Независимая визуализация рецепторов к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре
Предложен метод, позволяющий независимо визуализовать рецепторы к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре. В основе метода — реконструкция липопротеинов холестериловыми эфирами, содержащими различные хромофоры, рецепторное связывание их с клетками, флюоресцен...
Збережено в:
| Дата: | 1989 |
|---|---|
| Автори: | , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154984 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Независимая визуализация рецепторов к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре / A.А. Крутов, Α.Ю. Мишарин, В.П. Цибульский, Т.Л. Бушуева, B.Р. Бабаев, В.С. Репин // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 102-109. — Бібліогр.: 26 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-154984 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1549842019-06-17T01:31:17Z Независимая визуализация рецепторов к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре Крутов, А.А. Мишарин, А.Ю. Цибульский, В.П. Бушуева, Т.Л. Бабаев, В.Р. Репин, В.С. Структура и функции биополимеров Предложен метод, позволяющий независимо визуализовать рецепторы к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре. В основе метода — реконструкция липопротеинов холестериловыми эфирами, содержащими различные хромофоры, рецепторное связывание их с клетками, флюоресцентная микроскопия клеток при различных длинах волн. Запропоновано метод, що дозволяє незалежно візуалізувати рецептори до нативних і модифікованих ліпопротеїнів низької щільності на клітинах у культурі. В основі методу – реконструкція ліпопротеїнів холестериловими ефірами, що містять різні хромофори, рецепторне зв’язування їх з клітинами, флуоресцентна мікроскопія клітин за різних довжин хвиль. The method is suggested to prepare cholesteryl esters derivatives containing fluorescent chromophores in acyl chains. The reconstitution of low-density lipoproteins (native and malondialdehyde-treated ones) has been carried out by fluorescent cholesteryl esters. Using the receptor mediated binding of fluorescent lipoproteins to human skin fibro-blasts and mouse macrophages the possibility of independent visualization of receptors is shown by means of fluorescent microscopy using observations with different vawe-lenghts. 1989 Article Независимая визуализация рецепторов к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре / A.А. Крутов, Α.Ю. Мишарин, В.П. Цибульский, Т.Л. Бушуева, B.Р. Бабаев, В.С. Репин // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 102-109. — Бібліогр.: 26 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000CA http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154984 577.161.2.011—547.96 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров |
| spellingShingle |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Крутов, А.А. Мишарин, А.Ю. Цибульский, В.П. Бушуева, Т.Л. Бабаев, В.Р. Репин, В.С. Независимая визуализация рецепторов к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре Биополимеры и клетка |
| description |
Предложен метод, позволяющий независимо визуализовать рецепторы к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре. В основе метода — реконструкция липопротеинов холестериловыми эфирами, содержащими различные хромофоры, рецепторное связывание их с клетками, флюоресцентная микроскопия клеток при различных длинах волн. |
| format |
Article |
| author |
Крутов, А.А. Мишарин, А.Ю. Цибульский, В.П. Бушуева, Т.Л. Бабаев, В.Р. Репин, В.С. |
| author_facet |
Крутов, А.А. Мишарин, А.Ю. Цибульский, В.П. Бушуева, Т.Л. Бабаев, В.Р. Репин, В.С. |
| author_sort |
Крутов, А.А. |
| title |
Независимая визуализация рецепторов к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре |
| title_short |
Независимая визуализация рецепторов к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре |
| title_full |
Независимая визуализация рецепторов к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре |
| title_fullStr |
Независимая визуализация рецепторов к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре |
| title_full_unstemmed |
Независимая визуализация рецепторов к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре |
| title_sort |
независимая визуализация рецепторов к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1989 |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154984 |
| citation_txt |
Независимая визуализация рецепторов к нативным и модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре / A.А. Крутов, Α.Ю. Мишарин, В.П. Цибульский, Т.Л. Бушуева, B.Р. Бабаев, В.С. Репин // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 102-109. — Бібліогр.: 26 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT krutovaa nezavisimaâvizualizaciâreceptorovknativnymimodificirovannymlipoproteinamnizkojplotnostinakletkahvkulʹture AT mišarinaû nezavisimaâvizualizaciâreceptorovknativnymimodificirovannymlipoproteinamnizkojplotnostinakletkahvkulʹture AT cibulʹskijvp nezavisimaâvizualizaciâreceptorovknativnymimodificirovannymlipoproteinamnizkojplotnostinakletkahvkulʹture AT bušuevatl nezavisimaâvizualizaciâreceptorovknativnymimodificirovannymlipoproteinamnizkojplotnostinakletkahvkulʹture AT babaevvr nezavisimaâvizualizaciâreceptorovknativnymimodificirovannymlipoproteinamnizkojplotnostinakletkahvkulʹture AT repinvs nezavisimaâvizualizaciâreceptorovknativnymimodificirovannymlipoproteinamnizkojplotnostinakletkahvkulʹture |
| first_indexed |
2025-07-14T07:01:11Z |
| last_indexed |
2025-07-14T07:01:11Z |
| _version_ |
1837604768795590656 |
| fulltext |
УДК 577.161.2.011—547.96
A. А. Крутов, Α. Ю. Мишарин, В. П. Цибульский, Т. Л. Бушуева,
B. Р. Бабаев, В. С. Репин
НЕЗАВИСИМАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ РЕЦЕПТОРОВ
К НАТИВНЫМ И МОДИФИЦИРОВАННЫМ ЛИПОПРОТЕИНАМ
НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ НА КЛЕТКАХ В КУЛЬТУРЕ *
Предложен метод, позволяющий независимо визуализовать рецепторы к нативным и
модифицированным липопротеинам низкой плотности на клетках в культуре. В основе
метода — реконструкция липопротеинов холестериловыми эфирами, содержащими раз-
личные хромофоры, рецепторное связывание их с клетками, флюоресцентная микроско-
пия клеток при различных длинах волн.
