Нуклеотидные последовательности, предположительно связанные с участками инициации репликации ДНК у Drosophila melanogaster
Фракция ДНК, обогащенная участками инициации репликации, выделена из культивируемых эмбриональных клеток D. melanogaster с использованием метода вытеснения новосинтезированной ДНК из репликационной петли. Посредством гибридизационных экспериментов показано, что, по крайней мере, часть участков иници...
Збережено в:
| Дата: | 1989 |
|---|---|
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155213 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Нуклеотидные последовательности, предположительно связанные с участками инициации репликации ДНК у Drosophila melanogaster / А.П. Сидоренко, Г.А. Худолий, Н.Г. Шуппе // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 5. — С. 100-104. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-155213 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1552132019-06-17T01:28:02Z Нуклеотидные последовательности, предположительно связанные с участками инициации репликации ДНК у Drosophila melanogaster Сидоренко, А.П. Худолий, Г.А. Шуппе, Н.Г. Геном и его регуляция Фракция ДНК, обогащенная участками инициации репликации, выделена из культивируемых эмбриональных клеток D. melanogaster с использованием метода вытеснения новосинтезированной ДНК из репликационной петли. Посредством гибридизационных экспериментов показано, что, по крайней мере, часть участков инициации репликации относится к повторяющимся последовательностям и обладает высокой эволюционной консервативностью. Фракцію ДНК, збагачену ділянками ініціації реплікації, виділено з культивованих ембріональних клітин D. melanogaster з використанням методу витіснення новосинтезованої ДНК з реплікаційної петлі. За допомогою гібридизаційних експериментів показано, що, принаймні, частина ділянок ініціації реплікації належить до повторюваних послідовностей і володіє високою еволюційної консервативністю. The DNA fraction enriched in replication initiation sites was isolated from cultured embryonic cells of Drosophila melanogaster using a method of nascent DNA strands extrusion. Hybridization experiments have shown that at least a part of replication initiation sites are repetitive sequences and are highly conservative in evolution. 1989 Article Нуклеотидные последовательности, предположительно связанные с участками инициации репликации ДНК у Drosophila melanogaster / А.П. Сидоренко, Г.А. Худолий, Н.Г. Шуппе // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 5. — С. 100-104. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000EE http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155213 575:576.315.42 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Геном и его регуляция Геном и его регуляция |
| spellingShingle |
Геном и его регуляция Геном и его регуляция Сидоренко, А.П. Худолий, Г.А. Шуппе, Н.Г. Нуклеотидные последовательности, предположительно связанные с участками инициации репликации ДНК у Drosophila melanogaster Биополимеры и клетка |
| description |
Фракция ДНК, обогащенная участками инициации репликации, выделена из культивируемых эмбриональных клеток D. melanogaster с использованием метода вытеснения новосинтезированной ДНК из репликационной петли. Посредством гибридизационных экспериментов показано, что, по крайней мере, часть участков инициации репликации относится к повторяющимся последовательностям и обладает высокой эволюционной консервативностью. |
| format |
Article |
| author |
Сидоренко, А.П. Худолий, Г.А. Шуппе, Н.Г. |
| author_facet |
Сидоренко, А.П. Худолий, Г.А. Шуппе, Н.Г. |
| author_sort |
Сидоренко, А.П. |
| title |
Нуклеотидные последовательности, предположительно связанные с участками инициации репликации ДНК у Drosophila melanogaster |
| title_short |
Нуклеотидные последовательности, предположительно связанные с участками инициации репликации ДНК у Drosophila melanogaster |
| title_full |
Нуклеотидные последовательности, предположительно связанные с участками инициации репликации ДНК у Drosophila melanogaster |
| title_fullStr |
Нуклеотидные последовательности, предположительно связанные с участками инициации репликации ДНК у Drosophila melanogaster |
| title_full_unstemmed |
Нуклеотидные последовательности, предположительно связанные с участками инициации репликации ДНК у Drosophila melanogaster |
| title_sort |
нуклеотидные последовательности, предположительно связанные с участками инициации репликации днк у drosophila melanogaster |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1989 |
