Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 1. Образование и характеристика олигомерных окрашенных цепей

Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 1. Образование и характеристика олигомерных окрашенных цепей

Инкубацией моноэтаноламина, формальдегида и нитрата серебра получен окрашенный металлокомплекс. Он включает олигомерные этаноламино-формальдегидные цепочки с брутто-формулой NC₅H₁₃O₄, образующие координационные связи с ионами металла. Число связанных с Ag элементарных цепочек определяет цвет комплек...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Datum:1994
Hauptverfasser: Личина, М.В., Шугалий, А.В.
Format: Artikel
Sprache:Russian
Veröffentlicht: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1994
Schriftenreihe:Биополимеры и клетка
Online Zugang:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155062
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 1. Образование и характеристика олигомерных окрашенных цепей / М.В. Личина, А.В. Шугалий // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 2. — С. 38-44. — Бібліогр.: 15 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-155062
record_format dspace
spelling irk-123456789-1550622019-06-17T01:30:54Z Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 1. Образование и характеристика олигомерных окрашенных цепей Личина, М.В. Шугалий, А.В. Инкубацией моноэтаноламина, формальдегида и нитрата серебра получен окрашенный металлокомплекс. Он включает олигомерные этаноламино-формальдегидные цепочки с брутто-формулой NC₅H₁₃O₄, образующие координационные связи с ионами металла. Число связанных с Ag элементарных цепочек определяет цвет комплекса – от фиоле­тового до оранжево-красного. В условиях длительной инкубации не исключен вариант формирования комплекса красной окраски с разветвленной сеткой из олигомерных цепочек. Інкубацією моноетаноламіна, формальдегіда i нітрату срібла отримано металокомплекс. Він мітить олігомурні етаноламніо-формальдегідні ланцюжки з брутто-формулою NC₅H₁₃O₄, що утворюють координаційні зв'язки з іоном металу. Число пов'язаних в Ag- елементарних ланцюжюв обумовлює колір комплексу від фіолетового до оранжево- червоного. За умов тривалої інкубації не виключається варіант формування комплексу червоного забарвлення з розгалуженою сіткою з oлiгoмeрниx ланцюжків. For DNA probe contrasting is proposed a coloured coordination complex of Ag. It consist of the oligomer ethanolamino-formaldehyde chains with brutto-formula NC₅H₁₃O₄ which are connected by coordination bonds with the metal ion. The numbers of ligand depend on the incubation media, the time of reaction and determine the complex colour– from violet to orange-red. It isn't excluded the branching of the single chain by atom N with the forming of the red coloured complex. 1994 Article Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 1. Образование и характеристика олигомерных окрашенных цепей / М.В. Личина, А.В. Шугалий // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 2. — С. 38-44. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0003A1 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155062 577.113.4:577.336 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
description Инкубацией моноэтаноламина, формальдегида и нитрата серебра получен окрашенный металлокомплекс. Он включает олигомерные этаноламино-формальдегидные цепочки с брутто-формулой NC₅H₁₃O₄, образующие координационные связи с ионами металла. Число связанных с Ag элементарных цепочек определяет цвет комплекса – от фиоле­тового до оранжево-красного. В условиях длительной инкубации не исключен вариант формирования комплекса красной окраски с разветвленной сеткой из олигомерных цепочек.
format Article
author Личина, М.В.
Шугалий, А.В.
spellingShingle Личина, М.В.
Шугалий, А.В.
Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 1. Образование и характеристика олигомерных окрашенных цепей
Биополимеры и клетка
author_facet Личина, М.В.
