Связывание алкилирующих производных олигонуклеотидов клетками в присутствии добавок, стимулирующих процесс трансфекции
Изучено влияние ряда добавок, применяемых для улучшения трансфекции эукариотических клеток нуклеиновыми кислотами, на связывание клетками фибробластов мыши L-929 и асцитной карциномы Кребс-2 [4-N-2-хлорэтил)-N-метиламинобензил]-5' - [³²P] фосфамидов олигонуклеотидов разного состава и длины. Пок...
Збережено в:
| Дата: | 1989 |
|---|---|
| Автори: | , , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155019 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Связывание алкилирующих производных олигонуклеотидов клетками в присутствии добавок, стимулирующих процесс трансфекции / А.С. Буторин, В.В. Власов, Ε.М. Иванова, А.С. Райт, И.Г. Шишкина. Л.В. Юрченко, Л.А. Якубов // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 4. — С. 71-75. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-155019 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1550192019-06-17T01:27:36Z Связывание алкилирующих производных олигонуклеотидов клетками в присутствии добавок, стимулирующих процесс трансфекции Буторин, А.С. Власов, В.В. Иванов, Е.М. Райт, А.С. Юрченко, Л.В. Шишкина, И.Г. Якубов, Л.А. Клеточная биология Изучено влияние ряда добавок, применяемых для улучшения трансфекции эукариотических клеток нуклеиновыми кислотами, на связывание клетками фибробластов мыши L-929 и асцитной карциномы Кребс-2 [4-N-2-хлорэтил)-N-метиламинобензил]-5' - [³²P] фосфамидов олигонуклеотидов разного состава и длины. Показано, что диметилсульфоксид, ДЭАЭ-декстран и полилизин неэффективны или малоэффективны для увеличения степени связывания. Заметный эффект оказывало соосаждение олигонуклеотидных производных на клетках хлористым кальцием из фосфатного буфера: связывание производных клетками возрастало как минимум на порядок, а уровень специфической модификации нуклеиновых кислот внутри клетки – в шесть раз. Вивчено вплив ряду добавок, які застосовано для поліпшення трансфекції еукаріотичних клітин нуклеїновими кислотами, на зв’язування клітинами фібробластів миші L-929 і асцитної карциноми Кребс-2 [ 4-N-2-хлоретил)-N-метиламінобензил ]-5 '-[³²P ]фосфаміду олігонуклеотидів різного складу і довжини. Показано, що диметилсульфоксид, ДЕАЕ-декстран і полілізин неефективні або малоефективні для збільшення ступеня зв’язування. Помітний ефект чинило соосаждення олігонуклеотидних похідних на клітинах хлористим кальцієм з фосфатного буфера : зв’язування похідних клітинами зростало як мінімум на порядок, а рівень специфічної модифікації нуклеїнових кислот всередині клітини – у шість разів. The effect of components facilitating transfection on the uptake of the alkylating 4-(N-2-chloroethyl-N-methylamino) -benzyl 5'-[³²P]phosphamides of oligodeoxyribonucleotides of various length and structure by the L-929 mouse fibroblasts and Krebs-2 ascite carcinoma cells was investigated. Dimethylsulfoxide, DEAE-dextran and polylysine had a little or no effect on the uptake. Substantial effect has been observed when oligonucleotide derivatives were coprecipitated with the cells by calcium chloride from the phosphate buffer. Uptake of the derivatives by cells increased at least by one order of magnitude and the level of nucleic acids specific modification within the cells —by factor of 6. 1989 Article Связывание алкилирующих производных олигонуклеотидов клетками в присутствии добавок, стимулирующих процесс трансфекции / А.С. Буторин, В.В. Власов, Ε.М. Иванова, А.С. Райт, И.Г. Шишкина. Л.В. Юрченко, Л.А. Якубов // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 4. — С. 71-75. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000D7 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155019 577.252.42:577.113.6 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Клеточная биология Клеточная биология |