Введение. Рецептор-зависимый эндоцитоз липопротеинов низкой плот-
ности ( Л Н П ) клетками интенсивно изучается в связи с участием этого
процесса в патогенезе атеросклероза [1—5]. Установлено, что клетки
макрофагальной природы наряду с рецепторами для нативных Л Н П
имеют рецепторы для Л Н П , подвергшихся определенной химической
модификации [4—8], в частности для липопротеинов, обработанных ма-
лоновым диалъдегидом ( м д а - Л Н П ) . Взаимодействие модифицирован-
ных Л Н П с макрофагами является одним из возможных механизмов
образования «пенистых клеток» в сосудистой стенке [9] . В связи с этим
независимая визуализация Л Н П - и мда-ЛНП-рецепторов способна дать
информацию о путях проникновения и распределении липопротеинов в
клетках сосудистой стенки.
Одним из применяемых подходов к локализации ЛНП-рецепторов
является взаимодействие клеток в культуре с Л Н П , реконструирован-
ными гидрофобными флюоресцентными зондами [10—16]. Аналогично
рецепторы для модифицированных Л Н П были локализованы на клет-
ках в культуре с использованием реконструированных м д а - Л Н П [8,
13]. В настоящей работе предлагается методический подход к незави-
симой визуализации Л Н П - и мда-ЛНП-рецепторов, использующий ре-
конструкцию липопротеинов двумя различными хромофорами, инкуба-
цию липопротеинов с исследуемыми клетками с последующей флюорес-
центной микроскопией при двух длинах волн.
Материалы и методы. Тонкослойную хроматографию проводили па пластинках
«Kiesclgel 60», « P S C Kieselgel 60» («Merck», Ф Р Г ) . Аналитическое ультрацентрифуги-
рование проводили иа приборе «Beckman Ε» (США) .
Аминокапроновая кислота получена от «Chemapol» ( Ч С С Р ) , 7-нитро-4-хлорбензо-
2-окса-! ,3-диазол (NBD-хлорид) , N-метилимидазол, 2,4,6-триизопропилбензолсульфо-
нилхлорид (ТПС-хлорид) , бис-диметилацеталь малонового диальдегида — от «Aldrich»
(США), Ν,Ν-диметиламинонафталинсульфонилхлорид (дансилхлорид) , триолеин, холе-
стерилолеат и фосфатидилхолин яичного желтка — от «S igma» (США), холестерин от
«Мегск» ( Ф Р Г ) , остальные реактивы и растворители соответствовали стандартным
квалификациям хч и осч. Культуральные среды и фетальная сыворотка теленка (ФСТ)
получены от «Flow Labora tor ies» (США), пластиковая посуда — от «Falkon plast ics»
и «Nunc» ( Д а н и я ) .
Л Н П выделяли из плазмы крови здоровых доноров по [17], липопротеиндефицит-
ную сыворотку по [18], Л Н П обрабатывали малоновым диальдегидом, как в ра-
боте [19].
Содержание общего белка определяли по [20]; аполипопротеина В ( а п о В ) — м е -
тодом ИФА [21]; фосфолипидов — по липидному фосфору [22]; общего и свободного
холестерина — с использованием набора «Boehr inger Mannhe im Kal ibra t ion Kit» ( Ф Р Г ) .
6- (7-н и т р о б е н з 0-2-0 к с а-1,3-д и а з о л-4-)и л-а м и н о г е к с а н о в а я к и с -
л о т а ( I I I ) . Смесь NBD-хлорида (200 мг, 1,0 ммоль) , 6-аминокапроновой кислоты
(197 мг, 1,5 ммоль) и 100 мл абсолютного диоксана кипятили 2 ч, к смеси добавляли
* Представлена членом редколлегии О. В. Рохлиным.
102 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3
2 г с и л и к а г е л я JI 4 0 / 1 0 0 и у п а р и в а л и в в а к у у м е . Смесь продуктов , а д с о р б и р о в а н н у ю
на силикагеле , п о м е щ а л и в верхнюю часть колонки ( 2 , 5 X 1 2 см) с тем ж е силикагелем ,
у р а в н о в е ш е н н ы м смесью бензол : д и о к с а н ( 5 : 1 ) . К о л о н к у п р о м ы в а л и 200 мл той ж е
смеси, п р о д у к т I I I э л ю и р о в а л и смесью б е н з о л : диоксан ( 2 : 1 ) , у п а р и в а л и и к р и с т а л -
л и з о в а л и из 80 %-ного водного метанола . О р а н ж е в ы е к р и с т а л л ы , т е м п е р а т у р а п л а в л е -
ния 150—152 °С, Я т а х , диоксан , 465 нм (23000) . В ы х о д 185 мг (63 % ) .
