Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування

Розглянуто теоретичні основи кондуктометричного методу вимірювань та можливість його використання для реєстрації перебігу ферментативних процесів, що проілюстровано відповідними даними різних дослідників. Наведено приклади багатьох кондуктометричних перетворювачів, які використовують при створенні б...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2005
Автор:	Дзядевич, С.В.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2005
Назва видання:	Біополімери і клітина
Теми:	Огляди
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155133
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування / С.В. Дзядевич // Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, № 2. — С. 91-106. — Бібліогр.: 98 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-155133
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1551332019-06-17T01:26:07Z Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування Дзядевич, С.В. Огляди Розглянуто теоретичні основи кондуктометричного методу вимірювань та можливість його використання для реєстрації перебігу ферментативних процесів, що проілюстровано відповідними даними різних дослідників. Наведено приклади багатьох кондуктометричних перетворювачів, які використовують при створенні біосенсорів, засоби іммобілізації активного матеріалу на їхню поверхню та схеми і методики вимірювань. Описано деякі моделі кондуктометричних фермент них біосенсорів, обговорено їхні переваги і недоліки, а також перспективи подальшого розвитку. Рассмотрены теоретические основы кондуктометрического метода измерений и возможность его использования для регистрации прохождения ферментативных реакций, что проиллюстрировано соответствующими данными разных исследователей. Приведены примеры многих кондуктометрических преобразователей, используемых при создании биосенсоров, методы иммобилизации активного материала на их поверх ность, схемы и методики измерений. Описаны некоторые модели кондуктометрических биосенсоров, обсуждены их преимущества и недостатки, а также перспективы дальнейшего развития. A theoretic principles of conductometric method of mesurements, possibility of their application for registration of enzymatic reactions, and examples of such application have been shown. Variants of different conductometric transducers for biosensor creation, immobilisation methods of active material onto surface, measure ments schemes and methods have been presented. Some examples of conductometric enzyme biosensors, their advantages and disadvantages, and perspectives of their application have been described. 2005 Article Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування / С.В. Дзядевич // Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, № 2. — С. 91-106. — Бібліогр.: 98 назв. — укр. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0006E1 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155133 577.15: 573.6 uk Біополімери і клітина Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Огляди Огляди
spellingShingle	Огляди Огляди Дзядевич, С.В. Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування Біополімери і клітина
description	Розглянуто теоретичні основи кондуктометричного методу вимірювань та можливість його використання для реєстрації перебігу ферментативних процесів, що проілюстровано відповідними даними різних дослідників. Наведено приклади багатьох кондуктометричних перетворювачів, які використовують при створенні біосенсорів, засоби іммобілізації активного матеріалу на їхню поверхню та схеми і методики вимірювань. Описано деякі моделі кондуктометричних фермент них біосенсорів, обговорено їхні переваги і недоліки, а також перспективи подальшого розвитку.
format	Article
author	Дзядевич, С.В.
author_facet	Дзядевич, С.В.
author_sort	Дзядевич, С.В.
title	Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування
title_short	Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування
title_full	Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування
title_fullStr	Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування
title_full_unstemmed	Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування
title_sort	кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2005
topic_facet	Огляди
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155133
citation_txt	Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування / С.В. Дзядевич // Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, № 2. — С. 91-106. — Бібліогр.: 98 назв. — укр.
series	Біополімери і клітина
work_keys_str_mv	AT dzâdevičsv konduktometričnífermentníbíosensoriteoríâtehnologíâzastosuvannâ
first_indexed	2025-07-14T07:13:37Z
last_indexed	2025-07-14T07:13:37Z
_version_	1837605550697742336
fulltext	I S S N 0233-7657. Біополімери і клітина. 2005. Т. 21 . № 2 ОГЛЯДИ Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування С. В. Дзядевич Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, 03143 , Україна Розглянуто теоретичні основи кондуктометричного методу вимірювань та можливість його використання для реєстрації перебігу ферментативних процесів, що проілюстровано відповідними даними різних дослідників. Наведено приклади багатьох кондуктометричних перетворювачів, які використовують при створенні біосенсорів, засоби іммобілізації активного матеріалу на їхню поверхню та схеми і методики вимірювань. Описано деякі моделі кондуктометричних фермент них біосенсорів, обговорено їхні переваги і недоліки, а також перспективи подальшого розвитку. Ключові слова: кондуктометричний біосенсор, імпеданс, провідність, фермент. Вступ. На сьогодні в усьому світі зростає не обхідність охорони навколишнього середовища, контролю біотехнологічних процесів, перевірки якості харчових продуктів і питної води, кількість клінічних тестів у медичній та ветеринарній діа гностиці, які потребують все ширшого використан ня в практиці високочутливих, селективних, швид ких та економічних методів аналізу. Серед них велику увагу приділяють приладам нового поко ління — біосенсорам [1—3 ]. Біосенсор перетворює зміну фізико-хімічних властивостей біоматриці в електричний або оптич ний сигнал з амплітудою, яка залежить від концен трації певної речовини в розчині. Функціонально прилад складається з двох частин: біоматриці — детектувального шару іммобілізованого біоматеріа- лу (ферментів [4, 5 ] , антитіл [6, 7] , рецепторів [8], органел [9], мікроорганізмів [10, 11]) і пере творювача (потенціометричного [12, 13], імпедіо- метричного [14, 15], амперометричного [16, 17], кондуктометричного [18, 19], акустичного [20], оптичного [21, 22] чи калориметричного [23, 24]). У наш час опубліковано низку оглядів [25— © С. В. ДЗЯДЕВИЧ, 2005 27], монографій [28—30], велику кількість експе риментальних робіт, де описано різні типи біо сенсорів. Але створенню саме кондуктометричних біосенсорів присвячено незначну частину згаданих праць, до того ж у деяких з них описано застосу вання даного типу перетворювачів для хромато графії і створення хімічних сенсорів з визначення вологості повітря та концентрацій певних газів [31 -33 ] . Зменшену увагу до кондуктометричних біо сенсорів у порівнянні з іншими типами датчиків можна пояснити недостатнім вивченням покладе них в основу їхньої роботи принципів, хоча кон дуктометричні датчики мають низку значних пере ваг, а саме: технологічно нескладний електрод порівняння, використання при роботі змінної на пруги малої амплітуди, що дозволяє уникнути фарадеївських процесів на електродах, відсутність світлочутливості, малі розміри та притаманність їм високого рівня інтеграції при застосуванні недоро гої тонкоплівкової стандартної технології. Майже всі електрохімічні методи аналізу [12— 17] базуються на використанні електродних елект рохімічних реакцій (потенціометрія, вольтамперо- 91 ДЗЯДЕВИЧ С. В. метрія, амперометрія, кулонометрія). На відміну від них кондуктометрія — це метод, при застосу ванні якого електродні електрохімічні реакції не проходять зовсім чи є допоміжними і не врахову ються. У зв'язку з цим у кондуктометричному методі величезне значення має одна з властивостей розчинів електролітів — провідність, до зміни якої призводить дуже широкий клас ферментативних реакцій. Як правило, вважається, що оскільки рідини, які аналізують, у більшості своїй мають значну фонову провідність, що легко змінюється під дією різноманітних факторів, то вибірковість і, таким чином, можливість використання кондуктометрич- ного методу реєстрації є малими [34]. Але в разі інтегральних мікробіосенсорів більшої частини цих труднощів можна уникнути, використовуючи дифе- ренційну схему вимірювань, яка дозволяє компен сувати зміну фонової провідності, вплив коливань температур та інші фактори [35, 36 ]. Цей огляд присвячено розгляду теоретичних принципів, що лежать в основі роботи кондукто- метричних біосенсорів, наведено приклади різних кондуктометричних перетворювачів, які викори стовують при створенні біосенсорів, та засоби іммо білізації активного матеріалу на їхню поверхню, описано деякі кондуктометричні ферментні біосен- сори, а також обговорено недоліки і перспективи подальшого розвитку кондуктометричних біосен сорів. Теоретичні основи кондуктометричного мето ду вимірювань. Кондуктометричний аналіз, як правило, проводять з використанням змінного стру му. Тому спочатку треба зупинитися на явищах, які виникають в електролітичній комірці при про ходженні синусоїдального змінного електричного струму та на межі розподілу метал—розчин, роз глянути питання електропровідності розчинів і різ них експериментальних схем вимірювань. Електрохімічний імпеданс системи метал— розчин. Перш за все необхідно наголосити на важливості природи поверхневого імпедансу межі розподілу електроліт—метал, тому що саме він головним чином визначає принцип роботи кондук тометричних перетворювачів. Ключем до вивчення подібної системи є уявлення про фізико-хімічні процеси, які в ній проходять, як про еквівалентний електричний ланцюг, де ці процеси замінюються відповідними електронними елементами, а саме — конденсаторами і резисторами. Розглянемо електродний процес на молекуляр ному рівні. Уявімо собі стан речовини, яка знахо диться досить далеко від межі розподілу фаз. Все редині гомогенної фази діють сили взаємодії окре мих заряджених чи полярних частинок. Сума всіх сил, які діють на ці частинки, дорівнює нулю. У стані рівноваги катіони та аніони електроліту роз поділяються рівномірно, як і молекули води. Отже, в цілому виконується правило електронейтраль- ності. Поблизу межі розподілу фаз рівновага різно манітних сил, які діють на частинки, порушується, оскільки з одного боку (наприклад, електродної поверхні) знаходяться іони з зовсім іншими власти востями, ніж значна частина іонів та дипольних молекул електроліту з другого боку поверхні. Те ж саме справедливо і для електронів та атомів матеріалу електрода. Внаслідок цього саме поблизу міжфазної поверхні сумарний вектор сил, які діють на частинку, не дорівнює нулю. В резуль таті такої анізотропії на межі розподілу фаз здій снюється відповідна орієнтація чи переорієнтація частинок, які знаходяться на більшій або меншій відстані від цієї межі під впливом згаданих направ лених сил. У такому змінному силовому полі час тинки прагнуть набути стану з найнижчою енер гією. Цей процес проходить на відстані декількох іонних радіусів та може спричинити більшу чи меншу дипольну орієнтацію молекул розчинника поблизу поверхні електрода. Орієнтовані диполі на поверхні електрода можна представити як зарядже ну пластину конденсатора, тобто виникає подвій ний електричний шар, подібний до конденсатора. Таким чином, вводиться кількісне поняття — єм ність подвійного електричного шару С п ш [37], яка, як правило, складає 10—20 мкФ/см2. Деякі заряджені частинки здатні перетинати подвійний шар та викликати електрохімічні реакції на поверхні електрода. Такий процес носить назву хімічної поляризації і може бути представлений деяким опором — опором перетину, що познача ється ЯП [38]. Відповідну формулу для нього зна ходять з рівняння Батлера-Волмера, яка при при кладеному сигналі малої амплітуди має вигляд: де Я — газова стала; Т — абсолютна температура, К; Р—стала Фарадея; п — кількість електронів, які беруть участь в електродній реакції; і0 — густи на струму обміну. 92 КОНДУКТОМЕТРИЧНІ ФЕРМЕНТНІ БІОСЕНСОРИ: ТЕОРІЯ, ТЕХНОЛОГІЯ У випадку концентраційної поляризації при включенні струму в приелектродному шарі через дуже короткий проміжок часу концентрація іонів, які розраджуються, різко зменшується за рахунок малої швидкості їхньої доставки внаслідок дифузії з глибини електроліту до поверхні електрода. В результаті струм буде зменшуватися, а електрод ний потенціал — зростати. Таким чином, між си лою струму, яка періодично змінюється, та елект родним потенціалом виникає зміщення по фазі, а саме — зміна потенціалу постійно відстає в часі від зміни струму. Тобто в такій системі концент раційна поляризація за рахунок дифузії іонів з межі розподілу в об'єм електроліту робить деякий внесок у поверхневий імпеданс, особливо на низь ких частотах [39 ]. Цей дифузійний чи «варбургов- ський» імпеданс, 2 д и ф , залежить від частоти і опи сується рівнянням: (2) де а) — циклічна частота змінного -струму; £) — коефіцієнт дифузії. Таким чином, електрохімічний імпеданс систе ми металевий електрод—розчин можна змоделюва- ти еквівалентною схемою, наведеною на рис. 1, а. Відповідна їй імпедансна крива представлена на рис. 1, б. Якщо вимірювання проводять при частоті більше 10 Гц, то значенням дифузійного імпедансу можна знехтувати, і основний внесок у загальний електрохімічний імпеданс системи роблять опір розчину, ємність подвійного шару і опір перетину. При перебуванні металевого електрода в роз чині протягом значного часу на його поверхні формується непровідний шар оксиду та в системі з'являється додаткова ємність, яку на еквівален тній схемі можна представити конденсатором С о к с и д (рис. 2, а). Цей конденсатор додатково послідовно з'єднується з паралельно зв'язаними конденсато ром подвійного шару та опором перетину, а також з опором розчину. Імпедансна крива в цьому разі являє собою пряму лінію під деяким кутом до реальної осі (рис. 2, б). Опір електроліту та імпеданс межі розподілу залежать від природи, складу розчину і частоти змінного струму зовсім по-різному. Тому для фі- зико-хімічного аналізу можна використовувати ви мірювання опору електроліту або імпеданс межі розподілу, або повний електрохімічний імпеданс комірки, а залежно від того, який аналітичний Рис. 1. Класичний еквівалентний ланцюг (а) та відповідна йому імпедансна крива (б) межі розділу метал—електроліт: С п ц , — ємність подвійного шару, яка не залежить від частоти змінного струму; Д п — опір перетину, який модулює хімічну поляри зацію і також не залежить від частоти змінного струму; ZJSJЙ(f — дифузійний імпеданс, який модулює концентраційну поляри зацію та залежить від частоти змінного струму, / ? р о з ч — опір електроліту; ш — циклічні частоти змінного струму сигнал застосовують при проведенні аналізу, роз різняють звичайну кондуктометрію та низько- і високочастотну кондуктометрію. Електропровідність розчинів. Провідність рі дин — це результат дисоціації розчиненої речовини (електроліту) на іони і міграції їх під дією елект ричного поля. При проходженні електричного стру му через електроліти останні розкладаються на атоми чи групи атомів, які представляють собою частинки молекули розчиненої речовини, тобто іони. Отже, провідність електролітів є іонною [40]. При накладанні різниці потенціалів на елект роди, коли всередині електроліту утворюється еле ктричне поле, на хаотичний рух іонів накладається упорядкований рух у протилежні напрямки іонів різних знаків: негативно заряджених — до аноду, позитивно заряджених — до катоду (рис. 3). Таким чином, струм в електроліті обумовлений рухом іонів до електродів, на яких вони нейтралізуються та виділяються у вигляді нейтральних атомів (або молекул). Потік іонів, тобто кількість іонів, які проходять через одиничний переріз розчину електроліту за одиницю часу (р), можна визначити за формулою: рі = су - кісі %га& (И, - гіуісі Р ягасі^ , (3) де у — швидкість потоку розчину внаслідок при родної чи штучної конвенції; с, — концентрація 93 б Рис. 2. Еквівалентний ланцюг (а) та відповідна йому імпедансна крива (б) межі розподілу метал—електроліт з додатковою ємні стю оксиду (пояснення див. у підпису до рис. 1) іонів; Л, — коефіцієнт дифузії для них; гі — зарядо ве число; V, — швидкість іонів під дією прикладено го поля; і? — стала Фарадея. Таким чином, у формулі (3) перший доданок відображає внесок конвентивного потоку іонів, концентрація яких дорівнює с,, другий — внесок їхньої молекулярної дифузії, а третій — міграції іонів під дією прикладеної напруги. Температуру, як правило, приймають заданою та постійною (Т - соп^Х, %тай т = 0) і термодифузію іонів можна не враховувати. У реальних умовах всі три згаданих процеси частіше за все існують