Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации EcoRII с синтетическими фрагментами ДНК. Синтез субстратов с одним участком узнавания
Получены 14- и 30-звенные ДНК-дуплексы – субстраты эндонуклеазы рестрикции EcoRII. В участок узнавания введены модифицированные нуклеотидные звенья – m⁵dC и f⁵dU. Модификации не привели к искажению общей геометрии двойной спирали....
Збережено в:
| Дата: | 1987 |
|---|---|
| Автори: | , , , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1987
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155103 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации EcoRII с синтетическими фрагментами ДНК. Синтез субстратов с одним участком узнавания / С.А. Кузнецова, Е.А. Кубарева, Т.С. Орецкая, Н.Г. Долинная, Н.Ф. Крынецкая, Е.С. Громова, З.А. Шабарова, Д. Цех // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 6. — С. 283-289. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-155103 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1551032019-06-17T01:27:27Z Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации EcoRII с синтетическими фрагментами ДНК. Синтез субстратов с одним участком узнавания Кузнецова, С.А. Кубарева, Е.А. Орецкая, Т.С. Долинная, Н.Г. Крынецкая, Н.Ф. Громова, Е.С. Шабарова, З.А. Цех, Д. Структура и функции биополимеров Получены 14- и 30-звенные ДНК-дуплексы – субстраты эндонуклеазы рестрикции EcoRII. В участок узнавания введены модифицированные нуклеотидные звенья – m⁵dC и f⁵dU. Модификации не привели к искажению общей геометрии двойной спирали. Отримано 14- і 30-ланкові ДНК-дуплекси – субстрати ендонуклеази рестрикції EcoRII. У ділянку впізнавання введено модифіковані нуклеотидні ланки – m⁵dC і f⁵dU. Модифікації не спричинили спотворення загальної геометрії подвійної спіралі. 9-16 membered oligodeoxyribonucleotides forming DNA-duplexes with one EcoRII site (native or modified) were synthesized by the block triester method. The modifications involved the replacement of one (or two) cytidine or thymidine moieties in duplexes for m⁵dC or f⁵dU, respectively. 30-membered DNA-duplex was obtained by enzymatic ligation of five overlapping oligonucleotides. The substitutions introduced neither result in any significant destabilization nor distort the double helix geometry as is evidenced by the UV- and CD,-spectroscopy methods. 1987 Article Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации EcoRII с синтетическими фрагментами ДНК. Синтез субстратов с одним участком узнавания / С.А. Кузнецова, Е.А. Кубарева, Т.С. Орецкая, Н.Г. Долинная, Н.Ф. Крынецкая, Е.С. Громова, З.А. Шабарова, Д. Цех // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 6. — С. 283-289. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001FE http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155103 577.113.6.088.5 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров |
| spellingShingle |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Кузнецова, С.А. Кубарева, Е.А. Орецкая, Т.С. Долинная, Н.Г. Крынецкая, Н.Ф. Громова, Е.С. Шабарова, З.А. Цех, Д. Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации EcoRII с синтетическими фрагментами ДНК. Синтез субстратов с одним участком узнавания Биополимеры и клетка |
| description |
Получены 14- и 30-звенные ДНК-дуплексы – субстраты эндонуклеазы рестрикции EcoRII. В участок узнавания введены модифицированные нуклеотидные звенья – m⁵dC и f⁵dU. Модификации не привели к искажению общей геометрии двойной спирали. |
| format |
Article |
| author |
Кузнецова, С.А. Кубарева, Е.А. Орецкая, Т.С. Долинная, Н.Г. Крынецкая, Н.Ф. Громова, Е.С. Шабарова, З.А. Цех, Д. |
| author_facet |
Кузнецова, С.А. Кубарева, Е.А. Орецкая, Т.С. Долинная, Н.Г. Крынецкая, Н.Ф. Громова, Е.С. Шабарова, З.А. Цех, Д. |
| author_sort |
Кузнецова, С.А. |
| title |
Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации EcoRII с синтетическими фрагментами ДНК. Синтез субстратов с одним участком узнавания |
| title_short |
Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации EcoRII с синтетическими фрагментами ДНК. Синтез субстратов с одним участком узнавания |
| title_full |
Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации EcoRII с синтетическими фрагментами ДНК. Синтез субстратов с одним участком узнавания |
| title_fullStr |
Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации EcoRII с синтетическими фрагментами ДНК. Синтез субстратов с одним участком узнавания |
| title_full_unstemmed |
Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации EcoRII с синтетическими фрагментами ДНК. Синтез субстратов с одним участком узнавания |
| title_sort |
взаимодействие ферментов рестрикции и модификации ecorii с синтетическими фрагментами днк. синтез субстратов с одним участком узнавания |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1987 |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155103 |
| citation_txt |
Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации EcoRII с синтетическими фрагментами ДНК. Синтез субстратов с одним участком узнавания / С.А. Кузнецова, Е.А. Кубарева, Т.С. Орецкая, Н.Г. Долинная, Н.Ф. Крынецкая, Е.С. Громова, З.А. Шабарова, Д. Цех // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 6. — С. 283-289. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT kuznecovasa vzaimodejstviefermentovrestrikciiimodifikaciiecoriissintetičeskimifragmentamidnksintezsubstratovsodnimučastkomuznavaniâ AT kubarevaea vzaimodejstviefermentovrestrikciiimodifikaciiecoriissintetičeskimifragmentamidnksintezsubstratovsodnimučastkomuznavaniâ AT oreckaâts vzaimodejstviefermentovrestrikciiimodifikaciiecoriissintetičeskimifragmentamidnksintezsubstratovsodnimučastkomuznavaniâ AT dolinnaâng vzaimodejstviefermentovrestrikciiimodifikaciiecoriissintetičeskimifragmentamidnksintezsubstratovsodnimučastkomuznavaniâ AT kryneckaânf vzaimodejstviefermentovrestrikciiimodifikaciiecoriissintetičeskimifragmentamidnksintezsubstratovsodnimučastkomuznavaniâ AT gromovaes vzaimodejstviefermentovrestrikciiimodifikaciiecoriissintetičeskimifragmentamidnksintezsubstratovsodnimučastkomuznavaniâ AT šabarovaza vzaimodejstviefermentovrestrikciiimodifikaciiecoriissintetičeskimifragmentamidnksintezsubstratovsodnimučastkomuznavaniâ AT cehd vzaimodejstviefermentovrestrikciiimodifikaciiecoriissintetičeskimifragmentamidnksintezsubstratovsodnimučastkomuznavaniâ |
| first_indexed |
2025-07-14T07:12:16Z |
| last_indexed |
2025-07-14T07:12:16Z |
| _version_ |
1837605466450952192 |
| fulltext |
Структура
и функция
биополимеров
у д к 577.113.6.088.5
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ РЕСТРИКЦИИ
И МОДИФИКАЦИИ EcoRII
С СИНТЕТИЧЕСКИМИ ФРАГМЕНТАМИ ДНК.
СИНТЕЗ СУБСТРАТОВ С ОДНИМ УЧАСТКОМ УЗНАВАНИЯ
С. А. Кузнецова, Е. А. Кубарева, Т. С. Орецкая, Н. Г. Долинная,
Η. Ф. Крынецкая, Е. С. Громова, З. А. Шабарова, Д. Цех
Введение. Изучение механизма действия ферментов рестрикции и мо-
дификации II типа представляет значительный интерес как для реше-
ния проблемы белково-нуклеинового узнавания, так и в связи с поис-
ком более эффективных путей использования этих ферментов в генной
инженерии. В продолжение исследований эндонуклеазы рестрикции
EcoRII, проводимых в нашей лаборатории [1—3], возникла необходи-
мость расчета термодинамических и кинетических параметров, характе-
ризующих взаимодействие эндонуклеазы рестрикции EcoRII с узнавае-
мой последовательностью, определения природы и числа специфических
и неспецифических контактов белка и ДНК, а также выяснения струк-
турных особенностей белково-нуклеинового комплекса. Представляется
также важным провести сравнительное изучение фермента EcoRII и
его изошизомеров. Для решения этих задач в настоящее время осу-
ществлен синтез 14-звенных олигонуклеотидных дуплексов I—V и более
протяженного ДНК-дуплекса VI, содержащих один природный или мо-
дифицированный участок узнавания EcoRII (обозначен чертой):
5 acctacctggtggt3'* - . a9c.cj/£c^gj£gj. //· \ слтлсл і^лі^я г м-
tggatggaccacca , tggatggaccacca ^ggatggaccacca
j ' к 5' А
-*- *
U = 5-фтордезоксиуридин (f5U); С = 5-метилдезоксицитидин (m5C).