6 - (5 - Ν,Ν - д и м е т и л а м и н о н а ф т а л и н - 1 - с у л ь ф о н и л ) - а м и н о -
г е к с а н о в а я к и с л о т а ( I V ) . К р а с т в о р у д а н с и л х л о р и д а (135 мг, 0,5 ммоль )
в 50 м л ацетона д о б а в л я л и р а с т в о р 6 - а м и н о к а п р о н о в о й кислоты (163 мг, 1,25 ммоль )
в 18 мл воды, з а т е м д о б а в л я л и 2 м л 1 M р а с т в о р а б и к а р б о н а т а натрия , в ы д е р ж и в а л и
90 мин при 45 °С, упаривали , д о б а в л я л и 10 мл х л о р о ф о р м а и 10 мл н а с ы щ е н н о г о раст -
вора б и к а р б о н а т а натрия , водный слой э к с т р а г и р о в а л и х л о р о ф о р м о м ( 3 X 5 м л ) , объе -
диненный х л о р о ф о р м н ы й р а с т в о р сушили, у п а р и в а л и и ост ат ок х р о м а т о г р а ф и р о в а л и
на к о л о н к е ( 2 , 5 X 1 2 см) с силикагелем с использованием линейного г р а д и е н т а бен-
з о л : (бензол : дноксан) ( 2 : 1). Фракцию, с о д е р ж а щ у ю IV, х р о м а т о г р а ф и р о в а л и на пла -
стинке в системе гексан : ацетон : м у р а в ь и н а я кислота ( 7 0 : 3 0 : 1 ) . П о с л е э л ю и р о в а н и я
ацетоном и в ы с у ш и в а н и я в в а к у у м е получен светло-зеленый с т е к л о о б р а з н ы й п р о д у к т ;
Xmax, диоксан , 336 нм (34000) . В ы х о д 116 мг (0,47 м м о л ь ) , 93 %.
Х р о м о ф о р с о д е р ж а щ и е х о л е с т е р и л о в ы е э ф и р ы I и II ( о б щ и й
м е т о д ) . Смесь э к в и м о л я р н ы х количеств кислоты ( I I I или IV) и холестерина высуши-
вали п е р е у п а р и в а н и е м с а б с о л ю т н ы м толуолом, р а с т в о р я л и в а б с о л ю т н о м т о л у о л е
(3 м л / 1 м м о л ь ) , д о б а в л я л и Т П С - х л о р и д (1,2 э к в и в а л е н т а ) при 0 ° С , з а т е м 2,5 э к в и в а -
лента N - м е т и л и м и д а з о л а , перемешива л и в э в а к у и р о в а н н о й колбе 20 мин, д о б а в л я л и
т о л у о л (10 мл / 1 ммоль) и н а с ы щ е н н ы й раствор б и к а р б о н а т а н а т р и я (5 мл / 1 м м о л ь ) ,
водный слой э к с т р а г и р о в а л и т о л у о л о м ( 2 X 5 м л ) . О б ъ е д и н е н н ы й т о л у о л ь н ы й э к с т р а к т
п о с л е д о в а т е л ь н о п р о м ы в а л и р а в н ы м и о б ъ е м а м и насыщенного р а с т в о р а б и к а р б о н а т а
натрия , воды, 2 % соляной кислоты, воды, сушили, у п а р и в а л и и х р о м а т о г р а ф и р о в а л и
на колонке ( 1 , 8 X 1 0 см) с силикагелем в линейном градиенте б е н з о л : (бензол : аце-
тон) ( 2 : 1 ) .
3 - β - О - [ 6 - ( 7 - н и т р о б е н з о - 2 - о к с а - 1 , 3 - д и а з о л - 4 - ) и л а м и -
н о г е к с а н о и л ] х о л е с τ -5-e н ( I ) : о р а н ж е в ы е к р и с т а л л ы , т е м п е р а т у р а п л а в л е н и я
119—121 °С (из смеси гексан : ацетон, 5 : 1 ) . Н - Я М Р спектр: 0,630 с 18 CH 3 ; 0,815 д
(6,6) , 0,817 д (6,6) 26 CH 3 , 27 CH 3 ; 0,870 д (6,6) 21 C H 3 ; 0,961 с 19 C H 3 в холестери-
ловом ф р а г м е н т е ; 2,27 τ (6 ,7) ; 6,120 д (8 ,0) ; 8,431 д (8,0) а С Н 2 и протоны ацильного
ф р а г м е н т а . В ы х о д 84 %.
3 - β - О - [6 - (5 - Ν ,Ν-д и м е τ и л а м и н о н а φ τ а л и н - 1 - с у л ь ф о н и л
(-а м и д о г е к с а н о и л [ - х о л е с τ-5-e н ( I I ) . Н - Я М Р спектр: 0,626 с 18 CH 3 ; 0,814 д
(6,6) , 0,817 д (6,6) 26 CH 3 , 27 CH 3 ; 0,864 д (6,6) 21 CH 3 ; 0,960 с 19 C H 3 в холестери-
ловом ф р а г м е н т е ; 2,07 τ (6,5); 2,84 с, 7,14 д (7,3), 7,47 псевдо т, 7,52 псевдо г, 8,19 дд
(7,3; ~ 1 ) , 8,49 д осСН2, C H 3 N и протоны н а ф т а л и н о в о г о цикла . В ы х о д 7 2 % .
Р е к о н с т р у и р о в а н н ы е J l H П. Д л я введения соединений I и II в Л Н П от-
дельно получали смесь липидов: 4,8 мг ф о с ф а т и д и л х о л и н а яичного ж е л т к а , 2,4 мг трио-
леина , 2,0 мг холестерина , 4,4 мг х о л е с т е р и л о л е а т а и 4,0 мг соединения I (или I I ) раст -
в о р я л и в 1,2 мл абсолютного изопропанола . Р а с т в о р хранили в темноте при — 2 0 °С.