| topic_facet |
Геном и его регуляция |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155213 |
| citation_txt |
Нуклеотидные последовательности, предположительно связанные с участками инициации репликации ДНК у Drosophila melanogaster / А.П. Сидоренко, Г.А. Худолий, Н.Г. Шуппе // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 5. — С. 100-104. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT sidorenkoap nukleotidnyeposledovatelʹnostipredpoložitelʹnosvâzannyesučastkamiiniciaciireplikaciidnkudrosophilamelanogaster AT hudolijga nukleotidnyeposledovatelʹnostipredpoložitelʹnosvâzannyesučastkamiiniciaciireplikaciidnkudrosophilamelanogaster AT šuppeng nukleotidnyeposledovatelʹnostipredpoložitelʹnosvâzannyesučastkamiiniciaciireplikaciidnkudrosophilamelanogaster |
| first_indexed |
2025-07-14T07:17:07Z |
| last_indexed |
2025-07-14T07:17:07Z |
| _version_ |
1837605771812012032 |
| fulltext |
Геном
и его регуляция
УДК 575:576.315.42
А. П. Сидоренко, Г. А. Худолий, Н. Г. Шуппе
НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ,
ПРЕДПОЛОЖИТЕЛЬНО СВЯЗАННЫЕ С УЧАСТКАМИ
ИНИЦИАЦИИ РЕПЛИКАЦИИ ДНК У DROSOPHILA MELANOGASTER
Фракция ДНК, обогащенная участками инициации репликации, выделена из культиви-
руемых эмбриональных клеток D. melanogaster с использованием метода вытеснения
новосинтезированной ДНК из репликационной петли. Посредством гибридизационных
экспериментов показано, что, по крайней мере, часть участков инициации репликации
относится к повторяющимся последовательностям и обладает высокой эволюционной
консервативностью.
Введение. Изучение молекулярной структуры участков инициации реп-
ликации (УИР) Д Н К в клетках эукариот пока не привело к обнару-
жению универсальных последовательностей, подобных локусу огі у
прокариотических организмов. Между тем знание структурно-функцио-
нальной организации УИР необходимо как для понимания регуляции
репликативного синтеза Д Н К в онтогенезе, так и для разработки но-
вых принципов конструирования векторов в генетической инженерии
высших растений и животных. Существуют данные о том, что У И Р
входят во фракцию Д Н К , прилегающую к ядерному матриксу ( я м Д Н К )
[ 1J. Возможно, что у отдельных видов Д Н К эти участки имеют неоди-
наковую структуру, но не исключено, что между ними имеется опреде-
ленная гомология.
В настоящей работе проведено сравнение Д Н К разных видов по
их способности гибридизоваться с фракционированной Д Н К D. mela-
nogaster. В качестве зондов мы использовали Д Н К ядерного матрикса
D. melanogaster, фракцию генома, обогащенную УИР по методу вытес-
нения новосинтезированных нитей [5]; клонированную фракцию УИР.
В результате проделанной работы было показано наличие последова-
тельностей, гомологичных я м Д Н К и УИР генома D. melanogaster в
геномах D. virilis, крысы, мыши и человека.
Материалы и методы. Культуру эмбриональных клеток D. melanogaster 67j25D
[2] инкубировали с [14С]тимидином (3,7 кБк/мл, удельная активность 1,5 ГБк/ммоль)
в течение 18 ч. Импульсную метку, содержавшую 25 мкг/мл бромдезоксиуридина и
185 кБк/мл 3Н-дезоксицитидина (удельная активность 185 ГБк/ммоль), вводили на
10 мин.
Фракцию генома, обогащенную УИР, выделяли методом [3, 4], основанном на
вытеснении новосинтезированных цепей Д Н К в виде двухспиральных молекул в ре-
зультате миграции ветвей репликационной петли. Затем импульсно меченную низкомо-
лекулярную фракцию ДНК, выделенную с помощью градиента концентрации сахаро-
зы (5—20 %), обогащали молекулами ДНК, содержащими тяжелую метку в обеих це-
пях, используя двукратное центрифугирование в градиенте плотности CsCl [5].
ямДНК получали методом [6], описанным для клеток асцитной карциномы
Эрлиха.
Фракцию УИР клонировали, применяя в качестве вектора плазмиду pUClH.
В процессе выделения фракцию генома, обогащенную УИР, интенсивно обрабатывали
нуклеазой Sl для уничтожения однонитчатых «хвостов». Встраивание в плазмиду про-
ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 5
100
водили в сайт рестрикции SmaI после дополнительной инкубации Д Н К этой фракции
с фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I. Лигированным материалом трансформиро-
вали бактерии Е. coli штамма TGl [7]. Рекомбинантные плазмиды отбирали по изме-
нению цвета колоний на среде с изопропилтиогалактозидом и хромогенным субстратом
X-gal. Размеры вставок в плазмидах определяли по электрофоретическоп подвижности
в агарозном геле.