ДНК-дуплекс II содержит в центре участка узнавания 5-фтор-2'-дезок-
сиуридин. Это делает возможным применение метода ЯМР на ядрах
19F для изучения структуры белково-нуклеинового комплекса. В олиго-
нуклеотидных дуплексах III—V метилированы соседние с центральной
* Здесь и далее префикс d (дезокси) опущен, направление связи во всех дуплек-
сах, как в дуплексе I.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1987. — Т. 3, № б 2 8 3
парой остатки дезоксицитидина, которые модифицируются метилазой
EcoRII. Путем комбинации тяжей, входящих в состав дуплексов I и III,
получаются полуметилированные субстраты IV и V. Кроме того, нами
сконструирован 29-звенный ДНК-дуплекс VII, имеющий ту же нуклео-
тидную последовательность, что и субстрат VI, за исключением участка
узнавания EcoRII1 в котором отсутствует центральная АТ-пара:
5' 3'
GATGCTGCCAACCGGCTCTAGCTTCATAC
CTACGACGGTTGGCCGAGATCGAAGTAT G
3 ' 5 '
Наряду с синтезом задачей настоящей работы является определение не-
которых физико-химических характеристик полученных дуплексов.
Материалы и методы. В работе использовали дезоксинуклеозиды отечественного
производства; Т4-полинуклеотидкиназу (КФ 27.1.7.8), Т4-ДНК-лигазу (КФ 6.5.1.1)
(Вильнюс); 5-фтор-2'-дезоксиуридин («Fluka», Швеция), этиленциангидрин, триазол,
N-метилимидазол, бензойный ангидрид, 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорид, моно-
метокситритилхлорид, 2-меркаптоэтанол, диметилсульфат, пиперидин, безводный гидра-
зин («Мегск», Ф Р Г ) ; ДЭАЭ-целлюлозу ДЭ-23 («Whatman», Англия), [γ- 3 2Ρ]ΑΤΡ,
37 ТБк/ммоль (ВО «Изотоп», Моск. отд-ние).
Концентрацию олигонуклеотидов (на мономер), C0, определяли спектрофотометри
чески. Коэффициенты молярной экстинкции, ε26ο, олигонуклеотидов принимали равными
сумме ε260 составляющих мономеров, используя значение є2ео Для т 5 С — 5600 M - 1 с м - 1
и для f 5U — 5250 M - 1 с м - 1 [3]. Изучение комплексообразования олигонуклеотидов
проводили в 0,015 M цитратном буфере, рН 7,25, 0,15 M NaCl (дуплексы I—II I ) ,
в 0,05 M МЭС-буфере, рН 6,0, 0,02 M MgCl2 (дуплекс VI х ) , C0 (0,2—0,4). 10~3 M или
в 0,04 M трис-НС1-буфере, рН 7,6, 0,05 M NaCI, 0,005 M MgCl2, 0,007 M 2-меркаптоэта-
нол (дуплекс VI I ) , C0 0 , Ы 0 ~ 4 М. Температурную зависимость УФ-поглощения ком-
плексов измеряли на спектрофотометре «Сагу-219» (США) при непрерывном повыше-
нии температуры со скоростью 0,5 °С в 1 мин в термостатируемых кварцевых кюветах
с длиной оптического пути 1 и 10 мм. Температуру регистрировали при помощи медно-
константановой термопары. Гипохромию (h) и энтальпию (\Н°) комплексообразова-
ния определяли по [4].
Спектры кругового дихроизма (КД) ДНК-дуплексов снимали на дихрографе
«Jouan-ΙΙΙ» (Франция) при комнатной температуре.
С и н т е з о л и г о н у к л е о т и д о в ACCTACCTGGTGGT (a), ACCTACCUGG-
TGGT (б), ACCTACCTGGTGGT (в), ACCACCAGGTAGGT (г), ACCACCAGGTAGGT
(о), GATGCTGCC (е)9 AACCTGGCTCT (ж), AGCTTCATAC (з), AGGTTGGCAGCATC
(и), GTATGAAGCTAGAGCC (к) осуществляли фосфотриэфирным методом в раство-
ре [5]. Целевые олигонуклеотиды после полного их деблокирования (обработки смесью
концентрированный NH 3 -пиридин, 3 : 1, 50 °С, 24 ч и 80 % CH3COOH, 20 °С, 20 мин)
выделяли с помощью ионообменной хроматографии на колонке (15X300 мм) с ДЭАЭ-
целлюлозой в 0,005 M трис-НС1-буфере, рН 7,5, содержащем 7 M мочевину, в градиенте
концентрации NaCl (0—0,36 М) с последующей рехроматографией методом обращен-
нофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе
«Тгасог» (Нидерланды) на колонке «Ultrasphere TM-octyl» (5 мк, 4,6 ммХ25 см)
в линейном градиенте концентрации метанола (0—0,35 М), содержащем 0,1 M ацетат
аммония.