Р а с т в о р липидов (100 м к л ) , нагретый д о 40 °С, вводили шприцом в о х л а ж д е н н ы й д о
4 ° С буфер (1 м л ) : 140 м М NaCl , 2,7 м М KCl, 11,6 м М N a 2 H P O 4 , 1,5 м М K H 2 P O 4 . К по-
лученной эмульсии д о б а в л я л и 0,24 мл б у ф е р а , с о д е р ж а щ е г о Л Н П (2 мг апоВ) и 3 м л
Л Д С (60 мг б е л к а ) , перемешивали на вортексе 1 мин, и н к у б и р о в а л и при 3 7 ° С 24 ч.
П о л у ч е н н у ю прозрачную смесь ц е н т р и ф у г и р о в а л и в течение 24 ч при 40000 о б / м и н и
4 °С д л я ф л о т а ц и и н е п р о р е а г и р о в а в ш е й липидной эмульсии, д о в о д и л и плотность раство -
ра д о 1,063 г / м л и Л Н П в ы д е л я л и ф л о т а ц и е й при 40000 о б / м и н и 4 °С в течение 36 ч.
П р е п а р а т Л Н П , с о д е р ж а щ и й ф л ю о р е с ц и р у ю щ и й х о л е с т е р и л о в ы й эфир I или II хро-
м а т о г р а ф и р о в а л и на колонке 1 , 2 X 7 0 см с с е ф а р о з о й CL-4B, п р о в о д я х р о м а т о г р а ф и ю
в б у ф е р е со скоростью 19 м л / ч .
С п е к т р а л ь н ы е и з м е р е н и я . Спектры поглощения и з м е р я л и на спектрофо-
тометре « B e c k m a n D U 8», спектры П М Р — на приборе «WM500 , B r u k e r » ( Ф Р Г ) , спект-
ры флюоресценции — на приборе «Aminco S P F 500» при 25 °С в кювете с длиной опти-
ческого пути 1 см. Д л и н а волны в о з б у ж д е н и я 465 нм д л я N B D - с о д е р ж а щ и х х р о м о ф о -
ров, 335 нм — д л я д а н с и л - с о д е р ж а щ и х х р о м о ф о р о в . Тушение флюоресценции реконстру-
ированных Л Н П и м д а - Л Н П проводили йодид-ионом. К о н с т а н т у т у ш е н и я [23] опре-
д е л я л и по уравнению Ш т е р н а — Ф о л ь м е р а : JoII= 1+KsvC, г д е / и I0 — интенсивности
ISSN 0233-7657., БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 103
флюоресценции в присутствии и отсутствие тушителя, Ksv — константа тушения, С —
концентрация йодид-иона.
Иммуноферментный анализ проводили по методу [21] с использованием иммоби-
лизованных антител козы против Л Н П человека.
К л е т к и . Нормальные фибробласты выращивали из полученного путем биопсии
кусочка кожи предплечья здорового донора. Клетки культивировали при 37 0C в атмо-
сфере 95 % воздуха и 5 % двуокиси углерода в пластиковых флаконах с площадью
поверхности 75 см2 в среде Игла , содержащей 25 мМ H E P E S , 220 мМ N a H C O 3 , 1 %
незаменимых аминокислот, 100 м к г / м л канамицина, 2 мМ глутамин и 15 % ФСТ.
Перитониальные макрофаги мыши линии J774 культивировали в среде PRMI-1640,
содержащей 4 мМ глутамин, 100 м к г / м л канамицина и 10 % ФСТ.
Р е ц е п т о р н ы й и м м у н о ф е р м е н т н ы й а н а л и з ( Р И Ф А ) [21, 24]. Д л я
проведения экспериментов фибробласты и макрофаги выращивали в лунках 96-ячееч-
ной плашки до состояния монослоя. За 48 ч до начала эксперимента фибробласты от-
мывали Ф С Р и добавляли среду, содержащую 10 % Л Д С . После отмывки Ф С Р к
клеткам добавляли среду с 10 % Л Д С , содержащую антитела с пероксидазой хрена
(АТ-ПХ), и липопротеины в возрастающих концентрациях и инкубировали в течение
3 ч при 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % углекислого газа . Затем клетки отмывали
на холоду Ф С Р - Б С А и последовательно вносили 50 мкл 0,5 %-ного раствора тритона
Х-100 в 50 мМ цитратном буфере (рН 4,7) и добавляли 150 мкл субстратной смеси.
Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 50 %-ной серной кислоты, измеряли опти-
ческую плотность при 492 нм. К а ж д о е измерение проводили троекратно.
Ф л ю о р е с ц е н т н а я м и к р о с к о п и я . Клетки, помещенные в чашки диамет-
ром 35 мм инкубировали в среде, содержащей 10 % Л Д С в течение суток, затем среду
заменяли на свежую, содержащую реконструированные Л Н П или м д а - Л Н П (15—
20 мкг апоВ в 1 мл) , и инкубировали в течение 4 ч при 37°С, затем клетки отмывали
свежей средой в течение 10 мин при 37 °С, промывали ФСР и фиксировали 3 %-ным
раствором формальдегида в ФСР в течение 20 мин. Препараты промывали Ф С Р и до-
бавляли смесь Ф С Р — глицерин ( 1 : 9 ) . Визуализацию проводили на флюоресцентном
микроскопе «Opton», используя стандартный набор фильтров.
