Клонирование генома Rhizobium meliloti в векторах различного типа

При использовании бактериофага EMBL3 и плазмиды pVZ361 в качестве векторов для клонирова ния гетерологичной ДНК получены представительные банки генов штаммов CXMI и CXMI-I88 R. meliloti. В процессе скрининга фагового банка, генов идентифицированы, бактериофаги, несущие фрагменты ДНК с симбиотически...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1997
Автори:	Румянцева, Т.Б., Ерко, В.Н., Симаров, Б.В.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1997
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Теми:	Геном и его регуляция
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155189
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Клонирование генома Rhizobium meliloti в векторах различного типа / Т.Б. Румянцева, В.Н. Ерко, Б.В. Симаров // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 3. — С. 222-231. — Бібліогр.: 27 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-155189
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1551892019-06-17T01:25:52Z Клонирование генома Rhizobium meliloti в векторах различного типа Румянцева, Т.Б. Ерко, В.Н. Симаров, Б.В. Геном и его регуляция При использовании бактериофага EMBL3 и плазмиды pVZ361 в качестве векторов для клонирова ния гетерологичной ДНК получены представительные банки генов штаммов CXMI и CXMI-I88 R. meliloti. В процессе скрининга фагового банка, генов идентифицированы, бактериофаги, несущие фрагменты ДНК с симбиотическими генами (nif, nod) и генами eff+, предположительно участвующими в становлении эффективного бобово-ризобиального симбиоза. Плазмидный банк генов использован для комплементации лейциновых ауксотрофов для. изучения влияния, ауксотрофности на развитие симбиоза между клубеньковыми бактериями люцерны и их растение м-хозяином Medicago sativa. З використанням бактеріофага EMBL3 і плазміди pVZ301 як векторів для клонування гепіерологічної ДНК було отримано банки генів штамів СХМ1 та СХМ 1-188 R. meliloti. Під час скринінгу фагового банку «симбіотичними» генами (nif, nod) і eff+ -генами, які, імовірно, беруть участь у розвитку бобово-ризобіального симбіозу. Плазмідний банк генів використано для комплементації лейцинових ауксотрофів для вивчення впливу ауксотрофності на розвиток симбіозу між бульбочковими бактеріяліи люцерни та їх рослиною хазяїном Medicago sativa. Using bacteriophage EMBL3 and plasmid pVZ361 as vectors for lieterologous DNA cloning the gene banks of strains CXM1 and CXM1-188 Rhizobium meliloti have been obtained. When screening the phage bank of genes we identified bacteriophages containing DNA fragments with symbiotic genes (nif, nod) and eff+ genes which, obviously, take part in development of the legume-rhizobia symbiosis. The plasmid bank of genes has been used for complementation of leucine auxolrophs with the aim to investigate the impact of auxotrophy on development of symbiosis between nodule bacteria and their host-plant Medicago saliva. 1997 Article Клонирование генома Rhizobium meliloti в векторах различного типа / Т.Б. Румянцева, В.Н. Ерко, Б.В. Симаров // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 3. — С. 222-231. — Бібліогр.: 27 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000483 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155189 577.2:579.25:579.841.3 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Геном и его регуляция Геном и его регуляция
spellingShingle	Геном и его регуляция Геном и его регуляция Румянцева, Т.Б. Ерко, В.Н. Симаров, Б.В. Клонирование генома Rhizobium meliloti в векторах различного типа Биополимеры и клетка
description	При использовании бактериофага EMBL3 и плазмиды pVZ361 в качестве векторов для клонирова ния гетерологичной ДНК получены представительные банки генов штаммов CXMI и CXMI-I88 R. meliloti. В процессе скрининга фагового банка, генов идентифицированы, бактериофаги, несущие фрагменты ДНК с симбиотическими генами (nif, nod) и генами eff+, предположительно участвующими в становлении эффективного бобово-ризобиального симбиоза. Плазмидный банк генов использован для комплементации лейциновых ауксотрофов для. изучения влияния, ауксотрофности на развитие симбиоза между клубеньковыми бактериями люцерны и их растение м-хозяином Medicago sativa.
format	Article
author	Румянцева, Т.Б. Ерко, В.Н. Симаров, Б.В.
author_facet	Румянцева, Т.Б. Ерко, В.Н. Симаров, Б.В.
author_sort	Румянцева, Т.Б.
title	Клонирование генома Rhizobium meliloti в векторах различного типа
title_short	Клонирование генома Rhizobium meliloti в векторах различного типа
title_full	Клонирование генома Rhizobium meliloti в векторах различного типа
title_fullStr	Клонирование генома Rhizobium meliloti в векторах различного типа
title_full_unstemmed	Клонирование генома Rhizobium meliloti в векторах различного типа
title_sort	клонирование генома rhizobium meliloti в векторах различного типа
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1997
topic_facet	Геном и его регуляция
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155189
citation_txt	Клонирование генома Rhizobium meliloti в векторах различного типа / Т.Б. Румянцева, В.Н. Ерко, Б.В. Симаров // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 3. — С. 222-231. — Бібліогр.: 27 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT rumâncevatb klonirovaniegenomarhizobiummelilotivvektorahrazličnogotipa AT erkovn klonirovaniegenomarhizobiummelilotivvektorahrazličnogotipa AT simarovbv klonirovaniegenomarhizobiummelilotivvektorahrazličnogotipa
first_indexed	2025-07-14T07:16:03Z