С и н т е з д и н у к л е о т и д а (MeO)TrbzCp (ClPh) m5bzCp (ClPh, CNEt).
(MeO)2Trm5CLev получали из тимидина по методике [6]. Бснзоилирование, детритили-
рование этого соединения и конденсацию полученного m5bzCLev с (MeO) TrbzCp (ClPh,
Εt3Ν) осуществляли по [7]. Выход 80 %. Левулинильную защитную группировку уда-
ляли, как в работе [8]. Продукт реакции выделяли на колонке с силикагелем L40/100
в градиенте концентрации этанола в хлороформе (от 0 до 10 %) . Динуклеозидфосфат
(MeO)TrbzCp (ClPh) m5bzC фосфорилировали по стандартной методике [7]. Выход ди-
нуклеотида 65 %.
С и н т е з о л и г о н у к л е о т и д о в GATGCTGCCAACC (л), GGCTCTAGCTTCA-
TAC (ж), TAGAGCCGGTTGGC (н), GCCAACCGGCTCTA (о), GGTTGGCAGCATC
(η) описан в работе [9].
284 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1987. — Т. 3, № б 2 ~ 7-539 284
С и н т е з GATGCTGCCAACCTGGCTCTAGCTTCATAC (ρ) и GTATGAAGCTAG-
AGCCAGGTTGGCAGCATC (с), 5'-фосфорилирование олигонуклеотидов проводили с по-
мощью Т4-полинуклеотидкиназы в присутствии ATP или [γ- 3 2Ρ]ΑΤΡ [1]. Ферментатив-
ное лигирование олигонуклеотидов GATGCTGCC, pAACCTGGCTCT и pAGCTTCATAC,
один из которых содержал Б'-концевую метку 3 2 P, осуществляли на матрице из двух
олигонуклеотидов AGGTTGGCAGCATC и GTATGAAGCTAGAGCC с помощью Т4-ДНК-
лигазы в течение 16—18 ч (5—8 °С) в 0,05 M трис-НС1-буфере, рН 7,6, содержащем
0,01 M MgCl2, 0,005 M 2-меркаптоэтанол, 0,001 M спермидин и 1 мМ АТР. Аналогично
проводили лигирование 32Р-меченного олигонуклеотида pAGGTTGGCAGCATC и
GTATGAAGCTAGAGCC на матрице из GATGCTGCC, AACCTGGCTCT и AGCTTCATAC.
Выходы «верхнего» и «нижнего» тяжей 30-звенного дуплекса VI составили 85—95 %.
Анализ продуктов ферментативного сшивания олигонуклеотидов Т4-ДНК-лигазой ПРО-
В О Д И Л И электрофорезом в 20%-ном полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем 7 M
мочевину. 32Р-меченные 30-звенные олигонуклеотиды выделяли элюцией с геля.
С и н т е з GATGCTGCCAACCGGCTCTAGCTTCATAC (г) и GTATGAAGCTAGAG-
CCGGTTGGCAGCATC (у). Соединения (г) и (у) получали аналогично (ρ) и (с)
ферментативным лигированием олигонуклеотидов (л) и (м) на матрице (н) и олиго-
нуклеотидов (/с) и (η) на матрице (о) соответственно
Результаты и обсуждение. Для получения ДНК-дуплексов I—V,
содержащих природный или модифицированный участок узнавания эн-
донуклеазы EcoRII1 осуществлен синтез пяти 14-звенных олигонуклео-
тидов (а—(3), в том числе содержащих 5-фтордезоксиуридин и 5-метил-
дезоксицитидин, триэфирным растворным методом. Преимуществом
этого метода в данном случае является возможность введения модифи-
цированных звеньев в олигонуклеотиды в процессе синтеза. При синте-
зе олигонуклеотидов с модифицированными звеньями первым этапом
было преобразование 5-фтор-дезоксиуридина и б'-О-диметокситритил-
3'-левулинил-5-метилдезоксицитидина * в стандартные компоненты три-
эфирного синтеза. Для фторпроизводного это был б'-О-монометокситри-
тил-5-фтор-дезоксиуридин-З'- (я-хлорфенил-р-цианэтил) фосфат, полу-
ченный по методике [7]. (MeO)2Trm5CLev претерпевал превращения по
следующей схеме:
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1987. — Т. 3, № б 2 ~ 7-539 285
Конденсацию нуклеотидной и нуклеозидной компонент проводили, ис-
пользуя их в соотношениях от 1,25 : 1 до 1 : 1,5, что не влияло на выход
нужного продукта. Выходы на стадиях конденсации составили 80—
9 0 % . Этот результат хорошо согласуется с литературными данны-
ми [5, 7].