одночасно, накладаючись один на одного. Проте в крайньому випадку можна припустити, що вирізняється лише якийсь один. Так, наприклад, у нерухомому електроліті при однорідному складі розчину двома першими додан ками можна знехтувати і враховувати тільки міг рацію іонів під дією електричного поля. Тоді Рі = ~2Уісі р 6 г а < 1 V* = сіЩ бгао* хр , (4) де у, — швидкість руху іонів; с, — їхня концент рація; а иі = — рухливість, яка є сталою вели чиною для певного іона в нескінченно розведеному розчині. У табл. 1 наведено значення рухливості деяких іонів при нескінченному розведенні у вод них розчинах за температури 25 °С. Густина струму /', тобто віднесена до одиниці поверхні перерізу системи сила струму, є алгеб раїчною сумою добутку потоків іонів на їхні заря ди: І = р 2) 2А = Р ёгас! V 2 2ісіиі • (5) Анод Об'єм електроліту Катод Рис. 3. Вимірювання провідності електроліту та міграція іонів в об'ємі розчину З іншого боку, згідно із законом Ома, /' = 5 %гаг\ у , (6) де 5 — провідність, тобто величина, обернена опо ру. Тоді, порівнюючи формули (5) і (6), можна записати: « « ^ з д и , . (7) Отже, провідність розчину електроліту зале жить від концентрації і рухливості його іонів. Але вона також, як уже зазначалося, обернено про порційна опору розчину електроліту. А оскільки відомо, що опір розчину електроліту прямо про порційний відстані / між зануреними в нього елек тродами та обернено пропорційний їхній площі А, то Я = х £ , (8) де х — питома провідність. Підсумовуючи викладене вище, можна зробити висновок, що кондуктометричні вимірювання зага лом включають у себе визначення провідності роз чину між двома паралельними електродами. її знаходять за сумарним внеском усіх іонів, які перебувають у досліджуваному зразку. Під час біоспецифічної реакції можуть утворюватися нові іони, може змінюватися концентрація іонів, а та кож їхня рухливість. Усе це призводить до зміни провідності розчину, що й реєструється кондукто- метричним датчиком. Кондуктометричні схеми вимірювань. Як за значалося вище, кондуктометричний метод базу- 94 ється на вимірюванні провідності розчинів елект ролітів. Для цього, перш за все, необхідно заміряти активний опір між електродами, зануреними в досліджуваний розчин. Мостову схему для вимі рювань електричного опору вперше розроблено Уїтстоном, а Кольрауш застосував її для змінного струму (рис. 4, а). Такий міст складається з чо тирьох опорів. Теорія мостів свідчить про те, що найвища чутливість схеми досягається тоді, коли всі чотири плеча мають приблизно однакові опори. А ос кільки, як правило, Я{ = Я2, то міст змінного стру му можна врівноважити лише в тому разі, якщо окремо будуть врівноважені активні і ємнісні опо ри. Таким чином, оперуючи магазинами опорів та ємностей, для них підбирають такі значення, щоб величина нуль-індикатора була мінімальною. Тоді значення опору Ят буде відповідати значенню опо ру розчину Ях між електродами. Вимірювання опо рів розчинів електролітів за допомогою подібного мосту можна проводити з точністю 0,5—1 %. Однак використання мостової схеми потребує постійних додаткових маніпуляцій з магазинами опорів та ємностей, що само по собі не дуже раціонально і погіршує точність вимірювань. На рис. 4, б, показано схему модифікованого мосту Уїтстона. Він точніший і дозволяє безпосередньо реєструвати значення струму, який протікає через досліджувану комірку, не потребуючи додаткових маніпуляцій. На рис. 4, б, представлено схему вимірювань, у якій використано операційний підсилювач з ви- 95 ДЗЯДЕВИЧ с . в . Рис. 4. Схеми кондуктометричних установок: Л х — опір аналі зованого розчину; Ят — магазин опорів; С т — магазин ємно стей; Л 2 — певні опори, причому Л[ — Л 2; п — нуль-ін дикатор соким опором. У цьому випадку провідність 5 Х прямо пропорційна значенню струму на виході операційного підсилювача. Дану схему взято за основу при вимірюваннях з ферментними кондук- тометричними біосенсорами в роботі [41 ]. Також реальним є застосування чотирьохелек- тродної схеми вимірювань. У цьому разі струм пропускають через одну пару електродів, а падіння напруги вимірюють за допомогою другої пари елек тродів, що не поляризована струмом та відіграє роль зондів [42]. Наведені схеми вимірювань досить прості і найчастіше використовуються в експериментах. У кожної з них є свої переваги та недоліки, тому вибір потрібно робити залежно від поставлених задач у кожному конкретному випадку. Перетворювачі для кондуктометричних біо- сенсорів. Кондуктометричний перетворювач — це мініатюрний двохелектродний пристрій для вимі рювань провідності тонкого шару розчину, який знаходиться безпосередньо біля поверхні елект родів. Більшість авторів єдині в тому, що найкра щою структурою при розробці дизайну кондукто метричних електродів є гребінчаста структура [43 -49] . Фізико-хімічні процеси, що протікають в елек трохімічній комірці з кондуктометричним гребін частим перетворювачем, як уже згадувалося, у більшості своїй модулюються еквівалентними схе мами, подібними до зображених на рис. 1 і 2 [43-47] . У роботі [43] здійснено теоретичний розраху нок таких ланцюгів. У першому випадку (рис. 1), тобто за відсутності ланцюга ємності оксиду, отри мали: На рис. 5 наведено імпедансні криві, побудо вані відповідно до формул (9) і (10), та демонст рується зміна форми кривих при зміні різних параметрів ланцюга. З даних цього рисунку випли ває, що зміна всіх компонент ланцюга (за винят ком С п ш) спричинює зміни форми кривих. Але останні є суттєвими лише для низьких частот змінного струму. У випадку ж високих частот тільки зміна Ярвзч призводить до зсуву імпедансної кривої, тобто до зміни реальної компоненти ім педансу, а саме — провідності. Для підтвердження правильності запропонова ної і розрахованої моделі електрохімічного імпе дансу кондуктометричної комірки замість тонко- плівкових перетворювачів до вимірювальної схеми було підключено еквівалентний ланцюг з електрон ними елементами. Експериментальні імпедансні 96 КОНДУКТОМЕТРИЧНІ ФЕРМЕНТНІ БІОСЕНСОРИ: ТЕОРІЯ, ТЕХНОЛОГІЯ Рис. 5. Теоретично розраховані імпедансні криві для моделі кондуктометричної комірки. Частоту змінювали зі 100 Гц до 200 кГц. Параметри ланцюга: / — Д п - 5 кОм, Д р г а ч ~ 1 кОм, С п ш - - 5 нф; 2 — Д п - 10 кОм, Я р о з ч - 1 кОм, С п ш - 50 нф; З — Яп- - 10 кОм, Д р о з ч - 1 кОм, С п ш - 5 нф, С о к с и д - 1000 мкф; 4 — Д п - 10 кОм, Д р о з ч - 1 кОм, С п ш - 5 нФ, С о к с и д - 1 0 0 0 мкф; 5 — Д п - 10 кОм, Д р о з ч - 1 кОм, С п ш - 5 нФ, С о к с и д - 100 мкф; 6 — П„ - 10 кОм, Д р о з ч - 1 кОм, Срш ~ 5 нФ, С о к с и д - 10 мкф криві, отримані для еквівалентного ланцюга, від повідали імпедансним кривим, одержаним для ре альних перетворювачів, що підтверджувало вибір еквівалентної схеми [43, 46 ]. Під час ферментативної реакції, як уже зазна чалося, змінюється провідність розчину в приелек- тродній області, яку можна виміряти за допомогою кондуктометричного перетворювача. Це можна змоделювати, змінюючи фонову провідність за ра хунок варіювання концентрації КС1 у розчині та температури [43, 45, 46, 48, 49]. Показано, що зміна фонової провідності розчину головним чином впливає на високочастотну частину адмітансу. Та ким чином, внаслідок роботи на високій частоті досягається краща чутливість датчика. До того ж за таких умов експерименту основний внесок до сиг налу робить реальна компонента адмітансу, тобто провідність, що й потрібно для кондуктометричних біосенсорів. Подібним чином впливала на адмітанс і зміна температури розчину. У повідомленні [46] також показано, що при роботі на частотах більше 10 кГц електрохімічний імпеданс системи визначається головним чином об'ємними властивостями контактуючих фаз. Це дозволяє використовувати кондуктометричні пере творювачі для створення ферментних біосенсорів і знехтувати поверхневими ефектами на електродах та їхньою деградацією при зберіганні. Наступним важливим чинником успіху розроб ки кондуктометричних гребінчастих перетворюва чів є матеріал електродів. При розробці використо вували різноманітні матеріали: платину [41, 47— 54], золото [19, 41, 43, 46, 50, 55, 56], алюміній [43, 46, 57], нікель [43, 46, 57], мідь [43, 46, 53], титан [41, 43, 46], хром [43, 46], Т а 2 0 5 [44, 45], срібло [54 ] і вуглець [66 ]. Взагалі усі перераховані матеріали можна застосовувати, особливо якщо роботу виконують при змінному струмі високої частоти. Але кращі характеристки демонстрували електроди з благородних металів. Також показано, що при роботі з біологічними рідинами не бажано використання