Дослідження експресії гена екзопектатліази реІХ Klebsiella oxytoca VN13

Методом хроматографії на папері встановлено, що пектатліаза PeІХ K. охуіоса VN13 за субстратною специфічністю належить до екзопектатліаз. Для аналізу експреси рейс гена створено гібридну конструкцію, яка містить регуляторну ділянку реІХ та кодуючу частину гена β-галактозидази ІасХ. За характером екс...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2005
Hauptverfasser:	Лар, О.В., Ковтунович, Г.Л., Козировська, Н.О.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2005
Schriftenreihe:	Біополімери і клітина
Schlagworte:	Молекулярна та клітинна біотехнології
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155602
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Дослідження експресії гена екзопектатліази реІХ Klebsiella oxytoca VN13 / О.В. Лар, Г.Л. Ковтунович, Н.О. Козировська // Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, № 3. — С. 264-269. — Бібліогр.: 15 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-155602
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1556022019-06-18T01:27:03Z Дослідження експресії гена екзопектатліази реІХ Klebsiella oxytoca VN13 Лар, О.В. Ковтунович, Г.Л. Козировська, Н.О. Молекулярна та клітинна біотехнології Методом хроматографії на папері встановлено, що пектатліаза PeІХ K. охуіоса VN13 за субстратною специфічністю належить до екзопектатліаз. Для аналізу експреси рейс гена створено гібридну конструкцію, яка містить регуляторну ділянку реІХ та кодуючу частину гена β-галактозидази ІасХ. За характером експресії β-галактозидази в K. охуіоса VN13, трансформованої даною конструкцією, виявлено високий конститутивний рівень експресії ІасZ гена з реІХ промотору, а також його слабку здатність до активації за присутності індукторів рослинного походження. Отримано також дані стосовно регуляції експресії генів пектинолізису K. охуіоса VN13 рослинними продуктами, що дозволяє цій бактерії утворювати з вищими рослинами стійкі асоціації. Методом хроматографии на бумаге установлено, что пектатлиаза PelX Klebsiella oxytoca VN13 по субстратной специфичности относится к экзопектатлиазам. Для анализа экспрессии pelX гена создана гибридная конструкция, содержащая регуляторную область pelX и кодирующую часть гена (β-галактозидазы lacZ. По характеру экспрессии β-галактозидазы в K. oxytoca VN13, трансформированной данной конструкцией, определен высокий конститутивный уровень экспрессии lacZ гена с pelX промотора, а также его слабая индуцибельность в присутствии индукторов растительного происхождения. Получены данные о регуляции экспрессии генов K. oxytoca VN13 растительными продуктами, что позволяет этой бактерии создавать с высшими растениями стойкие ассоциации симбиотического характера. The belonging of the pectate lyase pelX of K. oxytoca VN13 to the exopectinase group was shown by paper chromatography. For an analysis of the pelX expression, fusion of the regulatory region of pelX and the coding part of reporter gene lacZ was constructed. The high constitutive level of the pelX expression and its slight inducibility in the presence of plant inducers was determined by the character of the fusion expression in K. oxytoca VN13. The data on regulation of the expression of pectinolytic genes of K. oxytoca VN13 by plant products were obtained. 2005 Article Дослідження експресії гена екзопектатліази реІХ Klebsiella oxytoca VN13 / О.В. Лар, Г.Л. Ковтунович, Н.О. Козировська // Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, № 3. — С. 264-269. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0006F0 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155602 577.113.5 ru Біополімери і клітина Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Молекулярна та клітинна біотехнології Молекулярна та клітинна біотехнології
spellingShingle	Молекулярна та клітинна біотехнології Молекулярна та клітинна біотехнології Лар, О.В. Ковтунович, Г.Л. Козировська, Н.О. Дослідження експресії гена екзопектатліази реІХ Klebsiella oxytoca VN13 Біополімери і клітина
description	Методом хроматографії на папері встановлено, що пектатліаза PeІХ K. охуіоса VN13 за субстратною специфічністю належить до екзопектатліаз. Для аналізу експреси рейс гена створено гібридну конструкцію, яка містить регуляторну ділянку реІХ та кодуючу частину гена β-галактозидази ІасХ. За характером експресії β-галактозидази в K. охуіоса VN13, трансформованої даною конструкцією, виявлено високий конститутивний рівень експресії ІасZ гена з реІХ промотору, а також його слабку здатність до активації за присутності індукторів рослинного походження. Отримано також дані стосовно регуляції експресії генів пектинолізису K. охуіоса VN13 рослинними продуктами, що дозволяє цій бактерії утворювати з вищими рослинами стійкі асоціації.