Схема синтеза отдельных олигонуклеотидов, входящих в состав
дуплексов I—VI, определялась наличием повторяющихся блоков и мо-
дифицированных нуклеозидов:
Таким образом были получены олигонуклеотиды (а—к) в количествах
50—170 ед. А2бо. Чистота препаратов составляла 95—98 %.
Нуклеотидную последовательность 14-звенных олигонуклеотидов
(а—д) подтверждали методом Максама — Гилберта в твердофазном
варианте [10], а остальных (е—к)—тем же методом в растворе [И].
* Соединение (MeO)2Trm5CLev синтезировано Л. JI. Сухановой по методике [6].
Дуплекс VI получен ферментативным лигпроЕанием пяти олиго-
рибонуклеотидов, собирающихся в растворе за счет комплементацион-
ных взаимодействий в дуплекс VT с тремя одноцепочечными разрывами:
е ж з
у 1 ι 1 ι 1
W
Разбивку дуплекса VI на составляющие олигонуклеотиды проводили
таким образом, чтобы короткие перекрывающиеся блоки были обога-
щены G-C-парами. Это должно повысить общую термическую устойчи-
Рис. 1. Электрофорез в 20 %-ном
ПААГ, содержащем 7 M мочевину,
продуктов ферментативного лигирова-
ния олигонуклеотидов: а — GATGCTGCC,
pAACCTGGCTCT и pAGCTTCATAC на
матрице AGGTTGGC AGCATC и
GTATGAAGCTAGAGCC (1 — реакцион-
ная смесь после 16 ч инкубирования, 2 —
*
исходный препарат pAACCTGGCTCT);
б — pAGGTTGGCAGCATC и GTATGAA-
GCTAGAGCC на матрице GATGCTGCC,
AACCTGGCTCT и AGCTTCATAC (1 —
реакционная смесь после 16 ч инкуби-
*
рования, 2 — исходный препарат pAGG-
TTGGCAGCATC) . Звездочкой отмечен
фосфатный остаток, несущий 32Р-метку.
Стрелкой указано положение красите-
лей-маркеров: XC ----- коплemu:г.нол,
B P B — б ρ о м φ е но л о в ы й с и пи й
Fig. 1. Separation of the enzymic iigaiion products in the 2 0 % polyacryiamide gel con-
taining 7 Al urea: a — GATGCTGCC pAACCTGGCTCT and pAGCTTCATAC on the mat-
rix formed I)у AGGTTGGCAGCATC ' and GTATGAAGCTACAGCC (7 — reaciion mixture
16 h after incubation, 2 - - initial pAACCTGGCTCT); 6 - pAGGTTGGO r,C ATC and
GTATGAAGCTAGAGCC on the matrix formed by GATGCTGCC, AACCTGGCTCT and
AGCTTCATAC {1 — reaction mixture 16 h after incubation, 2 — initial *
pAGGTTGGCAGCATC). 32P-Iabelled phosphate group is indicat-d with asterisk. Xylen-
cianol (XC) and brunipkcnol blue (BPB) markers are indicated with arrows
b o c t b ДНК-дуплекса с тремя одноцепочечными разрывами. Для репара-
ции последних использовал π Т4-ДН1\-лигазу, причем собирали по от-
дельности каждую из цепей дуплекса (рис. 1).
Предложенная схема синтеза позволяет получить отдельно «верх-
ний» π «нижний» тяжи олпгонуклеотпдного дуплекса, а также дает
возможность расширить набор субстратов для фермента рестрикции
EcoRII при минимальных затратах нуклеотпдного матери а. .. Так, ком-
бинируя 30-звенные олигонуклеотиды и олигонуклеотиды (с—к), не не-
сущие б'-концевой фосфатной группы, можно получить дуплексы с
контролируемым одноцепочечным разрывом:
G-A-T-G-C-T-G-C-C^ A-A-
Для оценки термической устойчивости полученных ДНК-дуплексов
и влияния введенных модификаций на структуру двойной спирали были
использованы УФ-спектроскопия и КД. Хотя эти методы не позволяют
охарактеризовать локальные возмущения, вносимые модифицированны-
284 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1987. — Т. 3, № б 2 ~ 7-539 286
ми основаниями, они дают возможность выяснить, как влияют модифи-
кации на геометрию и термодинамические параметры дуплекса в целом.