| spellingShingle |
Клеточная биология Клеточная биология Буторин, А.С. Власов, В.В. Иванов, Е.М. Райт, А.С. Юрченко, Л.В. Шишкина, И.Г. Якубов, Л.А. Связывание алкилирующих производных олигонуклеотидов клетками в присутствии добавок, стимулирующих процесс трансфекции Биополимеры и клетка |
| description |
Изучено влияние ряда добавок, применяемых для улучшения трансфекции эукариотических клеток нуклеиновыми кислотами, на связывание клетками фибробластов мыши L-929 и асцитной карциномы Кребс-2 [4-N-2-хлорэтил)-N-метиламинобензил]-5' - [³²P] фосфамидов олигонуклеотидов разного состава и длины. Показано, что диметилсульфоксид, ДЭАЭ-декстран и полилизин неэффективны или малоэффективны для увеличения степени связывания. Заметный эффект оказывало соосаждение олигонуклеотидных производных на клетках хлористым кальцием из фосфатного буфера: связывание производных клетками возрастало как минимум на порядок, а уровень специфической модификации нуклеиновых кислот внутри клетки – в шесть раз. |
| format |
Article |
| author |
Буторин, А.С. Власов, В.В. Иванов, Е.М. Райт, А.С. Юрченко, Л.В. Шишкина, И.Г. Якубов, Л.А. |
| author_facet |
Буторин, А.С. Власов, В.В. Иванов, Е.М. Райт, А.С. Юрченко, Л.В. Шишкина, И.Г. Якубов, Л.А. |
| author_sort |
Буторин, А.С. |
| title |
Связывание алкилирующих производных олигонуклеотидов клетками в присутствии добавок, стимулирующих процесс трансфекции |
| title_short |
Связывание алкилирующих производных олигонуклеотидов клетками в присутствии добавок, стимулирующих процесс трансфекции |
| title_full |
Связывание алкилирующих производных олигонуклеотидов клетками в присутствии добавок, стимулирующих процесс трансфекции |
| title_fullStr |
Связывание алкилирующих производных олигонуклеотидов клетками в присутствии добавок, стимулирующих процесс трансфекции |
| title_full_unstemmed |
Связывание алкилирующих производных олигонуклеотидов клетками в присутствии добавок, стимулирующих процесс трансфекции |
| title_sort |
связывание алкилирующих производных олигонуклеотидов клетками в присутствии добавок, стимулирующих процесс трансфекции |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1989 |
| topic_facet |
Клеточная биология |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155019 |
| citation_txt |
Связывание алкилирующих производных олигонуклеотидов клетками в присутствии добавок, стимулирующих процесс трансфекции / А.С. Буторин, В.В. Власов, Ε.М. Иванова, А.С. Райт, И.Г. Шишкина. Л.В. Юрченко, Л.А. Якубов // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 4. — С. 71-75. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT butorinas svâzyvaniealkiliruûŝihproizvodnyholigonukleotidovkletkamivprisutstviidobavokstimuliruûŝihprocesstransfekcii AT vlasovvv svâzyvaniealkiliruûŝihproizvodnyholigonukleotidovkletkamivprisutstviidobavokstimuliruûŝihprocesstransfekcii AT ivanovem svâzyvaniealkiliruûŝihproizvodnyholigonukleotidovkletkamivprisutstviidobavokstimuliruûŝihprocesstransfekcii AT rajtas svâzyvaniealkiliruûŝihproizvodnyholigonukleotidovkletkamivprisutstviidobavokstimuliruûŝihprocesstransfekcii AT ûrčenkolv svâzyvaniealkiliruûŝihproizvodnyholigonukleotidovkletkamivprisutstviidobavokstimuliruûŝihprocesstransfekcii AT šiškinaig svâzyvaniealkiliruûŝihproizvodnyholigonukleotidovkletkamivprisutstviidobavokstimuliruûŝihprocesstransfekcii AT âkubovla svâzyvaniealkiliruûŝihproizvodnyholigonukleotidovkletkamivprisutstviidobavokstimuliruûŝihprocesstransfekcii |