Ник-трансляцию ДНК-зондов осуществляли с помощью стандартного набора реак-
тивов («Amersham», США) [8]; гибридизацию (65 °С, 48 ч) на нейлоновых мембранных
фильтрах «Биодайн А» («Ріаіі», США) — согласно рекомендациям фирмы. Гибридиза-
ционные сигналы регистрировали на пленке PM-I (сСвема», СССР).
Результаты и обсуждение. Д л я выделения фракции генома, обога-
щенной УИР, асинхронную популяцию клеток дрозофилы метили в те-
чение 10 мин бромдезоксиуридином и 3Н-дезоксицитидином, что позво-
лило использовать фракционирование Д Н К в градиенте плотности
CsCl для дополнительной очистки УИР, содержащих тяжелую метку
в обеих комплементарных нитях [5]. Этот метод выделения фракции
У И Р считается наиболее адекватным, так как в модельной системе с
фаговой Д Н К дает возможность получать препараты с высокой степе-
нью обогащения последовательностями, несущими ori фагового генома
[5]. Полученная таким образом фракция
УИР имела электрофоретическую подвиж-
ность, соответствующую таковой фрагментов
маркерной Д Н К размером около 600 пар пук-
леотидов (п. н.) (рис. Ι , α ) .
Выделение я м Д Н К в условиях жесткой
обработки ядер клеток дрозофилы микрокок-
ковой нуклеазой после экстракции солевым
раствором с высокой ионной силой (2 M
NaCl) [6] позволяло получить фракцию
я м Д Н К со средним размером около 200 п. н.
(рис. 1 ,6 ) . Это согласуется с данными других
исследователей [6, 9] .
По нашим данным, препараты я м Д Н К и
УИР составляют соответственно десятые и
сотые доли процента геномной Д Н К дрозо-
филы.
Фракцию УИР клонировали в плазмиде
pUC18. После трансформации штамма TGl
Рис. 1. Электрофореграмма фракций ДНК: а —обога-
щенной УИР; б — ямДНК; e — pBR322, обработанная
рестриктазой AluL Цифры — стандарты молекулярной
массы
Fig. 1. Electrophoregram of DNA fractions enriched in
replication initiation sites (SIR) and DNA of the nucle-
ar matrix (nimDNA): a —SIR DNA; б — nrnDNA; в —
DNA pBR322 digested by the restriction endonuclease
AluI
E. coli были отобраны 110 бесцветных клонов, из которых 9 содер-
ж а л и инсерции. По электрофоретической подвижности размеры ИII-
серций составляли от 100 до 600 п. н. По современным представ-
лениям, ori эукариот должны входить в состав последователь-
ностей, связанных с ядерным матриксом [1]. Поэтому из клонирован-
ных УИР мы выбрали те последовательности, которые были представ-
лены и в я м Д Н К . Рекомбинантные плазмиды при гибридизации с
я м Д Н К давали сигналы различной интенсивности. Д л я дальнейших
исследований использовали рекомбинантный клон 408, несущий фраг-
мент УИР длиной около 600 п. н., дающий наиболее интенсивный сиг-
нал гибридизации с я м Д Н К .
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 5 101
По-видимому, связь Д Н К с ядерным матриксом имеет существен-
ное значение в регуляции репликативного синтеза в клетках высших
организмов [1]. Поэтому представляет интерес исследование, насколь-
ко универсальны процессы, регулирующие структурную и функцио-
нальную организацию геномов различных эукариот, и в первую оче-
редь, выяснение вопроса, какова степень консервативности в эволюции
последовательностей ДНК, участвующих в этих процессах.