Такая информация полезна для корректной интерпретации данных, по-
лученных при изучении белково-нуклеиновых взаимодействий.
Кривые плавления дуплексов I—III, VT и VII в дифференциальной
форме представлены на рис. 2, значения /І, Тпл Η ΔH0 комплексообразо-
вания приведены в таблице. Из экспериментальных данных видно, что
введение вместо остатка тимидина 5-фтордезоксиуридина практически
не влияет на ТПЛ и /2, но несколько понижает энтальпию комплексооб-
оазования. Результаты изучения дуплекса II согласуются с литератур-
Рис. 2. Кривые плавления (в дифференциальной форме) ДНК-дуплексов: a — I ( J ) , II
(2), III (Я) в 0,015 M нитратном буфере, рН 7,25, содержащем 0,15 M NaCl, C0 (0,2—
0,4) - IO- 3 М; б — V I ' ( / ) в 0,05 M МЭС-буфсре, рН 6,0, содержащем 0,02 M MgCl 2 ,
C0 0,3· IO-3 M и VII (2) в 0,04 M трис-НС1-буфере, рН 7,6, содержащем 0,05 M NaCl7
0,005 M MgCl 2 , 0,007 M 2-меркаптоэтанол, C0 0,1 - IO"1 M
Fig. 2. Melting curves (in differential form) for DNA-duplexes: a — I ( / ) , II (2), III (3)
in 0.015 M of citrate buffer, pi I 7.25, containing 0.15 M of NaCl, C0 (0.2— 0.4) · 10~3 M; 6 —
V T ( / ) in 0.05 M of MES-buiter, pH 6.0 containing 0.02 M of MgCl 2 , Cn 0.3· 10~3 M and
VI I (2) in 0.04 M of tris-HCl-buffer, pH 7.6 containing 0.05 M of NaCl, 0.005 M of
AlgCl2, 0.007 M of 2-mercaptoetHanoi, C0 0 . 1 -10 - 4 M
нымп данными. Так, недавно методом ЯМР-спектроскопии было пока-
-X-
зано, что A-U-napa менее устойчива, чем А-Т-пара, однако 12-звеиный
ДНК-дуплекс, содержащий 5-фтордезоксиуридин, в целом не дестаби-
лизирован [12]. В случае дуплекса III, содержащего 5-метплдезоксици-
гидии, можно было ожидать изменения термодинамических параметров
комплексообразования, так как известно, что 5-метильная группа ци-
тозииа экспонирована в большую бороздку двойной спирали, а это
должно вызвать изменение в гидратной оболочке дуплекса [13]. Однако
полученные результаты (рис. 2, а, таблица) свидетельствуют о том, что
введение одной — двух модификаций такого рода на 14 нуклеотидных
пар не влияет существенно на термодинамические свойства системы.
Для дуплекса VII характерно высокое значение Тпл; плавление проис-
ходит в узком интервале температур (рис. 2, б, таблица). В отличие от
этой системы плавление дуплекса VI7, содержащего три разрыва в цепи
фосфодиэфирных связей, не однофазно (рис. 2, б), что связано с гетеро-
генностью участков спаривания по длине и составу. В таблице приведе-
на температура полуперехода, отвечающая последней ступени.