last_indexed	2025-07-14T07:16:03Z
_version_	1837605704202977280
fulltext	î MN u ^ j - / о э / . ьиогюлимеры и клетка, i v y / . 1, 1.3. 1№ J Клонирование генома Rhizobium meliloti в векторах различного типа Т. Б. Румянцева, В. Н. Ерко\ Б. В. Симаров Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии 189620, С.-Петербург, шоссе Подбельского, 3 Институт физиологии растений и генетики Н А Н Украин ы 252022, Киев , ул. Васильковская , 3 1 / 1 7 При использовании бактериофага EMBL3 и плазмиды pVZ36J в качестве векторов для клонирова ния гетерологичной ДНК получены представительные банки генов штаммов CXMJ и CXMJ-I88 R. meliloti. В процессе скрининга фагового банка, генов идентифицированы, бактериофаги, несущие фрагменты ДНК с симбиотическими генами (nif, nod) и генами eff+, предположительно участвующими в становлении эффективного бобово-ризобиального симбиоза. Плазмидный банк генов использован для комплементации лейциновых ауксотрофов для. изучения влияния, ауксотроф- ности на развитие симбиоза между клубеньковыми бактериями люцерны и их растение м-хозяи ном Medicago sativa. Введение. Способность бактерий рода Rhizobium вступать в симбиоз с бобовыми растениями контро лируется обширной группой генов [1 ], большая часть которых (nod, nif, fix) начинает функциони ровать только при взаимодействии с растением в процессе формирования симбиотического азотфик- сирующего органа — клубенька — и репрессирова на в свободноживущем состоянии [2 ]. В связи со сложностью идентификации этих генов, обуслов ленной синхронной экспрессией и репрессией рас тительных и бактериальных генов при образовании симбиоза, а также тем, что для анализа мутантов клубеньковых бактерий необходима постановка трудоемких вегетационных опытов с растениями, генетический анализ таких генов и выявление их роли в симбиозе сильно затруднены. Ключевым этапом современного генетического анализа является получение банков генов изучае мого микроорганизма, в которых представлены по лные наборы фрагментов геномной ДНК. Клониро вание «симбиотических» генов с помощью банков генов позволяет в дальнейшем провести их струк турно-функциональный анализ и определить ха рактер экспрессии [3]. С другой стороны, они могут быть использованы для направленного конст- © Т. Б Р У М Я Н Ц Е В А , В Н. Е Р К О , Б. В. С И М А Р О В , 1997 руирования штаммов с улучшенными симбиотиче скими свойствами посредствм создания генотипов, сочетающих разные аллели соответствующих сим биотических генов. Применение векторов различного типа для конструирования банков генов зависит от цели исследования. Для клонирования генов, не имею щих четкого фенотипического проявления при рос те в культуре («симбиотические» гены, гены синте за фитогормонов, гены, мутации по которым при водят к утрате жизнеспособности, и др.), обычно используются фаговые банки генов. Плазмидные банки генов чаще применяются для клонирования генов с помощью комплементации функции их мутантного аллеля, если имеется возможность от личить исходный штамм от мутанта на селектив ных средах и в некоторых других случаях [4—6]. В данной работе проведено конструирование банков генов в векторах двух типов. Фаговый банк генов на основе бактериофага EMBL3 был исполь зован для клонирования участков ДНК, отвечаю щих за формирование симбиоза, а также участков, контролирующих эффективность симбиоза у штам мов СХМ1-188 и СХМ1-105 R. meliloti. Плазмид ный вектор pVZ361 был применен для построения банка генов штамма СХМ1 R. meliloti и клонирова ния локусов биосинтеза лейцина, ауксотрофность 222 К Л О Н И Р О В А Н И Е ГЕНОМА RHIZOBIUM MELILOTI по которым приводила к блокированию развития симбиоза. Материалы и методы. Бактериальные штам мы. В работе использовали штаммы Escherichia colt ВНВ2688 (N205 recA [yimm43\ cits, Ь2, red', Earn, Sam/y], у-лизогенный штамм (для приготов ления экстрактов для упаковки) [7 ]; ВНВ2690 (N205 recA" [yimrn34, cits, Ь2, red', Dam, Sam/y], у-лизогенный штамм (для приготовления экстрак тов для упаковки) [7 \|; С600 (F~, thi-1, thr-J, ІеиВЬ, lacYl, tonA21, supE44, Г ) [7]; HB101 (hdsS, hdsM. pro, leu, thi, recA, Str') [7]; OT14 (Str'-му- тант штамма LE392) [7]; Q359 (hsdR~, hsdM', supF, <^80, P2, su — хозяин для обнаружения Spf -рекомбинанток бактериофага Я) [7 ]; QR48 (recA, supE), получен из ВНИИ Генетики, Москва; W3350 (galKT, supO, Str s), получен из ВНИИ Гене тики, Москва. Штаммы R. meliloti: СХМ1 (Str'-му- тант производственного штамма 425а, не отличаю щийся от него по симбиотической активности) [8 ]; СХМ1-188 (УФ-индуцированный мутант штамма СХМ1, превышающий его по азотфиксирующей активности и симбиотической эффективности) [9, 101; Т46 (Nod, leu -мутант штамма СХМ1, несу щий Тп5 в лейциновом локусе) [11]; Т511/6 и Т918/6 (leu , тсГ-мутанты штамма СХМ1, полу ченные в результате переноса с помощью трансдук- ции 1еи::Тп5 фрагментов ДНК мутантов Т511 и Т918 в УФ-индуцированный метиониновый ауксот роф СХМ 1-6 [9 1. Коллекция лаборатории генетики и селекции микроорганизмов, ВНИИ сельскохозяй ственной микробиологии (С.-Петербург) [121; Т118 и Т482 (Тп5-мутанты штамма СХМ1-105 [9, 10] с повышенной симбиотической эффективно стью) [13]; Т798 (Тп5-мутант штамма СХМ1-188 с повышенной симбиотической эффективностью) ИЗ]. Плазмиды. pVZ36I (Nm1, Km r, lncQ-группа несовместимости, дериват RSF1010, при клониро вании по BamHI-сішту появляется устойчивость к стрептомицину) [14 ], pKSK5 (nodABC-тшы) [15]; pIDl (nifHDK-гены Klebsiella pneumoniae) [16]; pRK20l3 (Nm1, Со//?