Структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилятационной кардиомиопатии

Тропомиозин из нормального и пораженного дилятационной кардиомиопатией (ДКМП) миокарда человека получен в гомогенном состоянии методами высаливания и последовательной экстракции органическими и неорганическими растворителями. Для контрольных экспериментов получен тропомиозин скелетных мышц по аналог...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1998
Автори:	Сидорик, Л.Л., Федоркова, О.М., Ковеня, Т.В., Бобык, В.И., Родиин, Н.В., Мацука, Г.Х.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1998
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Теми:	Структура и функции биополимеров
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155222
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилятационной кардиомиопатии / Л.Л. Сидорик, О.М. Федоркова, Т.В. Ковеня, В,И. Бобык, Н.В. Родиин, Г.X. Мацука // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 3. — С. 203-209 — Бібліогр.: 27 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-155222
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1552222019-06-17T01:27:59Z Структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилятационной кардиомиопатии Сидорик, Л.Л. Федоркова, О.М. Ковеня, Т.В. Бобык, В.И. Родиин, Н.В. Мацука, Г.Х. Структура и функции биополимеров Тропомиозин из нормального и пораженного дилятационной кардиомиопатией (ДКМП) миокарда человека получен в гомогенном состоянии методами высаливания и последовательной экстракции органическими и неорганическими растворителями. Для контрольных экспериментов получен тропомиозин скелетных мышц по аналогичной методике. Молекулярная масса препаратов тропомиозина, выделенного как из нормального, так и патологического миокардов, была идентичной. При иммуноскрининге методом ELISA в сыворотках пациентов с ДКМП аутоантитела к тропо миозину миокарда с низкой иммунореактивностью были обнаружены в небольшом проценте сывороток, аутоиммунная реакция против тропомиозина скелетных мышц отсутствовала, Иммуноблотинг обоих препаратов миокардиальных тропомиозинов с наиболее иммунореактивными сыворотками пациентов с ДКМП показал, что эти антитела, взаимодействуют, в основном, с детерминантами конформационного типа. Таким образом установлено, что в отличие от исследованных ранее кардиоспецифических антигенов актина и миозина тропомиозин не претерпевает существенных структурных изменений при развитии ДКМП, способных приводить к изменению его иммуногенности. Тропоміозин з нормального і ураженого дилятаційною кардіоміоттіею (ДКМП) міокарда людини отримано в гомогенному стані методами висолювання і послідовної екстракції органічними та неорганічними розчинниками. Для контрольних експериментів одержано тропоміозин скелетних м'язів за аналогічною методикою. Молекулярна маса препаратів тропоміозину, виділеного як з нормального, так і патологічного міокардів, була однаковою. При імуноскринінгу методом ELISA у сироватках пацієнтів з ДКМП аутоантитіла до тропоміозину міокарда з низькою імунореактивністю були виявлені у невеликому відсотку сироваток, аутоімунна реакція проти тропоміозину скелетних м'язів була відсутня. Імуноблотинг обох препаратів тропоміозину міокардів з найімунореактивиіишми сироватками пацієнтів з ДКМП показав, що ці антитіла взаємодіють, в основному, з детермінантами конформаційного типу. Таким чином, знайдено, що на відміну від досліджених раніше кардіоспецифічних антигенів актину і міозину тропоміозин не піддасться суттєвим структурним змінам при розвиткові ДКМП, здатним призвести до зміни його імуногенності. Tropomyosin have been purified to homogeneity from normal, and affected by dilated cardiomyopathy (DCMP) human myocardium and from skeletal muscle as well. The molecular masses of both preparations of cardiac tropomyosins were identical. The immuno-screening of DCMP patients sera by EUSA method have shown the presence of autoantibodies directed against cardiac tropomyosin in the limited number of sera. No immunoreactivity have been detected against skeletal tropomyosin. Western blot analysis detected any linear determinants in tropomyosin molecule under denaturating conditions. We suggest that cardiac tropomyosin doesn't undergoes sufficient structural changes at dilated cardiomyopathy progression. 1998 Article Структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилятационной кардиомиопатии / Л.Л. Сидорик, О.М. Федоркова, Т.В. Ковеня, В,И. Бобык, Н.В. Родиин, Г.X. Мацука // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 3. — С. 203-209 — Бібліогр.: 27 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0004CF http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155222 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Сидорик, Л.Л. Федоркова, О.М. Ковеня, Т.В. Бобык, В.И. Родиин, Н.В. Мацука, Г.Х. Структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилятационной кардиомиопатии Биополимеры и клетка
description	Тропомиозин из нормального и пораженного дилятационной кардиомиопатией (ДКМП) миокарда человека получен в гомогенном состоянии методами высаливания и последовательной экстракции органическими и неорганическими растворителями. Для контрольных экспериментов получен тропомиозин скелетных мышц по аналогичной методике. Молекулярная масса препаратов тропомиозина, выделенного как из нормального, так и патологического миокардов, была идентичной. При иммуноскрининге методом ELISA в сыворотках пациентов с ДКМП аутоантитела к тропо миозину миокарда с низкой иммунореактивностью были обнаружены в небольшом проценте сывороток, аутоиммунная реакция против тропомиозина скелетных мышц отсутствовала, Иммуноблотинг обоих препаратов миокардиальных тропомиозинов с наиболее иммунореактивными сыворотками пациентов с ДКМП показал, что эти антитела, взаимодействуют, в основном, с детерминантами конформационного типа. Таким образом установлено, что в отличие от исследованных ранее кардиоспецифических антигенов актина и миозина тропомиозин не претерпевает существенных структурных изменений при развитии ДКМП, способных приводить к изменению его иммуногенности.