Данные КД свидетельствуют о незначительных конформационных
изменениях, индуцированных указанными выше модификациями. Как
видно из рис. 3, спектры КД дуплексов I—III почти полностью совпа-
дают. Спектр КД дуплекса VI7 (рис. 3) аналогичен спектру ДНК в
В-форме с 50 %-ным содержанием G-C-nap [14]. В отличие от этого
спектры дуплексов I—III имеют существенное сходство со спектром КД
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1987. — Т. 3, № 6 287
ДНК в Α-форме: точка нулевого перехода и максимум положительной
полосы смещены в коротковолновую область, положительная полоса
КД превышает отрицательную по амплитуде. Это позволяет нам сде-
лать предположение о наличии элементов Α-формы в двойной спирали
ДНК-дуплексов I—III. Недавно появились сообщения об Α-форме спи-
рали в кристаллическом состоянии у коротких двутяжевых олигодезок-
•.. G - G · - ·
сирибонуклеотидов, содержащих кластеры · · [15, 16]. В дуй-
* · Li Li * * *
лексах I—III имеются четыре такие последовательности. Другая воз-
можная причина отклонения спектров КД дуплексов I—III от канони-
ческого вида В-формы — влияние нуклеотидной последовательности на
Некоторые характеристики
синтетических дуплексов *
Some properties of the duplex
synthesized
N°
Дуп-
лекса
h,
%(±1)
ТПЛ·
°С (±1)
Δ H0**,
ккал/моль
(±5)
I 18 56 —94
II 21 55 - 7 5
III 19 56 — 8 8
VI' 22 40 —
VII 11 73 — 188
Рис. 3. Спектры КД ДНК-дуплексов I ( / ) , II
(2)у III (3) , VI ' (4). Условия, как на рис. 2;
20 °С
Fig. 3. CD spectra of DNA duplexes I (I)i II
(2), III (3), VV (4). Conditions as indicated
in Fig. 2
* Условия см. в подписи к рис. 2.
** Для дуплекса VI ' не рассчи-
тывали Δ#° бифазного конформа-
ционного перехода.
вид спектра при изогеомет-
ричности структуры корот-
ких ДНК-дуплексов — ка-
жется нам значительно ме-
нее вероятной.
Таким образом, результаты физико-химического изучения олиго-
нуклеотидных дуплексов I—III показывают, что введение нуклеотидных
аналогов ш5С и f5U не снижает устойчивости дуплексов и не приводит
к существенному искажению геометрии двойной спирали в целом. Сле-
довательно, эти дуплексы можно с успехом использовать в качестве
субстратов эндонуклеазы рестрикции EcoRII, и при интерпретации ре-
зультатов этих исследований исключить фактор «измененной» по срав-
нению с немодифицированным субстратом структуры.
Авторы выражают благодарность В. Г. Метелеву и А. А. Пурмалю
за помощь при проведении ВЭЖХ.
INTERACTION BETWEEN EcoRII RESTRICTION/MODIFICATION ENZYMES
AND SYNTHETIC DNA FRAGMENTS. SYNTHESIS OF SUBSTRATES
CONTAINING A SINGLE RECOGNITION SITE
S. A. Kuznetsova, E. A. Kubareva, T. S. Oretskaya, N. G. Dolinnaya, N. F. Krynetskaya,
E. S. Gromova, Z. A. Shabarova, D. Cech
Μ. V. Lomonosov State University, Moscow;
A. Humboldt University, GDR, Berlin
S u m m a r y
9-16 membered oligodeoxyribonucleotides forming DNA-duplexes with one EcoRII site
(native or modified) were synthesized by the block triester method. The modifications
involved the replacement of one (or two) cytidine or thymidine moieties in duplexes for
m5dC or f5dU, respectively. 30-membered DNA-duplex was obtained by enzymatic liga-
tion of five overlapping oligonucleotides. The substitutions introduced neither result in
any significant destabilization nor distort the double helix geometry as is evidenced by
the UV- and CD-spectroscopy methods.
288 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1987. — Т. 3, № 6 288
1. ДНК-подобные дуплексы, содержащие повторы. VIII . Синтез и свойства фрагмен-
тов ДНК-субстратов эндонуклеазы рестрикции EcoRII J Е. С. Громова, Μ. Н. Ви-
ноградова, А. А. Елов и др./ /Молекуляр. биология.— 1984.— 18, № 2.— С. 370—
381.
2. Interaction of EcoRII restriction and modification enzymes with synthetic DNA
fragments. V. Study of single-strand cleavages / A. A. Yolov, E. S. Gromova, E. A. Ku-
bareva et al. / / Nucl. Acids Res.— 1985.— 13, N 24.— P. 8 9 6 9 - 8981.
3. Interaction of EcoRII restriction and modification enzymes with synthetic DNA
fragments. VI. The binding and cleavage of substrates containing nucleotide analogs /
A. A. Yolov, M. N. Vinogradova, E. S. Gromova et al. JJ Ibid.— P. 8983—8998.
4. Синтез и изучение термической vcToft4HBocTH олигодезоксипибонуклеотидных ду-
плексов со структурными аномалиями / О. И. Грязнова. Н. Г. Долинная, М. Г. Иса-
гулянц и др. / / Биоорг. химия.— 1986.— 12, № 1.— С. 124—131.