-репликон, содержащий tra-ге- ны плазмиды pRK2) [17]. Бактериофаги. EMBL3 (red", garn , с hi', Ь189, N, nin5) [18]. Питательные среды. Штаммы R. meliloti вы ращивали на среде RGMC (дрожжевой экстракт, 10 г/л; триптон, 10 г/л: NaCl, 8 г/л; глюкоза, I г/л; MgCL 50 мМ; СаС12, 20 мМ); минимальная среда М9 [19] содержала в качестве источника азота 1 г/л (NH 4 ) 2 S0 4 , в качестве источника угле рода — 4 г/л маннита. Штаммы Е. coli выращива ли на среде LB [7 ]. В твердые среды добавляли 16 г/л агара («Difco», США). Для культивирования бактериофагов использовали среду L (среда LB с добавлением 10 мМ MgS0 4) с агаром (12 г/л) или без него. Антибиотики использовали в следующих концентрациях: стрептомицин (Str) — 100 мг/л, ампициллин (Ар) — 20 мг/л, неомицин (Nm) — 20 мг/л и 100 мг/л для Е. coli и R. meliloti соответственно. Культивирование бактериофагов. 1 мл ночной культуры Е. coli в среде L заражали фагом при множественности инфекции 0,01, инкубировали при 25 °С в течение 20 мин, после чего разбавляли в 500 раз средой L и выращивали в течение 16 ч с аэрацией при 37 °С. Для разрушения клеток добав ляли хлороформ, очищали фаголизат от разрушен ных клеток ц е н т р и ф у г и р о в а н и е м (3 мин, 14000 об/мин). Титр фага в надосадочной жидко сти обычно находился в пределах 10 ! 0 —10 п частиц фага в 1 мл. Однородность препаратов фаголизатов проверяли на присутствие стандартных генетиче ских маркеров (спектр адсорбции фага и иммуни тет) по характеру роста на тестерных штаммах Е. coli. Выделение ДНК. Фаговую ДНК выделяли бы стрым методом [20]. Препаративное выделение ДНК бактериофага EMBL3 проводили из 1 л куль туры Е. coli ОТ 14 с последующей очисткой в ступенчатом градиенте плотности CsCl [7 ]. Полу ченные препараты фаговой ДНК проверяли на способность к упаковке in vitro и по характеру роста на тестерных штаммах Е. coli (табл. 1). Плазмидную ДНК выделяли с помощью метода щелочного лизиса из 20 мл ночной культуры Е. coli [7 ]. Препаративное выделение плазмидной ДНК проводили из 500 мл ночной культуры Е. coli, используя метод Бирнбойма—Доли [21 ] и очистку ультрацентрифугированием в градиенте плотности CsCl [7 ]. Тотальную ДНК R. meliloti выделяли с помощью модифицированного метода Мармура [22]. Получение рекомбинантной ДЯК фага EMBL3. Рекомбинантные фаги EMBL3 получали лигированием частично рестрицированной тоталь ной ДНК штамма СХМ1 R. meliloti с рестрициро- ванным препаратом ДНК фагового вектора в соот ношении 1:3. Реакцию проводили при 12 °С в течение 2 ч, используя 85 ед. активности лигазы Т4 в 20 мкл смеси при конечной концентрации ДНК 400 мкг/мл. Получение упаковочных экстрактов. Экстрак ты для упаковки рекомбинантной ДНК фага EMBL3 получали с использованием штаммов Е. coli ВНВ2688 и ВНВ2690. Штаммы выращивали в 1,5 мл среды L при 32 °С до титра 2-Ю 8 , индуци- 223 Р У М Я Н Ц Е В А Т К. И Д Р Таблица I Способность к образованию негативных колоний фагами X на газоне различных мутантов Е. coli K.J2 П р и м е ч а н и е. «+» — образует; «-» — не образует негативных колоний. ровали развитие фагов при 45 °С и инкубировали в течение 90 мин при 37 °С. Клетки бактерий осаж дали центрифугированием (10 мин, 8000 об/мин) и дальнейшую обработку биомассы каждого штамма осуществляли различными способами. Биомассу штамма ВНВ2690 ресуспендировали в 3,5 мл буфе ра А (20 мМ трис, рН 8,0; 3 МхМ MgCl2; I мМ ЭДТА; 0,05 %-й /З-меркаптоэтанол) и обрабатыва ли ультразвуком 5—10 раз при максимальной ам плитуде по 5 с с минутными интервалами. Суспен зию разрушенных клеток центрифугировали в те чение 3 мин при 10 000 g и надосадочную жидкость хранили в жидком азоте до использования. Биомассу штамма ВНВ2688 ресуспендировали в 6 мл раствора В (10 %-я сахароза; 0,05 М трис- НС1, рН 7,8), добавляли 150 мкл раствора лизоци- ма (10 мг/мл в 0,01 М трис-HCI, рН 7,5) и разрушали замораживанием в жидком азоте и от таиванием. Суспензию разрушенных клеток цент рифугировали в течение 5 мин (38 000 об/мин) в роторе ТІ75 при 2 °С, отбирали надосадочную жидкость, которую до использования хранили при -70 °С [23]. Упаковка фаговой ДНК. Для упаковки исход ной и рекомбинантной ДНК фага EMBL3, а также ДНК фага Я к пробам ДНК (с концентрацией от 0,1 до 3,5 мкг в объеме 1—2 мкл) добавляли 10 мкл упаковочного экстракта штамма Е. coli ВНВ2688, 7 мкл буфера А, 2 мкл буфера Ml (буфер МІ в 10 мл содержит 400 мкл смеси 50 мМ спермидина, 100 мМ путресцина, 9 мкл 1 М MgCl2, 1 мкл /э-меркаптоэтанола, 75 мкл 0 J М АТФ и 9,515 мкл Н 2 0) и 2—4 мкл упаковочного экстракта E.coli ВНВ2690. Упаковку проводили в течение 90 мин при 27 °С [23 ]. Эффективность упаковки проверя ли по количеству негативных колоний на газоне штаммов Е. coli ОТ14, НВ101 и Y1088. Используя различные концентрации ДНК в пробе (от 0,1 до 3,5 мкг), определили, что максимальное число бляшкообразующих единиц (3-10) возникает при упаковке 3 мкг ДНК фага. При дальнейшем увели чении концентрации ДНК эффективность упаков ки не возрастала. ДНК—ДНК гибридизация. Для скрининга фа гового банка генов применяли гибридизацию нега тивных бляшек [24 ] с радиоактивно меченной плазмидой pSUP2021, несущей в своем составе Тп5. Фаги рассевали на чашки Петри, не допуская сплошного лизиса бактерии-хозяина (не более 500 фаговых бляшек на чашку). С каждой чашки снимали по две идентичные реплики на нитроцел- люлозные фильтры. Фильтры последовательно об рабатывали денатурирующим (1,5 М NaCl, 0,5 М NaOH) и нейтрализующим (1 М трис-НСІ, рН 8,0, 1,5 М NaCl) растворами и дважды— 10><SSC, рН 7,0, После просушки фильтры прогревали при 80 °С в течение 2 ч в вакууме. Фильтры, дающие позитивный ответ на гибридизацию с зондом, срав нивали с исходными чашками Петри и вырезали агар с гибридизующимися