| first_indexed |
2025-07-14T07:02:41Z |
| last_indexed |
2025-07-14T07:02:41Z |
| _version_ |
1837604863365611520 |
| fulltext |
Клеточная
биология
У Д К 577."52.42:577.113.6
А. С. Буторин, В. В. Власов, Ε. М. Иванова, А. С. Райт,
И. Г. Шишкина. Л. В. Юрченко, Л. А. Якубов
СВЯЗЫВАНИЕ АЛКИЛИРУЮЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ
ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ КЛЕТКАМИ В ПРИСУТСТВИИ ДОБАВОК,
СТИМУЛИРУЮЩИХ ПРОЦЕСС ТРАНСФЕКЦИИ
Изучено влияние ряда добавок, применяемых для улучшения трансфекции эукариоти-
ческих лгток нуклеиновыми кислотами, на связывание клетками фибробластов мыши
L-929 и асцит ной карциномы Кребс-2 \4-^-2-хлорэтил)-Аг-метиламинобензил]-5г - [ 3 2 P ]
фосфамидов олигонуклеотидов разного состава и длины. Показано, что диметилсуль-
(/)Оксид, ДЭАЭ-декстран и полилизин неэффективны или малоэффективны для увеличе-
ния степени связывания. Заметный эффект оказывало соосаждение олигонуклеотидных
производных на клетках хлористым кальцием из фосфатного буфера: связывание про-
изводных клетками возрастало как минимум на порядок, а уровень специфической мо-
дификации нуклеиновых кислот внутри клетки — в шесть раз.
Введение. Полученные к настоящему времени данные о возможности
блокирования функций определенных мРНК клеток с помощью произ-
водных олигонуклеотидов, комплементарных этим мРНК, указывают
па возможность создания эффективных методов регуляции экспрессии
генов с помощью таких производных [1—5]. Одним из основных фак-
торов, снижающих эффективность действия олигонуклеотидных произ-
водных на клеточные нуклеиновые кислоты, является слабое проникно-
вение полианионов-олигонуклеотидов в клетки [6]. Известно, что эф-
фективность трансфекции эукариотических клеток существенно возра-
стает при обработке клеток препаратами нуклеиновых кислот в присут-
ствии поликатионов (полилизин и ДЭАЭ-декстран), диметилсульфокси-
да или если обработка клеток производится в условиях осаждения нук-
леиновых кислот фосфатом кальция [7—10]. Можно было ожидать, что
аналогичные приемы могут быть использованы для повышения эффек-
тивности введения в клетки производных олигонуклеотидов. Целіью на-
стоящей работы и было исследование проникновения алкилирующих
олигонуклеотидных производных 5'-[32P] - [4- (N-2-хлорэтил) -N-метил-
аминобеизил]-5'-фосфамидов олигонуклеотидов * в эукариотические
клетки при вышеуказанных условиях обработки.
Материалы и методы. В работе использовали H E P E S фирмы «Мегск» ( Ф Р Г ) ,
[4- (N-2-хлорэтил)-N-метиламинобензил] амин, полученный из Новосиб. ин-та орг. химии
Сиб. отд-ния АН СССР, γ - [ З І Р ] аденозинтрифосфат с удельной активностью более
200 Т Б к / м м о л ь производства Ин-та ядер, физики А Н УзССР, пластиковые планшеты
фирмы «Flow Labora tor ies» (Англия). Олигодезоксирибонуклеотиды d (pApC) 6 ,
(KpT)8 , d (ρΤ) ίο синтезированы по описанным ранее методикам [11, 12]. Введение ра-
диоактивной метки в б'-конец олигонуклеотидов проводили методом обмена в реакции
с γ - [ 3 Φ ] Λ Τ Φ , катализируемой полинуклеотидкиназой [13]. Присоединение [4-(Ν-2-
хлорэтил)-N-метиламинобензил] амина к 5 ' -фосфату олигонуклеотида с помощью фосфа-
мидной связи осуществляли, как описано в работе [14]. Алкилирующие производные
олигонуклеотидов подвергали дополнительной очистке обращеннофазовой хроматогра-
* Сокращение в тексте C lR-d (pN)
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А 1989. Т. 5. № 4 71
фией на к о л о н к е с сорбентом «Nucleos i l С-18» ф и р м ы « M a c h e r e y - N a g e l » ( Ф Р Г ) и ана-
л и з и р о в а л и гель - электрофорезом в 20 %-ном п о л и а к р и л а м и д н о м геле ( П А А Г ) .