5. Narang S. A. DNA-synthesis JJ Tetrahedron.— 1983.— 39, N 1.—P. 3—22.
6. Chemische Synthese von Nonadeoxyribonucleotiden mit den Abgewandelten Basen
Uracil, 5-Bromuracil und 5-Metylcytosin nach dem Triester Verfahren / A. Rozenthal,
D. Cech, V. P. Veiko et al . / /Tetrahedron Lett.— 1984.—25. N 39 .—P. 4353—4356.
7. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. III. Синтез концевых
инвертированных повторов ISl-элемента / 3. А. Шабарова, В. П. Вейко, Н. Г. До-
линная и др. / / Биоорг. химия.— 1987.— 13, № 5.— С. 628—642.
8. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих З'-концевую фосфатную груп-
пу / В. П. Вейко, Т. С. Орецкая, Ε. М. Волков и др. / / Химия природ, соединений.—
1984.—№ 5.—С. 637—641.
9. Изменения в регламенте синтеза олигодезоксирибонуклеотидов на автоматах-синте-
заторах «Виктория-2» и «Виктория-4М» / Т. С. Орецкая, Е. А. Кубарева, С. М. Гряз-
нов и др . / /Химия природ, соединений.— 1987.— Лг2 1.— С. 153—155.
10. Chemische Synthese, Isolierung und Sequenzierung von Tetradecadesoxyribonucleoti-
den mit den Abgewandelten Basen 5-Fluoruracil und 5-Methylcytosin / A. Rozenthal,
F. Shubert, D. Cech et al. J J Biomed. Biochim. Acta.— 1985.—44, N 10,—S. 75—83.
11. Maxam Α., Gilbert W. A new method for sequencing D N A / / P r o c . Nat. Acad. Sci.
USA.— 1977.— 74, N 2.— P. 560—564.
12. Cremer A. B., Mikita T., Beardsley G. P. Chemical consequences of incorporation of
5-fluorouracil into DNA as studied by NMR//Biochemistry .— 1987.—26, N 2.—
P. 391—397.
13. Molecular structure of (m5dC-dG)3: the role of the methyl group in 5-methyl cytosine
in stabilizing Z D N A / S . Fuju, A. H.-J. Wang, G. A. van der Marel et a l . / / N u c l .
Acids Res.— 1982.— 10, N 23.— P. 7879—7892.
14. Marck C., Guschlbauer W. A simple method for the computation of first neighbour
frequencies of DNAs from CD spectra J J Ibid.— 1978.— 5, N 6 . — P . 2013—2031.
15. Shakked Z., Rabinovich D. Sequence-dependent conformation of an A-DNA double
helix. The crystal structure of the octamer d(G—G—Τ—A—T—A—C—C) / / J . Мої.
Biol.— 1983.— 166, N 2.— P. 183—201.
16. Raman spectra of single crystals of r(GCG) d (CGC) and d(CCCCGGGG) as models
to A DNA, their structure transitions in aqueous solution and comparison with
double-helical poly (dG) · poly (dC) / L. M. Benevides, A. H.-J. Wang j A. Rich et al. J J
Biochemistry.— 1986.—25, N 1.—P. 41—50.
МГУ им. Μ. В. Ломоносова Получено 20.06.86
Гумбольдт, ун-т, Берлин
У Д К 577.151.45
ИЗБИРАТЕЛЬНОСТЬ РЕСТРИКТАЗЫ BspRI
В ОТНОШЕНИИ СОБСТВЕННЫХ САЙТОВ НА ДНК *
В. Р. Сагитов, А. 3. Метлицкая, А. А. Александров
Введение. Д л я р я д а р е с т р и к т а з (HaeIIIy HhaI [1] , EcoRl [2 , 3] , PstI [4 ] ,
HinfI [5], HindIII и BamHI [6]) показано, что скорость гидролиза ДНК
в различных сайтах существенно отличается. В предельных случаях
некоторые сайты полностью устойчивы к действию фермента, хотя и
обладают канонической последовательностью для данной рестриктазы
[7]. Причина этого явления неизвестна. Предполагают, что эффектив-
ность гидролиза ДНК определяется ближайшим окружением сайта [2].
Действительно, на олигонуклеотидах было показано, что скорость гид-
ролиза ДНК для рестриктаз HaeIII, BspRI и BsuRI зависит от того,
* Представлена членом редколлегии М. Д. Франк-Каменецким.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1987. — Т. 3, № 6 289
|