format	Article
author	Лар, О.В. Ковтунович, Г.Л. Козировська, Н.О.
author_facet	Лар, О.В. Ковтунович, Г.Л. Козировська, Н.О.
author_sort	Лар, О.В.
title	Дослідження експресії гена екзопектатліази реІХ Klebsiella oxytoca VN13
title_short	Дослідження експресії гена екзопектатліази реІХ Klebsiella oxytoca VN13
title_full	Дослідження експресії гена екзопектатліази реІХ Klebsiella oxytoca VN13
title_fullStr	Дослідження експресії гена екзопектатліази реІХ Klebsiella oxytoca VN13
title_full_unstemmed	Дослідження експресії гена екзопектатліази реІХ Klebsiella oxytoca VN13
title_sort	дослідження експресії гена екзопектатліази реіх klebsiella oxytoca vn13
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2005
topic_facet	Молекулярна та клітинна біотехнології
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155602
citation_txt	Дослідження експресії гена екзопектатліази реІХ Klebsiella oxytoca VN13 / О.В. Лар, Г.Л. Ковтунович, Н.О. Козировська // Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, № 3. — С. 264-269. — Бібліогр.: 15 назв. — укр.
series	Біополімери і клітина
work_keys_str_mv	AT larov doslídžennâekspresíígenaekzopektatlíazireíhklebsiellaoxytocavn13 AT kovtunovičgl doslídžennâekspresíígenaekzopektatlíazireíhklebsiellaoxytocavn13 AT kozirovsʹkano doslídžennâekspresíígenaekzopektatlíazireíhklebsiellaoxytocavn13
first_indexed	2025-07-14T07:48:27Z
last_indexed	2025-07-14T07:48:27Z
_version_	1837607743213535232
fulltext	ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2005. Т. 21. № З МОЛЕКУЛЯРНА І КЛІТИННА БІОТЕХНОЛОГІЇ Дослідження експресії гена екзопектатліази реІХ Klebsiella oxytoca VN13 О. В. Лар, Г. Л. Ковтунович, Н. О. Козировська Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, 03143, Україна Методом хроматографії на папері встановлено, що пектатліаза РеІХ К охуіоса ¥N13 за субстратною специфічністю належить до екзопектатліаз. Для аналізу експреси рейс гена створено гібридну конструкцію, яка містить регуляторну ділянку реІХ та кодуючу частину гена Р-галактозидази ІасХ. За характером експресії р~-галактозидази в К. охуЮса ¥N13, трансформова ної даною конструкцією, виявлено високий конститутивний рівень експресії ІасХ гена з реІХ промотору, а також його слабку здатність до активації за присутності індукторів рослинного походження. Отримано також дані стосовно регуляції експресії генів пектинолізису К. охуіоса ¥N13 рослинними продуктами, що дозволяє цій бактерії утворювати з вищими рослинами стійкі асоціації. Ключові слова- Klebsiella oxytoca ¥N13, екзопектатліаза, ген реІХ. Вступ. Пошук генетичних детермінант пектолі- тичної активності ендофітної бактерії К. охуіоса УШЗ як можливих факторів її вірулентності дозво лив встановити наявність у даної бактерії при наймні двох типів пектолітичних ферментів — пек- татліази і полігалактуронази [1 ]. Клонування реїХ гена К. охуіоса УШЗ, який кодує пектатліазу [2], і створення мутантного штаму з інактивованою хромосомною копією реІХ дозволило ідентифіку вати присутність у геномі К. охуіоса УШЗ додат кового пектатліазного гена, що не має гомології з реІХ геном за нуклеотидною послідовністю. Дану роботу присвячено дослідженню характе ру експресії реІХ гена порівняно з загальною пек татліазного активністю К. охуіоса УШЗ для визна чення можливої ролі продукту гена реІХ у процесі взаємодії К. охуіоса УШЗ з рослиною. Матеріали і методи. Бактеріальні штами і плазміди, які використано в роботі, наведено в табл. 1. © 0 . В. ЛАР, Г. Л. КОВТУНОВИЧ, Н. О. КОЗИРОВСЬКА, 