А л к и л и р у ю щ и е п р о и з в о д н ы е олигонуклеотидов о с а ж д а л и хлористым кальцием по
методике , описанной в р а б о т е [10] . П р о ц е н т о с а ж д е н н о г о реагента определяли по
разнице радиоактивности аликвоты супернатанта до и после осаждения.
В р а б о т е и с п о л ь з о в а л и клетки асцитной к а р ц и н о м ы Кребс-2 , перевиваемой на
м ы ш а х линии СС57 BR, а т а к ж е перевиваемую к у л ь т у р у клеток ф и б р о б л а с т о в мышей
L-929. В ы р а щ и в а н и е L-клеток , выделение я д е р и изучение с в я з ы в а н и я олигонуклеотид-
ных п р о и з в о д н ы х с к л е т к а м и проводили, как описано в р а б о т е [15] . Одновременно с
о л и г о н у к л е о т и д н ы м и п р о и з в о д н ы м и п р и б а в л я л и 2 M CaCl 2 д о концентрации 125 мМ
или д р у г и е д о б а в к и . Д л я опытов по субклеточному ф р а к ц и о н и р о в а н и ю клетки в ы р а -
щ и в а л и в 50 мл среды д о о б р а з о в а н и я монослоя IO7 клеток и о б р а б а т ы в а л и аналогич-
ным о б р а з о м . В ы д е л е н и е матричных Р Н К ( м Р Н К ) проводили согласно методике [13] .
К л е т к и асцитной к а р ц и н о м ы Кребс-2 (5 -Ю 6 клеток в 1 мл) и н к у б и р о в а л и в ра-
створе Хэнкса , с о д е р ж а щ е м 0,01 M H E P E S , р Н 7,2, с меченными 3 2 P олигонуклеотид-
ными п р о и з в о д н ы м и в присутствии различных д о б а в о к . П о окончании инкубации клет-
ки о т м ы в а л и п я т и к р а т н ы м о с а ж д е н и е м (500 g, 15 мин) и ресуспендированием в раст-
воре Хэнкса на х о л о д у ( 4 ° С ) . П о л у ч е н н ы й осадок ресуспендировали в р а с т в о р е Хэнк-
са и просчитывали на сцинтилляционном счетчике.
О б р а б о т к а клеток а л к и л и р у ю щ и м и производными олигонуклеотидов , а т а к ж е
определение степени м о д и ф и к а ц и и биополимеров а л к и л и р у ю щ и м и реагентами описаны
в р а б о т е [6] .
Д л я качественного а н а л и з а м о д и ф и к а ц и и биополимеров клетки подвергали мяг-
к о м у лизису в присутствии 7 M мочевины и 0,5 %-ного D S - N a («Serva» , Ф Р Г ) при
нагревании д о 90 °С в течение 1—3 мин, а з атем а л и к в о т ы л и з а т а наносили па д вух -
ступенчатый 5—20 % - н ы й П А А Г в 7 M мочевине. К а ж д у ю д о р о ж к у геля р а з р е з а л и и
о п р е д е л я л и р а д и о а к т и в н о с т ь на старте , в 5 %-ном геле, на границе м е ж д у ступенями
и в 20 %-пом геле. С у м м а р н у ю р а д и о а к т и в н о с т ь первых трех о б р а з ц о в считали вклю-
чившейся в биополимеры. В качестве к о н т р о л я использовали нереакционноспособные
п р о и з в о д н ы е тех олигонуклеотидов , а л к и л и р у ю щ а я группировка к о т о р ы х была под-
вергнута и с ч е р п ы в а ю щ е м у гидролизу в воде [ H O R d (pN) п ] .
