависят от схемы скрининга, примененной для
отбора гибридом, которую следует строить таким образом, чтобы в нее
были включены факторы отбора, способствующие селекции клонов,
производящих антитела с необходимым набором свойств. В данном
\а в а г л й
Рис. 1. Электрофорез моноклональных антител к урокиназе: а — UIG-I ; б — UIG-2;
в — UIG-3; г — UNG-4; д — UNG-5; є — стандарты молекулярной массы 97000; 68000;
47000; 25000; 17000; 14000
Fig. 1. SDS electrophoresis of monoclonal antibodies against urokinase: a — UIG-I :
6 —UIG-2; β —UIG-3; г —UNG-4; д — UNG-5; e — molecular weight s tandards:
97000; 68000; 47000; 25000; 17000; 14000
случае для исследования культуральных сред гибридом применяли
двухэтапный скрининг, специально адаптированный для выявления вы-
сокоаффинных и специфичных антител, способных в составе иммуно-
сорбента эффективно и избирательно сорбировать урокиназу из разбав-
ленных многокомпонентных белковых растворов (например, мочи).
Культуральные среды гибридом, ответившие положительно при обыч-
ном радиоиммунном анализе на планшетах, пропускали через микро-
колонки, аффинно связывающие мышиные иммуноглобулины. Получен-
ные таким образом «двухслойные» сорбенты проверяли на способность
связывать урокиназу непосредственно из мочи. Если культур а лъные
среды гибридом содержали антитела к урокиназе, то в моче, прошед-
шей через «двухслойный» сорбент, падала активность урокиназы. Вве-
дение второго теста позволило существенно сократить объем работ по
культивированию гибридом и клонировать только те популяции гибри-
домных клеток, которые производили антитела, удовлетворявшие по-
ставленной задаче. Так, из 490 первичных популяций, культуральные
среды которых были исследованы радиоиммунным тестом, положитель-
но ответивших было 48. Из них по результатам второго теста были ото-
браны девять популяций, которые и были клонированы. В результате
получены пять независимых (происходящих из разных первичных по-
пуляций) клонов, производящих высокоаффинные и специфичные ан-
титела против человеческой урокиназы, связывающиеся как с высоко-,
так и с низкомолекулярной формами фермента. Все клоны были раз-
множены в виде асцитных опухолей в мышах линии Balbfcy а антитела
из асцитных жидкостей были очищены высаливанием 18 %-ным суль-
фатом натрия и последующей хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.
Результаты электрофореза и изоэлектрофокусирования (рис. 1, 2) сви-
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 7 — 9-92 97
детельствуют о том, что получены гомогенные препараты пяти различ-
ных антител. Все они относятся к IgGl подклассу иммуноглобулинов.
Антитела UIG-1, UIG-2 и UIG-3 ингибируют активность урокиназы как
в тесте на фибриновых пластинках, так и с хромогенным субстратом
гілазмина D-Val-Leu-Lys-pNa (рис. 3, 4) . Амидолитическая активность
Рис. 2. Изоэлектрофокусирование моноклональных антител к урокиназе: а — UIG-1;
б — UIG-2; в —UIG-3 ; г — UNG-4; д — UNG-5
Fig. 2. Isoelectrofocusing of monoclonal antibodies against urokinase: a — UIG-1; б —
UIG-2; e — UIG-3; г —UNG-4; д — UNG-5
Рис. 3. Ингибирование урокиназы моноклональными антителами (определение актив-
ности урокиназы — н а пластинках фибринового геля): a — UNG-4; б — UNG-5; в —
UIG-I ; г — UIG-2; д — UIG-3; е — контроль в отсутствие антител. Антитела в кон-
центрации 10 нмолей/л добавляли в гель до полимеризации. Концентрация урокиназы
10 нмолей/л
Fig. 3. Inhibition of urokinase activity by monoclonal antibodies studies on fibrin gel
plates: a — UNG-4; 6 — UNG-5; в — UIG-1; г —UIG-2; д — UIG-3; control without
antibodies. Antibodies c o n t e n t — 1 0 nmol/1. Urokinase concentration — 10 nmol/1
урокиназы с хромогенным субстратом Glu-Gly-Arg-pNa ингибируется
только антителами UIG-3. Антитела UNG-4 и UNG-5 не ингибируют
активности урокиназы (рис. 2). Аффинность полученных антител мож-
но оценить по константам ингибирования. Из данных, приведенных на