бляшками. Далее фаги размножали и осуществляли повторную гибридиза цию. Блот-гибридизацию проводили по методу Сау- зерна [7, 25], дот-гибридизацию — по \|23]. Для приготовления меченых зондов использо вали препараты плазмидной ДНК, полученной по сле очистки центрифугированием в градиенте плот ности CsCl для предотвращения появления неспе цифических сигналов гибридизации. Зонды метили радиоактивными изотопами фосфора ( 3 2Р или 3 3 Р) методом ник-трансляции [7 ]. Скрещивание бактерий. Штаммы-реципиенты Т46, Т511/6 и Т918/6 R. meliloti для скрещивания и комплементации их лейциновых ауксотрофно- стей выращивали в течение 16 ч на ротационном шейкере в жидкой среде RGMC при 180 об/мин и 224 28 °С. Штамм Е. coli НВ101, содержащий плазми- ду-помощницу pRK2013, необходимую для моби лизации банка генов в реципиентный штамм, а также донорный штамм Е. coli С600, содержащий банк генов pVZ36J::CXM\, выращивали в жидкой среде LB, дополненной соответствующими антиби отиками, при 180 об/мин и 37 °С до середины логарифмической фазы роста. Осажденные центри фугированием клетки штамма-донора, помощника и штаммов-реципиентов ресуспендировали в дис тиллированной стерильной воде. Скрещивание осу ществляли на твердой среде RGMC (6 ч) при соотношении донор:помощник:реципиент 1:1:3. По сле скрещивания проводили скрининг leu -транс- конъюгатов: для штамма Т46 R. meliloti — на твер дой минимальной среде, для штаммов Т511/6 и Т918/6 R. meliloti — то лее с добавкой метионина (20 мг/л). Трансформация. Штамм Е. coli С600 транс формировали рекомбинантной плазмидной ДНК в модификации Харди [26 ]. Анализ симбиотических свойств R. meliloti. Симбиотические свойства штаммов R. meliloti оце нивали в микровегетационном опыте, согласно ме тодике [27 ]. Семена люцерны с. Зайкевича стери лизовали концентрированной серной кислотой в течение 2 мин, промывали дистиллированной во дой, проращивали в течение суток при 28 °С и высаживали в стерильные пробирки (20 х 200 мм), содержащие вермикулит и солевой питательный раствор. Проростки инокулировали суспензией бак терий 107 клеток/растение. Выращивали растения в течение 5 недель при 22 °С, после чего определя ли сухую массу побегов и присутствие в клубень ках бактерий соответствующего фенотипа. Результаты и обсуждение. Получение банка генов R. meliloti СХМI-188 в бактериофаге EMBL3. Фаг EMBL3 имеет ряд генетических осо бенностей, способствующих клонированию в нем гетерологичной ДНК и селекции рекомбинантных фаговых частиц, в которые произошло встраивание чужеродной ДНК [4, 23]. Две полилинкерные последовательности с сайтами для эндонуклеаз ре стрикции позволяют произвести замещение цент ральной части фага длиной 13,7 тыс. п. н., содер жащей гены red и gam, гетерологичной ДНК. Присутствие генов red и gam в геноме EMBL3 определяет его фенотип как Spt и позволяет ему эеплицироваться по механизму катящегося кольца т упаковываться в капсиды в штаммах Е. coli ОТ 14 і QR48. Ген red отвечает за общую фаговую )екомбинацию, а ген gam — за синтез ингибитора іактериальной гес/?С-экзонуклеазы. Их отсутствие фиводит к блокированию а-реиликации. Развитие К Л О Н И Р О В А Н И Е ГЕНОМА RHIZOBIUM MELILOTI фага EMBL3, несущего ген gam, в штамме Е. coli Q359, лизогенном по фагу Р2, невозможно из-за блокирования его репликации продуктом гена old фага Р2. К росту на штамме Q359 способны только двойные мутанты red', gam~ (Spi -фенотип) за счет упаковки в капсид кольцевых конкатамерных мо лекул ДНК. Образование кольцевых конкатамеров происходит с помощью recA-иути рекомбинации, если у фага присутствует c/zz-сайт, узнаваемый г£С#С-эндонуклеазой, которая участвует в гесА-ш- висимой рекомбинации. У вектора EMBL3 с/гі-сайт сохраняется при получении рекомбинантных red~ gam'-фагов. Жизнеспособность рекомбинантов red' gam' определяется системой рекомбинации хозяи на. Штамм Q359 по системе рекомбинации отно сится к гесВС , и для рекомбинантных фагов путь репликации по механизму катящегося кольца не блокирован, в то время как исходный фаг EMBL3 не способен развиваться в данном штамме. Поэто му мы использовали штамм Q359 для селекции рекомбинантных фагов. Стратегия получения банка генов заключалась в расщеплении ДНК фага EMBL3 и тотальной ДНК R. meliloti рестриктазой EcoRI, лигировании этих компонентов и селекции гибридной популяции фа гов в штамме Q359 Е. coli. Для определения общего числа жизнеспособных рекомбинантов лигирован- ные смеси после упаковки in vitro высевали на газон бактерии Е. coli ОТ 14. Для получения представительного банка генов потребовалось провести тестирование (проверку и определение рабочих концентраций) ключевых компонентов системы клонирования — экстрактов для упаковки фаговой ДНК в капсиды, препаратов тотальной ДНК R. meliloti, расщепленных фермен тами до размеров, приемлемых для клонирования в векторе, и штаммов Е. coli, используемых для селекции рекомбинантных фагов. При конструировании банка генов штамма R. meliloti СХМ1-188 его тотальную ДНК частично гидролизовали эндонуклеазой EcoRI до фрагментов 22—23 тыс п. н., что является максимальной клонирующей емкостью для EMBL3 и позволяет в дальнейшем рекомбинантным фагам нормально упаковываться в капсиды и развиваться по литиче- скому пути. Тотальную ДНК удалось частично расщепить при использовании 0,9 ед. активности EcoRI на 1 мкг ДНК с различным интервалом времени обработки одинаковых проб ферментом. Рестрицированную ДНК тестировали электрофоре зом в 0,5 %-м агарозном геле. Проба тотальной ДНК оптимального размера получена при 30 мин- обработке ферментом. ДНК фага EMBL3 полно стью расщепляли этой же рестриктазой. 