Формамид и глицерин в секвенировании GC-богатой ДНК

Формамид и глицерин в секвенировании GC-богатой ДНК

Известно, что формамид и глицерин повышают качество секвенирования. В данной работе проведено сравнение влияния различных концентраций формамида и глицерина на секвенирование ОС-богатой матрицы и показано, что наиболее еффективным является добавление к реакционной смеси 5 % формамида или 7,5–10 % гл...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Datum:2001
Hauptverfasser: Кваша, С.М., Забаровский, Е.Р., Кашуба, В.И., Рындич, А.В.
Format: Artikel
Sprache:Russian
Veröffentlicht: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2001
Schriftenreihe:Біополімери і клітина
Schlagworte:
Короткі повідомлення
Online Zugang:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155538
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Формамид и глицерин в секвенировании GC-богатой ДНК / С.М. Кваша, Е.Р. Забаровский, В.И. Кашуба, А.В. Рындич // Біополімери і клітина. — 2001. — Т. 17, № 3. — С. 253-255. — Бібліогр.: 6 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-155538
record_format dspace
spelling irk-123456789-1555382019-07-05T23:31:56Z Формамид и глицерин в секвенировании GC-богатой ДНК Кваша, С.М. Забаровский, Е.Р. Кашуба, В.И. Рындич, А.В. Короткі повідомлення Известно, что формамид и глицерин повышают качество секвенирования. В данной работе проведено сравнение влияния различных концентраций формамида и глицерина на секвенирование ОС-богатой матрицы и показано, что наиболее еффективным является добавление к реакционной смеси 5 % формамида или 7,5–10 % глицерина. Відомо, що формамід та гліцерин підвищують ефективність секвенування. В даній роботі порівняно вплив різних концентрацій формаміду та гліцерину на секвенування GC-багатих матриць і показано, що найефективнішим є додавання до реакційної суміші 5 % формаміду або 7,5–10 % гліцерину. Formamide and glycerol are known to increase the sequencing efficiency. We compared the ability of different concentration of these co-solvents to improve the sequencing results of GC-rich template. Herein, we report that addition of 5 % formamide and 7.5–10 % glycerol is the most effective for sequencing GC-rich templates. 2001 Article Формамид и глицерин в секвенировании GC-богатой ДНК / С.М. Кваша, Е.Р. Забаровский, В.И. Кашуба, А.В. Рындич // Біополімери і клітина. — 2001. — Т. 17, № 3. — С. 253-255. — Бібліогр.: 6 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0005B5 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155538 577.113.5 ru Біополімери і клітина Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
topic Короткі повідомлення
Короткі повідомлення
spellingShingle Короткі повідомлення
Короткі повідомлення
Кваша, С.М.
Забаровский, Е.Р.
Кашуба, В.И.
Рындич, А.В.
Формамид и глицерин в секвенировании GC-богатой ДНК
Біополімери і клітина
description Известно, что формамид и глицерин повышают качество секвенирования. В данной работе проведено сравнение влияния различных концентраций формамида и глицерина на секвенирование ОС-богатой матрицы и показано, что наиболее еффективным является добавление к реакционной смеси 5 % формамида или 7,5–10 % глицерина.
format Article
author Кваша, С.М.
Забаровский, Е.Р.
Кашуба, В.И.
Рындич, А.В.
author_facet Кваша, С.М.
Забаровский, Е.Р.
Кашуба, В.И.
Рындич, А.В.
author_sort Кваша, С.М.
title Формамид и глицерин в секвенировании GC-богатой ДНК
title_short Формамид и глицерин в секвенировании GC-богатой ДНК
title_full Формамид и глицерин в секвенировании GC-богатой ДНК
title_fullStr Формамид и глицерин в секвенировании GC-богатой ДНК
title_full_unstemmed Формамид и глицерин в секвенировании GC-богатой ДНК
title_sort формамид и глицерин в секвенировании gc-богатой днк
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate 2001
topic_facet Короткі повідомлення
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155538
citation_txt Формамид и глицерин в секвенировании GC-богатой ДНК / С.М. Кваша, Е.Р. Забаровский, В.И. Кашуба, А.В. Рындич // Біополімери і клітина. — 2001. — Т. 17, № 3. — С. 253-255. — Бібліогр.: 6 назв. — рос.