2005 Бактеріальні середовища і умови вирощуван ня. Для вирощування бактерій застосовували сере довище ЬВ і мінімальне середовище М9 [6]. Ан тибіотики ампіцилін і рифампіцин використовува ли в концентрації 100 мкг/мл, канаміцин — 50 мкг/мл, хлорамфенікол — 60 мкг/мл. Генно-інженерні методи. Виділення плазмід і хромосомної ДНК, гідроліз ендонуклеазами ре стрикції, лігування, гель-електрофорез та елюцію ДНК з гелю здійснювали за стандартними методи ками [7]. Для отримання компетентних клітин бактерій і трансформації користувалися методом Нішімури [8]. Біохімічне визначення пектатліазної та р-га- лактозидазної активності. Загальну пектатліазну активність у лізатах бактеріальних культур знахо дили за методом, що базується на спектрофотомет ричному моніторингу вивільнення ненасичених продуктів з полігалактуронату натрію, які мають максимум поглинання при 235 нм [9 ]. За одиницю активності брали кількість ферменту, що вивільняє 1 мкмоль ненасичених уронідів з полігалактуро нату за 1 хв. 264 ЕКСПРЕСІЯ ГЕНА ПЕКТАТЛІАЗИ реІХ KLEBSIELLA OXYTOCA V N I 3 /Ї-Галактозидазну активність у лізатах бак теріальних культур вимірювали, використовуючи методику, яка грунтується на спектрофотометрич ному моніторингу вивільнення забарвленого про дукту (о-нітрофенолу) з безбарвного о-нітрофеніл- /ї-а-галактопіранозиду (ОНПГ) з максимумом по глинання при 420 нм [6]. За одиницю активності брали кількість ферменту, яка вивільняє 1 мкмоль о-нітрофенолу за 1 хв. Питому активність ферментів виявляли, пе рераховуючи загальну активність ферменту на 1 мл бактеріальних лізатів, вирівняних за оптич ною густиною. Отримані результати обробляли статистично за допомогою програми SigmaPlot. Вибірка складала не менш ніж чотири повторності. Хроматографія на папері. Хроматографію на папері здійснювали за методикою Цинка [10]. Як контроль при проведенні хроматографії використо вували продукти реакції, що утворювалися при дії ендополігалактуронази (3.2.1.15) з Rhizopus sp. («Sigma», США). Реакцію з полігалактуроназою проводили за методикою Насуно [11]. Рослинний екстракт виготовляли, розтираючи в ступці 1 г сирої маси корінців двотижневих паростків пшениці з додаванням 1 мл дистильова ної води. Отриманий екстракт стерилізували філь труванням. Даний розчин вважали за 100 %. Результати і обговорення. Встановлення суб стратно! специфічності РеІХ. Для визначення субстратної специфічності ферменту, який коду ється клонованим нами реІХ геном К. oxytoca VN13 [1 ], проведено хроматографічний аналіз продуктів, що утворюються при дії РеІХ на полігалактуронат натрію (ПГН). Використовували лізати нічних культур бактерій Escherichia coli, трансформованих плазмідою pPLll, що містить повну послідовність реІХ гена [2 ]. До реакційної суміші додавали бак теріальний лізат у співвідношенні 1:9, 1:19, 1:39 для того, щоб прослідкувати динаміку утворення продуктів реакції. Для порівняння проводили ре акцію з комерційною ендополігалактуроназою з Rhizopus sp. (КФ 3.2.1.15), додаючи до реакційної суміші водний розчин полігалактуронази в концен трації 0,5; 0,125; 0,3 і 0,08 мг/мл. Після інкубації при температурі 37 °С протягом 12 год суміш краплями наносили на хроматографічний папір (рис. 1). З даних рис. 1 видно, що при поступовому зменшенні концентрації ПГН у реакційній суміші характер продуктів, які утворює РеІХ, не зміню ється, що свідчить про екзосубстратну специфіч ність згаданого ферменту. Продуктом реакції в цьому разі є лише димери галактуронової кислоти з ненасиченим 