format	Article
author	Сидорик, Л.Л. Федоркова, О.М. Ковеня, Т.В. Бобык, В.И. Родиин, Н.В. Мацука, Г.Х.
author_facet	Сидорик, Л.Л. Федоркова, О.М. Ковеня, Т.В. Бобык, В.И. Родиин, Н.В. Мацука, Г.Х.
author_sort	Сидорик, Л.Л.
title	Структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилятационной кардиомиопатии
title_short	Структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилятационной кардиомиопатии
title_full	Структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилятационной кардиомиопатии
title_fullStr	Структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилятационной кардиомиопатии
title_full_unstemmed	Структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилятационной кардиомиопатии
title_sort	структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилятационной кардиомиопатии
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1998
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155222
citation_txt	Структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилятационной кардиомиопатии / Л.Л. Сидорик, О.М. Федоркова, Т.В. Ковеня, В,И. Бобык, Н.В. Родиин, Г.X. Мацука // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 3. — С. 203-209 — Бібліогр.: 27 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT sidorikll strukturnofunkcionalʹnoeizučenietropomiozinamiokardakakautoantigenapridilâtacionnojkardiomiopatii AT fedorkovaom strukturnofunkcionalʹnoeizučenietropomiozinamiokardakakautoantigenapridilâtacionnojkardiomiopatii AT kovenâtv strukturnofunkcionalʹnoeizučenietropomiozinamiokardakakautoantigenapridilâtacionnojkardiomiopatii AT bobykvi strukturnofunkcionalʹnoeizučenietropomiozinamiokardakakautoantigenapridilâtacionnojkardiomiopatii AT rodiinnv strukturnofunkcionalʹnoeizučenietropomiozinamiokardakakautoantigenapridilâtacionnojkardiomiopatii AT macukagh strukturnofunkcionalʹnoeizučenietropomiozinamiokardakakautoantigenapridilâtacionnojkardiomiopatii
first_indexed	2025-07-14T07:17:33Z
last_indexed	2025-07-14T07:17:33Z
_version_	1837605798410190848
fulltext	ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1998. Т. 14. № 3 Структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилятационной кардиомиопатии Л. Л. Сидорик, О. М. Федоркова, Т. В. Ковеня* В, И. Бобык, Н. В. Родиин, Г. X. Мацука Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины 252143, Киев, ул. Академика Заболотного, 150 Тропомиозин из нормального и пораженного дилятационной кардиомиопатией (ДКМП) миокарда человека получен в гомогенном состоянии методами высаливания и последовательной экстракции органическими и неорганическими растворителями. Для контрольных экспериментов получен тропомиозин скелетных мышц по аналогичной методике. Молекулярная масса препаратов тропомиозина, выделенного как из нормального, так и патологического миокардов, была идентич ной. При иммуноскрининге методом ELISA в сыворотках пациентов с ДКМП аутоантитела к тропо миозину миокарда с низкой иммунореактивностью были обнаружены в небольшом проценте сывороток, аутоиммунная реакция против тропомиозина скелетных мышц отсутствовала, Иммуноблотинг обоих препаратов миокардиальных тропомиозинов с наиболее иммунореактивны- ми сыворотками пациентов с ДКМП показал, что эти антитела, взаимодействуют, в основном, с детерминантами конформационного типа. Таким образом установлено, что в отличие от исследованных ранее кардиоспецифических антигенов актина и миозина тропомиозин не претер певает существенных структурных изменений при развитии ДКМП, способных приводить к изменению его иммуногенности. Введение. Изучение молекулярных механизмов развития аутоиммунных системных и органоспеци- фических патологий важно не только для понима ния процессов нарушения собственной толерантно сти на уровне молекулярных взаимодействий ли- ганд (антиген) — рецептор, активации иммунеком петентных клеток и развития иммунного ответа, но и для выяснения молекулярных механизмов воз никновения и патогенеза этих аутоиммунных забо леваний. Наиболее распространенными заболева ниями, участие аутоиммунных процессов в кото рых не подлежит сомнению [І ], являются различ ные сердечно-сосудистые патологии. В течение ря да лет в нашей лаборгітории исследуются молеку лярные механизмы развития тяжелой сердечной патологии неизвестной природы — идиопатической дилятационной кардиомиопатии (ДКМП), которая