Результаты и обсуждение. В задачи данной работы входило: 1) вы-
бор структур и простого метода получения хромофорсодержащих хо-
лестериловых эфиров, пригодных для реконструкции липопротеинов;
2) проведение реконструкции Л Н П и мда-ЛНП хромофорсодержащими
холестериловыми эфирами, характеристика реконструированных час-
тиц, доказательство сохранения антигенных свойств апоВ; 3) визуали-
зация Л Н П - и мда-ЛНП-рецепторов в культурах фибробластов экс-
плантантов кожи человека и макрофагов мыши линии 1774. (Рецептор-
ное связывание липопротеинов с данными клеточными культурами ис-
следовано [3, 4, 6, 8, 9].)
Х р о м о ф о р с о д е р ж а щ и е х о л е с т е р и л о в ы е э ф и р ы I
и II. Среди гидрофобных флюоресцентных зондов, использовавшихся
для реконструкции Л Н П , наиболее удобны флюоресцентные аналоги
холестериловых эфиров жирных кислот, содержащие хромофорный
фрагмент в ацильной [10] или стериновой [ И , 14] части молекулы.
Число использованных соединений достаточно велико, однако их полу-
чение требует проведения синтеза по оригинальной схеме в каждом кон-
кретном случае. В настоящей работе получены и использованы холес-
териловые эфиры I и II.
X-MH(CH2)s COO-Y
^ о - d ^ c u ν 0
ш - у - л Ф T W x - p d . γ . „
Синтез тривиален и состоит из модификации аминофункции 6-ами-
нокапроновой кислоты стандартными реагентами, используемыми для
104 ISSN 0233-7657., БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 104
флюоресцентной дериватизации аминогрупп; ацилирования полученны-
ми продуктами гидроксильной функции холестерина в присутствии кон-
денсирующих реагентов [25]. Спектральные характеристики приведены
в табл. 1. Данная схема позволяет просто получить холестериловые
эфиры с требуемыми спектральными свойствами.
Р е к о н с т р у и р о в а н н ы е л и п о п р о т е и н ы . Соединения I и
II вводили в инкубационную смесь в составе липидной эмульсии, со-
держащей очищенный фосфатидилхолин яичного желтка , холестерин,
Рис. 1. Гель-хроматография реконструированных липопротеинов Л Н П - І на колонке
0 ,8X60 см с сефарозой CL-4B, скорость 14 м л / ч (хроматографический профиль разде-
ления м д а - Л Н П - П аналогичен). Стрелкой указан объем выхода нативных Л Н П
Fig. 1. Gel c h r o m a t o g r a p h y of reconst i tu ted l ipoproteins LDL-I on 0 .8X60 cm co lumn
wi th CL-4B Sepharose . E lu ton ra te w a s 14 m l / h . (The separa t ion of mda -LDL- I I h a s the
same picture.) The a r row shows the elut ion vo lume of na t ive LDL
Рис. 2. Распределение оптической плотности при аналитическом ультрацентрифугиро-
вании реконструированных липопротеинов Л Н П - І при 280 ( / ) и 465 нм (2) через
140 мин после начала ультрацентрифугирования. (Центрифугирование в растворе KBr,
плотность 1,17 г /л , скорость 17000 об/мин)
Fig. 2. Optical densi ty dis t r ibut ion du r ing the analyt ica l u l t r a cen t r i f uga t i on of reconst i -
tu ted l ipoproteins LDL-I at 280 nm (1) and 465 nm (2) 140 min a f te r the b e g i n n i n g of
u l t r acen t r i fuga t ion . Cen t r i f uga t i on w a s carried out in KBr solution, d e n s i t y — 1 . 1 7 g/1,
17000 rpm
триолеин, холестерилолеат. В состав инкубационной смеси входили
Л Н П (или мда -ЛНП) и свежая липопротеиндефицитная сыворотка
плазмы крови (d> 1,216 г / м л ) , содержащая катализаторы обмена не-
полярных липидов. Реконструированные липопротеины выделяли дву-
кратным ультрацентрифугированием с последующей гель-хроматогра-
фией (рис. 1). Совпадение объемов выхода белка и хромофоров свиде-
тельствует о хроматографической гомогенности выделяемой фракции.
Данные аналитического ультрацентрифугирования при двух длинах
Т а б л и ц а 1
Спектральные свойства холестериловых эфиров I u I I
Spectral properties of cholesteryl esters I and II
Спектры I Спектры II
Растворитель Поглощения λ, HM Флюоресценции λ , Поглощения, λ Флюоресценции
(ε) HM (ν) нм (ε) λ , HM (ν)
Гексан
Бензол
Этилацетат
Диоксан
Этанол
Метанол
463 (24000)
463 (21600)
462 (23000)
463 (23000)
465 (24000)
465 (23500)
509 (0,37)
517 (0,55)
515 (0,69)
517 (0,49)
530 (0,50)
532 (0,43)
337 (29000)
347 (29000)
343 (36000)
343 (34000)
345 (34000)
345 (34000)
469 (0,36)
480 (0,48)
490 (0,41)
484 (0,57)
510 (0,40)
512 (0,40)
104 ISSN 0233-7657., БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 105
волн указывают на гомогенность препаратов по данным флотации
(рис. 2) . Состав и спектральные свойства реконструированных липо-
протеинов сведены в табл. 2.