Результаты и обсуждение. В первых экспериментах мы проверили
возможность осаждения алкилирующих производных олигонуклеотидов
добавлением хлористого кальция в фосфатный буфер до концентрации
125 мМ в условиях, использованных в работе [10], а также измерили
уровень связывания этих производных клетками L-929. Результаты при-
ведены в табл. 1.
Как видно из таблицы, осаждение олигонуклеотидных производных
хлористым кальцием происходит в растворе Хэнкса лучше, чем в фос-
Т а б л и ц а 1
Осаждение и связывание клетками L-929 алкилирующих производных олигонуклеотидов
в буфере А и растворе Хэнкса в присутствии и отсутствие 125 мМ CaCl2 (в процентах
от количества добавленного в пробу)
Precipitation and uptake by the L-929 cells of the various oligonucleotide derivatives
in buffer A and Hanks solution in the presence and in the absence of 125 mM CaCl2
(in per cents of the derivative added)
Р е а г е н т
Концентра -
ция р е а г е н -
т а , мкМ
О с а ж д е н и е C a C l 2
Связывание к л е т к а м и
в р а с т в о р е Х э н к с а
Р е а г е н т
Концентра -
ция р е а г е н -
т а , мкМ
в б у ф е р е А
в р а с т в о р е
Хэнкса + C a C l 2 - C a C l 2
ClRd (рАрС)б 0 , 2 7 , 5 5 8 , 5
2 , 0 1 7 , 5 6 4 , 0 5 , 0 1,0
C l R d ( p T ) 8 0 , 2 9 , 5 19 —
2 , 0 8 , 0 18 ,5 3 , 0 0 , 4 7
C l R d ( P T ) 1 6 0 , 0 1 2 9 7 9
0 ,1 1 4 , 5 8 0 , 5 7 , 0 0 , 4 8
72 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А 1989. Т. 5. № 4 72
фатном буфере А (21 мМ HEPES, рН 7,05, 137 мМ NaCl, 5 мМ KCl,
1 мМ Na2HPO4, 6 мМ глюкоза), использованном авторами работы [10].
При сравнении наших результатов с данными работы [10] оказалось,
что наличие алкилирующей группировки на 5'-конце не влияет замет-
но на степень осаждения и качественную зависимость от длины и сос-
тава олигонуклеотидов. Степень связывания олигонуклеотидных произ-
водных с клетками L-929 коррелирует со степенью их осаждения фос-
фатом кальция и подчиняется тем же закономерностям в зависимости
от длины олигонуклеотида и его нуклеотидного состава. Наиболее зна-
чительное увеличение степени связывания олигонуклеотидного произ-
водного с клетками при кальций-фосфатном осаждении наблюдалось в
случае гексадекатимидилатного реагента.