225 Р У М Я Н Ц Е В А Т. Б. И Д Р . При тестировании упаковочных экстрактов мы определили, что максимальное количество фаговой ДНК, которое упаковывается в капсиды in vitro, составляет 3 мкг в пробе (см. «Материалы и мето ды»). Поэтому при лигировании мы использовали по 3 мкг ДНК расщепленного вектора и варьирова ли количество гетерологичной тотальной ДНК R. melilotl Лигированную рекомбинантную ДНК упа ковывали in vitro с последующим заражением тес- терного штамма Е. coli Q359. После упаковки в донорные капсиды при соотношении вектор:встрой~ ка 3:1 получили 6-Ю 4 независимых фаговых кло нов, которые были отобраны на тестерном штамме Е. coli Q359. В качестве контроля на эффектив ность клонирования осуществляли контрольные упаковки фаговой ДНК, полученной на различных этапах конструирования банка. Эффективность формирования негативных клонов на тестерных штаммах Е. coli упала у фага EMBL3, обработан ного ферментами (рестриктазой и лигазой), по сравнению с эквивалентным количеством нативной ДНК на два порядка (10 ъ и 108 соответственно). Это свидетельствует о том, что при лигировании рестрикция препятствовала образованию исходного фага EMBL3. При упаковке in vitro рекомбинант- ных фагов, представляющих банк генов (набор рекомбинантных EMBL3::CXM 1 -188), эффектив ность упаковки снизилась на четыре порядка (104) по сравнению с нативным фагом и на два порядка (10°) по сравнению с фагом EMBL3, прошедшим через процесы рестрикции и лигирования (табл. 2). Идентификация генов с помощью гомологич ных зондов. Для идентификации в фаговом банке рекомбинантных фагов, несущих дикие копии ге нов, необходимых для дальнейших исследований, мы использовали радиоактивно меченные зонды. Зондом для поиска «симбиотических» генов {nodу nif) служил EcoR/-фрагмент (8,5 тыс. п. н.) с тыс. п. н. Р и с . 1. И д е н т и ф и к а ц и я р е к о м б и н а н т н ы х ф а г о в , несущих nodABС-гены R. melilotl CXM1-188 : а~ гибридизация негатив ных колоний, представляющих собой банк генов EMBL3: :CXMl- 188, с молекулярным зондом — nod ABC-ее нами (стрелкой от мечена одна из негативных колоний, дающих позитивный ответ на гибридизацию); б— электрофореграмма EcoRI-рес- триктов Д Н К рекомбинантного ф а г а EMBL3 с tiod ABC-гетми (дорожка / ) и фага EMBL3 (дорожка 2) посІАВС-гєнами плазмиды pKSK5 и Ps/7-фрагмент (4,8 тыс. п. н.) плазмиды pIDJ с ш/#/Ж-генами. Результаты гибридизации in situ показали, что в построенном банке генов присутствуют рекомби- нантные фаги, содержащие вышеперечисленные ге ны. На рис 1 показана идентичность рекомбинан тных фагов EMBL3 nodABC-тшлм. Из рис 1, б, Таблица 2 Получение банка генов штамма СХМ1-188 R. melilotl в фаговом векторе EMBL3 З — — 3 - Ю 8 о 3 — EcoRI 8 - Ю 2 0 3 — EcoRI, лигаза Т4 9 Ю 6 0 З 1 EcoRI, лигаза Т 4 6 10 4 6 - Ю 4 226 видно, что отобранный после гибридизации in situ фаговый клон песет дополнительную ДНК. Ранее в лаборатории генетики и селекции мик роорган измок В НИ И СХМ (С.-Петербург) была получена коллекция Тп5-мутантов R. meliloti, про являющих повышенную эффективность (Eff+) в симбиозе с Medicago sativa. Для идентификации фагов, несущих дикие копии фрагментов ДНК, мутации в которых приводили к повышенной эф фективности симбиоза, были взяты в качестве зон дов плазмиды pSL6, pSL7 и pSL9 (сконструированы Л. Л. Шарыповой) с мутантными копиями е//+-ге- нов мутантов Т798, Т482 и ТІ 18 R. meliloti соот ветственно. В результате гибридизации in situ бан ка генов с этими зондами отобраны рекомбинант- ные фаги EMBL3, названные нами FR482, FR118 и FR798, несущие дикие копии ДНК с е//~-генами штаммов СХМ 1-105 и СХМ1-188 R. meliloti соот ветственно. При блот-гибридизации £еа/?/-фраг- ментов тотальной ДНК штаммов СХМ 1-105, СХМ!-188 и мутанта Т482 R. meliloti с радиоактив но меченной ДНК рекомбинантного фага FR482 показано, что у мутанта Т482 исчезает EcoRI- фрагмент длиной около 4 тыс. п. н. и появляется фрагмент около 10 тыс. п. н., что свидетельствует о встраивании Тп5 в этот фрагмент при получении Eff'r-мутанта Т482 из исходного штамма СХМ1- 105 (рис. 2). Получение банка генов R. meliloti СХМ J в плазмидном векторе. Банк генов штамма СХМ1 R. meliloti был построен в плазмидном векторе pVZ36I, сконструированном и изученном группой тыс. п. н. ХЕ 1 2 3 1 2 3 Рис. 2. Электрофорез (а) и блотинг-гибридизация (б) тотальной Д Н К R. meliloti, рестрицированной £ с а Я / - э н д о н у к л е а з о й , с Д Н К рекомбинантного фага FR482, меченной изотопом 3 2 Р : 1 — штамм C X M ' 1 - Ш R. meliloti\ 2 — мутант 7 4 8 2 R. meliloti:, 3 штамм СХМ 1-105 R. meliloti; / Е — Д Н К фага А , рестрицирован- ная ондонуклеазой EcoRI К Л О Н И Р О В А Н И И ГЕНОМА RHIZOBIUM МЕЬІЬОТІ исследователей кафедры генетики МГУ. Особенно стью этой плазмиды является наличие в ней гена устойчивости к стрептомицину, контролируемого репрессором, кодируемым двумя находящимися в составе плазмиды генами tnpA и tnpR фага Я. Ген tnpR содержит сайт для рестриктазы ВатНІ, встройка в который гетерологичной ДНК будет предотвращать выработку репрессора и соответст венно позволит экспрессироваться гену стрептоми цин-устойчивости. Эта особенность позволяет вести простой отбор рекомбинантов на среде, содержащей стрептомицин. Преимуществом этого вектора явля ется его способность к мобилизации из Е. coli в клетки клубеньковых бактерий при конъюгации с помощью конъюгативных плазмид (например pRK2013) благодаря наличию mo/нсайта. Кроме того, плазмида pVZ36J способна реплицироваться в ризобиях, поскольку базовым репликоном для нее является плазмида RSF1010, обладающая широким кругом хозяев среди