В этой связи мы провели гибридизацию фракций УИР, я м Д Н К и
клона 408, происходящих из ядер клеток D. melanogaster, с геномной
Рис. 2. Дот-гибридизация геномной 3 2 Р-ДНК D. melanogaster с геномными Д Н К эука-
риот: а — D. melanogaster; б — D virilis; в — крысы; г — мыши; д — человека (1—4—2;
1; 0,5; 0,1 мкг Д Н К соответственно)
Fig. 2. Dot-hybridization of genomic DNA of eukaryotes with genomic 3 2P-DNA of Dro-
sophila melanogaster: a — DNA of Drosophila melanogaster; б — DNA of Drosophila vi-
rilis; в — DNA of a rat; г — D N A of a mouse; d — human DNA (1-4—2; 1; 0.5; 0.1 μg
of DNA, respectively)
Рис. 3. Дот-гибридизация 3 2 Р-ямДНК с геномными Д Н К эукариот: а — D. melano-
gaster:; б — D. virilis; в — крысы; г — мыши; д — человека (1—4 аналогично рис. 2)
Fig. 3. Dot-hybridization of genomic DNA of eukaryotes with 3 2P-nmDNA: a — DNA of
Drosophila melanogaster, б — DNA of Drosophila virilis; в — DNA of a ra t ;a— DNA of
a mouse; д — human DNA (1-4 — the same as in Fig. 2)
Д Н К других видов, нанесенной на нейлоновые фильтры в виде пятен
с уменьшающимся количеством Д Н К .
В экспериментах по дот-гибридизации геномных Д Н К D. virilis,
крысы, мыши и человека с нефракционированной 3 2 Р-ДНК D. melano-
gaster было обнаружено, что в них присутствуют гомологичные после-
довательности (рис. 2). Учитывая, что в подобных экспериментах дуп-
лексы образуются в основном повторами, полученная гибридизация
свидетельствует о наличии в геномах этих видов гомологичных повто-
ряющихся последовательностей. В контрольных опытах по дот-гибри-
дизации Д Н К D. melanogaster с Д Н К плазмиды pUC18 как в прямом,
так и в обратном вариантах гибридизация не была обнаружена.
Эксперименты, где в качестве меченых проб были использованы
я м Д Н К (рис. 3) и фракция УИР (рис. 4) показывают, что в состав
этих фракций входят повторяющиеся последовательности, гибридизую-
щиеся с геномными Д Н К других видов. Сравнение интенсивности сиг-
налов гибридизации с калибровочным рядом геномной Д Н К D. mela-
nogaster свидетельствует о том, что во фракции УИР в меньшей степе-
ни, чем в ямДНК, представлены повторы, гибридизующиеся с геномными
Д Н К других видов. Действительно, в случае я м Д Н К (рис. 3) 2 мкг
Д Н К D. virilis, крысы и мыши дают примерно такой же сигнал гибри-
дизации, как и 0,1 мкг Д Н К D. melanogaster, а в случае фракции УИР
(рис. 4) сигналы от 2 мкг геномной Д Н К этих видов имеют значитель-
но более слабую интенсивность, чем 0,1 мкг Д Н К D. melanogaster.
102 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 5
Д л я экспериментов по гибридизации мы использовали также одну
из клонированных последовательностей фракции У И Р (клон 408), ко-
торая была представлена и в я м Д Н К D. melanogaster (рис. 5) . Ока-
залось, что во всех тестированных геномах присутствуют семейства
повторов, гибридизующиеся с клонированной последовательностью
Д Н К , причем геном мыши (рис. 5, г) содержит д а ж е больше членов
этого семейства, чем собственный геном D. melanogaster.
В соответствии с принципами метода выделения У И Р клон 408 дол-
жен нести в качестве вставки УИР Д Н К дрозофилы. Однако доказать
Рис. 4. Дот-гибридизация 3 2Р-УИР Д Н К с геномными Д Н К эукариот: а — D. melano-
gaster·, б — D. virilis·, в — крысы; г — мыши; д — человека (1—4 аналогично рис. 2)
rig. 4. Dot-hybridization of genomic DNA of eukaryotes with 3 2P-SIR DNA; a — DNA of
Drosophila melanogaster; б — DNA of Drosophila virilis; в — DNA of a rat; г — DNA of
a mouse; д — human DNA (1-4— the same as in Fig. 2).
Рис. 5. Дот-гибридизация 32Р-фрагмента УИР Д Н К с геномными Д Н К эукариот: а —
D. melanogaster; б — D. virilis·, в — крысы; г — мыши; д — человека (/—4 аналогично
рис. 2)
Fig. 5. Dot-hybridization of genomic DNA of eukaryotes with cloning 3 2 P-fragment of
SIR; a — DNA of Drosophila melanogaster, б — DNA of Drosophila virilis·, в — DNA of
a rat; г — DNA of a mouse; д — human DNA (1-4— the same as in Fig. 2)
это прямыми экспериментами пока невозможно. Поэтому мы не можем
полностью исключить возможности того, что клонированный участок
генома D. melanogaster не имеет отношения к инициации репликации.