характеризуется расширением левого желудочка © Л. Л. С И Д О Р И К , О. М. Ф Е Д О Р К О В А , Т. В. К О В Е Н Я , В. И. Б О В Ы К , Н. В. Р О Д Н И Н , Г. X. МАЦУКА, 1998 сердца, гибелью кардиомиоцитов и коллагенозом ткани миокарда, приводящими обычно к летально му исходу. Рядом исследователей было показано наличие в сыворотках пациентов с различными сердечными патологиями (миокардит, ДКМП, ост рая ревматическая лихорадка, постинфарктный миокардиальный синдром и др.) аутоантител к ряду кардиоспецифических антигенов, таких как АНТ (аденин-нуклеотид-транслокатор) и дегидро- геназа кетокислот митохондрий [2, 3 ], /З-адреноре- цептор [4, 5 ] , а-изоформа миозина и тропомиозин [6 ] , что иногда сопровождалось депозитом антител в виде иммунных комплексов в тканях миокарда с последующим их некрозом [ 7 ] . В отличие от миокардитов или постинфарктно го синдрома молекулярные механизмы аутоиммун ных и патологических процессов при ДКМП изуче ны недостаточно. Ранее нами были выявлены и охарактеризованы аутоантитела против основных кардиоспецифических антигенов, играющих клю- 203 С И Д О Р И К л. л. И Д Р . чевую роль в сократительных процессах сердечной мышцы — миозина и актина [8 ,9 ] . Полученные нами данные позволили выдвинуть предположение о том, что в процессе развития ДКМП основные антигены миокарда, в частности, актин и миозин претерпевают определенные конформационные из менения, что и приводит к драматическому изме нению их иммунореактивности, вызывающей мощ ную аутоиммунную реакцию организма против собственных антигенов. Далее это было подтверждено и при исследова нии АТРазной активности миозина и акто-миози- нового комплекса миокарда [10] , когда АТР&зная активность патологического миозина была меньше нормы в несколько раз, что однозначно свидетель ствует о структурных изменениях молекулы мио зина, затрагивающих активный центр молекулы, при развитии данной патологии. С другой стороны, критичным для работы со кратительного аппарата сердечной мышцы являет ся функционирование; комплекса регуляторных белков — тропомиозина (ТМ) и семейства тропо- нинов (Тн). Если для гладких и скелетных мышц функционирование этого регуляторного комплекса изучено во многих аспектах, то структурно-функ циональные особенности комплекса ТМ — Тн даже нормального миокарда изучены весьма слабо. Тем более нам представлялось важным попытаться вы яснить возможную роль комплекса регуляторных белков миокарда в развитии ДКМП. В ряде работ, описывающих наличие аутоанти- тел к ТМ при некоторых сердечных патологиях (острая ревматическая лихорадка [11] , миокарди ты [12 \| и пост-стрептококковый гломерулонефрит [13]) , отмечается, что эти аутоантитела дают пе рекрестную реакцию между антигеном стрептокок ка группы А и гликопротеинами миокарда, имею щими строгую структурную гомологию в а-спи- ральном участке со стрептококковым белком Мб. К данным гликопротеинам принадлежат такие кар- диоспецифические антигены, как миозин, тропоми озин, виментин, а-актинин. ТМ, как и большинство миофибриллярных белков, существует в нескольких изоформах, и основные изменения в их экспрессии происходят во время миогенеза. ТМ кодируется мультигенным семейством [13] , представляет собой суперспираль ный димер, стабилизирующий филаменты актина, и является ключевым белком в контроле сокраще ния поперечно-полосатых мышц. Биохимические исследования показали, что для сердечной мышцы: характерно присутствие молекул ТМ, в основном, в виде аа-гомодимера [13 J. В ассоциации с Тн- комплексом основная функция ТМ скелетных и сердечных мышц — регуляция кальций-чувстви тельного взаимодействия актина и миозина. Комп лекс ТМ — Тн ингибирует АТРазную активность акто-миозина при внутриклеточных концентраци ях кальциевых ионов, характерных для расслаб ленной мышцы. В ответ на освобождение Са 2 + саркоплазматическим ретикулумом тропонин С (ТнС) связывает добавочные ионы кальция и сиг нал конформационных изменений передается через Тн-связанный ТМ-комплекс. Акто-миозин активи руется, АТРазная активность резко нарастает, что и приводит к сокращению саркомера. При определенных сердечных патологиях было отмечено нарушение экспрессии генов отдельных белков саркомера, что в свою очередь нарушало функции сердечной мышцы и могло приводить к развитию определенных патологий. Так, показано, что мутации в тяжелых цепях вентрикулярного миозина (/3-МНС), а-ТМ и кардиального тропони- на Т (ТнТ) приводят к развитию семейной гипер трофической кардиомиопатии [15, 16] . При ДКМП роль комплекса регуляторных белков, возможные мутации в них, приводящие к изменению антиген- ности и к дальнейшему нарушению сокращения миофибрилл сердца, практически не изучены. Основной целью нашей работы было выяснение того, может ли ТМ миокарда являться мишенью для аутоиммунной агрессии при ДКМП, происхо дит ли изменение антигенных свойств ТМ при развитиии этой патологии и сопровождается ли это какими-то структурно-функциональными измене ниями в молекуле ТМ. Материалы и методы. Сыворотки пациентов с ДКМП были любезно предоставлены Институтом кардиологии им. Стражеско АМН Украины. Диаг ноз ДКМП устанавливался согласно рекомендаци ям ВОЗ (от 1980 и 1985 гг.) с помощью клиниче ских, лабораторных и инструментальных методов исследования. Были исследованы 39 сывороток па циентов с ДКМП и 27 сывороток здоровых доноров. Все сыворотки тестировались количественно на на личие ревматоидного фактора, а также на наличие иммуноглобулинов классов G и М — для стандар тизации результатов. В работе и с п о л ь з о в а л и реактивы фирм «Sigma», «Віо-Rad» и «Calbiochem» (США), конъю- гат против IgG и IgM человека (разобщенный) — фирмы «Amersham» (Великобритания), плашки для иммуноферментного анализа фирмы «Dynatech» (Великобритания), нитроцеллюлоза ВА-85 фирмы «Shleicher & Shull» (ФРГ). Концентрации балков определяли по методу Брэдфорда [17] . Электрофорез белков проводили в градиенте 204 концентрации (7—22 %) ПААГ в денатурирующих условиях по Лэммли [18] . Выделение тропомиозина миокарда. Тропоми- озин выделяли из миокарда пациента, погибшего от ДКМП (ТМд), и миокарда практически здорово го индивидуума, погибшего в результате несчаст ного случая (ТМн), по описанному методу [19] с модификациями. Навеску кусочка миокарда из мельчали ножницами и промывали в боратном буфере для миофибрилл (40 мМ Н 3 В 0 3 , 0,1 М К О ) до светло-желтого цвета. Ткань гомогенизировали в буфере для экстракции миозина (0,3 М К О , 0,15 М К 2 Н Р 0 4 , рН 6,8, 0,01 М N a 2 H P 0 4 , 1 мМ MgCl 2, 2 мМ PMSF) в гомогенизаторе Поттера, После экстракции миозина и центрифугирования (6000 g 30 мин) осадок заливали тремя объемами дистиллированной воды и оставляли на 30 мин при 4 °С. Осадок собирали центрифугированием при 6000 g, 30 мин, затем заливали двумя объемами дистиллята. Собранный центрифугированием оса док смешивали с этанолом ( 1 : 1 , v \v) , выдержива ли в течение 30 мин и осаждали при 6000 g, 30 мин. Таким же образом проводили дальнейшую экстракцию ТМ эфиром. Далее экстрагировали ТМ из эфирного осадка в семи объемах 1 М раствора К О , рН которого доводили до 7,0 содой, в течение 12—14 ч при 4 °С. Затем рН супернатанта доводили 1 н. Н О до 4,3 и выдерживали в течение 1 ч при 4 ° С Гелеподобный осадок собирали центрифугированием при 6000 g (30 мин) гомогенизировали в дистилляте и высали вали сульфатом аммония ступенчато до конечного насыщения 70 %. Тропомиозиновый осадок диали- зовали против дистиллята, подкисленного Н О до рН 4,7. Тропомиозин скелетных мышц выделяли по аналогичной методике. Чистоту полученных белков определяли элект- рофоретически. Твердофазный илмуноферментный анализ (ELISA). Аутоантитела против ТМн и ТМд выяв ляли методом ELISA [20 ] с модификациями. Анти гены иммобилизовали в течение ночи при 4 °С в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,2. Концентрация антигенов 5 мкг/мл. Затем плашки были тщатель но отмыты натрий-фосфатным буфером (PBS), рН 7,2, содержащим 0,1 % Tween-20 (PBS-T), и свободные сайты адсорбции блокировали буфером PBS-T с 0,5 %-желатиной (PBS-T-Gel). Сыворотки в соответствующем разведении в буфере PBS-T-Gei инкубировали в течение 2 ч при 37 °С и в течение ночи — при 4 °С. После интенсивной отмывки в PBS-T плашки инкубировали 1 ч с биотинилиро- ванными антителами против IgG или IgM челове- СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ И З У Ч Е Н И Е Т Р О П О М И О З И Н А ка, затем в течение 20 мин — с конъюгатом стреп- тавидин—пероксидаза.. Результат реакции визуа лизировали добавлением субстрата (0,05 мг/мл ABTS с 0,05 % Н 2 0 2 ) и определяли количественно при 405 нм на риддере Titertek («Muitiscan», Вели кобритания) . Результаты, полученные с исследуемыми сыво ротками при указанном