грам-отрицательных бактерий. Обычно емкость векторов типа pVZ36J, имею щих размеры около 10 тыс. п. н., варьирует от 10 до 20 тыс. п. н. Для получения таких фрагментов нами была выделена тотальная ДНК из 5 мл жидкой культуры штамма СХМ1 R. meliloti, кото рую затем частично рестрицировали ферментом ВатНІ из расчета 10 ед. активности на 1 мкг ДНК. Качество рестрикции оценивали через определен ные интервалы времени с помощью электрофореза в агарозном геле. Выход рестриктов оптимального размера достигался при гидролизе в интервале от 15 до 20 мин. Для получения банка генов нами были использованы рестрикты после 15-мин гидро лиза, размер которых варьировал от 15 до 20 тыс. п. н. Центральным моментом для полученші реком бинантных плазмид, несущих в репликоне pVZ36I фрагменты геномной ДНК штамма СХМ1 R. meliloti, была оптимизация условий системы транс формации штамма С600 Е. coli. Для этого строили кривую поглощения плазмидной ДНК вектора ком петентными клетками в зависимости от условий трансформации. Была определена оптимальная концентрация плазмидного вектора в условиях, дающих максимальный выход трансформантов. Она составила 100 нг плазмидной ДНК в 200 мкл суспензии компетентных клеток и обеспечивала максимальный выход неомицин-устойчивых кло нов. Эти данные использовали при трансформации компетентных клеток рекомбинантными плазмида- ми pVZ36J::CXMl для получения наибольшего ко личества клонов Е. coli С600 (рVZ36/:;СХМ 1) в расчете на 1 мкг вектора. Рекомбинантные ДНК pVZ367::СХМ1 получа- 227 Р У М Я Н Ц Е В А т. г;. И Д Р . ли лигированием і?ага///-расщепленного вектора и частично рестрицированной тотальной ДНК R. meliloti СХМ1 с применением 84 ед. активности лигазы Т4. Осуществлено несколько вариантов ли- гирования, в которых использовали рестрикты раз мером 15 и 20 тыс. п. н. Полученными при этом лигазатами трансформировали компетентные клет ки штамма Е. coli С600. В результате получены 2-Ю 3 клонов, содержащих рекомбинантные плаз миды pVZ361::CXMl. Частоты трансформации ис ходным вектором pVZ361 и набором рекомбинант ных векторов pVZ36I::CXMl (прошедшим этапы рестрикции и лигирования с гетерологичной ДНК) составили 10~4 и 10"ь на 1 мкг вектора соответствен но. Все п о л у ч е н н ы е клоны, несущие pVZ36/::СХМ1, были Str r и Nm r , несущие исход ный вектор pVZ36J — Str s, Nm r. Комплементация ауксотрофных мутаций банком генов R. meliloti СХМ1. Полученный по вышеописанной методике банк генов штамма СХМ1 R. melilotU содержащийся в Е. coli С600, использовали для комплементации ауксотрофных по лейцину мутаций у штаммов Т46, Т511/6 и Т918/6 R. meliloti, являющихся производными штамма СХМ1 и содержащих Тп5 в двух различ ных лейциновых локусах на хромосоме [12]. В результате двух независимых трехродитель- ских скрещиваний ауксотрофного по лейцину му танта R. meliloti Т46, штамма Е. coli НВ101 (pRK2()13) и банка генов pVZ36I::CXM\ получены ПО прототрофных клонов. Частота комплемента ции мутантного лейцинового гена составила 10"ъ Bum HI Hind III Hmdlll ВатНІ I ВатНІ Hindi Рис . 3. Рекомбинантная плазмида pRVZ::Leu (23 ,8 тыс. п. н.) 20 -і 12- 1 2 3 4 5 6 7 8 Р и с . 4. Симбиотическая активность штаммов R. meliloti: 1 — контроль без и н о к у л я ц и и ; 2 — R. meliloti СХМ1 (Fix ) ; З — R. meliloti T46 (NocT); 4 — leu - трансконъюгаты R. meliloti T46 , с о д е р ж а щ и е плазмиду pVZ36l::leu (Fix+); 5 — R. meliloti 'Г5ІІ /6 (Nod~); 6 — leu - трансконъюгаты R. meliloti T 5 I I / 6 с плазмидой pVZ3bl, несущей в своем составе фрагмент Д Н К , комплементирующий л е й ц и н о в у ю ауксотрофность , но не спо собный к комплементации метиониновой ауксотрофности штам ма T 5 I I / 6 ШосГ); 7 — R. meliloti Т 9 1 8 / 6 (Nod); 8 — leu - трансконъюгаты R. meliloti T 9 1 8 / 6 с плазмидой pVZ36J, несу щей в своем составе фрагмент Д Н К , комплементирующий л е й ц и н о в у ю ауксотрофность , но не способный к комплемента ции метиониновой ауксотрофности штамма Т 9 1 8 / 6 (NocT). В скобках указан фенотип штамма . О п ы т проводили в 12 повтор- ностях. H C P Q 5 " 0 , 8 3 ; варианты, существенно п р е в ы ш а ю щ и е контрольный. П о оси ординат — средняя масса сухих расте ний , мг прототрофных клонов на реципиент при соотноше нии в смеси скрещивания донор:реципиент 1:10 и 10~8 — при соотношении 1:1. Из трансконъюгатов выделена рекомбинантная плазмида, обозначенная pRVZwleu. С использованием эндонуклеаз ре стрикции ВатНІ и HindiII построена карта фраг мента ДНК, комплемснтирующего ауксотрофность по лейцину у мутанта Т46 (рис. 3). Таким же образом была проведена комплемен тация лейциновых ауксотрофностей транспозантов Т511/6 и Т918/6, в результате которой получили по четыре прототрофных клона для каждого мутан та. При соотношении в смеси скрещивания до- нор:реципиент 1:3 частота образования прототроф ных трансконъюгатов составила 10 7 . Прототрофные трансконыогаты, полученные от мутантов Т46, Т511/6 и Т918/6, были протестиро ваны в микровегетационном опыте. Результаты изучения симбиотической активности мутантов и трансконъюгатов, содержащих соответствующие плазмиды, которые комплементируют лейциновую ауксотрофность, представлены на рис 4. Видно, что масса растений, инокулированных прсготроф- ными трансконъюгатами Т46 (pVZ36J::leu), соот ветствует массе растений штамма СХМ 1, что сви детельствует о нормальном клубенькообразовании и азотфиксации этих растений. Растенші, инокули- 228 К Л О Н И Р О В А Н И Е ГЕНОМА RHIZOBIUM MELILOTI рованные трансконъюгатами Т511/6 (leu, met) и Т918/6 (leu , met), остаются на уровне контроля без инокуляции. На корнях этих растений образу ются белые