T а б л и ц а 2
Связывание олигонуклеотидного производного ClRd(pT)x& с клетками в присутствии
добавок, улучшающих трансфекцшо (концентрация производного в среде 1 мкМ)
Uptake of the oligonucleotide derivative ClRd(pT)l6 by the cells in the presence
of components facilitating transfection (concentration of the derivative in the medium
was 1 \xM)
Тип обработки
О т н о с и т е л ь н ы й у р о в е н ь св яз ы в ания от растворенного
в с р е д е , %
Тип обработки L-929 Кребс-2 Тип обработки
1,5 ч 0 ,5 ч 1,5 ч 3 ч
Контроль (раствор Хэнкса) 1,2 1,2 1,4 2 , 1
2 %-ный диметилсульфоксид 1,2 1,3 1,5 2 , 1
ДЭАЭ-декстран, 20 м к л / м л 1,1 2,1 3,4 6 , 5
Полилизин, 20 м к г / м л 1,7 2,1 2,1 2 , 1
CaCl2 , 12,5 мМ 2,2 — — — •
CaCl2 , 125 мМ 12,0 10,7 15,0 22 ,0
В табл. 2 приведены результаты определения уровня связывания
L-клетками и клетками асцитной карциномы Кребс-2 наиболее хорошо
осаждаемого фосфатом кальция олигонуклеотидного производного
ClRd (рТ) I6 при разных временах инкубации в присутствии различных
добавок, улучшающих трансфекцию эукариотических клеток нуклеино-
выми кислотами. Из таблицы видно, что диметилсульфоксид, ДЭАЭ-
декстран и полилизин неэффективны или малоэффективны для повы-
шения связывания олигонуклеотидного производного. В более высоких
концентрациях, чем указано в таблице, эти добавки были токсичны и
вызывали гибель клеток. Заметный эффект на связывание олигонукле-
отидных производных клетками оказывал лишь хлористый кальций.
Чтобы выяснить, действительно ли наблюдаемые эффекты свя-
заны с увеличением количества реагентов, проникающих в клет-
ки, мы провели электрофорез лизатов клеток, обработанных про-
изводными [32P] ClRd (рТ) 16 в присутствии и отсутствие CaCl2. Видно,
что существенное количество радиоактивности включается во фракцию
биополимеров и в том и в другом случае. Суммарная радиоактивность,
связавшаяся с клетками, в присутствии хлористого кальция оказалась
в семь раз выше, чем без него, однако в первом случае (+CaCl2) в
области биополимеров содержалось около трети радиоактивности, а во
втором (—CaCl2) —около двух третей (табл. 3). Следовательно, уве-
личение уровня модификации биополимеров в результате обработки
клеток хлористым кальцием можно оценить как трехкратное.
Факт модификации, а не реутилизации радиоактивного фосфора
доказывали кислотной обработкой радиоактивных биополимеров, при
этом происходил гидролиз фосфамидной связи и вся радиоактивность
после электрофореза оказывалась в зоне исходного олигонуклеотида.
(Результаты не приведены.)
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А 1989. Т. 5. № 4 73
Из клеток, обработанных олигонуклеотидным реагентом, была вы-
делена РНК- Для этого клетки лизировали NP-40, разделяли цитоплаз-
матическую фракцию и фракцию ядер. Распределение радиоактивности
между ядром и цитоплазмой в обоих случаях было примерно одинако-
вым. Из цитоплазматической фракции была выделена суммарная РНК,
а затем хроматографией на олиго(сПГ) -целлюлозе — поли (А)-содержа-
щая мРНК (поли(А)+-мРНК). В каждом случае определен уровень
модификации мРНК в молях алкилирующего агента на молъ нуклеоти-
да. Как видно из табл. 4, уровень неспецифической модификации РНК
повышался в три раза, а уровень специфической — в шесть раз.