4,5-зв'язком на невідновлюваль- ному кінці. У той же час ендополігалактуроназа при дії на той самий субстрат розщеплює його до олігомерних продуктів, розмір яких поступово зменшується за рахунок подальшого розщеплення. Кінцевим продуктом є димери галактуронової кис лоти. Рис. 1. Субстратна специфічність РеІХ К. охуіоса У М 3, визна чена методом хроматографії на папері: 1—4 — розведення ре акційної суміші з полігалактуроназою; 5 — моногалактуронат; 6 — реакційна суміш без додавання бактеріального лізату; 7— 9 — розведення реакційної суміші з пектатліазою. Продукт у точці старту — полігалактуронат натрію (ПГН); МГН — м о н о галактуронат натрію; ДГН — дигалактуронат натрію 265 ЛАР О. В., КОВТУНОВИЧ Г. Л., КОЗИРОВСЬКА н. о. Перевірка експресії гена lacZ, який міститься у плазміді рСВ192.. Вектор рСВ192 використовува ли для створення гібридної конструкції, до складу якої входить lacZ ген під реІХ промотором (рис. 2, а). Даний вектор дозволяє експресію lacZ гена за умови наявності промотору перед його кодуючою послідовністю. Три стоп-кодони TAG, TAG і ТАА, а також сайт зв'язування з рибосомою розташовані таким чином, що дозволяють трансляцію негіб- ридного \zxfL навіть при умові клонування вище lacZ промоторної ділянки досліджуваного гена ра зом з частиною його кодуючої послідовності. Для перевірки /?-галактозидазної активності, що кодується ІасХ геном у складі плазміди рСВІ92, створено гібридну конструкцію, яка містить зазна чений Іасг ген під Р, а с промотором у складі вектора 266 file:///zxfL ЕКСПРЕСІЯ ГЕНА ПЕКТАТЛМЗИ pelX KLEBSIELLA OXYTOCA VN ІЗ Таблиця 2 ß-Галактозидазна активність Е. coli JM109 з плазмідами pGalQ та рСВ192 pDK5 (рис. 2, а). На даному векторі розташований промотор Р и с та сильний гтпВ термінатор транс крипції. Вектор дозволяє експресію клонованого під Р,1 С промотор гена, який має власний сайт зв'язу вання з рибосомою і старт-кодон. Pstl фрагмент рСВ192, що містить повну послі довність lacZ, елюювали з агарозного гелю та клонували у вектор pDK5, гідролізований Pstl. Отриманою лігазною сумішшю трансформували компетентні клітини Е. coli JM109. Бактерії висі вали на середовище з ампіциліном, X-Gal та ізо- пропілтіогалактозидом (ІПТГ). Робоча концентра ція ІПТГ у даному разі складала 1 мМ, що дозво ляє зняти репресію Р, а с промотору. Цей промотор містить у своїй послідовності оператор для зв'язу вання Lacl-penpecopa і за відсутності ІПТГ є заре- пресованим, оскільки lad ген, який кодує Lad, знаходиться в складі плазміди pDK5, що гарантує репресію Р, а с у мультикопійному векторі. Відібрано два клони трансформантів, які утво рювали голубі колонії на середовищі з X-Gal та ІПТГ, що свідчить про продукування /?-галактози- дази даними клонами. Оскільки клітини Е. coli JM109, трансформовані плазмідою pDK5, не утво рюють забарвлених колоній в аналогічних умовах, то можна стверджувати, що /5-галактозидаза у даному випадку продукується створеною гібридною конструкцією на плазміді pGalQ. Рестрикційний аналіз підтвердив ідентичність одержаної конст рукції очікуваній (даних не наведено). Конструкцію pGalQ біохімічним методом пе ревірено на наявність /?-галактозидазної активності порівняно з вихідною плазмідою рСВ192. Результа ти дослідження наведено в табл. 2. Отримані дані дозволяють зробити висновок про те, що ген lacZ, який міститься в плазміді рСВ192, є функціональним. Створення гібридної конструкції, яка міс тить регуляторну ділянку реІХ і кодуючу частину гена /?