електродів з титану, хрому і алю мінію, тому що вони мають низьку чутливість до зміни іонної сили розчину та швидко досягають насичення за провідністю. Стосовно характеристичних розмірів електро дів, то власні дослідження і результати, представ лені в роботах [48, 50], показали, що мініатю ризація перетворювачів не потребує технологічно складного збільшення кількості пальців на елект роді за рахунок зменшення їхніх розмірів, як це вважалося раніше. Навпаки, це спричинює падіння чутливості датчика. Мініатюризацію треба здій снювати, рівномірно зменшуючи як робочу повер хню електрода, так і характеристичні розмір. З іншого боку, недоцільно виготовляти електроди з великими пальцями (хоча чутливість датчика при цьому може зростати), оскільки тут визначальною стає товщина біологічно чутливої мембрани. Основ ну роль при виборі розмірів сенсора відіграє спів відношення між товщиною мембрани, характери стичними розмірами електродів та їхньою актив ною площею. При виготовленні кондуктометричних перетво рювачів, в основному, використовують технології мікроелектроніки, а саме — фотолітографію, ваку умне напилення. Про їхні переваги детально йшло ся в огляді [25]. Крім того, деякі автори при виготовленні перетворювачів застосовували товсто- плівкову друковану технологію [54, 58 ], кращі властивості якої описано в огляді [26]. Але всі дослідники єдині в одному: виготовлення кондукто метричних перетворювачів значно простіше за таке усіх інших типів електрохімічних датчиків. Кондуктометричний метод у ферментному каталізі. Класичний кондуктометричний метод ви мірювань можна використовувати у ферментатив ному каталізі для визначення концентрацій певних 97 ДЗЯДЕВИЧ С. В. речовин і активності ферментів. Селективність тут досягається завдяки саме ферментам, які каталі зують лише певні реакції. У цьому разі мова йде не про біосенсори, а про використання згаданого методу для потреб ензимології. Одну з перших робіт подібного плану опуб ліковано у 1961 році. В ній показано можливість визначення вмісту сечовини у розчині [59] мето дом, який базувався на відмінності в електричній провідності розчинів сечовини і карбонату амонію, що утворюється в ході реакції гідролізу сечовини під дією уреази. В роботі використано мостову схему вимірювань. Показано також, що активність уреази зменшується, якщо в розчині присутні іони важких металів: Ag, Щ та ін. Такі електроліти, як ИаСІ і КС1, не впливають на активність уреази, але їхня висока концентрація може призвести до помилок, особливо за незначного вмісту сечовини. При низьких концентраціях електроліту, коли не використовується буферний розчин, під час гідро- дізу сечовини рН середовища поступово змінюється від 7 до 9. Але така зміна рН викликає лише незначне зменшення активності уреази, тоді як провідність розчину під час реакції змінюється значно. Діапазон концентрації сечовини, яку мож на визначати, знаходився в межах 0,1 мкМ—2 мМ, оптимальне значення рН для активності уреази — рН 7. У роботі також порівняно кондуктометрич- ний метод аналізу з іншими і показано, що перший спосіб є дуже точним, швидким і досить простим. До того ж при його застосуванні точність визначен ня не залежить від забарвлення розчинів на відміну від оптичних методів. У 1965 році з'явилася робота, у якій кондукто- метричний метод використано для вивчення кіне тики ферментативного гідролізу сечовини, а також для визначення активності уреази [60]. Дослід ження виконували у диференційному режимі вимі рювань. Система складалася з двох пар платинових платівок, кожна з яких знаходилася у своїй вимі рювальній комірці. Фермент містився лише в одній з них, а різницю сигналів досліджували від обох комірок. Таким чином, унеможливлювалися всі похибки, які пов'язані з коливаннями різноманіт них зовнішніх факторів (температура, розведення та ін.). Діапазон визначення сечовини складав 1—75 мМ, а активності уреази — 0,04—2,5 од. акт/ мл. У даній роботі класичний фотометричний ме тод порівнювали з кондуктометричним, внаслідок чого показано, що останній містить у собі всі можливості класичного методу, але є швидшим і більш точним. Ще в одній роботі цього ж часу виявлено, що зміна провідності в ході ферментативної реакції може слугувати універсальною характеристикою глибини хімічних перетворень субстратів [61 ]. На віть якщо провідність продуктів реакції дуже мало відрізняється від такої субстратів, то зміна в'яз кості розчину і ступеня гідратації молекул та іонів під час перетворення субстратів (особливо за наяв ності у розчині інших носіїв електричного струму) спричинює помітну зміну провідності досліджу ваної суміші. Щоб експериментально перевірити можливості кондуктометрії, автори обрали реакції, які зумов люють різні механізми зміни провідності розчинів. Важливо було встановити характер зміни про відності як у разі явної зміни іонного складу розчину, так і тоді, коли за перебігу реакції зміню ються лише в'язкість розчину і ступінь гідратації молекул. Тому досліджували ферментативний гід роліз ацетилхоліну і крохмалю, а також фермента тивну деполімеризацію гіалуронату. У першому випадку гідроліз ацетилхоліну суп роводжується розривом складноефірного зв'язку з утворенням вільної оцтової кислоти, яка дисоціює на протон і СН3СОО~. Протон не бере участі в загальному механізмі провідності, оскільки реакція проходить у фосфатному буфері, рН 7,8, але поява в розчині аніонів СН 3СОО" під час гідролізу при зводить до зростання провідності розчину. В друго му випадку до розчину крохмалю додавали про фільтровану слину людини, яка спричинює змен шення в'язкості розчину при підвищенні ступеня гідролізу крохмалю, що збільшує провідність роз чину у ході реакції. При використанні гіалуро- нідази зростання провідності було викликане змен шенням в'язкості розчину внаслідок деполімери зації молекул гіалуронату. Авторами показано, що кондуктометричний метод є досконалішим, забезпечує більшу точність та меншу трудомісткість у порівнянні з загаль новідомими методами біохімічного аналізу. За до помогою лише одного приладу та одного методу без будь-яких модифікацій було знято кінетичні криві трьох зовсім різних за своїм характером фермента тивних процесів, тоді як при класичному фермен тативному аналізі потрібно було б три різні уста новки, які працюють за різними принципами. 98 У своїй наступній роботі автори модифікували власну кондуктометричну установку і використали диференційний режим вимірювань для вивчення активності колагенази, трипсину, лактатдегідро генази та псевдохолінестерази [62 ]. Але всі згадані вище роботи носять дещо фраг ментарний характер, незважаючи на те, що в них показано принципову можливість використання кондуктометричного методу для реєстрації перебігу ферментативних процесів. На початку 80-х років на прикладі комплекс ного вивчення уреази було проведено детальний аналіз можливостей і обмежень кондуктометрично го методу вимірювань [63 ]. Першу частину роботи присвячено вивченню впливу на провідність дослід жуваного розчину рН середовища, концентрації в ньому сечовини, уреази і солі без проходження ферментативної реакції. Показано, що зміна кон центрації складових частин розчину не призводить до значної зміни його провідності, тому таку зміну надалі можна не враховувати. При цьому графік залежності провідності від рН має дзвоноподібну форму з максимумом при рН 8,0 для трисового буфера та при рН 6,0 — для цитратного. У другій частині роботи вивчали вплив зазна чених умов середовища на гідроліз сечовини. Пока зано, що рН 7,2 — це оптимум для уреази в цитратному буфері. Але при такому значенні рН швидкість реакції значно залежить від іонної сили розчину і зменшується при її підвищенні на відміну від реакції з рН 6,5, де вона залишається майже незмінною. Визначено константу Міхаеліса, яка відповідає 2,5 мМ сечовині в 4,5 мМ цитратному буфері, рН 6,5. Також отримано лінійну залеж ність швидкості ферментативної реакції від концен трації уреази в розчині. Досить вдало наведено приклад успішного використання кондуктометрич ного методу для вивчення ферментативної актив- ності уреази, показано дуже високу чутливість методу та збії' кинетичних параметрів, визначених за допомогою класичних і електрохімічних методів. У роботах [64, 65] використано шестиканаль- ний кондуктометр, за допомогою якого вивчено цілу низку різних ферментів. Базуючись на прове дених дослідженнях, виокремлено п'ять факторів, які кожен окремо чи в комбінації між собою спричинюють зміну провідності, що дає змогу ви користовувати кондуктометричний