Т а б л и ц а 3
Алкилирование биополимеров в клетках L-929 реагентом ClRd(pT)[c> по данным
электрофореза клеточных лизатов в двухступенчатом 5—20 %-ном ПААГ с мочевиной
Alkylation of biopolymers in L-929 cells by ClRd(pT)l6 as estimated from counting
ot the gel slices
- C a C l 2 -!-CaCl2
У ч а с т о к г е л я Р а д и о а к т и в -
ность , имп/мин
Д о л я р а д и о а к -
тивности во
ф р а к ц и и биопо-
л и м е р о в
Р а д и о а к т и в -
ность , имп/мин
Д о л я радиоак -
тивности во
ф р а к ц и и биопо-
л и м е р о в
Старт 950 2880
5 %-ный гель 803 64 % 2036 31 %
Граница 370 2037
20 %-ный гель 1187 15490
Т а б л и ц а 4
Модификация мРН1\ при обработке клеток реагентом ClRd(pT)ι6 в присутствии
и отсутствие CaCl2
mRNA modification after treatment with the oligonucleotide derivative ClRd(pT)x^
in the presence and in the absence of CaCl2
П о к а з а т е л ь - C a C l 2 H-CaCl2
Суммарная радиоактивность в пробе, имп/мин, по Черепкову 9-IO 7 9 -10 7
Связалось с клетками, % от содержания в пробе 0 , 1 7 2 , 9
Уровень модификации Р Н К , моль /моль нуклеотида:
суммарная Р Н К 5 , 7 - 1 0 ~ 6 1 , 6 - 1 0 - 5
поли (А) + м Р Н К 1 , 9 . 10-5 1.1-10—4
П р и м е ч а н и е . Концентрация ClRd (рТ) ί 6 — 4,5 мкМ, количество клеток в пробе —
5-10 6 , инкубация — 3 ч при 37 °С.
Таким образом, для алкилирующих производных олигонуклеотидов
использование диметилсульфоксида, полилизина и ДЭАЭ-декстрана в
отличие от нуклеиновых кислот высокой степени полимерности оказа-
лось неэффективным. Существенное повышение уровня захвата олиго-
нуклеотидных производных наблюдалось при обработке клеток хлори-
стым кальцием в присутствии фосфатного буфера. Эта процедура со-
осаждения олигонуклеотидных производных с клетками может найти
свое !Применение для направленного воздействия на биополимеры кле-
ток in vivo.
Авторы выражают благодарность Μ. Н. Абдукаюмову, Ю. С. Скоб-
лову и И. В. Рабинову за опытные препараты γ-[3 2Ρ]ΑΤΦ вида В с
объемной активностью 37 ГБк/мл.
74 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А 1989. Т. 5. № 4 74
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Kiiorre D. G., Vlassov V. V. C o m p l e m e n t a r y addressed (sequence-specif ic) modif i -
cat ion of nucleic a c i d s / / P r o g r . Nucl. Acids Res. and Мої. Biol.— 1985—32.—
P. 291—322.
2. Zamecnic P. C., Stephenson Ai. L. Inhibi t ion of Rous sa rcoma v i rus repl icat ion and
cell t r a n s f o r m a t i o n by a specific o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e / / P r o c . Nat . Acad . Sci. USA.—
1978.—75, N 1 . — P . 280—284.
3. Stepfienson M. LZamecnic P. C. Inhibi t ion of Rous sa rcoma v i rus R N A t r a n s l a t i o n
by a specific o l igonucleot ide / / Ibid.— P. 285—288.
4. Подавление синтеза иммуноглобулина в клетках миеломы МОРС-21 алкилирующи-
ми производными олигонуклеотида, комплементарного м Р Н К , кодирующей легкую
цепь иммуноглобулина / В. В. Власов, А. А. Годовиков, В. Ф. З а р ы т о в а и д р . / /
Докл . АН СССР.— 1984.—276, № 5 . — С . 1263—1265.
5. Anti-messenger o l igonucleot ides : specific inhibit ion of rabbi t β -g lob in syn thes i s in
whea t germ ex t rac t s and Xenopus oocytes / C. Cazenave , N. Lorean , J. J . Toulme,
C. H e l e n e / / B i o c h i m i e . — 1 9 8 6 . — 6 8 , N 9 . — P . 1063—1069.
6. Направленная модификация полиадениловых фрагментов информационной Р Н К в
клетках асцитной карциномы Кребс-2 алкилирующим производным нонатимидилу-
ридииа / Ε. М. Иванова , Г. Г. Карпова , Д . Г. Кнорре и д р . / / М о л е к у л я р . биоло-
гия,— 1984.—18, № 3 , — С . 613—619.