рис. 4, следует, что константа ингибирования для антител UIG-3 состав-
ляет 1 нмоль/л, для UIG-I и UIG-2— 10 пмолей/л. Величины констант
говорят о высокой аффинности антител. Проверку специфичности по-
лученных антител проводили с помощью тестов связывания и тормо-
98 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 7 — 9-92 98
жения иммуносорбции посторонними антигенами. Ниже приведены ан-
тигены, которые были исследованы как в тесте прямого связывания,
так и торможения иммуносорбции и не проявляли сродства к монокло-
нальным антителам к урокиназе:
1. Трипсин
2. Химотрипсин
3. Плазмин
4. Эластаза
5. Пепсин
6. Тромбин
7. Овальбумин i
8. Фибриноген
9. Гемоглобин
10. Человеческий сывороточный альбумин
11. Тканевый активатор плазминогена
Все антитела сохраняют функциональную активность после иммо-
билизации ковалентной пришивкой на агарозный гель. Иммуносорбен-
ты эффективно связывают урокиназу из мочи: 1 мл сорбента с 2 м г
антител связывает до 90 % уро-
киназной активности из 5 л мо-
чи (около 0,5 мг урокиназы).
После элюции урокиназы препа-
рат имеет удельную активность
140 000 ед. Плоуга на 1 мг бел-
ка и содержит смесь низко- и
высокомолекулярной форм уро-
киназы (рис. 5). Выход фермен-
та в конечном препарате по от-
ношению к исходному количест-
ву в моче составляет 50—
60%.
Рис. 4. Ингибирование урокиназы моноклональными антителами. Активность опреде-
ляли с помощью хромогенного субстрата плазмина. Концентрация урокиназы 10 пмо-
лей/л, UIG — отрицательный десятичный логарифм молярной концентрации антител
UIG-I ( / ) , UIG-2 (2), UIG-3 (3)
Fig. 4. Inhibition of urokinase activity by monoclonal antibodies studied with plasmin
chromogenic substrate. Urokinase concentration — 10 pmol/1; U I G - n e g a t i v e Ig of an-
tibodies concentration UIG-1 ( / ) ; UIG-2 (2) and UIG-3 (<3)
Рис. 5. Электрофорез и зимография препарата урокиназы, полученного из мочи одно-
стадийной очисткой на сорбенте с моноклональными антителами
Fig. 5. Electrophoresis and zymography of urinary urokinase after one-step purification
on sorbent with monoclonal antibodies
Задача получения моноклональных антител к урокиназе, способ-
ных в составе иммуносорбента эффективно связывать фермент непо-
средственно из человеческой мочи, с целью создания промышленной
технологии является достаточно сложной. Это связано, в первую оче-
редь, с тем, что антиген в моче присутствует в чрезвычайно низкой
концентрации (1 нмоль/л). В то же время одним из требований техно-
логии является высокая скорость протока жидкости через колонку с
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 7 — 9-92 99
иммуносорбентом. Таким образом, необходимо обеспечить хорошие ки-
нетические параметры захвата фермента, что предъявляет высокие тре-
бования к аффинности антител. Для отбора клонов гибридных клеток,
продуцирующих высокоаффинные и специфические антитела к уроки-
назе, в работе был предложен двухэтапный вариант скрининга конди-
ционированных культуральных сред. На втором этапе связывание уро-
киназы антителами тестируется по убыванию функциональной актив-
ности этого фермента, что позволяет применять для скрининга неочи-
щенные препараты урокиназы или даже мочу. Низкая концентрация
урокиназы в моче и присутствие разнообразных посторонних белков
создают неблагоприятные условия для образования иммунного комплек-
са антитело — урокиназа. В связи с этим полноценное связывание уро-
киназы из мочи будет наблюдаться только для высокоаффинных и спе-
цифичных антител. По этой причине применение «функционального»
теста позволило из положительно ответивших при радиоиммунном ана-
лизе клонов отобрать лишь клоны — продуценты высокоаффинных ан-
тител, пригодных к созданию иммуносорбентов для выделения уроки-
назы из мочи. Это позволило существенно сократить объем работы по
культивированию и клонированию гибридом — из 48 первичных попу-
ляций, ответивших положительно при радиоиммунном анализе, лишь
девять успешно прошли испытания на «функциональном» тесте.