метод для реє страції перебігу ферментативних реакцій (табл. 2). В багатьох реакціях виявляються одночасно декіль ка факторів, а саме: фактори 3 і 5 — для реакцій з фосфорилазою, фактори 1, 3—5 — для реакцій з апіразою. Найбільше впливають на зміну про відності і дозволяють використовувати кондукто метрію в ензимології фактори 1 і 2. Зменшення розмірів заряджених частинок не призводить до значної зміни провідності (субстрати фосфатаз). У реакціях, де має місце міграція протонів, необхідно додатково враховувати той факт, що на зміну провідності впливає тип буфера. Аніонний буфер зменшує провідність, а ка тіонний — підвищує за рахунок протонування, тоб то з'являється додаткова можливість обирати бу фер для варіацій зміни провідності, яка має місце внаслідок дії інших факторів. Це було продемонст ровано збільшеною зміною провідності, яку спо стерігали в трисовому або імідазольному буфері при реакціях з ліпазами, а також незначною змі ною провідності для цих ферментів у фосфатному буфері. Цими ж авторами показано, що кондуктомет ричний метод можна також використати для всіх реакцій, які продукують зміни рН і визначаються, як правило, рН-титруванням. Чутливість таких методів можна порівнювати, але кондуктометрія має певні переваги. Перш за все, така установка 99 ДЗЯДЕВИЧ С. В. дешевша та простіша у використанні. Крім того, на відміну від кондуктометрії титрометрію можна про водити лише в одному напрямку зміни рН, і вона потребує складніших маніпуляцій при роботі. Кондуктометричний метод було застосовано і для вивчення піроглутамілпептидази, при цьому отримано константи Міхаеліса, які відповідали 0,34 і 0,47 мМ для похідних аланіну і тирозину від повідно [66]. Але незважаючи на численні переваги, кондук- тометричні методи мають ряд обмежень. Відно шення сигналу до рівня шумів не повинно бути нижчим за 2 %. В цьому разі певну роль відіграє також концентрація буфера та інших інгредієнтів, які можна додавати до реакційної суміші. При сутність нереакційноздатних іонів у розчині змен шує чутливість методу. Але буфери з низькою іонною силою можна використовувати для визна чення низьких концентрацій субстратів до тих пір, поки буде виконуватися співвідношення сиг нал/шум. Одним з недоліків кондуктометрії є та кож малоспецифічність, його застосування не дає змоги відрізнити одну реакцію від іншої, що може призводити до артефактів. Похибки досить часто спричинює також ємність подвійного шару та поля ризація електродів під час реакції. Однак усі ці дослідження стали основою для подальшого удоско налення кондуктометричних біосенсорів. Іммобілізація біологічного матеріалу на по верхню кондуктометричних перетворювачів. Ва жливою частиною створення будь-якого біосенсора є вибір способу іммобілізації біологічного матеріалу на поверхню перетворювача, для чого придатні всі принципи і методи, які зазвичай використовують при розробці біосенсорів і досить детально описані раніше [25—27]. При створенні кондуктометричних біосенсорів фермент найчастіше включали до плівки альбу мінового гелю за допомогою глутарового альдегіду [19, 41, 53, 54, 67—70]. Наприклад, у роботі [41] уреазу було іммобілізовано шляхом нанесення на поверхню електродів суміші (10 мкл), яка містила фермент (100 мг/мл), сироватковий альбумін бика (100 мг/мл) та 2,5 %-й розчин глутарового аль дегіду. Гель фермент—альбумін формували протя гом 9—10 хв при температурі 20 °С, товщина отриманої плівки складала близько 1,5 мм. У роботах [67—70] ферменти глюкозооксидазу, уре азу, ацетил- і бутирилхолінестеразу іммобілізували в насичених парах глутарового альдегіду. В цьому випадку краплю суміші (0,1 мкл), що містила фермент (50 мг/мл), сироватковий альбумін бика (50 мг/мл) та 10 %-й гліцерин наносили на чутли ву поверхню перетворювача, який протягом 0,5 год перебував у насичених парах глутарового аль дегіду. Уреазу також ковалентно зв'язували з колаге новою мембраною [53]. Колагенову плівку оброб ляли 0,2 М розчином НС1 у метанолі протягом 48 год за кімнатної температури. Плівку тричі відмивали в дистильованій воді, потім переносили в 2 %-й водний розчин моногідрату гідразину на 4 год. Плівку знову відмивали та вносили у сві- жоприготовлений розчин 0,2 М ИагЮ 2 і 0,2 М НС1 на 5 хв. Далі її додавали до розчину, який містив 25 мг ферменту в 10 мл буферного розчину. Таким чином отримували ферментативно активну мемб рану. Ще один метод іммобілізації ферменту — це його електрохімічне осадження в присутності полі меру [54, 71 ]. Фермент вводили до полімерної матриці-носія шляхом простого захвату під час полімеризації. Фермент-поліпірольну плівку синте зували на поверхні золотих гребінчастих елект родів за потенціостатичного режиму в 0,1 М наси ченому М2-фосфатному буферному розчині (рН 7), який містить 0,1 М тетраетиламоній-тетрафторбо- рат, 0,1 М пірол і 4 мг/мл уреази, для сенсора з визначення сечовини та в 0,1 М насиченому Ы2- фосфатному буферному розчині (рН 7,0), що міс тить 10 мМ перхлорат калію, 0,1 М пірол та 2 мг/мл глюкозооксидази, для сенсора з визначен ня глюкози [71 ]. Процес електрохімічної поліме ризації технологічно зручний: дозволяє вибирати і підтримувати розміри, форму та товщину мембра ни, забезпечує контроль за процесом осадження, дає можливість виготовляти різні мікробіосенсори і мультисенсори в одному технологічному циклі. У роботі [49] автори для іммобілізації уреази використовувалт золь-гель метод. Краплю суміші (5 мкл), яка містила уреазу (50 мг/мл у 5 мМ імідазоль-НСІ буфері), змішану в пропорції 1:1 з золь-гель розчином (5 мл тетраметилортосилікату, 1 мл води і 50 мкл НС1), наносили на чутливу поверхню перетворювача для полімеризації. Час полімеризації складав від 1 до 3 хв залежно від співвідношення тетраметилортосилікату і води. Зрозуміло, що наведено лише кілька методів іммобілізації ферментів на поверхню перетворю вачів, використовується ж їх значно більше. Оби- 100 раючи конкретний метод іммобілізації ферменту, необхідно враховувати такі загальні принципи: фермент повинен бути стабільним при проходженні реакції; бажано, щоб реагенти, які утворюють по перечні зшивки, взаємодіяли з хімічними групами, відсутніми в активному центрі, а якщо це не виконується, то згаданий реагент повинен бути якомога більших розмірів, щоб не проникати до активного центра; активний центр ферменту за вжди слід захищати якимось чином; процедура відмивання незв'язаного ферменту не повинна не гативно впливати на іммобілізований фермент; по трібно враховувати механічні властивості носія. Якщо перераховані фактори присутні, то метод іммобілізації вибрано вдало. Кондуктометричні ферментні біосенсори. Перший кондуктометричний біосенсор для визна чення сечовини описано в роботі [41 ]. Прилад являв собою кремнійову основу з шаром окисненого кремнію, на яку за допомогою методу фотолі тографії було напилено пару золотих гребінчастих та змієподібних електродів. Експерименти здій снювали як у лабораторних, так і в клінічних дослідженнях. Відгук біосенсора на сечовину знахо дився в діапазоні 0,1—10 мМ у 5 мМ імідазольному буфері, рН 7,5. Значення Х м для іммобілізованого ферменту було вищим, ніж для ферменту в роз чині, що автори пояснювали дифузійним лімі туванням. Результати лабораторних досліджень за допомогою біосенсора порівнювали із загальноп рийнятими клінічними експериментами, внаслідок чого показано добре співвідношення між ними (ко ефіцієнт кореляції більше 0,99). Подібний кондуктометричний біосенсор було використано також як мультисенсор [19]. На по верхню однієї пари електродів датчика в шарі гелю іммобілізували уреазу, другої пари — Ь-аспарагі- назу, а на поверхню третьої пари електродів — триферментну систему уреаза—креатиназа—креа- тиніназа. Такий мультисенсор використовували для визначення сечовини, Ь-аспарагіну та креа- тиніну відповідно. Сенсор тестували як з кожним субстратом окремо, так і в мультирежимі. Отрима но кінетичні та калібровочні криві. У табл. З наведено дані з розробки різних кондуктометричних ферментних біосенсорів, одер жані в різні роки. З цієї таблиці видно, що най частіше кондуктометричні перетворювачі викори стовували при створенні біосенсорів для визначен ня сечовини. КОНДУКТОМЕТРИЧНІ ФЕРМЕНТНІ БІОСЕНСОРИ: ТЕОРІЯ, ТЕХНОЛОГІЯ 101 В роботі [71 ] описано кондуктометричний біо сенсор для визначення вмісту сечовини у складі мультисенсору поряд із амперометричним, призна ченим для визначення концентрації глюкози. При лад характеризувався високою селективністю і про стотою у використанні. Його було застосовано для