разведении против данного антигена, сравнивали с результатами для пула 27 нормальных сывороток, исследованных в тех же условиях. Антиген-положительными считали сыво ротки, значение О Д 4 0 5 которых было выше 2 О Д 4 0 5 для пула нормальных сывороток. Иммуноблотинг (Western-blot). Иммунобло- тинг наиболее реактивных сывороток против иссле дуемых антигенов проводили, как описано ранее [21 ] с небольшими модификациями. Препаратив ный электрофорез в градиенте концентрации ПААГ осуществляли в денатурирующих условиях но Лэм мли [18] . Нитроцеллюлозную реплику препаратив ного электрофореза после отмывки в буфере PBS-T и заполнения свободных сайтов адсорбции буфером PBS-T-Gel разрезали поперек на узкие полоски шириной 2—3 мм и все дальнейшие процедуры, включая инкубацию с индивидуальными сыворот ками, с конъюгатом и красителем, проводили в Mini-Incubation Trays (фирма «Віо-Rad», США) для такого типа Western-blot анализа. Сыворотки в разведении 1 : 50 в PBS-T-Gel буфере с 0,03 %-м азидом натрия инкубировали с полосками блота в течение 2 ч при 37 °С и 14 ч при 4 °С (так как аутоантитела имеют низкую аффинность). Реак цию визуализировали, используя разобщенный конъюгат биотинилированных вторых антител козы против иммуноглобулинов G и М человека с после дующей инкубацией со стрептавидин-конъюгиро- ванной пероксидазой. Блот окрашивали раствором 4-хлоро-1-нафтола (0,5 мг/мл) в 50 мМ трис-НС1, рН 7,5, с 0,05 % Н 2 0 2 . Реакцию останавливали, опуская полоски блота по мере развития окраски и фона, в дистиллированную воду. Результаты и обсуждение. Модифицирован ный нами метод выделения ТМ позволяет получить достаточные для выполнения дальнейших исследо ваний количества высокоочищенного препарата белка. На рис. 1 представлена электрофореграмма препаратов ТМ, выделенных из нормального и пораженного ДКМП миокардов. Оказалось, что оба препарата имеют одинаковую молекулярную массу и изоэлектрическую точку (данные не представле ны), что может свидетельствовать об отсутствии существенных различий в первичной структуре исследуемых антигенов, а также о сходном харак тере процессинга этих белков в течение миогенеза 205 ШОРИК Л. Л И ДР. реактивности ТМн и ТМд против сывороток паци- кД** ентов с ДКМП в реакции ELISA. ду Видно, что только незначительный процент сывороток пациентов с ДКМП можно считать пози тивными, и уровень иммунного ответа против ТМ 67 в целом значительно ниже, чем иммунный ответ тех же пациентов против препаратов миозина, 45 выделенного из ДКМП-миокарда, что было опреде лено нами ранее. Никакой иммунной реакции не было отмечено при тестировании сывороток паци ентов против ТМ, выделенного из скелетных мышц. Можно считать, что ТМ является низкоим- муногенным, то есть при развитии ДКМП молеку- 14 ла ТМ (в отличие от ранее исследованных миозина и актина) не претерпевает существенных структур н і М Р и с 1. Электрофореграмма препаратов тропомиозина, выделен ного из нормального ( / ) и пораженного ДКМП (2) миокардов; М — смесь стандартных белковых маркеров как нормального миокарда, так и при развитии патологии. Точечные мутации в молекуле ТМ бы ли обнаружены только при исследовании пациен тов с острой ревматической лихорадкой [11 ] , пост вирусным миокардитом [12] и семейной гипертро фической к а р д и о м и о п а т и е й [ 2 2 ] . Подобные отличия отмечены и при исследовании других кар диоспецифических антигенов, таких как миозин. Можно предположить, что различный характер по ражения основных миофибриллярных белков при разных сердечных патологиях (включая и разные виды кардиомиопатии) обусловливает и разный патогенез этих заболеваний. Следующим этапом изучения структурно-фун кциональных особенностей ТМ при ДКМП было определение иммунореактивности исследуемых ан тигенов против сывороток пациентов с ДКМП и здоровых доноров. Предварительное тестирование всех исследуе мых сывороток на наличие ревматоидного фактора, а также определение концентраций естественных (natural) иммуноглобулинов классов G и М показа ло отсутствие корреляции интенсивности иммунно го ответа против исследуемых антигенов (ТМн и ТМд) и относительной концентрации IgG и IgM в тестируемых сыворотках. Это свидетельствует о специфичности иммунного ответа аутоантител сы вороток пациентов к исследуемым антигенам. На рис 2 представлены результаты изучения иммуно- Р и с 2. Иммунореактивность препаратов