Шугалий, А.В.
author_sort Личина, М.В.
title Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 1. Образование и характеристика олигомерных окрашенных цепей
title_short Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 1. Образование и характеристика олигомерных окрашенных цепей
title_full Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 1. Образование и характеристика олигомерных окрашенных цепей
title_fullStr Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 1. Образование и характеристика олигомерных окрашенных цепей
title_full_unstemmed Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 1. Образование и характеристика олигомерных окрашенных цепей
title_sort конструирование днк-зонда с использованием соли серебра. 1. образование и характеристика олигомерных окрашенных цепей
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate 1994
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155062
citation_txt Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 1. Образование и характеристика олигомерных окрашенных цепей / М.В. Личина, А.В. Шугалий // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 2. — С. 38-44. — Бібліогр.: 15 назв. — рос.
series Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv AT ličinamv konstruirovaniednkzondasispolʹzovaniemsoliserebra1obrazovanieiharakteristikaoligomernyhokrašennyhcepej
AT šugalijav konstruirovaniednkzondasispolʹzovaniemsoliserebra1obrazovanieiharakteristikaoligomernyhokrašennyhcepej
first_indexed 2025-07-14T07:10:39Z
last_indexed 2025-07-14T07:10:39Z
_version_ 1837605365038972928
fulltext УДК 577.113.4:577.336 М. В. Личина, А. В. Шугалий КОНСТРУИРОВАНИЕ ДНК-ЗОНДА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СОЛИ СЕРЕБРА. 1. ОБРАЗОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ОЛИГОМЕРНЫХ ОКРАШЕННЫХ ЦЕПЕЙ Инкубацией моноэтаноламина, формальдегида и нитрата серебра получен окрашенный металлокомплекс. Он включает олигомерные этаноламино-формальдегидные цепочки с брутто-формулой NCbHxzO^, образующие координационные связи с ионами металла. Число связанных с Ag элементарных цепочек определяет цвет комплекса — от фиоле­ тового до оранжево-красного. В условиях длительной инкубации не исключен вариант формирования комплекса красной окраски с разветвленной сеткой из олигомерных цепочек. Наиболее часто применяемые ДНК-зонды содержат 32Р-меченные нук- леотиды. Существует, однако, много проблем, связанных с радиоактив­ ным мечением. Среди них стабильность зонда, безопасность использова­ ния, стоимость изотопов, необходимость специального оборудования. Альтернативные методы включают следующие подходы. 1. Мечение биотином и детектирование авидин/стрептавидинового конъюгата, приготовленного с ферментом, флюоресцентными группами или электронноплотными частицами. Биотин может быть введен в зонд как биотинированный нуклеотидтрифосфат ник-трансляцией, слу­ чайным праймированием [1] или с использованием фотоактивного ана­ лога фотобиотина, который сшивается с Д Н К при облучении [2J. 2. Мечение другими гаптенами, такими как дигоксигенин или суль- фоновые группы, и детектирование конъюгатом фермент—антигаптено- вые антитела [3]. 3. Непосредственное сшивание детектируемого белка, например, пероксидазы хрена с ДНК-зондом с помощью комплекса фермент — по- лиэтиленимин или глютаральдегид [4]. Существенным недостатком это­ го метода является нестабильность полученного зонда при температурах выше 45 °С и влияние белка на гибридизацию Д Н К — Д Н К [5]. 