Следует особо отметить, что разработанный метод скрининга мо-
жет оказаться полезным при получении моноклональных антител и к
другим ферментам. Он позволяет работать, имея неочищенный препа-
рат антигена. Известно, что многие ферменты в высокоочищенном виде
либо дороги, либо вообще недоступны. Клоны — продуценты антител к
примесным белкам — отсеиваются на втором этапе скрининга. Ранее
предлагался вариант скрининга с использованием неочищенных препа-
ратов ферментов по ингибированию их активности антителами [14],
однако ограниченность данного метода очевидна — удается получать
лишь ингибирующие моноклональные антитела. В нашем случае уда-
лось, используя лишь частично очищенный препарат урокиназы, полу-
чить как ингибирующие (UIG-1, 2 и 3), так и неингибирующие (UNG-5,
6) моноклональные антитела. Высокие константы связывания (К инг ДЛЯ
UIG-I и UIG-2 10 пмолей/л) !позволили создать эффективные иммуно-
сорбенты, пригодные для создания промышленной технологии односта-
дийного получения высокоочищенной урокиназы из человеческой мочи.
Полученные в работе моноклональные антитела различным обра-
зом модулируют активность урокиназы: UIG-I и UIG-2 ингибируют ак-
тивацию плазминогена, но не ингибируют амидолизиса низкомолеку-
лярного субстрата, в то время как UIG-3 при связывании полностью
инактивирует фермент; UNG-5 и UNG-6 не влияют на ферментативную
активность. Очевидно, что набор антител с таким спектром свойств
важен не только для биотехнологии, но и для исследования кинетиче-
ских свойств и структуры урокиназы. Полученные антитела можно ис-
пользовать и в клинической практике. Здесь следует отметить реаль-
ность создания на их основе диагностических тест-систем на фермент,
а также возможное применение для направленного регулирования его
активности при урокиназной терапии и при развитии патологических
процессов, сопровождающихся повышением уровня урокиназы в тка-
нях, как это известно в случае некоторых видов рака [15].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Colleti D. On the regulation and control of f ib r ino lys i s / /Thromb. Haemostas.—
1981.—43, N 2 .—P. 77—89.
2. Bertele V., Salzmati E. W. Antithrombotic therapy in coronary artery disease / / Ar-
teriosclerosis.—1985.—5, N 2 .—P. 119—134.
3. Shibatani T., Kakimoto T., Chibata /. Purification of high molecular weight urokina-
se from human urine and comparative study of two active forms of urokinase / /
Thromb. Haemostas.— 1983 —49, N 2 .—P. 91—95.
1 0 0 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 7 — 9-92 100
4. Husain S., Gurewich У., Lipinski В. Purification and partial characterization о!
single-chain high molecular weight form of urokinase from human urine / / A r c h . Bio-
chem. and Biophys.— 1983.—220, N 1.—P. 31—38.
5. Huber K·, Kirchheimer /., Binder B. Rapid isolation of HMW urokinase from native
human u r ine / /Thromb. Haemostas.— 1982.—47, N 3.—P. 197—202.