Наши предварительные исследования клона 408 свидетельствуют о
том, что он не гибридизуется с гетерогенной ядерной Р Н К дрозофилы
и, по-видимому, несет отрезок генома, расположенный в нетранскриби-
руемой области. В дальнейшем планируется провести секвенирование
вставки, содержащейся в клоне 408, и охарактеризовать полученную
последовательность.
Таким образом, на основании полученных данных можно заклю-
чить, что, по крайней мере, часть последовательностей, участвующих
в инициации репликативного синтеза и в прикреплении Д Н К к ядер-
ному матриксу у D. melanogaster, относится к повторяющимся после-
довательностям, обладающим высокой эволюционной консервативно-
стью. Это, возможно, указывает на универсальность механизмов, регу-
лирующих структурную организацию ядра и репликацию генома в
клетках эукариот.
Авторы выражают благодарность А. П. Акифьеву за конструктив-
ные замечания при обсуждении результатов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. The role of the nuclear matrix in the organization and function of DNA / W. G. Nel-
son, K. J. Pienta, E. R. Barrack, D. S. C o f f e y / / A n n . Rev. Biophys. Chem.—1986.—
15.—P. 457—475.
2. Линии эмбриональных клеток Drosophila melanogaster, пересеваемые in vitro /
В. Т. Какпаков, В. А. Гвоздев, Т. П. Платова, JL Г. Полукарова / / Генетика.—
1969,—5, Ко 12,—С. 67—75.
ISSN 0233-7G57. Б І ІОПОЛІ !МЕРЫ H КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 5 103
3. Zannis-Hadjopoulos M., Persico M., Martin R. G. The remarkable instability of repli-
cation loops provides a general method for the isolation of origins of DNA replica-
tion / / Cell.—19811.—27, N 1 (2).— P. 155—163.
4. Zannis-Hadjopoulos M., Chepelinsky A. B., Martin R. G. Mapping of the З'-end posi-
tions of SV40 nascent s t r a n d s / / J . Мої. Biol.— 1983.—165, N 3 .—P. 5ΘΘ—607.
5. Разин С. В., Кекелидзе Μ. Г., Луканидин Ε. Μ. Пространственная организация реп-
ликонов в эукариотическом ядре: прикрепление участков начала репликации к ядер-
ному скелету / / Молекуляр. биология.— 1986.—20, № 2.— С. 387—395.
6. Яровая О. В., Разин С. В. Два типа участков прикрепления Д Н К к ядерному скеле-
ту в клетках асцитной карциномы Э р л и х а / / Т а м же.— 1983.—17, JVb 2.— С. 303—
313.
7. Gibson Т. / . Structure of the Epstein-Biairr virus genome: Dissertation.— Cambridge,
11984.—153 p.
8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекуляр-
ное клонирование.— М. : Мир, 1984.—479 с.
9. Aelen J. Μ. A., Opstelten R. J. G., Wanka F. Organization of DNA replication in Phy-
sarum polycephalum. Attachment of origins of replicons and replication forks to the
nuclear matrix / / N u c l . Acids Res.— 1983 —11, N 4 .—P. 1181—1195.
Ин-т общ. генетики им. Η. И. Вавилова Получено 29.03.88
АН СССР, Москва
Ин-т хим. физики АН СССР, Москва
THE NUCLEOTIDE SEQUENCES PROBABLY CONNECTED
WITH THE INITIATION SITES OF DNA REPLICATION
IN DROSOPHILA MELANOGASTER
A. P. Sidorenko, G. A. Khudoly, N. G. Schuppe
N. I. Vavilov Institute of General Genetics, Academy of Sciences
of the USSR, Moscow
Instutute of Chemical Physics, Academy of Sciences of the USSR, Moscow
S u m m a r y
The DNA fraction enriched in replication initiation sites was isolated from cultured em-
bryonic cells of Drosophila melanogaster using a method of nascent DNA strands extru-
sion. Hybridization experiments have shown that at least a part of replication initiation
sites are repetitive sequences and are highly conservative in evolution.
104 ISSN 0233-7657. БΙΙΟΠΟJTPIMEPbI IT КЛЕТКА. 1989. Τ. 5. № 5
|