клубенокоподобные структуры, не спо собные к азотфиксации, что вызывает интерес, поскольку Met -штамм СХМ 1-6, являющийся роди тельским штаммом, от которого произошла метио- ниновая ауксотрофность штаммов Т511 /6 и Т918/6, имеет Noct, ,Ргх+-фенотип. Из образовавшихся клубеньков были вновь выделены предполагаемые трансконъюгаты Т46, среди которых только 46 % сохранили комплемен- тирующую плазмиду pRVZ::leu. В качестве конт роля на стабильность плазмид в клетках, находя щихся в клубеньках, в микровегетационном опыте были использованы трансконъюгаты штамма СХМ1, несущие космиду pLAFRL Утрата космиды pLAFRl, не несущей гетерологичной ДНК в клу беньках, составила в наших экспериментах 3 % (табл. 3). Цель данной работы состояла в 1) клонирова нии геномной ДНК R. meliloti в векторах двух типов: фаговом — EMBL3 и плазмидном — pVZ36J; 2) идентификации в полученных банках генов рекомбинантов, несущих «симбиотические» гены (nod, nif) и гены, предположительно участву ющие в становлении эффективного бобово-ризоби- ального симбиоза. Библиотека генов штамма СХМ 1-188 была сконструирована в бактериофаге EMBL3, а штамма СХМ1 — в плазмидном векторе pVZ36J. Эти векто ры различаются по стратегии клонирования и так тике поиска нужных фрагментов ДНК в банке генов. Результаты клонирования в этих векторах геномной ДНК двух штаммов R. meliloti позволили дать сравнительную характеристику этих векторов при их применении для построения ризобиальных геномных библиотек (табл. 4). Максимальная емкость клонирования у бакте риофага EMBL3 и pVZ36I теоретически отличается на 7 тыс п. н. Существенно различно и количество полученных рекомбинантов — 6 • 104 для фага и на порядок меньше для плазмидного вектора — 2-Ю 3 . Для определения количества гибридных фагов и плазмид, составляющих банк генов, использовали формулу [7]: N _ 1п(1 - Р) ~ 1п(1 -х/у) ' где N — число клонов, с вероятностью р содержа щее любую искомую последовательность ДНК; р — вероятность обнаружения искомой копии гена, рав ная 0,99; х — размер фрагмента ДНК, клонирован ного в векторе (для EMBL3 х = 24000 п. н.; для pVZ36J— 17600 п. н.); у— размер генома (для R. meliloti у = 7 • 106, из которых 4 • 10ь п. н. приходится на ДНК хромосомы и по 15 105 п. н. — на ДНК двух мегаплазмид — МЕГА 1 и МЕГА 2. Подстав ляя эти значения в формулу, получаем минималь ное количество рекомбинантных векторов, необхо димое для того, чтобы весь геном R. meliloti был представлен в полученной библиотеке генов. Та ким образом, для фагового банка генов N=1500 , Таблща 3 Утрата рекомбинантных плазмид pVZ361::CXM 1 и космиды pLAFRl у трансконъюгатов штамма СХМ J R. meliloti, 229 Р У М Я Н Ц Е В А Т. Б И Д Р для плазмидного N - 1822. Из этого следует, что для идентификации индивидуальных генов в раз ных геномных библиотеках необходимо анализиро вать различное количество рекомбинантов. Сопо ставив количество клонов в полученном банке генов с количеством клонов, требуемых для нахож дения индивидуального гена (см. табл. 4, значения в колонках 3 и 4), можно утверждать, что нами получен представительный банк генов в фаге EMBL3 и пригодный для поиска генов методом комплементации банк в плазмиде pVZ36l, что и было показано в процессе поиска nodABC-, nifIIDK-, eff- и /<?м-генов R. meliloti. Последние годы в исследованиях по симбиоти- ческой азотфиксации привели к осознанию необхо димости проведения детального генетического ана лиза симбиотических свойств микросимбионта клу беньковых бактерий. Без выяснения генетического контроля наиболее существенных для симбиоза ха рактеристик невозможен переход от стихийной аналитической селекции к направленному констру ированию штаммов этих микроорганизмов с повы шенной азотфиксирующей активностью и эффек тивностью. Поэтому клонирование генов, непосред ственно не у ч а с т в у ю щ и х в симбиозе , но оказывающих значительное влияние на эффектив ность азотфиксации, усвоение фиксированного азо та, а также на развитие симбиоза, для изучения их вклада в симбиотические взаимоотношения бакте рий и растений является необходимостью в совре менных исследованиях биологической фиксации атмосферного азота. Представителями таких генов являются eff+~ гены R. meliloti [13], мутации в которых приводят к повышению эффективности усвоения фиксиро ванного азота растением-хозяином. В результате построения банка генов R. meliloti в фаге EMBL3 проведено клонирование трех £// +-генов штаммов СХМ 1-105 и СХМ 1-188 R. meliloti с целью их дальнейшего изучения. Другим представителем генов, не участвую щих, по-видимому, непосредственно в симбиозе, но влияющих на его развитие, являются гены биосин теза лейцина. Клонирование /<?^-генов штамма СХМ І R. meliloti было произведено с помощью банка генов, построенного на основе плазмиды pVZ361. Изучение роли этих генов в симбиозе является предметом дальнейшей работы. Т. Б. Рум'янцева, В. Н. Єрко, Б. В. Сімаров Клонування геному Rhizobium meliloti у векторах різного типу Резюме З використанням бактеріофага EMBL3 і плазміди pVZ30l як векторів для клонування гепіерологічної ДНК було отримано банки генів штамів СХМ1 та СХМ 1-188 R. meliloti. Під час скринінгу фагового банку «симбіотичними» генами (nif, nod) і eff -генами, які, імовірно, беруть участь у розвитку бобово- ризобіального симбіозу. Плазмідний банк генів використано для комплементації лейиинових ауксотрофів для вивчення впливу ауксотрофності на розвиток симбіозу між бульбочко вими бактеріяліи люцерни та їх рослиною хазяїном Medicago sativa. Т. В. Rumiantseva, V. N. Yerko, В. V. Simarov Cloning of genome of Rhizobium meliloti in vectors of different types Summary Using bacteriophage EMBL3 and p las mid pVZ36l as vectors for heterologous DNA cloning the gene banks of strains СХМ 1 and CXM1-188 Rhizobium meliloti have been obtained. When screening the phage bank of genes we identified bacteriophages containing DNA fragments with symbiotic genes (nif, nod) and eff -genes which, obviously, take part in development of the legume-rhizobia symbiosis. The plasmid bank of genes has been used for complementation of leucine auxotrophs with the aim to investigate the impact of auxotrophy on development of symbiosis between nodule bacteria and their host-plant Medicago sativa. С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы 1. Long S. R. Rhizobium genetics / / Annu. Rev. G e n e t . - - 1 9 8 9 . — 2 3 . — P . 