4. Получение флюоресцентно меченных ДНК-зондов, в частности, введением алифатических аминогрупп и присоединением к ним флюо- рохромов дансихлорида или флюоресцеинизотиоцианата [6]. Наиболее высокая чувствительность с использованием этого подхода достигнута флюоресцентным мечением ДНК, содержащей тиофосфорные эфиры, за счет алкилирования монобромтиманом фосфатных мостиков в сахаро- фосфатном остове Д Н К [7]. Ранее было предложено использовать нитрат серебра для пикограм- мового детектирования в геле белков и нуклеиновых кислот [8, 9 ] . Ме­ ханизм появления окраски неясен, высказывались лишь отдельные пред­ положения [9J. Впоследствии [10—13] появились варианты базового метода, в которых использовались иные реакционные смеси или моди­ фицировались условия в зависимости от типа иммобилизующего геля. Мы, со своей стороны, для повышения чувствительности детектирования предложили непосредственное фотометрирование окрашенного полиак- риламидного геля, опуская этап фотографирования [14]. При этом ми­ нимальное количество регистрируемых рестрикционных фрагментов Д Н К животного происхождения составило 20—40 пг. © М. В. Личина, А. В. Шугалий, 1994 38 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 2 При всей методической простоте и достаточно высокой чувствитель­ ности существенным ограничением подхода, в частности, применительно к ДНК является то обстоятельство, что контрастированные молекулы иммобилизуются в геле в процессе фиксации и не могут быть перенесе­ ны на мембраны для дальнейших исследований. Используя тот же агент—нитрат серебра, мы поставили цель раз­ работать метод контрастирования ДНК-зонда для его последующего применения в молекулярной гибридизации. Суть контрастирования — образование комплекса ДНК с олигомерными цепями, взаимодейству­ ющими со свободными амино/имино группами оснований и имеющими интенсивную окраску. Из дальнейшего изложения будет ясна зависи­ мость цвета комплекса от степени олигомеризации. Для реализации поставленной цели было необходимо решить сле­ дующие задачи: — разработать условия олигомеризации цепей; — определить характеристики образованного окрашенного комп­ лекса; — предложить оптимальный режим получения ДНК-зонда, т. е. мо­ лекул ДНК с фиксированным вкладом олигомерных окрашенных цепей; — оценить стабильность модифицированных молекул; — установить границы их использования в качестве молекулярно­ го зонда. Решению первых двух задач посвящено настоящее сообщение, по­ следующих трех — дальнейшие публикации. В реакционной смеси, содержащей компоненты для контрастирова­ ния ДНК — формальдегид, моноэтаноламин и нитрат серебра, развива­ ется окраска раствора. При этом реакция, если судить по изменению цвета, является, по крайней мере, двухпараметрической — зависит от рН раствора и соотношения этаноламин : формальдегид. Для характе­ ристики цвета, кроме визуального сравнения, мы использовали спект­ ральные особенности каждой фракции (здесь и в дальнейшем под фрак­ циями подразумевается реакционная смесь с фиксированным содержа­ нием всех трех компонентов, которая инкубируется при данной темпе­ ратуре в течение заданного времени). Из достаточно диффузного спект­ ра с помощью одного из светофильтров мы выделяли определенную спектральную полосу и уже в ней выявляли интенсивность поглощения фракции. В зависимости от светофильтра измеряли степень фиолетовой, зеленой, оранжевой или красной окраски фракции. Для характеристики выбрано шесть фракций, имеющих рН 8,15 (1-ая фракция) и далее со смещением на 0,15 ед. рН в кислую область. Из рис. 1 видно, что фракции с различным значением рН ведут себя по-разному. У наиболее щелочной фракции 1 (рН 8,15, рис. 1, а) ин­ тенсивность окраски практически не изменяется со временем, причем во все сроки инкубации она фиолетовая. В то же время нарастание ин­ тенсивности окраски фракции 4 (рН 7,7, рис. 1, б) сопровождается изме­ нением ее цвета от фиолетового в первые 1,5 и 4 ч инкубации до голубо­ вато-фиолетового' (7 ч) и, наконец, зеленого (24 ч). Соответственно пер­ вые три точки на кривой рис. 1, б, мы измеряли с фиолетовым свето­ фильтром, последнюю — с зеленым. Фракция 5 (рН 7,55, рис. 1, в) с аналогичным изменением интенсивности имеет к 4-му ч инкубации зе­ леную