-галактозидази lacZ. Для одержання даної конструкції використано плазміду рСВ192. Уні кальні і БтаІ сайти знаходяться в полілінкері рСВ192 на відстані 48 нуклеотидних пар (н. п.) один від одного, що дозволяє здійснити ефективний подвійний гідроліз плазміди рестриктазами Ряґ/ і БтаІ. Джерелом промоторної частини реІХ була плазміда рЬС28Р, яка містить фрагмент хромосом ної ДНК К. охуіоса ¥N13 з повною послідовністю реІХ гена та прилеглих некодуючих ділянок [1 ]. рЬС28Р гідролізували рестриктазами Ря/ і БтаІ, в результаті чого отримано фрагмент розміром 700 н. п., який включав ділянку розміром 608 н. п. вище старт-кодону реІХ та 92 н. п. його кодуючої части ни (рис. 2, б). Серед отриманих клонів трансфор мантів виявлено два, які давали голубе забарвлен ня колоній на Х-Оаі. Обидва позитивних клони було перевірено рестриктним аналізом та підтверд жено їхню ідентичність, а також відповідність от риманої конструкції очікуваній. Подальшу роботу проводили з одним клоном. Створена конструкція отримала назву рваІР. Вивчення характеру експресії реІХ. Конструк цію рйаІР використано для вивчення характеру експресії реІХ гена, який визначали за рівнем /?-галактозидазної активності, при додаванні до се редовища для росту бактерій індукторів. Особливу увагу було приділено двом індукторам — ПГН, продукти розщеплення якого відомі як індуктори експресії пектиназних генів фітопатогенних бак терій роду Егтпіа, та рослинному екстракту, що може містити у своєму складі низькомолекулярні індуктори і також відомий як індуктор експресії пектиназних гешв Е. спгуьапіпеті та Е. сагоіочога. Для проведення цього дослідження К. охуіоса УШЗ трансформували рСаІР. Відомо, що К. оху іоса ¥N13 має свою власну /?-галактозидазу, тому загальна /3-галактозидазна активність К. охуіоса УШЗ, трансформована рЄаІР, буде складатися з власної /ї-галактозидазної активності та активності /?-галактозидази, яка кодується створеною нами гібридною конструкцією. Враховуючи цей факт, як контроль при проведенні дослідження використову вали К. охуіоса УШЗ, трансформовану рСВ192. Активність промотору гена реІХ досліджували в логарифмічній фазі росту бактеріальної культури. Отримані результати представлено діаграмами на рис. 3. У дев'ять разів вищий базовий рівень /3-галак- тозидазної активності в Е. соїі (27,55 од.) у порів нянні з експресією даного злиття в К. охуіоса 267 ЛАР О. В., КОВТУНОВИЧ Г. Л., КОЗИРОВСЬКА н. о . и.мкМ'хе'ш1 U, мкМхв'мл* 30- 25- 20- 15- / О - и.мкМхв -мл 1 4 Рис. 3. /?-Галактозидазна активність Е. coli JM109 і К. oxytoca VN13, трансформованих pGalP, та загальна пектатліазна активність К. oxytoca VN 13: а — /3-галактозидазна активність Е. coli JM109 (pGalP); б — /J-галактозидазна активність К oxytoca VN 13 (pGalP); в — загальна пектатліазна активність К oxytoca VN13 (1—гліцерин; 2—полігалактуронат натрію; 3—рослинний екстракт; 4—глю коза) (1,71 од.) свідчить про зарепресованість гена реІХ в К. охуіоса при відсутності індукції. Оскільки субстрат не в повній мірі знімає репресію вказаного гена в К. охуіоса УШЗ, можна припустити існу вання додаткового негативного регулятора його ак тивності. Додавання глюкози за наявності в середовищі гліцерину як доступного джерела вуглецю призво дить до дворазового зниження активності /?-галак- тозидази в К. охуіоса. УШЗ з 1,71 до 0,79 од., однак наявності в регуляторній ділянці реІХ гена оператора для БАК не було виявлено. Полігалактуронат, який додавали до середови ща, спричинив дворазове збільшення активності /?