series Біополімери і клітина
work_keys_str_mv AT kvašasm formamidiglicerinvsekvenirovaniigcbogatojdnk
AT zabarovskijer formamidiglicerinvsekvenirovaniigcbogatojdnk
AT kašubavi formamidiglicerinvsekvenirovaniigcbogatojdnk
AT ryndičav formamidiglicerinvsekvenirovaniigcbogatojdnk
first_indexed 2025-07-14T07:45:23Z
last_indexed 2025-07-14T07:45:23Z
_version_ 1837607549612851200
fulltext ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2001. Т. 17. № З Формамид и глицерин в секвенировании GC-богатой ДНК С. Μ. Кваша1, 2, Ε. Р. Забаровский2, 3, 4, В. И. Кашуба1, 2, 3, А. В. Рындич1 * Институт молекулярной биологии и генетики HAH Украины Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143, Украина Е. mail: kvashasergei@usa.net 2 Центр геномных исследований, Каролинский институт Стокгольм, 17177, Швеция 3 Микробиологический и опухолевый центр, Каролинский институт Стокгольм, 17177, Швеция 4 Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Ул. Вавилова, 32, 117984, Москва, Россия Известно, что формамид и глицерин повышают качество секвенирования. В данной работе проведено сравнение влияния различных концентраций формамида и глицерина на секвенирование ОС-богатой матрицы и показано, что наиболее еффективным является добавление к реакционной смеси 5 % формамида или 7,5—10 % глицерина. 5'-Нетранслируемые области факторов роста, транскрипционных факторов, компонентов сигна- льной трансдукции имеют высокий GC-состав [1 ]. В то же время секвенирование GC-богатой ДНК связано с определенными трудностями из-за высо- кой температуры ее плавления. GC-богатые обла- сти ДНК могут образовывать вторичные стуктуры, затрудняющие на определенных стадиях прохожде- ние полимеразной реакции, в частности, при дена- турации матрицы, отжиге праймеров, синтезе нук- летидной цепи полимеразой [2 ]. В предыдущих сообщениях було показано, что добавление к реакционной смеси таких реагентов, как формамид и глицерин, улучшает качество секвенирования GC-богатой ДНК. Но при этом отсутствовало сравнение влияния различных кон- центраций формамида и глицерина на этот про- цесс. Поэтому целью наших экспериментов было определение оптимальной концентрации формами- да и глицерина для эффективного секвенирования GC-богатой ДНК. © С. М. КВАША, Е. Р. ЗАБАРОВСКИЙ, В. И. КАШУБА, А. В. РЫНДИЧ, 2001 В качестве матрицы для секвенирования был использован 5'-конец (1—2031 п. н.) гена калиево- го канала человека Kvl.7 (регистрационный номер в GenBank AJ310479), содержащего 78,6 % гуани- новых и цитозиновых нуклеотидов. Секвенирование осуществляли с помощью ABI PrismRBig Dye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA) на секвенаторе ABI 310 (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA), согласно протоколу изготовителя. Предварительные эксперименты показали, что секвенирование 5'-конца гена калиевого канала человека Kv 1.7 без добавления формамида и глице- рина было неэффективным (150 п. н.). Не наблюдалось улучшений в эффективности секвенирования после денатурации ДНК при помо- щи NaOH [3 ] или после прогрева ДНК при 94 °С на протяжении 5 мин перед полимеразной реак- цией. Повышение температуры денатурации до 96 °С также не оказало никакого влияния на каче- ство секвенирования. Сан и др. [4 ] предположили, что быстрая ренатурация матрицы из-за высокого GC-состава может препятствовать амплификации ДНК, что 253 mailto:kvashasergei@usa.net КВАША С Μ. И ДР. приводит к низкой эффективности секвенирования. Поэтому были проведены реакции секвенирования с добавлением формамида и глицерина в различ- ных концентрациях. В предыдущих сообщениях было показано, что добавление к реакционной смеси 10 % формамида значительно повышает эффективность секвениро- вания [5, 6]. Присутствие формамида в реакционной смеси в низких концентрациях (1,25 и 2,5 %) позволило незначительно повысить эффективность секвениро- вания 5'-конца гена калиевого канала человека Kvl.7 (280 и 310 п. н. соответственно). Присутст- вие же формамида в концентрации 5 % повысило эффективность этого процесса до 400 п. н. Даль- нейшее увеличение концентрации формамида (7,5 и 10 %) привело к значительному снижению эф- фективности секвенирования (170 и 80 п. н. соот- ветственно). Концентрация формамида 15 % в реакционной смеси полностью ингибировала реак- цию (рисунок). Таким образом, присутствие в реакционной смеси 5 % формамида является наиболее эффек- тивным для секвенирования 5'-конца гена калиево- го канала человека К ν 1.7, а не 10 %, как было описано для секвенирования гена р53 [5]. Это можно объяснить использованием в полимеразных реакциях различных ферментов. Также нужно от- метить тот факт, что в секвенировании гена р53 была использована лишь одна концентрация фор- мамида (10 %) и не была проведена проверка различных концентраций формамида для выбора оптимальной. Присутствие глицерина в реакционной смеси в низких концентрациях (1,25 и 2,5 %) привело к возрастанию эффективности этого процесса (250 и 300 п. н. соответственно). Концентрация глицерина 5 % в реакционной смеси повысила эффективность секвенирования лишь до 330 п. н. Одинаковое влияние на секвенирование имело присутствие в реакционной смеси 7,5 и 10 % глицерина (450 п. н.). Повышение концентрации глицерина до 15 % привело к снижению эффективности секвенирова- ния (360 п. н.) (рисунок). Таким образом, присутствие в реакционной смеси 7,5—10 % глицерина является оптимальной концентрацией для секвенирования 5'-конца гена калиевого канала человека Kvl.7. Эффект формамида может объясняться полной денатурацией GC-богатой ДНК и предотвращением ренатурации одноцепочечных молекул ДНК. В то же время формамид понижает устойчивость фер- мента к высокой температуре. Поэтому 5 %-я концентрация фармамида является оптимальной Влияние различных концентраций формамида (I) и глицерина (2) на эффективность секвенирования для секвенирования GC-богатой матрицы. Даль- нейшее увеличение его концентрации приводит к уменьшению эффективности секвенирования. Предотвращение ренатурации одноцепочечных молекул ДНК и повышение устойчивости фермен- та к высокой температуре может объяснить эффект глицерина. Присутствие 7,5—10 % глицерина в реакционной смеси является оптимальной концен- трацией для секвенирования GC-богатой матрицы. Однако увеличение его концентрации до 15 % вызывает падение эффективности секвенирования. Возможно, глицерин в концентрации выше 10 % ингибирует активность ферментов. В заключение следует отметить, что в наших экспериментах показано влияние различных кон- центраций формамида и глицерина на эффектив- ность секвенирования GC-богатой ДНК. Наилуч- шие результаты были получены при добавлении к реакционной смеси 5 % формамида или 7,5—-10 % глицерина. S. М. Kvashaf Е. R. Zabarovskyy V. L Kashubaf А. V. Rynditch Formamide and glycerol in sequencing of GC-rich DNA Summary Formamide and glycerol are known to increase the sequencing efficiency. We compared the ability of different concentration of these co-solvents to improve the sequencing results of GC-rich template. Herein, we report that addition of 5 % formamide and 7.5—10 % glycerol is the most effective for sequencing GC-rich templates. 254 ФОРМАМИД И ГЛИЦЕРИН В СЕКВЕНИРОВАНИИ GC-БОГАТОЙ ДНК С. М. Кваша, Є. P. Забаровський, В. I. Кашуба, А. В. Риндич Формамід і гліцерин у секвенуванні GC-багатої ДНК Резюме Відомо, що формамід та гліцерин підвищують ефективність секвенування. В даній роботі порівняно вплив різних концент- рацій формаміду та гліцерину на секвенування GC-багатих матриць і показано, що найефективнішим є додавання до реакційної суміші 5 % формаміду або 7,5—10 % гліцерину. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Kozak Μ. An analysis of vertebrate mRNA sequences: intima- tions of translations control / / J. Cell Biol.—1991.—115, N 4.—P. 887—903. 2. Hengen P. N. Cycle sequencing through GC-rich regions / / Trends Biochem. Sci.-1996.—21, N 1.—P. 33—34. 3. Agarwal R. K, Perl A. PCR amplification of highly GC-rich DNA template after denaturation by NaOH 11 Nucl. Acids Res.—1993.—21, N 22.—P. 5283—5284. 4. Sun Y., Hegamyer G., Colburn N. Я. PCR-direct sequencing of a GC-rich region by inclusion of 10% DMSO: application to mouse c-jun / / Biotechniques.—1993.—15, N 3.—P. 372— 374. 5. Zhang W., Reading C., Deisseroth A. B. Effect of nucleotide concentration on specificity of sequence amplification / / Trends Genet.—1992.—8, N 10.—P. 332. 6. Zhang W., Hu G., Deisseroth A. Improvement of PCR sequencing by formamide / / Nucl. Acids Res.—1991.—19, N 23.—P. 6649. УДК 577.113.5 Надійшла до редакції 22.01.2001 255

Ähnliche Einträge