окраску, далее — желто-оранжевую. Наконец, фракция 7 (рН 7,25, рис. 1, г) изменяет окраску от желтой (1,5 ч) до желто-оранже­ вой и оранжево-красной во все остальные сроки инкубации. Представление об общем характере изменения суммарной интен­ сивности различных окрасок в зависимости от рН дает рис. 2. Кривая 1 получена со светофильтром СЗС-9, имеющим широкую полосу пропус­ кания, которая включает практически все регистрируемые цвета (АД = = 6000 см-1, Ятах = 20 500 см -1). Для сравнения на кривой 2 представ­ лен вклад индивидуального компонента (зеленая окраска). Из анализа данных по изменению цвета фракций видно, что разви­ тие окраски идет от фиолетовой к оранжево-красной, т. е. происходит ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 2 39 переход от коротковолновой в длинноволновую часть спектра. Этот пе­ реход осуществляется практически для всех фракций, имеющих р Н < 8 , и при длительной инкубации, например, в течение нескольких суток все фракции приобретают темно-оранжевый или красноватый оттенок. Рис. 3 демонстрирует ассоциацию цвета фракции с материалом различной молекулярной массы. При центрифугировании в 2 М саха­ розе фракции 5 после 24-ч инкубации мы наблюдали разделение полосы на зеле­ ную и красно-оранжевую (а, кривые 2 и 2а), при этом материал красно-оранжевой полосы имел большую плот­ ность, т. е. был более поли­ мерным. Его положение при раскапывании совпадает с полосой, образованной фракцией 7, которая после инкубации в течение суток имела оранжево-красную окраску (а, кривая 3). При этом материал фракции 1 с фиолетовой окраской оста­ вался практически у менис­ ка (а, кривая 7), т. е. был наименее полимерным. При регистрации с ши­ рокополосным фильтром СЗС-9 образованных после центрифугирования полос наблюдается смещение мак­ симума полосы, вызванное различным вкладом того или иного цветового компо­ нента (рис. 3, б). Для фио­ летовой фракции максимум Рис. 1. Интенсивность окраски фракций (/, о. е.) как функция спектрального цвета (к, нм) и времени инкубации (t, ч): а — фракция 1 (рН 8,15); 6 — 4 (рН 7,7); 6 — 5 (7,55); г —7 (7,25) смещается на ~ 1 0 нм в фиолетовую область спектра, для оранжево- красной— на ^ 3 0 нм в красную, что подтверждает изменение вклада каждого компонента в различных фракциях. Для зеленого компонента мы оценили молекулярную массу, прове­ дя гель-фильтрацию на сефадексе G-10 препарата фракции 5 после 7 ч инкубации. Использованным маркерам ализарину и динитрофенолу со­ ответствуют на нашей колонке значения коэффициента доступности Kav = 4,2 и 7,2 соответственно (см. [15]). Экстраполируя эти значения к Kav=\J для измеряемой фракции, мы получили величину молекуляр­ ной массы олигомера с зеленой окраской ~650. Элементарный анализ фиолетового, зеленого и красного олигоме- ров, выделенных после лиофильной сушки растворов различной окрас­ ки, дал значения процентного вклада отдельных элементов, указанные в таблице. Поскольку для различных олигомеров эти значения мало ва­ рьируют, предполагаемая структура олигомера должна включать эле­ ментарную цепочку, повторенную п раз. Эта цепочка, как мьг считаем, может иметь вид NH2—СН2—СН20—СН20—СН20-СН2ОН. Расчет 40 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 2 процентного вклада элементов подобной цепочки с двумя молекулами воды представлен в пос^днем столбце таблицы, вычисленные значения согласуются с экспериментом. Если смесь этанегламина и формальдегида инкубировать без Ag, то олигомер окрашивается сразу же после добавления иона металла. Рав­ новесному состоянию отвечает ситуация, когда при использованных на­ ми соотношениях Ag : этаноламин=1 : (20—200) все ионы металла име­ ют максимально возможное количество лигандов. Исходя из оцененной молекулярной массы зеленого олиго- мера ~650 комплекс с зеленой окрас­ кой включает три олигомерные цепоч­ ки. Добавление к зеленому комплексу