тропомиозина, выде ленного из нормального (ТМн), пораженного ДКМП (ТМд) миокардов и из скелетных мышц (ТМс), определенная в реак ции ELISA. Условия проведения реакции — в разделе «Матери алы и методы» 206 ных изменений, что может привести к изменению антигенносте. Информация, полученная с помощью реакции ELISA, является неполной без данных иммунобло- тинга — высокочувствительного метода, позволяю щего установить не только наличие многих аутоан- тигенов при исследуемых патологиях, но также определить природу детерминант, против которых вырабатываются аутоантитела. Результаты, пред ставленные на рис 3, показывают, что даже в наиболее иммунореактивных сыворотках, исполь зуемых в данном эксперименте, нет аутоантител к ТМ, способных узнавать детерминанты линейного типа. Наличие кардиоспецифических аутоантител к ТМ было недавно описано группой исследователей при изучении сывороток пациентов с острой ревма тической лихорадкой (ОРЛ) [11] . Ранее многими исследователями были описаны кардиореактивные аутоантитела в сыворотке пациентов с ОРЛ: эти аутоантитела имели иммунологический перекрест с антителами М белка стрептококка и генерирова лись против сходного структурного а-спиральногс участка таких белков, как Мб белок стрептококка, миозин и ламинин миокарда [23, 24 ] . Сходные аутоантитела были выявлены у больных с острым пост-стрептококковым гломерулонефритом и неос- ложненной стрептококковой инфекцией [11] . С помощью мышиных моноклональных антител про тив М белка стрептококка была продемонстрирова на их высокая реактивность с ТМ сердца человека и ТМ сердца кролика [25]. Более того, эти моноклональные антитела вы- 12 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 Рис. 3. Иммуноблотинг препаратов тропомиозина, выделенного из нормального ( /—6) и пораженного ДКМП (7—12) миокар дов: /—4 и 7—10 — инкубация с сыворотками пациентов с ДКМП; 5, 6, 11, 12 — с сьшоротками здоровых доноров; 13 — контроль сорбции конъюгата; 14 — контроль эффективности переноса препарата ТМ с геля на нитроцеллюлозу (окраска полоски блота в Ponceau). Положение ТМ обозначено стрелкой С Т Р У К Т У Р Н О - Ф У Н К Ц И О Н А Л Ь Н О Е И З У Ч Е Н И Е Т Р О П О М И О З И Н А являли детерминанты линейного типа у ТМ в иммуноблотинге, хотя исследованные сыворотки пациентов с ОРЛ подобной реактивности в имму ноблотинге не показали. Это согласуется с пол ученными ранее данными многочисленных иссле дований о природе и структурно-функциональных особенностях natural antibodies (аутоантител) по сравнению с provocated antibodies (антителШй, полученными иммунизацией лабораторных живо тных) к одному и тому же антигену и является базисом для понимания особенностей развития аутоиммунных патологий, когда происходит «отме на толерантности» и развиваются аутоиммунные реакции против собственных антигенов [26] . В случае ОРЛ ТМ-позитивными были почти 100 % исследованных пациентов, в случае пост стрептококкового острого гломерулонефрита — около 10 %, при миокардитах — 5—8 %, а в случае неосложненной стрептококковой инфекции, синдрома Кавасаки и у здоровых доноров не было выявлено ни одного случая наличия аутоантител к ТМ миокарда [11] . Это можно объяснить перво причиной данных патологий — острой стрептокок ковой инфекцией, при которой генерируется боль шое количество антител, перекрестно реагирующих как с белком Мб стрептококка, так и гомологичны ми а-спиральными последовательностями таких белков миокарда, как миозин и тропомиозин. Па тологии же вирусной или другой этиологии (в частности ДКМП) имеют иные механизмы разви тия аутоиммунных процессов, при которых не от мечается значительного количества аутоантител к данному гомологичному супер-спирализованному участку антигенов, таких как тропомиозин. В случае ДКМП ни одна из теорий ее проис хождения не основана на первичной стрептококко вой инфекции: предпочтение отдается вирусной и токсической (например, алкогольная ДКМП) моде лям патогенеза ДКМП. Поэтому и природа, и функциональное значение аутоантител при ДКМП будут, естественно, отличаться от таковых при сердечных патологиях микробиального происхож дения. Функционально ТМ играет важную роль в мышечном сокращении и релаксации. Когда мыш ца активируется освобождающимися ионами каль ция, молекулы ТМ, ассоциированные с Тн-белка- ми, индуцируют конформационные изменения в тропонинах. Полученные