О локализации хромофоров в гидрофобной области реконструиро-
ванных липопротеинов судили по сравнению их спектров флюоресцен-
ции с таковыми соединений I и II в разных растворителях (табл. 1).
Рис. 3. Тушение флюоресценции реконструиро-
ванных липопротеинов в присутствии йодид-
иона: 1, 3 — флюоресценция триптофановых
х р о м о ф о р о в в Л Н П и воде соответственно
( в о з б у ж д е н и е при 295 нм, флюоресценция при
330 н м ) ; 2 — флюоресценция холестерилового
эфира I в реконструированных Л Н П - І І (воз-
б у ж д е н и е при 465 нм, флюоресценция при
520 нм) . Тушение флюоресценции м д а - Л Н П - Н
измеряли аналогично
Fig . 3. The q u e n c h i n g of l ipoprote in ch romopho-
res in t he p resence of iodide ion: 1,3 — the
t r y p t o p h a n f luorescence in L D L and in wa te r ,
respect ive ly (exci ta t ion at 295 nm, f luorescen-
ce at 330 n m ) ; 2 — t he f luorescence of LDL- I
(exci ta t ion at 465 nm, f luorescence a t 520 n m ) .
The q u e n c h i n g of m d a - L D L - I I in the p resence
of iodide ion w a s the s a m e
Зависимость интенсивности флюоресценции Л Н П - І и мда-ЛНП-І І от
концентрации тушителя, не проникающего в гидрофобную область,
представлена на рис. 3. Низкое значение константы Штерна <— Фоль-
мера (Ksv = Oi9) указывает на отсутствие контакта хромофора с вод-
ной фазой. Такое же значение Ksv было получено для гидрофобных ос-
татков триптофана апоВ в составе Л Н П , в то время как для свобод-
ного триптофана в воде Ksv составляет 12,0 [26].
Т а б л и ц а 2
Состав и свойства реконструированных липопротеинов
Composition and properties of reconstituted lipoproteins
Характеристика ЛНП-1 мда-ЛНП-ІІ
Состав (апоВ : фосфолипид : хромофорсо-
д е р ж а щ и й холестериловый эфир, моль :
моль : моль)
эфир, моль :
1:730 (4-70) : 5 6 ( 4 - Ю ) 1 :690 (4 -70 ) :53(=М0)
Спектр поглощения, HM 465 342
Спектр флюоресценции, HM 522 492
П р и м е ч а н и е . С о д е р ж а н и е апоВ рассчитано из данных И Ф А и определения коли-
чества белка ; с о д е р ж а н и е фосфолипида — из определения липидного фосфора ; содер-
ж а н и е эфиров холестерина I и II — из спектров поглощения (см. « М а т е р и а л ы и ме-
т о д ы » ) .
Данные иммуноферментного анализа (ИФА) указывают на сохра-
нение антигенных свойств апоВ в реконструированных Л Н П и мда-
Л Н П . Содержание апоВ, рассчитанное из калибровочной кривой, по-
лученной методом ИФА, находится в соответствии с содержанием об-
щего белка (табл. 2) .
В з а и м о д е й с т в и е р е к о н с т р у и р о в а н н ы х л и п о п р о -
т е и н о в с к л е т к а м и в к у л ь т у р е . Рецепторное связывание
Л Н П - І и мда-ЛНП-І І исследовалось методом РИФА. Связывание
Л Н П - І с фибробластами соответствует связыванию нативных Л Н П
(рис. 4, а). Это позволяет локализовать участки клеточной поверхности,
связывающие Л Н П - І в виде отдельных флюоресцирующих гранул
106 ISSN 0233-7657., БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 106
(рис. 4 , 6 ) . В случае мда -ЛНП-П накопления метки в культуре фибро-
бластов не наблюдалось. Связывание Л Н П - І и мда -ЛНП-П с макро-
фагами мыши линии J744 представлено на рис. 5. В этом случае свя-
зывание мда -ЛНП-П превосходит связывание Л Н П - І в 5 раз, что со-
Рис. 4. Связывание реконструированных липопротеинов с фибробластами кожи челове-
ка : а — Р И Ф А (взаимодействие Л Н П - І ( / ) и м д а - Л Н П - Н (2 ) ) ; б — флюоресцентная
микроскопия клеток после инкубации с Л Н П - І (фильтр 510 нм, Х 4 0 0 )
F ig . 4. In terac t ion of reconst i tu ted l ipoproteins with h u m a n skin f ibroblas ts : a — ELIRA
(b ind ing of LDL-I (1) and of mda -LDL- I I ( 2 ) ) ; б — f luorescent microscopy of cells af-
ter their in teract ion wi th LDL-I (f i l ter — 510 nm, m a g n i f i c a t i o n — 1 : 4 0 0 )
гласуется с данными [9] . Включение хромофоров в культуру макро-
фагов, наблюдаемое методом флюоресцентной микроскопии, качествен-
но соответствует данным РИФА. Включение хромофоров в клетки зна-
чительно снижается в присутствии нереконструированных липопротеи-
нов, что указывает на рецептор-опосредованный характер захвата
клетками реконструированных липопротеинов.