дополнительного количества Ag должно немедленно приводить к пере­ распределению уже связанных лиган- J 2 1 № фракции Рис. 2. Изменение интенсивности суммарной окраски различных фракций (1) и доли в ней зеленого компонента (2) после инкубации в течение 7 ч. Окраска фракций: 1, 2 — фиолетовая; 3, 4 — голубовато-фиолетовая; 5 — зеленая; 6 — желто-оранжевая; 7 — оранжево-красная Рис. 3. Материал фракций 1 (/), 5 (2 и 2а), 7 (3) после центрифугирования в 2 М сахарозе — а. По оси ординат — интенсивность окраски, измеренная в полосе пропус­ кания соответствующих фильтров. Римские цифры обозначают цвет полосы: / — фио­ летовый; / /— зеленый; / / / — оранжево-красный. Счет по каплям осуществляли со дна пробирки, каждая точка соответствует усредненной пробе из 10 капель. Стрелкой по оси абсцисс указан верх пробирки. Сдвиг максимума суммарной спектральной по­ лосы при измерении фракций с широкополосным светофильтром СЗС-9 — б. Для ре­ гистрации взято по две пробы из фракций 1, 5 (зеленый компонент отвечает кривой 2) и 7. Знак минус по оси ординат означает сдвиг в фиолетовую область спектра, плюс — в красную дов на свободные ионы металла и уменьшению их числа в координаци­ онном комплексе. При этом отмечается изменение цвета от зеленого к фиолетовому. С учетом данных о минимальной плавучей плотности фио­ летового компонента (рис. 3, а, кривая 1) это означает, что комплекс с фиолетовой окраской содержит, по-видимому, минимальное количест- Содержание Элемент, % элементов в препаратах различно окрашенных фракций Фракция Фиолетовая Зеленая Оранжево-красная NC 6H 1 30 4 -2H 20 С н N О Остаток 31,5±0,7 8,0±0,1 8,7±0,3 51,8±1 — 29,8±0,6 7,7±0,1 8,0±0,5 52±2 2,5 31,6±0,8 7>9±0,2 8,1 ±0,3 47,7±2,5 4,8 32 9,1 7,5 51 — ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 2 41 во связанных с ионом металла элементарных цепочек. Напротив, комп­ лекс с оранжево-красной окраской имеет максимальное количество ли- гандов (п = 4—6). Добавление к нему избытка Ag приводит, как мы наблюдали, к переходу цвета в ряду оранжево-красный ->- зеленый, по­ вторное добавление — зеленый ->- фиолетовый. Координационные связи в силу своей лабильности вносят дополни­ тельную сложность в определение молекулярной массы комплексов. Так, при использовании метода гель-хроматографии на колонке со стироге- лем методически необходимо провести лиофилизацию материала для последующего растворения лиофилизованного осадка в тетрагидрофура- не. Оказалось, что лиофилизованные препараты, полученные из фрак­ ций фиолетового и зеленого цвета, при лиофилизации обесцветились. Они имели идентичную хроматографическую подвижность и элюирова- ли в той зоне, которая отвечает выходу стандартных маркеров с моле­ кулярной массой 100—200. Несмотря на приблизительность оценки мож­ но утверждать, что в обоих случаях мы имеем дело с единственной мо­ номерной цепочкой NC5H13O4, полученной при диссоциации комплекса с п=\ (фиолетового) или /2 = 3 (зеленого). Тем не менее, нельзя исключить и случая разветвления уже обра­ зованной элементарной цепочки NC5H13O4 по атомам N с образованием структур типа: т#-мг — ш2о-що •• .•• I I H' — CHZ — CH20 — CHZQ — --• При этом каждый ион металла может образовывать координационную связь с двумя соседними атомами N с обеих сторон, что предполагает удвоенное содержание в комплексе показанной на схеме разветвленной цепи. Образование подобных структур ассоциировано, очевидно, только с красной (оранжево-красной) окраской комплекса. При попытке оце­ нить молекулярную массу оранжево-красного комплекса мы столкну­ лись с ситуацией, когда при хроматографии на сефадексе G-200 с интер­ валом разрешения 5—200 кД наш препарат не проникал внутрь гранул геля и элюировал со свободным объемом. Это означает, что молекуляр­ ная масса подобного оранжево-красного комплекса по крайней мере превышает 6-Ю5. При коротких сроках инкубации (несколько часов) заметна гетерогенность комплекса по молекулярной массе: в 2 М са­ харозе (рис. 3, а, кривая 3), кроме основного пика, присутствует сла­ бая оранжево-красная окраска практически по всему объему центри­ фужной пробирки. При достаточно большом значении п разветвленная структура вряд ли может быть использована для контрастирования ДНК-зонда из-за стерических препятствий в условиях молекулярной гибридизации. Тем не менее, открывается возможность достраивания зонда в уже сформи­ рованном гибридизационном дуплексе для получения максимально ин­ тенсивной окраски комплекса. Подбором соответствующих условий инкубации мы осуществили достраивание исходно слабо-фиолетового зонда в составе дуплекса до интенсивной темно-оранжевой окраски (подробные результаты будут приведены во втором сообщении). Таким образом, в качестве контрастирующей «метки» для окраши­ вания ДНК-зонда предлагается использовать этаноламино-формальде- гидный комплекс. Он образуется после формирования элементарной це­ почки с брутто-формулой NC5H13O4, которая в качестве лиганда входит 42 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 2 в состав координационного комплекса серебра. Число лигандов в комп­ лексе зависит от состава среды, времени инкубации и определяет цвет комплекса — от фиолетового до оранжево-красного. Реально, по-види­ мому, разветвление элементарной цепочки по атому N с образованием пространственной сетки. Реактивы и приборы. В работе использовали следующие реактивы: шуноэтаноламин (2-аминоэтанол), перегнанный при 107 °С под вакуумом 25 мм рт. ст., к формальдегид ДПО «Синтез»; азотнокислое серебро (Уральский з-д химреактивов); борная и лимонная кислоты (обе ос. ч.), натрий лимоннокислый 5,5 водный (Ленинградский з-д «Красный хи­ мик»); трис-(оксиметил)-аминометан, 3-кратно перекристаллизованный (НПО «Биохимреактив», Олайне); динитрофенол, ализарин (оба ч.), сахароза, дважды перекристаллизованная (Шостка); голубой декстран 2000 (м. м. 2-Ю6), сефадексы G-10 и G-200 фирмы «Pharmacia» (Швеция). Оптическую регистрацию проводили на спектрофотометре «Spe- cord UV-VIS» (ГДР) с широкополосным светофильтром СЗС-9, имею­ щим >.тах = 20 500 см-1 и полуширину полосы пропускания АД = = 6000 см-1, а также с фильтрами зеленого (Ят ах=19 600 см-1, АД = = 3200 см-1), оранжевого (Лтах=17 000 см~\ АД =1840 см"1) и крас­ ного цвета (Ятах=15 900 см"1, АД = 1900 см -1). Ультрацентрифугирова- кие осуществляли на центрифуге К24Д (ГДР) в течение 24 ч в про­ бирках объемом 10 мл. Для гель-хроматографии использовали колонки стирогеля с размером пор 20, 50 и 100 нм. Хроматографию на сефадек- сс проводили по методике [15] с 0,02 М натрий-цитратным буфером в качестве элюирующего раствора. Оптимальный состав инкубационной смеси. К 2 мл 0,05 М боратно- го буфера добавляли 1 мг азотнокислого серебра (5,8-10_6 М), 0,0118 мл этаноламина (2-10~4 М), 0,014 мл 30 %-го формальдегида (1,Ы0 _ 4М) п 0,5—0,15 мл 10 %-й лимонной кислоты в зависимости от требуемого значения рН раствора. Молярное соотношение Ag : этаноламин : форм­ альдегид составляло в данном случае 1 : 34 : 19. Фракции указанного со­ става с различными значениями рН (6,87—9,25) инкубировали при 30 °С в течение 1—72 ч, через определенный промежуток времени от­ бирали аликвоты по 0,4 мл и проводили оптические измерения. Для центрифугирования отобранную аликвоту после инкубации в течение 24 ч наслаивали на 2 М сахарозу и после раскапывания содержимого пробирки осуществляли оптические измерения. Для проведения элементарного анализа и гель-хроматографии на колонках со стирогелем измеряемые фракции лиофилизировали. Авторы выражают благодарность И. П. Лаврентьеву за участие в обсуждении результатов и проф. И. Н. Тодорову — за ценные замеча­ ния, высказанные при подготовке статьи. Авторы также признательны А. С. Астаховой и А. И. Кузаеву за проведение элементарного анализа и гель-хроматографии на стирогеле. М. В. Личина, О. В. Шугалш КОНСТРУЮВАННЯ ДНК-ЗОНДА 3 ВИКОРИСТАННЯМ СОЛ1 СР1БЛА. I. УТВОРЕННЯ I ХАРАКТЕРИСТИКА ОЛ1ГОМЕРНИХ ЗЛБАРВЛЕНИХ ЛАНЦЮПВ Р е з ю м е 1.'