нами данные дают осно вание полагать, что при развитии ДКМП тропоми озин, выполняющий важную функционально-регу- ляторную роль, в отличие от других компонентов миофибрилл (миозина или актина) не претерпевает столь драматических изменений, могущих приве- 207 С И Д О Р И К Л Л. И Д Р . сти к изменению его антигенности. В то же время известно, что ДКМП характеризуется развитием изменений в функционировании кальциевых насо сов миофибрилл сердечной мышцы, в свою очередь, приводящих к нарушению нормального сокраще ния сердечных саркомеров [27 ]. Резонно предполо жить, что определенные структурно-функциональ ные перестройки могут происходить в комплексе Тн-белков. Выявление возможных изменений в комплексе тропониновых белков миокарда, иссле дование молекулярных особенностей их взаимодей ствия с акто-миозиновым комплексом сердечной мышцы при развитии ДКМП является предметом дальнейших исследований. Л. Л. Сидорик, О. М. Федор кова, Т. В. Ковеня, В. I. Бобик, М. В. Роднін, Г. X. Мацука Структурно-функціональне вивчення тропоміозину міокарда як аутоантигена при цилятаційній кардіоміопатії Резюме Тропоміозин з нормального і ураженого дилятаційною кар- діоміоттіею (ДКМП) міокарда людини отримано в гомоген ному стані методами висолювання і послідовної екстракції органічними та неорганічними розчинниками. Для контроль них експериментів одержано тропоміозин скелетних м'язів за аналогічною методикою. Молекулярна маса препаратів тро поміозину, виділеного як з нормального, так і патологічного міокардів, була однаковою. При імуноскринінгу методом ЕЫ- SA у сироватках пацієнтів з ДКМП аутоантитіла до тро- гюміозину міокарда з низькою імунореактивністю були вияв лені у невеликому відсотку сироваток, аутоімунна реакція проти тропоміозину скелетних м'язів була відсутня. Імуно- блотинг обох препаратів тропоміозину міокардів з найімуно- реактивиіишми сироватками пацієнтів з ДКМП показав, що ці антитіла взаємодіють, в основному, з детермінантами конформаційного типу. Таким чином, знайдено, що на відміну від досліджених раніше кардіоспецифічних антигенів актину і міозину тропоміозин не піддасться суттєвим структурним змінам при розвиткові ДКМП, здатним призвести до зміни його імуногенності. L. L. Sidorik, О. М. Fedorkova, Т. У. Kovenja, У I. Bobyk, N. У Rodnin, G. Kh. Matsuka Structural and functional studies of cardiac tropomyosin as; autoantigen at dilated cardiomyopathy Summary Tropomyosin have been purified to homogeneity from normal and affected by dilated cardiomyopathy (DCMP) human myocardium and from skeletal muscle as well. The molecular masses of both preparations of cardiac tropomyosins were identical. The immuno- screening of DCMP patients sera by ELISA method have shown the presence of autoantibodies directed against cardiac tropomyosin in the limited number of sera. No immunoreactivity have been detected against skeletal tropomyosin. Western blot analysis detected any linear determinants in tropomyosin molecule under denaturating conditions. We suggest that cardiac tropomyosin doesn't undergoes sufficient structural changes at dilated cardiomyopathy progression. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Rose N. R., Neumann D. A., Herskowitz A. Autoimmune myocarditis: concepts and questions / / Immunol. Today.— 1991 .—12, N 6.—P. 253—255 . 2. Schultneiss Я , P., Bolte H. D. Immunological analysis autoan tibodies against the adenine nucleotide traitislocator in dilated cardiomyopathy / / J. Мої. Cell. Cardiol .—1985.—17.— P. 603—612 . 3. Neumann D. A., Bureck C. L, Baughman K. L. et al Circulating heart-reactive antibodies in patients with myocar ditis or cardiomyopathy / / Amer. Coll. Cardiol .—1990.— 16 .—P. 839—846. 4. Limas C. J., Limas C. Immune-mediated modulation of Д-adrenoreceptor function in human dilated cardiomyopathy / / Clin. Immunol, and Immunopathol .—1993.—68, N 2 . — P. 204—207 . 5. Limas C. J., Limas C, Kubo S. H., Olivari H.-T. Anti-beta- receptor antobodies in human dilated cardiomyopathy and correlation with HLA-DR antigens / / Amer. J. Cardiol.— 1990.—65, N 1.—P. 4 8 3 — 4 8 7 . 6. Rose N. R., Herskowitz A., Neumann D., Neu N. Autoimmune myocarditis: a paradigm of post-infectious autoimmune disease / / Immunol. T o d a y . — 1 9 8 8 . — 9 . — P . 1 1 7 - 1 2 0 . 