Рис. 5. Связывание реконструированных липопротеинов с макрофагами мыши 1744:
а — Р И Ф А (взаимодействие Л Н П - І ( / ) и м д а - Л Н П - Н (2 ) ) ; б — флюоресцентная мик-
роскопия клеток после инкубации с м д а - Л Н П - П (фильтр 460 нм, Х 4 0 0 )
Fig. 5. In terac t ion of reconst i tu ted l ipoproteins with mouse m a c r o p h a g e s J774: a —
ELIRA (b ind ing of LDL-I ( / ) and of mda -LDL- I I (2) ) \ б — f luorescent microscopy of
cells a f t e r their in teract ion with mda -LDL- I I (f i l ter — 460 nm, m a g n i f i c a t i o n — 1 : 4 0 0 )
Таким образом, предложенный метод позволяет одновременно и
независимо идентифицировать и локализовать рецепторы для нативных
и модифицированных Л Н П .
В заключение мы считаем нужным отметить, что 1) методы рекон-
струкции Л Н П гидрофобными соединениями [10—16] в наших опытах
оказались малоэффективными либо вследствие низкого содержания
хромофора в реконструированной частице [10, 14], либо из-за денату-
рации Л Н П и потери антигенных свойств апоВ [11 —13]; 2) использо-
вание соединений I и II позволяет локализовать поверхностные рецеп-
торы на клетках в культуре, однако малоэффективно в опытах по на-
104 ISSN 0233-7657., БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 107
коплению холестериловых эфиров в клетках (отсутствие корреляции
между содержанием хромофора внутри клетки и количеством рецепти-
рованных липопротеинов, что, вероятно, связано с лизосомалъной де-
градацией I и II, происходящей в процессе интернализации).
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Brown М. S., Goldstein J. L. Receptor media ted endocytosis : ins igh ts f rom l ipoprote-
in receptor s y s t e m / / P r o c . Nat . Acad. Sci. USA.— 1979.—76, N 7 . — P . 3330—3337.
2. Mahley R. W., Jnnerarity T. L. Lipoprotein receptors and cholesterol homeos tas i s / /
Biochim. et biophys. acta .— 1983.—737, N 2 . — P . 197—222.
3. Goldstein J. L., Brown M. S. B ind ing and d e g r a d a t i o n of low densi ty l ipoproteins by
cul tured h u m a n f ibroblas ts : a compar i son of cells f rom a normal subjec ts and f rom a
pa t ien t h o m o z y g o u s famil ia l h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a / / J . Biol. Chem.— 1974.—249,
N 16 .—P. 5153—5162.
4. Henriksen T., Mahoney E. M., Steinberg D. Enhanced m a c r o p h a g e d e g r a d a t i o n of
low dens i ty l ipoprote ins previously incubated with cul tured endothel ia l cells. Recog-
nit ion by receptors for acetyla ted low densi ty l i p o p r o t e i n s / / P r o c . Nat . Acad. Sci.
USA.— 1981.—78, N 10 .—P. 6499—6503.
5. Pits R. E., Innerarity 7\ L., Mahley R. W. Foam cell in explan ts of a therosclerot ic
rabbi t ao r t a s have receptors to β-very low densi ty l ipoproteins / / Arter iosclerosis .—
1983.—3, N 1 . — P . 2—12.
6. A binding site on m a c r o p h a g e s tha t media ted up take and deg rada t ion of ace ty la ted
low densi ty l ipoproteins p roduc ing mass ive cholesterol deposi t ion / J. L. Golds te in ,
S. K- Ho, Y. K. Basu, M. S. B r o w n / / P r o c . Nat . Acad. Sci. USA.— 1979.—76, N 1.—
P. 333—337.
7. Altered metabol i sm (in vivo and in vitro) of p la sma l ipoproteins a f t e r selective
chemical modif ica t ion of lysine res idues of the apopro te ins / R. W. Mahley, T. L. In-
nerar i ty , H. M. Weisgraber , S. Y. O h / / J . Clin. Invest .— 1979,—64, N 3 . — P . 743—
750.
8. Malondialdehyde a l te ra t ion of low densi ty l ipoproteins leads to cholesteryl ester
accumula t ion in h u m a n monocyte — m a c r o p h a g e s / A. M. Foge lman , I. Schechter ,
J . Seage r et al. / / Proc. Nat . Acad. Sci. USA.— 1980.—77, N 4 . — P . 2214—2218.
9. Brown M. S., Goldstein / . L. Lipoprotein metabol i sm in the mac rophage : implicat ion
for cholesterol deposi t ion in a t h e r o s c l e r o s i s / / A n n u . Rev. Biochem.— 1983.—52,
N 2 . — P . 223—261.
10. Sclar L. A., Mantullin W. W., Pownall H. J. F luorescent cholesteryl es ters in the
core of low densi ty l i p o p r o t e i n / / B i o c h e m . and Biophys. Res. C o m m u n s — 1982.—105,
N 2.— P. 674—680.
11. N-(2-Naphtyl)-23,24-dinor-5cholen-22amino-3-ol, a f luorescent cholesterol a n a l o g u e /
Y. J . Kao, A. K. Soutar , K.-Y. H o n g et a l . / / B i o c h e m i s t r y . — 1978.—17, N 13.—
P. 2689—2696.
12. Reconstituted low densi ty l ipoprotein: a vehicle for the delivery of hydrophobic f luo-
rescent probes to c e l l s / M . Krieger, L. C. Smith, R. G. M. Anderson et al. / / J . Supr .
S t ruc t .— 1979.—10, N 4 — P. 467—478.