6. Выделение и очистка урокиназы / С. В. Кольцова, Л. К. Шатаева, Т. Ф. Сухарева
и др. / / В о п р . мед. химии.— 1981.—27, № 5.—С. 623—626.
7. Проявление аллельных генов легких цепей иммуноглобулинов в гибридных лимфо-
идных клетках /М. Н. Петросян, А. Б. Червонский, А. Р. Ибрагимов и д р . / / Д о к л .
АН СССР.— 1981.—256, № 2.—С. 509—512.
8. Density separation of spleen cells increases fusion frequency and yield of Ig-produ-
cing hybridomas / P. van Mourik, R. A. Rivero, Th. H. van der Kwast et a l . / / J . Im-
munol. M e t h . - 1984.—68, N 1.— P. 45—53.
9. Astrup T., Mullertz S. The fibrin plate method for estimation fibrinolytic activity / /
Arch. Biochem.— 1951.—40.— P. 346—351.
10. Methods for determination of plasmin, antiplasmin and plasminogen by means of
substrate S-2251 / P . Friberger, M. Knos, S. Gustavsson et a l . / / H a e m o s t a s i s —
1978—7, N 2—3.—P. 138—145.
11. Sumi H., Robbins K. S. A functionally active heavy from human high molecular
weight u r o k i n a s e / / J . Biol. Chem.— 1983.—258, N 13.—P. 8014—8019.
12. Laemmly U. K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of
bacteriophage T4 / / Nature.— 1970.—227, N 5259,—P. 680—685.
13. Granelli-Piperno A., Reich E. A study of proteases and proteases inhibitor complexes
in biological f l u i d s / / J . Exp. Med.— 1978.—148, N 1.—P. 223—234.
14. Monoclonal antibody to human 66000 molecular weight plasminogen activator from
melanoma cells. Specific enzyme inhibition and one-step affinity purification / L. S. Ni-
elsen, J. G. Hansen, P. A. Andreasen et al. / / EMBO J.— 1983.—2.— P. 115—
119.
15. Immunocytochemical localization of urokinase-type plasminogen activator in Lewis
lung ca rc inoma/L . Skriver, L. Larsson, V. Kielberg et a l . / / J . Cell Biol.— 1984.—99,
N 2,— P. 753—758.
Ин-т эксперим. кардиологии Получено 02.11.87
Всесоюз. кардиол. науч. центра АМН СССР, Москва
Ин-т высокомолекуляр. соединений АН СССР, Ленинград
НИИ гематологии и переливания крови МЗ РСФСР, Ленинград
MONOCLONAL ANTIBODIES FOR ONE-STEP ISOLATION
OF HIGHLY PURIFIED UROKINASE
G. A. Kratasyuk, L. Z. Jakubov, V. V. Sinitsyn, D. S. Domogatsky, О. V. Rohklin
Institute of Experimental Cardiology, the All-Union Cardiological
Research Center, Academy of Medical Sciences of the USSR, Moscow
N. A. Bynyaeva, Z. D. Fedorova
Institute of Haematology and Blood Transfusion,
Ministry of Public Health of the RSFSR, Leningrad
S. V. Koltsova, G. V. Samsonov
Institute of High-Molecular Weight Compounds,
Academy of Sciences of the USSR, Leningrad
S u m m a r y
Five independent hybridom clones producing monoclonal antibodies with high affinity
and specificity for human urokinase are isolated using specially adopted screening tech-
nique. Both inhibiting urokinase activity and noninhibiting antibodies are obtained. They
do not crossreact with other serin proteases and some of them have dissociation constants
lower than 10 pmol/1. Immunosorbents with these monoclonal antibodies are effective
for isolation of urokinase from urine: 2 mg of antibodies attached to 1 ml of sepharose
binds 0.5 mg of urokinase.
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № З 101
|