-галактозидази в К, охугоса ¥N13 (з 1,71 до 3,97 од.), у той час як загальна пектатліазна ак тивність цієї бактерії зросла у 8,5 разу (з 0,008 до 0,068 од.). Звертає увагу той факт, що оскільки полігалактуронат є складовою частиною клітинної стінки рослин, то така незначна індукованість екс пресії реІХ у даних умовах може засвідчувати відсутність будь-якої ролі цього ферменту К. оху- іоса в процесі внутрішньої колонізації рослин. На користь такого припущення свідчать також отри мані нами раніше дані [12] стосовно того, що екзопектинази непатогенних бактерій, зокрема, ек- зополігалактуроназа К. охуїоса УШЗ не беруть участі в процесі внутрішньої колонізації рослинних тканин цією бактерією. За даними літератури, екзопектинази фітопатогенних бактерій роду Erwi- піа залучені до процесу індукції захисної відповіді рослини [13, 14]. Рослинний екстракт, як це видно з діаграм, не впливає на рівень експресії /З-галактозидази ні в Е. coli (27,55 од. на гліцерині та 28 од. при додаванні екстракту), ні в К. oxytoca VN 13 (1,71 та 1,91 од. відповідно). Найцікавішим виглядає той факт, що додавання рослинного екстракту до середовища призводить до зниження в 1,5 разу загальної пек- татліазної активності К. oxytoca VN 13 (0,008 од. на гліцерині та 0,005 од. при додаванні екстракту) на фоні високого рівня індукції ПГН. Цей результат відрізняється від існуючих в літературі даних щодо індукції експресії пектатліазних генів Е. chrysanthe- ті і Е. carotovora, загальна пектатліазна активність яких значно збільшується у присутності рослинно го екстракту [15, 16]. Суттєвий рівень конститутивного синтезу РеІХ та низький рівень індукції реІХ гена при додаванні субстрату може вказувати на роль РеІХ як ініціа тора процесу пектинолізису. Незначна кількість продуктів розщеплення пектину, що утворюється внаслідок конститутивного синтезу РеІХ, перетво рюючись на власне індуктори — 5-кето-4-дезоксиу- ронат, 2,5-дикето-З-дезоксиглюконат та 2-кето-З- дезоксиглюконат — дозволяє зняти репресію інших 268 ЕКСПРЕСІЯ ГЕНА ПЕКТАТЛІАЗИ реІХ KLEBSIELLA OXYTOCA VN13 генів, залучених до процесу деполімеризації клі тинної стінки рослини, що входять до складу KdgR регулону. Пригнічення експресії пектатліазних генів рос линним екстрактом може вказувати на продуку вання рослиною певних речовин, які контролюють пектолітичну активність ендофітної бактерії К. оху- toca. З одного боку, присутність пектину в середо вищі стимулює бактерію до його розщеплення і дозволяє колонізувати рослину, з іншого, — рос линні продукти контролюють підвищення рівня експресії різних генів пектолітичної системи, уни каючи мацерації тканин та підтримуючи чисель ність бактерій в асоціації на сталому рівні. На явність такого механізму дозволила б пояснити, чому навіть при здатності до високого рівня синте зу пектатліаз в умовах повної дерепресії пектиназ- них генів ендофітна бактерія К. oxytoca VN13, на відміну від фітопатогенних бактерій роду Erwinia, не спричинює м'якої гнилі рослин. О. V. Lar, G. L. Kovtunovych, N. О. Kozyrovska Study of exopectate lyase gene of Klebsiella oxytoca VN13 expression Summary The belonging of the pectate lyase pelX of К oxytoca VN13 to the exopectinase group was shown by paper chromatography. For an analysis of the pelX expression, fusion of the regulatory region of pelX and the coding part of reporter gene lacZ was constructed. The high constitutive level of the pelX expression and its slight inducibility in the presence of plant inducers was determined by the character of the fusion expression in К oxytoca