7. DeSclieerder I. M., DeBysore M.y Algoed L. et al Charac teristic anti-heart antibody patterns in post-cardiac injury syndrome, endocarditis and acute myocarditis / / Eur. Heart J .—1987 .—8.—P. 2 3 7 — 2 3 8 . 8. Бобык В. И., Веберов А. В., Рябенко Д. В. и др. Очистка тканеспецифических антигенов из нормального миокарда и миокарда пациентов с дилятационной кардиомиопатией / / Биополимеры и клетка.—1993.—9, № 6 .—С. 61—64. 9. Sidorik L L., Rodnin N. У., Bobyk У. I. et al. Investigation of autoantibodies directed against tissue-specific myocardial an tigens in dilated cardiomyopathy / / Там ж е . — 1 9 9 5 . — 1 1 , № P. 81—86 . 10. Болгарин P. И., Роднин И. В., Сидорик Л. Л. Изучение аутоантител к триптофанил-тРНК синтетазе при систем ных аутоиммунных заболеваниях / / Молекуляр. биоло гия.—1998.—№ 3 . — С . 11. Khanna А. К, Nomura У., Fischetti У. A., Zabriskie J. В. Antibodies in the sera of acute rheumatic fever patients bind to human cardiac tropomyosin / / J . Autoimmun.—1997.—10.— P. 99—106 . 12. Liao L., Sindhwari R.f Rojkind M. et al. Antibody-mediated autoimmune myocarditis depends on genetically determined target organ sensitivity / / J. Exp. Med .—1995 .—181 .— P. 1123—1131 . 13. Kaplan M. H.f Svec M. H. Immunologic relation of streptococ cal and tissue antigens. III. Presence in human sera of streptococcal antibody cross-reactive with heart tissue. Associa tion with streptococcal infection, rheumatic fever, and glome rulonephritis / / Ib id .—1964 .—119 .—P. 651—666 . 14. Muthuchamy M.f Grupp J. L., Grupp G. et al. Molecular and physiological effects of overexpressing striated muscle ^-tropo myosin in the adult murine heart / / J. Biol. Chem.—1995.— 270 , N 5 1 . — P . 3 0 5 9 3 — 3 0 6 0 2 . 15. Ross R. S., Bulkley В. H., Hutchins G. M. et al. Idiopathic familial myocardiopathy in three generations: a clinical and pathological study / / Amer. Heart J .—1978 .—96 .—P. 170— 178. 16. Mestroni JL, Miani D., DiLenarda A. et al. Clinical and pathologic study of familial dilated cardiomyopathy / / Amer. J. Cardiol .—1990.—65.—P. 1449—1453 . 17. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of 208 С Т Р У К Т У Р Н О - Ф У Н К Ш О Н А Л Ь Н О Е И З У Ч Е Н И Е Т Р О П О М И О З И Н А protein binding / / Anal. Biochem.—1976.—86, N 1 .— P. 193—200. 18. Laemmli U. JC Cleavage of structural proteins during the: assembly of the bacteriophage T4 / / Nature.—1970.—227, N 52 .—P. 680—685 . 19. Mische S., Manjula B. N.f Fischetti V. A. Relationship of Streptococcal M protein with human and rabbit tropomyosin; the complete amino acid sequence of human cardiac alpha tropomyosin, a highly conserved contractile protein / / Bio chem. and Biophys. Res. Communs.—1987.—142.—P. 8 1 3 — 818. 20. Matsiota P., Druet P., Dosquet P. et al Natural autoantibodies in systemic lupus erythematosus / / Clin. Exp. Immunol.— 1987 .—69.—P. 7 9 — 8 8 . 21. Ternynck 7., Bleux C, Gregoire /. et al Comparison between autoantibodies arising during Trypanosoma cruzi infection in mice and natural autoantibodies / / J. Immunol.—1990.—144. N 4 .—P. 1504—1511. 22. Fiorito S., Autore C, Fragola P. V. et al HLA-DRs antigen linkage in patients with hypertrophyc obstructive car diomyopathy / / Amer. Heart J . — 1 9 8 6 . — I l l — P . 91—94 . 23. Kaplan M. H.t Freugley J. D. Autoimmunity to the heart in cardiac disease. Current concepts of the relation of autoim munity to rheumatic fever, postcardiotomy and post-infarction syndromes and cardiomyopathies / / Amer. J. Cardiol.— 1969 .—24 .—P. 4 5 9 — 4 7 3 . 24. Zabriskie /. B. Rheumatic Fever: the interplay between host, genetics, and microbe. Levis and Conner Memorial Lecture / / Circulation.—1985.—71.—P. 1077—1086 . 25. Fenderson P. C, Fischetti V. A., Cunningham M. W. Tropo myosins shares immunologic epitopes with group A streptococ cal M proteins / / J. Immunol .—1989.—142.—P. 2475—2481 . 26. Avrameas S. Natural autoantibodies: from «Ііоггог autotoxicus* to «gnothi seaution* / / Immunol. Today .—1991 .—12.—P. 154—159. 27. Movsesian M. A., Bristow M. R., Krall J. C a 2 + uptake by cardiac sarcoplasmic reticulum from patients with idiopathic d i la ted c a r d i o m y o p a t h y / / Circ . R e s . — 1 9 8 9 . — 6 5 . — P. 1141 — 1144. Поступила в редакцию 24.02.98 209

Структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилятационной кардиомиопатии

Репозитарії

Схожі ресурси