клінічних досліджень. Міккельсеном і співавт. охарактеризовано кон дуктометричні біосенсори для визначення сечовини і D-амінокислот [53]. Біосенсори виготовляли з використанням ферментів уреази і оксидази D- амінокислот. Мінімальна концентрація сечовини, яку можна було визначити, складала 5 мкМ, ліній ний динамічний діапазон — три порядки. Дослід жено вплив буферної ємності розчину на величину відгуку. При розробці сенсора для аналізу D- амінокислот фермент коіммобілізували з катала- зою, оскільки продукований в ході ферментативної реакції пероксид водню пригнічує оксидазу D- амінокислот. Також порівнювали мідний і платино вий електроди та різні типи буферних розчинів, внаслідок чого показано доцільність використання платинових електродів та гліцинового буфера. Виз начено рН-оптимум сенсора для D-амінокислот та його селективність відносно різноманітних аміно кислот. Такий сенсор демонстрував стабільні ре зультати протягом 33 днів. Два типи кондуктометричних товстоплівкових біосенсорів для визначення сечовини описано в роботі [54]. Перший тип сенсорів виготовлено шля хом друкування двох гребінчастих електродів на основі А1 20 3 з використанням платинової пасти, другий — за технологією «green tape». Останній являв собою чотири паралельних срібно-паладі- йових електроди. Уреазу іммобілізували ковалент ним зв'язуванням в альбуміновому гелі. Час відгу ку в обох випадках складав близько 10 хв. Ди намічний діапазон для першого біосенсора складав 0,1—50 мМ сечовини з областю лінійності 0,1 — 4 мМ, для другого — 10 мкМ"5 мМ сечовини з областю лінійності 10—350 мкМ. Показано мож ливість використання такого типу приладів у ме дичному аналізі. Кондуктометричний біосенсор на основі інгі- біторного аналізу для визначення фосфорорганіч них пестицидів вперше описано в роботі [70]. Як чутливий елемент використовували ферменти аце тил- і бутирилхолінестеразу. Досліджено чутли вість біосенсора до ряду пестицидів (діізопропіл- фторфосфат, параоксон-етил, параоксон-метил, трихлофон), наведено мінімально визначені кон центрації інгібіторов, які склали 5-Ю"" М для діізопропілфторфосфату, 10~8 М для параоксон-ети- лу та 5-Ю"7 М для параоксон-метилу і трихлорфо- ну. Авторами вивчено залежність величини відгуку біосенсора від часу інкубації датчика в розчині пестицидів, показано можливість відновлення ак тивності ферменту в мембрані, використовуючи реактиватор піридин-2-альдоксим-метйодид, зроб лено висновок про можливість використання описа них біосенсорів для аналізу фосфорорганічних пес тицидів у водних розчинах. Вірогідність використання кондуктометричного уреазного біосенсора для визначення іонів важких металів продемонстровано в роботі [74]. В ній наведено ряд чутливості важких металів до уреази, який має вигляд: п£* > Си 2 + > С<і2+ > Со 2 + > РЬ 2 + > > Бг 2 +, показано можливість реактивації ферменту після пригнічення ЕДТА. У роботі [75] здійснено порівняльний аналіз робочих характеристик ферментних біосенсорів для визначення пеніциліну на основі кондуктометрич них планарних електродів і рН-чутливих польових транзисторів. Показано, що аналітичні характери стики обох датчиків подібні, вони мають короткий час відгуку та високу операційну стабільність, але з технологічної точки зору планарні кондуктомет- ричні електроди є простішими та дешевшими при виготовленні. Це робить їх більш перспективними для виробництва і використання на практиці. Та кож продемонстровано можливість підбору необ хідного динамічного діапазону роботи датчиків за рахунок зміни буферної ємності середовища. Авторами [95, 96] показано застосування кон дуктометричних біосенсорів для аналізу загальної токсичності розчину при дослідженні фотодегра- дації паратіон-метилу. Отримані результати по рівняно з такими, що одержані традиційним висо кочутливим методом високоефективної рідинної хроматографії та за допомогою приладу з визна чення токсичності «Люмістокс» (Німеччина). Вияв лено, що токсичність розчину різко збільшується з початком процесу фотодеградації пестициду. Роз чин також залишається токсичним і тоді, коли 102 КОНДУКТОМЕТРИЧНІ ФЕРМЕНТНІ БІОСЕНСОРИ: ТЕОРІЯ, ТЕХНОЛОПЯ паратіон-метил повністю розклався. Але автори не протиставлять біосенсорний метод іншим, а лише мають на увазі використання його як додаткового швидкого методу для раннього скринінгу великої кількості зразків. Висновки. Таким чином, всебічно розглянуто та проаналізовано застосування кондуктометрично- го методу вимірювань для реєстрації перебігу фер ментативних процесів як при використанні стан дартних кондуктометрів, так і за допомогою кон- дуктометричних ферментних біосенсорів. Даний метод універсальний, забезпечує більшу точність та меншу трудомісткість порівняно з загальнові домими методами біохімічного аналізу. Кондуктометричні біосенсори також демонст рують низку переваг у порівнянні з іншими типами датчиків. Це, перш за все, використання при їх ньому виготовленні недорогої тонкоплівкової стан дартної технології, яка разом із застосуванням оптимизованої методики іммобілізації біологічного матеріалу дозволяє значно зменшити як собівар тість подібних пристроїв, так і вартість аналізу в цілому. Для інтегральних мікробіосенсорів дуже легко забезпечити диференційний режим вимірю вань, що дозволяє компенсувати зовнішні впливи на систему і значно підвищити точність вимі рювань. Наведені дані вказують на перспективність розробки таких приладів. Але оскільки цей напря мок у розвитку біосенсорів ще досить молодий, тому, мабуть, до сьогодні і не існує комерційних приладів на їхній основі. Частину цієї роботи виконано завдяки фінан совій підтримці фонду НАТО (Collaborative Linkage Grant No 979775) та комплексної програми Націо нальної Академії Наук України «Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій». S. V. Dzyadevych Conductometric enzyme biosensors: theory, technology, application Summary A theoretic principles of conductometric method of mesurements, possibility of their application for registration of enzymatic react ions, and examples of such application have been shown. Variants of different conductometric transducers for biosensor creation, immobilisation methods of active material onto surface, measure ments schemes and methods have been presented. Some examples of conductometric enzyme biosensors, their advantages and disad vantages, and perspectives of their application have been described. Key words: conductometric biosensor, impedance, condcutance, enzyme. С. В. Дзядевич Кондуктометрические ферментные биосенсоры: теория, технология, применение Резюме Рассмотрены теоретические основы кондуктометрического метода измерений и возможность его использования для реги страции прохождения ферментативных реакций, что проил люстрировано соответствующими данными разных исследо вателей. Приведены примеры многих кондуктометрических преобразователей, используемых при создании биосенсоров, ме тоды иммобилизации активного материала на их поверх ность, схемы и методики измерений. Описаны некоторые модели кондуктометрических биосенсоров, обсуждены их пре имущества и недостатки, а также перспективы дальнейшего развития. Ключевые слова кондуктометрический биосенсор, импеданс, проводимость, фермент. ПЕРЕЛІК ЛІТЕРАТУРИ 1. Coulet P. R. What is a biosensor? / / Biosensor principles and application / Eds L. J. Blum, P. R. Coulet.—New York: Marcel Dekker Inc., 1991.—P. 1—6. 2. Thevenot D. R., Toth K, Durst R. A., Wilson G. S. Electrochemical biosensors: recommended definitions and clas sification (Technical report) / / Pure Appl. Chem.—1999.— 71—P. 2333—2348. 3. Hall E. A. H. Recent progress in biosensor development / / Int. J. Biochem.—1988.—20, N 4.—P. 357—362. 4. Mizutani F., Yamanaka Т., Tanabe Y, Tsuda К An enzyme electrode for L-lactate with chemically amplified electrode / / Anal. Chim. Acta.—1985.—177.—P. 153—166. 5. Bartlett P. N.. Whitaker R. G. Strategies for the development of amperometric enzyme electrodes / / Biosensors.— 1987/1988.-3.—P. 359-379 . 6. Morrison L. E. Time resolved detection of energy transfer: theory and application to immunoassays / / Anal. Biochem.— 1988.—174.—P. 101 — 120. 7. Lee H. A., Morgan M. R. A. Food immunoassay: application of polyclonal, monoclonal and recombinant antibodies / / Trends Food Sci. Technol.—1993.—3.—P. 129—134. 8. Buch R. M., Rechnitz G. A. Neuronal biosensors / / Anal. Chem.—1989.—61, N 8.—P. 533A—542A. 9. Lewis R. Biological recognition repackaged / / Bioscience.— 1989.—39, N 5.—P. 288—291. 