13. Preparation and spectral proper t ies of lipophilic f luorescent der ivat ives . Appl icat ion
to p l a sma low densi ty l ipoproteins / J. R. Falck, M. Krieger, J. L. Goldste in ,
M. S. B r o w n / / J . Amer. Chem. S o c . - 1981.—103, N 2 4 . — P . 7396—7398.
14. Lipoproteins reconst i tu ted with steroid c o n t a i n i n g the n i t robenzoxad iazo 1 f luoropho-
r e / J . F. Gra ig , D. R. Via, W. W. Mantu l l in et al. / / J . Lipid Res.— 1981.—22, N 4.—
P. 687—696.
15. Replacement of cholesteryl es ters of low densi ty l ipoprotein with endogeneous chole-
steryl l i n o l e a t e / M . Krieger, M. S. Brown, J. R. Faus t , J. L. G o l d s t e i n / / J . Biol.
Chem.— 1978.—253, N 12 .—P. 4093—4101.
16. Sklar L. A., Graig / . FPownall H. J. Induced circular dichroism of incorpora ted
f luorescent cholesteryl es ters and polar lipids as a probe of h u m a n serum low densi ty
l ipoprotein s t ruc ture and m e l t i n g / / I b i d . — 1981.—256, N 9 . — P . 4286—4292.
17. Separation of the main l ipoprotein densi ty c lasses f rom h u m a n p lasma by ra te zonal
u l t r a cen t r i f uga t i on / J. R. Pa t sch , S. Suiler, G. Kos tner et a l . / / J . Lipid Res.—
1974.—15, N 3 . — P . 356—366.
18. Lindgren F. T. P r e p a r a t i v e u l t r acen t r i fuga l l abora to ry procedures and s u g g e s t i o n s
for l ipoprotein analys is . Analys i s lipids and l ipoproteins / Ed. E. C. Perkins .— New
York: Amer. Oil Chemis t s Soc., 1975 .—P. 204—224.
19. Haberland Μ. EFogelman A. M., Edwards P. A. Specificity of receptor-media ted
recogni t ions of malondia ldehyde-modi f ied low densi ty l ipoproteins / / Proc. Nat . Acad.
Sci. USA.— 1982.—79, N 4 . — P . 1712—1716.
20. Lowry O. H., Rosenbrough N. /., Farr A. L. Pro te in measu remen t with the Folin phe-
nol r eagen t / / J . Biol. Chem.— 1951,—93, N 2 . — P . 265—275.
21. Enzyme-linked immunoreceptor a s say of low densi ty l ipoprotein receptors / S. N. Pre-
obrazhensky , V. O. Ivanov, I. V. Fuki et a l . / / A n a l y t . Biochem — 1985.—149, N 2.—
P. 269—274.
22. Vaskovsky V. E., Kostetsky Ε. V., Vasendin / . M. A universa l r eagen t for phospholi-
pid a n a l y s i s / / J . Chromatogr .— 1975.—114, N 2 . — P . 129—141.
1 0 8 ISSN 0233-7657., БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 108
23. Владимиров Ю. Α., Добрецов Г. Е. Флюоресцентные зонды в исследовании биоло-
гических мембран.— М. : Наука , 1980.—320 с.
24. Enzyme immunoas say of the receptors for modif ied low dens i ty l i p o p r o t e i n s /
S. N. Preobrazhensky , V. P. Tsibulsky, I. V. Fuki et a l . / / A n a l v t . Biochem.— 1986.—
154, N 3 . — P . 382—387.
25. A. c. 1126574 СССР, М К И 4 , H 02 № 1/08. Способ получения спин-меченных эфи-
ров холестерина и спин-меченного лецитина / А. Ю. Мишарин, Н. Г. Бушмакина ,
Б. К. Чернов / / О т к р ы т и я . Изобретения.— 1984 .—№ 44 ,—С. 109—111.
26. Lehrer S. S. So lu te per tu rba t ion of protein f luorescence. The quench ing of the t ryp to-
phan f luorescence of model compounds and of lysozyme by iodide ion / / Biochemist-
ry .—1971,—10, N 15 ,—P. 3254—3263.
Н И И эксперим. кардиологии Получено 25.02.88
Всесоюз. кардиолог, науч. центра А М Н СССР, Москва
I N D E P E N D E N T V I S U A L I Z A T I O N O F R E C E P T O R S FOR T H E NATIVE
AND M O D I F I E D LOW DENSITY L I P O P R O T E I N S IN CELL C U L T U R E S
A. A. Krutov, A. Yu. Misharin, V. P. Tsibulsky, T. L. Bushueva,
V. R. Babaev, V. S. Repin
Ins t i tu te of Exper imenta l Cardio logy, Al l -Union Cardiological Research Center ,
Academy of Medical Sciences of the U S S R , Moscow
S u m m a r у
The method is sugges t ed to p repare cholesteryl es ters der ivat ives con ta in ing f luorescent
ch romophores in acyl chains. The reconst i tu t ion of low-densi ty l ipoproteins (nat ive and
malond ia ldehyde- t rea ted ones) has been carr ied out by f luorescent cholesteryl es ters .
Us ing the receptor media ted b ind ing of f luorescent l ipoproteins to h u m a n skin fibro-
b la s t s and mouse m a c r o p h a g e s the possibil i ty of independent v isua l iza t ion of receptors
is shown by m e a n s of f luorescent microscopy us ing observa t ions with d i f ferent vawe-
lenghts .
ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. Λ« З 109
|