4 8 3 — 5 0 6 . 2. Watson R. J. Molecular genetics of Rhizobium meliloti sym biotical nitrogen fixation / / Biotechnol. Adv. -1989.—7.— P . 3 1 — 4 5 . 3. Batut J., Terzaghi В., Gherardi M. et at Localization of a symbiotic fix region on Rhizobium meliloti pSym megapiasmid more than 200 kilobases from the nod-nif region / / Мої. and Gen . G e n e t . — 1 9 8 5 . — 1 9 9 . — P . 2 3 2 — 2 3 9 . 4. Клонирование Д Н К . Методы / Под ред. Д . Гловера. Пер. с англ .—М.: Мир, 1 9 8 8 . - 5 3 8 с. 5. Long S. R., Buikema W. /., Ausubel E. M. Cloning of Rhizobium meliloti nodulation genes by direct complementation of Nod' mutants / / Nature . —1 982. 2 9 8 . — P . 485—488 . 6. Michiels J., Broek A. V., Vanderleyden J. Molecular cloning and nucleotide sequence of the Rhizobium phaseoli recA gene / / Мої. and Gen. Genet . — 1 9 9 ! . - 2 2 8 . — P . 486—490 . 7. Maniatis Т., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual .—New York: Cold Spring Harbor Lab. , 1 9 8 2 . - 5 4 5 p. 8. Федоров С. H., Б у теина О. Ю., Симаров Б. И. Мутагенное действие У Ф - и з л у ч е н и я на клубеньковые бактерии лю церны и анализ симбиотических свойств полученных аук сотрофных мутантов / / Г е н е т и к а . — 1 9 8 3 . — 1 9 , № 5 .—С. 7 2 7 — 7 3 6 . 9. Федоров С. Н. Получение мутантов клубеньковых бак терий л ю ц е р н ы с измененными симбиотическими свой ствами под действием У Ф - и з л у ч е н и я : Автореф. дис. ... канд. биол. н а у к . — Л . , 1987. — 1 6 с. 10. Федоров С. # . , Симаров Б. В. Получение мутантов с измененными симбиотическими свойствами у Rhizobium meliloti под действием У Ф - л у ч е й / / С.-х. биология.— 1 9 8 7 . — 9 . — С . 4 4 — 4 9 . 11 . Aronshtam A. A., Umarov В. R., Yerko V. N. et at. Use of a Rhizobium meliloti cosmid gene bank for cloning the leucine biosynthesis gene, which is involved in regulation the develop ment of nitrogen-fixing symbiosis with alfalfa / / Soviet G e net ics .—29, N 2 . — P . 185—192. 12. Ерко В. H., С тарчен ков Е. П. К о м п л е м е н т а ц и я 230 К Л О Н И Р О В А Н И Е ГЕНОМА RHIZOBIUM MELILOTI лейциновой ауксотрофности Rhizobium meliloti банком ге нов Rhizobium teguminosarum II Физиология и биохимия культур, р а с т е н и й . — 1 9 9 4 . — 2 6 , № 3 ,—С. 2 6 4 — 2 6 8 . 13. Симаров Б. В., Шарыпова Л. А., Чеснокова. О. Н. и др. Анализ Тп5~мутантов Rhizobium meliloti с повышенной симбиотической эффективностью / / Генетика .—1990 .— 26, № 4 . - - С . 6 3 0 — 6 3 5 . 14. Zinchenko V. 11 Proc . 5 Int. Symp. on photosynthetic pro- karyotes .—Grindenwald , 1 9 8 5 . — P . 3 7 1 . 15. Kondorosi В., Hanfalvi Z., Kondorosi A. Physical and geneti- cal analysis of a symbiolic region of R. meliloti: identification of nodulation genes / / Мої. and Gen . Genet . — 1 9 8 3 . — 3 6 . — P. 445—452 . 16. Banfalvi Z., Sakanyan V., Koncz C. et ai Location of nodulation and nitrogen fixation genes on a high molecular weight plasmid of R. meliloti II I b i d . — 1 9 8 1 . — 1 8 4 . — P . 318 — 325. 17. Figurski. D. //., Helinski D. R. Replication of an origin containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans / / Proc . Nat. Acad. Sci. USA.— 1979. — 7 6 . — P . 1648—1652 . 18. Frischanf A., Lehrach H., Poustka A., Murray N. Lambda replacement vectors carrying polylinker sequences / / J. Мої. Biol .—1983. — 1 7 0 , N 4.~— P . 8 2 7 — 8 4 2 . 19. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике.—М.: Мир, 1976.—507 с. 20. Kaslov D. С. A rapid method for purifying Я DNA from phage lysates / / Nucl. Acids R e s . — 1 9 8 6 . — 1 4 , N 1 6 . — P . 6767. 2 1 . Birnboin #. C, Doly S. A. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA / / Ibid.— 1 9 7 9 . — 7 . — P . 1 5 1 3 — 1 5 2 3 . 22. Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic ac id from microorgan isms / / J . Мої. Biol. — 1 9 6 1 . — 3 . — P . 2 0 8 — 2 1 8 . 2 3 . Мазин А. В., Кузнеделов К. Д., Краев А. С. и др. Методы молекулярной генетики и генной и н ж е н е р и и . — Н о в о с и бирск: Н а у к а , 1990 .—248 с. 24. Grunstein М.у Hogness D. S. Colony hybridization: a method for the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene / / Proc . Nat. Acad. Sci. U S A . — 1 9 7 5 . — 7 2 . — P . 3 9 6 1 — 3 9 6 5 . 25 . Southern E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments by gel electrophoresis / / J. Мої. Bio l .—1975.— 9 8 . — P . 5 0 3 — 5 1 7 . 26. Плазмиды. Методы / П о д ред. К. Харди . П е р . с англ. — М.: Мир, 1989 .—267 с. 27. Федоров С. Н., Фокина И. F., Симаров Б. В. Оценка симбиотических свойств клубеньковых бактерий люцерны в лабораторных условиях / / С. -х . б и о л о г и я . — 1 9 8 6 . — 1 . — С. 112—118 . У Д К 577 .2 :579 .25 :579 .841 .3 Поступила в редакцию 13.1 1.96 231

Клонирование генома Rhizobium meliloti в векторах различного типа

Репозитарії

Схожі ресурси