10. Wiseman A. Comparison of use of immobilized cells and immobilized enzymes for bioanalysis: considerations in deter mination of ethanol / / Trends Anal. Chem.—1992.—11, N 8—P. 303—306. 11. Karube L, Sode K. Microbial sensors for process and environ mental control / / Bioinstrumentation and biosensors / Ed. D. L. Wise.—New York: Marcel Dekker Inc., 1991.—P. 149— 160. 12. Dumschat C, Muller H., Stein K, Schwedt G. Pesticide-sen sitive ISFET based on enzyme inhibition / / Anal. Chim. Acta—1991.—252.—P. 7—9. 13. Bergveld P. Thirty years of ISFETOLOGY. What happened in the past 30 years and what may happen in the next 30 years? / / Sensors and Actuators В.—2003 —88— P. 1—20. 14. Jossinet J., McAdams E. T. The sin-electrode interface impedance / / Innov. Tech. Biol. Med.—1991.—12, N 1,— P. 2 1 - 3 1 . 15. Macdonald J. R. Impedance/admittance response of a binary 103 ДЗЯДЕВИЧ с. в. electrolyte / / Electrochim. Acta. —1992.—37, N 6 — P. 1007—1014. 16. Lorenzo E., Pariente F., Hernandez L, Tobatina F., Darder M., Wu G., Maskus M., Abruna H. D. Analytical strategies for amperometric biosensors based on chemically modified elec trodes / / Biosensors and Bioelectronics.—1998.—13.— P. 319—332. 17. Дзядевич С. В. Амперометрические биосенсоры. Основные принципы работы и особенности датчиков разных генераций / / Біополімери і клітина.—2002.—18, № 1.—С. 13—25. 18. Kelt D. В., Davey С. L Conductimetric and impediometric devices / / Biosensors. A practical approach / Ed. A. F. Gass.—Oxford: IRL Press, 1990.—P. 125—153. 19. Cullen D. bC., Sethi R.bS., Lowe C. R. Multi-analyte miniature conductance biosensor //- Anal. Chim. Acta.—1990.—231. P. 33—40. 20. Fawcett N.. Evans J., Chien L-C, Flowers N. Nucleic acid hybridization detected by piezoelectric resonance / / Anal. Lett—1988.—21, N 7.—P. 1099—1114. 21. Roef P. Attention focuses on optical fibre biosensors / / Sensor Rev.—1987.—7, N 3.—P. 127—132. 22. Smardzewski R. R. Multi-element optical waveguide sensor: general concept and design / / Talanta.—1988.—35, N 2.— P. 95—101. 23. LuongJ. H. Т., Mulchandani A., Guibault G. G. Developments and application of biosensors / / Tibtechnology.—1988.—6.— P. 310—316. 24. Dittmar A., Pauchard Т., Delhomme G., Vernet-Maury E. A thermal conductivity sensor for measurement of skin blood-flow / / Sensor and Actuators.—1992.—7, N 1—3.—P. 327—331. 25. Дзядевич С. В. Биосенсоры на основе ион-селективных полевых транзисторов: теория, технология, практика / / Біополімери і клітина.—2004.—20, № 1.—С. 7—16. 26. Дзядевич С. В. Амперометрические биосенсоры. Совре менные технологии и коммерческие варианты анализа торов / / Біополімери і клітина.—2002.—18, № 5.— С. 363—376. 27. Дзядевич С. В., Солдаткін О. П. Кондуктометричний метод у ферментативному аналізі / / Укр. біохім. журн.— 1994.—66, № 4.—С. 30—42. 28. Hall Е. Biosensors.—Cambridge: Open Univ. press, 1991.— 351 p. 29. Tran Minh C. Biosensors.—London: Chapman & Hall, 1993.—236 p. 30. Kress-Rogers E. Handbook of biosensors and electronic noses: medicine, food, and environment.—New York: CRC press, 1997.—720 p. 31. Glass R. S., Perone S. P., Ciarlo D R. Application of information theory to electroanalytical measurements using a multielement, microelectrode array / / Anal. Chem.—1990.— 62.—P. 1914—1918. 32. Hoffheins B. S., LaufR. J., Siegel M. W. Intelligent thick-film gas sensor / / Hybrid Circuits.—1987.—14.—P. 8—12. 33. Alder J. F., Fielden P. R., Clark A. J. Simultaneous conduc tivity and permittivity detector with a single cell for liquid chromatography / / Anal. Chem.—1984.—56— P. 985—988. 34. Дорохова E. H., Прохорова Г. В. Аналитическая химия. Физико-химические методы анализа.—M.: Высш. школа, 1991.—256 с. 35. Gopel W., Jones Т. A., Kleitz М., Lundstrom J., Seiyama Т. Conductometry / / Sensors. A Comprehensive Survey / / Eds W. Gopel, J. Hesse, J. N. Zemel.—Weinheim: VCII Ver- lagsgesellschaft, 1991.—Vol. 2, pt I.—P. 314—337. 36. Kelt D. B. The principles and potential of electrical admittance spectroscopy: an introduction / / Biosensors: Fundamentals and Applications / Eds A. P. F. Turner, I. Karube, G. S. Wilson.—Oxford: Oxford Univ. press, 1987.—P. 427—468. 37. Камман К Работа с ионо-селективными электродами.— M.: Мир, 1980.—283 с. 38. Феттер К. Электрохимическая кинетика.—M.: Химия, 1967.—855 с. 39. McAdams Е. Т., Jossinet J. Electrode-electrolyte impedance and polarisation / / Innov. Tech. Biol. Med.—1991—12, N 1.—P. 11—20. 40. Антропов Л. И. Теоретическая электрохимия.—M.: Высш. школа, 1984.—519 с. 41. Watson L. D., Maynard P., Cullen D. С, Sethi R. S., Brettle J., Lowe C. R. A microelectronic conductometric biosensor / / Biosensors.—1987/1988. —3.—P. 101—115. 42. Kissinger P. Т., Heineman W. R. Laboratory techniques in electroanalytical chemistry.—New York: Marcel Dekker Inc., 1984.—...p. 43. Дзядевич С. В., Шульга А. А., Пацковский С. В., Архипова В. Н., Солдаткин А. П., Стриха В. И. Тонкопленочный кондуктометрический датчик для ферментных биосенсоров / / Электрохимия.—1994.—30, № 8.—С. 982—987. 44. Olthuis W., Volanschi A., Bomer J. G., Bergveld P. A new probe for measuring electrolytic conductance / / Sensors and Actuators В.—1993 —13—14— P. 230—233. 45. Olthuis W., Smith A., Van der Zalm R. A. J., Bergveld P. New operational modes for the Ta205-based electrolyte conductance cell / / Sensors and Actuators В.—1994.—18—19.—P. 65— 68. 46. Dzyadevich S. V., Shutga A. A., Patskovsky S. V, Arkhipova V. N.. Soldatkin A. P., Strikha V. I. Thin-films conductometric transducer for enzyme biosensor / / Rus. J. Electrochem.— 1994 —30, N 8.—P. 887—891. 47. Weimar V., Gopel W. A. c. measurements on tin oxide sensors to improve selectivities and sensitivities / / Sensors and Ac tuators В.—1995.—26—27.—P. 13—18. 48. Sheppard N. F., Tucker R. C, Wu C. Electrical conductivity measurements using microfabricated interdigitated electrodes / / Anal. Chem.—1993.—65.—P. 1199—1202. 49. Lee W. Y., Kim S. R., Kim Т. H., Lee К S., Shin M. C, Park J. К Sol-gel-derived thick-film conductometric biosensor for urea determination in serum / / Anal. Chim. Acta.—2000,— 404.—P. 195—203. 50. Jacobs P., Suls J., Sansen W. Performance of a planar differential-conductivity sensor for urea / / Sensors and Ac tuators В.—1994.—20.—P. 193—198. 5\.Hintsche R., Moller В., Dransfeld I., Wollenberger U., Sc- heller F., Hoffmann B. Chip biosensors on thin-film metal electrodes / / Sensors and Actuators В.—1991.—4.—P. 287— 291. 52. Trebbe U., Niggemann M., Cammann K., Fiaccabrino G. C , Koudelka-Hep M., Dzyadevich S., Shulga O. A new calcium sensor based on ion-selective conductometric microsensors — membranes and features / / Fres. J. Anal. Chem.—2001.— 371.—P. 734—739. 53. Mikkelsen S. K, Rechnitz G. A. Conductometric transducers for enzyme-based biosensors / / Anal. Chem.—1989.—61.— P. 1737—1742. 54. Bilitewski U., Drewes W., Schmid R. D. Thick film biosensors for urea / / Sensors and Actuators В.—1992.—7.—P. 321 — 326. 55. McNeil C. J., Athey D., Ball M., On Ho W., Krause S., Armstrong R. D., Wright J. D., Rawson K. Electrochemical 104 КОНДУКТОМЕТРИЧНІ ФЕРМЕНТНІ БЮСЕНСОРИ: ТЕОРІЯ, ТЕХНОЛОГІЯ sensors based on impedance measurement of enzyme-catalyzed polymer dissolution: theory and application / / Anal. Chem.— 1995.—67.—P. 3928—3935. 56. Sergeeva T. A., Lavrik N. V., Rachkov A. E., Kazantseva Z. I., Piletsky S. A., Etskaya A. V. Hydrogen peroxide — sensitive enzyme sensor based on phtalocyanine thin film / / Anal. Chim. Acta.—1999.—391.—P. 289—297. 57. Endres H.-E., Drost S. Optimization of the geometry of gas-sensitive interdigital capasitors / / Sensors and Actuators В.—1991.—4.—P. 95—98. 58. On Ho W., Krause S., McNeil C. J., Pritchard J. A., Armstrong R. D., Athey D., Rawson K. Electrochemical sensor for measurement of urea and creatinine in serum based on ac impedance measurement of enzyme-catalyzed polymer transfor mation / / Anal. Chem.—1999.—71.—P. 1940—1946. 59. Chin W. T., Kroontje W. Conductivity method for determina tion of urea / / Anal. Chem.—1961.—33, N 12,—P. 1757— 1760. 60. Bourrelly P., Bourrelly-Durand V. Méthode d'etude par con- ductometric différentielle de la cinétique de Phydrolise en- zymatique de l'uree / / J. Chem. Phys.—1965.—65.— P. 673—677. 61. Андреев В. С, Роаенгарт В. И., Торубаров В. А. Регист рация кинетики ферментативных реакций высокочастот ным способом / / Укр. биохим. жури.—1965.—37, № 6.— С. 920—926. 62. Андреев В. С, Баштанов А. В. Дифференциальный кон- дуктометрический прибор для регистрации физико-хими ческих процессов / / Заводская лаборатория.