ч<убащею моноетаноламша, формальдепда i штрату ср1бла отримано металокомплекс. Bin MicTHTb сшгомерш етаноламшо-формальдепдш ланцюжки з брутто-формулою NC5Hia04, що утворюють координацшш зв'язки з юном металу. Число пов'язаних в Ag- елементарних ланцюжюв обумовлюе кол!р комплексу в1д ф1олетового до оранжево- червоного. За умов тривалоГ шкубацп не виключаеться вар1ант формування комплексу червоного забарвлення з розгалуженою т к о ю з oлiгoмepниx ланцюжк1в. ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 2 43 М. V. Lichina, A. V. S hug alii ^ THE DNA PROBE CONSTRUCTION WITH,USE THE SILVER SALT. 1. THE FORMATION AND CHARACTERIZATION OF THE OLIGOMER COLOURED CHAINS S u m m a r y For DNA probe contrasting is proposed a coloured coordination complex of Ag. It con­ sist of the oligomer ethanolamino-formaldehyde chains with brutto-formula NC5H13O4, which are connected by coordination bonds with the metal ion. The numbers of ligand depend on the incubation media, the time of reaction and determine the complex colo­ ur — from violet to orange-red. It isn't excluded the branching of the single chain by atom N with the forming of the red coloured complex. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Leary J. J., Brigati D. J., Ward D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots//Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1983.—80, N 13.— p. 4045—4049. 2. Forster A. C, Mclnnes J. L., Skingle D. S., Symons R. H. Non-radioactive hybridiza­ tion probes prepared by the chemical labelling of DNA and RNA with a novel rea­ gent, photobiotin // Nucl. Acids Res.—1985.—13, N 3.—P. 745—761. 3. Sverdlov E. D.t Monastyrskaya G. S., Gustova L. I. et al. // Biochim. et biophys. ac­ ta.—1974.—340, N 1.—P. 153—165. 4. Renz M.f Kurz C. A colorimetric method for 'DNA hybridization//Nucl. Acids Res.— 1984.—12, N 8.—P. 3435—3444. 5. Al-Hakim A. #., Hull R. Studies towards the development of chemically synthesized non-radioactive biotinylated nucleic acid hybridization probes//Ibid.— 1986.— 14, N 24.— P. 9965—9976. 6. Фрумгарц Л. А., Киприянов С. М., Калачиков С. \М. и др. Получение флуорес­ центно меченной ДНК и использование ее в качестве зонда при молекулярной гиб­ ридизации//Биоорг. химия.—1986.—12, № П.—С. 1508—1513. 7. Hodges R. R., Conway N. Е., McLaughlin L. W. «Post-assay» covalent labeling of phosphorothioate-containing nucleic acids with multiple fluorescent markers//Bio­ chemistry.—1989.—28, N 1.—P. 261—267. 8. Switzer R. C, / / / , Merril C. R., Shifrin S. /Anal. Biochem.— 1979.— 98, N 1.— P. 231—237. 9. Somerville L. L., Wang K. The ultrasensitive-silver «proteins» stain also detects na­ nograms of nucleic acids//Biochem. and Biophys. Res. Communs.— 1981.— 102, N 1.—P. 53—58. 10. Beidler J. L., Hilliard P. R., Rill R. L. Ultrasensitive staining of nucleic acids with silver//Anal. Biochem.—1982.—126, N 2.—P. 374—380. 11. Merril C. R., Pratt M. E. A silver stain for the rapid quantitative detection of pro­ teins or nucleic acids on membranes or thin layer plates//Ibid.— 1986.— 156, N 1.— P. 96—110. 12. Lomholt В., Frederiksen S. Detection of a few picograms of DNA on polyacrylamide gels by silver staining//Ibid.—1987.—164, N 1.—P. 146—149. 13. Datar R. H., Bhisey A. N.//Ind. J. Biochem. and Biophys.—1988.—25.—P. 373—375. 14. Личина М. В., Шугалий А. В., Тодоров И. Н. VI конф. по спектроскопии биополи­ меров.—Харьков, 1988.—С. 194—195. 15. Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот.— М. : Наука, 1985.— С. 109—167. Ин-т хим. физики РАН, Черноголовка Получено 22.09.93 44 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. X? 2

Ähnliche Einträge