7. Juliano R., Mat/hew Е. In te rac t ion of po lynucleo t ides wi th cul tured m a m m a l i a n
c e l l s / / E x p . Cell Res.— 1972,—73, N 1 . — P . 3—12.
8. Warden D., Thome H. I/. The infect ivi ty of po lyoma v i rus DNA for m o u s e embryo
cells in the presence of d i e thv l - aminoe thv ldex t ran / / J . Gen. Virol .— 1968.—3, N 4.—
P. 371—377.
9. Graham F. L., van der Eb A. J. A new technique for the a s sav of infect ivi ty of h u m a n
adenov i ru s 5 DNA / / Viro logy.— 1973.—52, N 2 . — P . 456—467.
10. Stenberg K., Obers B., Chattopadhyaya J. B. Prec ip i ta t ion of nucleot ides by calcium
phospha te / / B i o c h i m . et biophys. acta.—19'82.—697, N 2 . — P . 170—173.
11. Зарытова В. Φ., Иванова Ε. M., Романенко В. П. Синтез олигонуклеотидов в хло-
роформе триэфирным м е т о д о м / / Б и о о р г . химия.— 1983.—9, № 4.— С. 516—521.
12. Б а ус к Е. В., Горн В. В., Лебедев А. В. Унифицированный вариант твердофазного
триэфирного синтеза 5 ' -фосфорилированных олигонуклеотидов на основе β-циан-
угиловых п-хлорфениловых эфиров Ы-ацилнуклеозид-б ' -фосфатов / / Там ж е —
1985,—11, № 6 , — С . 815—820.
13. Маниатис Т., Фрич 3., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.— М. : Мир,
1984 —479 с.
14. Годовикова Т. С., Зарытова В. Φ., λ'илимская Л. М. Реакционноспособные фосфа-
миды Mono- и динуклеотидов / / Биоорг. химия.— 1986.—12, № 4.— С. 475—481.
1 Г). Взаимодействие алкилирующих производных олигонуклеотидов с фибробластами
м ы ш е й / В . В. Власов, б . Е. Горохова, Ε. М. Иванова и д р . / / Б и о п о л и м е р ы и клет-
ка,— 1986,—2, № 6 . — С . 323—327.
Ин-т биоорг. химии Сиб. отд-ния АН СССР, Получено 15.02.88
Новосибирск
U P T A K E O F O L I G O N U C L E O T I D E ALKYLATING D E R I V A T I V E S
BY T H E C E L L S IN T H E P R E S E N C E O F S U B S T A N C E S
S T I M U L A T I N G T R A N S F E C T I O N
A. Воиtorin, V. V. V las sov , Ε. M. I v a n o v a , A. S. R y t e ,
L. V. Yurchenko , L G. Sh i shk ina , L. A. Yakubov
Ins t i tu te of B ioo rgan ic Chemis t ry ,
S iber ian Branch of the U S S R Academy of Sciences, Novosib i rsk
S u m mаrу
The effect of c o m p o n e n t s f ac i l i t a t ing t r ans fec t ion on the up t ake of the a l k y l a t i n g 4-(N-2-
ch lo roe thy l -N-methy lamino) -benzy l 5 ' - [ 3 * P ] p h o s p h a m i d e s of o l igodeoxyr ibonuc leo t ides of
var ious length and s t ruc tu re by the L-929 m o u s e f ib rob las t s and Krebs-2 asci te carc ino-
ma cells w a s inves t iga ted . Dimethylsu l foxide , D E A E - d e x t r a n and polylys ine had a l i t t le
or no effect on the up take . S u b s t a n t i a l ef fect ha s been observed w h e n o l igonucleo t ide de-
r iva t ives were coprecipi ta ted with the cells by calcium chlor ide f rom the p h o s p h a t e buf-
fer. Up take of the der iva t ives by cells increased at least by one order of m a g n i t u d e and
the level of nucleic acids specific modi f ica t ion wi thin the cells — b y fac tor of 6.
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И F4JIETKA 1989. Т. 5. № 4 75
|