—1968.—34, № 12.—С. 1546—1548. 63. Hanss M., Rey A. Application de la conductometrie a l'étude des reactions enzymatiques. Système uree-urease / / Biochim. et Biophys. Acta.—1971.—227.—P. 630—638. 64. Lawrence A. J. Conductometrie enzyme assays / / Eur. J. Biochem.—1971.—18.—P. 221—225. 65. Lawrence A. /., Moores G. R. Conductometry in enzyme studies / / Eur. J. Biochem.—1972.—24.—P. 538—546. 66. Besson C, Vessillier S., Gonzales T., Saulnier J., Wallach J. Conductometrie assay of pyroglutamyl peptidase activity / / Anal. Chim. Acta.—1994.—294.—P. 305—309. 67. Shutga A. A., Dzyadevich S. V., Sotdatkin A. P., Patskovsky S. V., Strikha V. /., Etskaya A. V. Thin-film conductometrie biosensor for glucose and urea determination / / Biosensors and Bioelectronics.—1994.—9.—P. 217—223. 68. Shutga A. A., Dzyadevich S. V., Soldatkin A. P., Patskovsky S. V., Strikha V. I. Conductometrie biosensors for glucose and urea based on microfabricated thin-film interdigitated array- electrodes / / Biol. Ital.—1993.—23, N 6.—P. 40—45. 69. Шулъга А. А., Дзядевич С В., Солдаткин А. П., Пацков- ский С. В., Стародуб Н. Ф., Страха В. И., Ельская А. В. Тонкопленочный кондуктометрический энзимобиосенсор для определения глюкозы и мочевины в крови / / Электро химия—1993.—29, № 8—С. 998—1002. 70. Дзядевич С. В., Солдаткин А. П., Шульга А. А., Стриха В. И., Ельская А. В. Кондуктометрический биосенсор для определения фосфороорганических пестицидов / / Журн. аналит. химии.—1994.—49, № 8.—С. 874—878. 71. Hin В. F. Y., Sethi R. S., Lowe С. R. Multi-analyte micro electronic biosensor / / Sensors and Actuators B.—1990.—1.— P. 550-554 . 72. Nyamsi Hendji A. M., Jafffrezic-Renault N., Martelet C, Dzyadevich S. V., Shutga A. A., Soldatkin A. P., Etskaya A. V. Enzyme biosensor based on micromachined interdigitated conductometrie transducer: application to the detection of urea, glucose, acetyl and butyrylcholine chlorides / / Sensors and Actuators В.—1994.—21.—P. 123—129. 73. Dzyadevich S. V., Shutga A. A., Soldatkin A. P., Nyamsi Hendji A. M., Jaffrezic-Renault N., Martelet C. Application of conductometric for sensitive detection of pesticides biosensor based on the cholinesterases / / Electroanalysis.—1994.—6.— P. 752—758. 74. Zhylyak G. A, Dzyadevich S. V., Korpan Y. I., Soldatkin A. P., Etskaya A. V. Application of urease conductometric biosensor for heavy-metal ion determination / / Sensors and Actuators В.—1995.—24—25.—P. 145—148. 75. Dzyadevich S. V., Zhylyak G. A., Soldatlin A. P., Etskaya A. V. Conductometric urease microbiosensor based on thin-films interdigitated electrodes for urea determination / / Biopolimery i kletka.—1996.—12, N 1.—P. 53—57. 76. Архипова В. H., Дзядевич С. В., Солдаткин А. П., Ельская А. В. Ферментные биосенсоры для определения пени циллина на основе кондуктометрических пленарных элект родов и рН-чувствительных полевых транзисторов / / Укр. 6ioxiM. журн.—1996.—68, № 1.—С. 27—32. 77. Castillo-Ortega М. М., Rodriguez D. Е., Encicas J. С, Plascencia М., Mendez-Velarde F. A., Olayo R. Conduc tometric uric acid and urea biosensor prepared from elrctrocon- ductive polyaniline-poly(n-butyl methacrylate) composites / / Sensors and Actuators В.—2002.—85.—P. 19—25. 78. Limbut W., Thavarungkul P., Kanatharana P., Asaawatre- ratanakul P., Limsakul C, Wongkittisuksa B. Comparative study of controlled pore glass, silica gel and Poraver^fot the immobilization of urease to determine urea in a flow injection conductometric biosensor system / / Biosensors and Bioelec tronics.—2004.—8.—P. 813—821. 79. Steinschaden A, Adamovic D., Jobst G., Glatz R., Urban G. Miniaturised thin film conductometric biosensors with high dynamic range and high sensitivity / / Sensors and Actuators В.—1997.—44.—P. 365—369. 80. Lee W.-Y., Lee K. S., Kim T.-H, Shin M.-C, Park J.-K. Microfabricated conductometric urea biosensor based on sol-gel immobilized urease / / Electroanalysis.—2000.—12.—P. 78— 82. 81. Sheppard N. F, Mears D. J., Guiseppi-Elie A. Model of an immobilized enzyme conductometric urea biosensor / / Biosen sors and Bioelectronics.—1996.—11.—P. 967—979. 82. Gatlardo Soto A. M., Jaffari S. A., Bone S. Characterisation and optimisation of AC conductometric biosensors / / Biosen sors and Bioelectronics.—2001.—16.—P. 23—29. 83. Jin P., Yamaguchi A., Asari Oi F., Matsuo S., Tan J., Misawa H. Glucose sensing based on interdigitated array micro- electrode / / Analyt. Sci.—2001.—17.—P. 841—846. 84. Senillou A., Jaffrezic N., Martelet C, Cosnier S. A laponite clay-poly (pyrrole-pyridinium) matrix for the fabrication of conductometric microbiosensors / / Analyt. Chim. Acta.— 1999—401 —P. 117—124. 85. Дзядевич С. В., Корпан Я. И., Солдаткин А. П., Шульга А. А., Стриха В. И., Ельская А. В. Использование кондук тометрических микросенсоров для определения кинети ческих параметров ферментов / / Укр. 6ioxiM. журн.— 1993.—65, № 5.—С. 47—54. 86. Soldatkin А. P., Etskaya А. V., Shutga A. A., Jdanova A. S., Dzyadevich S. V., Jaffrezic-Renault N., Martelet С, Ctechet P. Glucose sensitive conductometric biosensor with additional NAFION membrane: reduction of influence of buffer capacity on the sensor response and extension of its dynamic range / / Anal. Chim. Acta.—1994.—288.—P. 197—203. 87. Дзядевич С. В., Солдаткш О. П., Apxinoea В. М., Шульга 105 ДЗЯДЕВИЧ с. в. О. А., Єльська Г. В. Концуктометричний ферментний глюкосенсор. Пошук шляхів поліпшення аналітичних ха рактеристик / / Укр. біохім. журн.—1995.—67, № 6.— С. 53—59. 88. Білоіван О. А., Дзядевич С. В., Солдаткін О. П., Ста- родуб М. Ф., Єльська Г. В. Ензимосенсор на основі трипсину та кондуктометричних планарних електродів для визначення вмісту білків та пептидних субстратів у водних розчинах / / Укр. біохім. журн.—1997.—69, № 2.—С. 14— 18. 89. Soldatkin A. P., Dzyadevich S. V., Korpan Y. I., Arkhipova V. N.. Zhylyak G. A., Piletsky S. A., Sergeeva T. A., Panasyuk T. L., Etskaya A. V. Biosensors based on conductometric detection / / Biopolimery і kletka.—1998.—14, N 4.— P. 268—277. 90. Dzyadevich S. V., Arkhipova V. N.. Soldatkin A. P., Etskaya A. V., Shutga A. A. Glucose conductometric biosensor with potassium hexacyanoferrate (III) as an oxidizing agent / / Anal. Chim. Acta.—1998.—374.—P. 11—18. 91. Архипова B. #., Дзядевич С. В., Щувайло О. Н., Солдат- кин А. П., Ельская А. В., Жафрезик-Рено Н., Жафрезик Г., Мартле К. Концепция мультибиосенсора для опре деления различных токсичных веществ на основе фермен тного ингибиторного анализа / / Біополімери і клітина.— 2001.—17, № 1.—С. 70—77. 92. Dzyadevych S. V., Arkhypova V. N., Korpan Y. I., Etskaya A. V., Soldatkin A. P., Jaffrezic-Renault N.. Martelet C. Conduc tometric formaldehyde sensitive biosensor with specifically adapted analytical characteristics / / Analyt. Chim. Acta.— 2001.—445.—P. 47—55. 93. Arkhypova V. N., Dzyadevych S. V., Soldatkin A. P., Etskaya A. V., Jaffrezic-Renault N.. Jaffrezic #., Martelet C. Multi- biosensor based on enzyme inhibition analysis for determination of different toxic substances / / Talanta.—2001.—55.— P. 919—927. 94. Dzyadevych S. V., Arkhypova V. N., Etskaya A. V., Jaffrezic- Renault N., Martelet C, Soldatkin A. P. Conductometric enzyme biosensors for substrates or inhibitors analysis / / Curr. Top. Analyt. Chem.—2001.—2.—P. 179—186. 95. Dzyadevych S. V., Soldatkin A. P., Chovelon J.-M. Assessment of the toxicity of parathion and its photodegradation products in water samples using conductometric enzyme biosensors / / Analyt. Chim. Acta.—2002.—459.—P. 33—41. 96. Dzyadevych S. V., Chovelon. J.-M. A comparative photo- degradation studies of methyl parathion by using Lumistox test and conductometric biosensor technique / / Materials Sci. and Engin. C—2002.—21.—P. 55—60. 97. Mai Anh Т., Dzyadevych S. K, Chau Van M., Jaffrezic- Renault N., Due Chien N., Chovelon J.-M. Conductometric tyrosinase biosensor for the detection of diuron, atrazine and its main metabolites / / Talanta.—2004.—63.—P. 365—370. 98. Dzyadevych S. V., Soldatkin A. P., Arkhypova V. N., Etskaya A. V, Chovelon J.-M., Georgiou C , Martelet C, Jaffrezic- Renault N. Early-warning electrochemical biosensor system for the environmental monitoring based on enzyme inhibition effect / / Sensors and Actuators В.—2005.—105.—P. 81—87. УДК 577.15; 573.6 Надійшла до редакції 18.02.04 106

Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування

Репозитарії

Схожі ресурси