VN13. The data on regulation of the expression of pectinolytic genes of К oxytoca VN13 by plant products were obtained. Key words: Klebsiella oxytoca VN13, exopectate lyase, pelX gene. E. В. Лар, Г. Л. Ковтунович, H. А. Козыровская Исследование экспрессии гена экзопектатлиазы pelX Klebsiella oxytoca VN13 Резюме Методом хроматографии на бумаге установлено, что пек- татлиаза PelX Klebsiella oxytoca VN13 по субстратной специ фичности относится к экзопектатлиазам. Для анализа экс прессии pelX гена создана гибридная конструкция, содержащая регуляторную область pelX и кодирующую часть гена (1-галак- тозидазы lacZ. По характеру экспрессии fl-галактозидазы в К oxytoca VN13, трансформированной данной конструкцией, оп ределен высокий конститутивный уровень экспрессии lacZ гена с pelX промотора, а также его слабая индуцибельность в присутствии индукторов растительного происхождения. По лучены данные о регуляции экспрессии генов К. oxytoca VN13 растительными продуктами, что позволяет этой бактерии создавать с высшими растениями стойкие ассоциации симбио- тического характера. Ключевые слова' Klebsiella oxytoca VN13, экзопектатлиаза, ген pelX. ПЕРЕЛІК ЛІТЕРАТУРИ 1. Kovtunovych G., Lar О., V. Kordyum, Kleiner D. Enhancing the internal plant colonization rate with endophytic nitrogen- fixing bacteria / / Biopolimery і kletka.—1999.—15, N 4.— P. 300—306. 2. Лар О. В., Ковтунович Г. Л., Козировська Н. О. Кло- нування і аналіз гена пектатліази pelX Klebsilla oxytoca VN13 / / Біополімери і клітина.—2002.—№ 5.—С. 417— 422. 3. Benes V., Hostomsky Z., Arnold L, Paces V. M13 and pUC vectors with new unique restriction sites for cloning / / Gene.— 1993.—130, N 1.—P. 151—152. 4. ShneiderK, Beck C. High copy number vector for fusion gene expression / / Gene.—1985.—42, N 1.—P. 37—48. 5. Kleiner D., Paul W., Merrick M. Construction of multicopy expression vectors for regulated over-production of proteins in Klebsiella pneumoniae and other enteric bacteria / / J. Gen. Microbiol.—1988.—134.—P. 1779—1784. 6. Miller J. Experiments in molecular genetics.—New York: Cold Spring Harbor Lab. press, 1972.—431 p. 7. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual.—New York: Cold Spring Harbor Lab. press, 1989. 8. Nishimura A., Morita M., Sugino Y. Rapid and highly efficient method for preparation of competent Escherichia coli cells / / Nucl. Acids Res.—1990.—18, N 20—P. 6169. 9. Starr M., Chatterjee A., Starr P., Buhanan G. Enzymatic degradation of polygalacturonic acid by Yersinia and Klebsiella species in relation to clinical laboratory procedures 111. Clin. Microbiol.—1977 —N 6.—P. 379—386. 10. Zink R., Chatterjee A. Cloning and expression in Escherichia coli of pectinase genes of Erwinia carotovora subsp. carotovora II Appl. Environ. Microbiol.—1985.—49, N 3.—P. 714—717. 11. Nasuno S., Starr M. Polygalacturonase of Erwinia carotovora II J. Chem. -1990—41 . -P . 5298-5306. 12. Yanisch-Perron C, Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors / / Gene.—1985.—33, N 1.— P. 103—119. 13. Ковтунович Г. Л., Лар О. В., Козировська Н. О. Роль гена екзополігалактуронази у процесах взаємодії Klebsiella oxy toca VN13 з коренями проростків пшениці / / Біополімери і клітина.—2002.—18, № 4.—С. 319—323. 14. Hugouvieux-Cotte-Pattat N., Condemine G, Nasser W., Re- verchon S. Regulation of pectinolysis in Erwinia chrysanthemi II Annu. Rev. Microbiol.—1996.—50.—P. 213—257. 15. Shevchik V., Kester H., Benen J. Characterisation of the exopolygalacturonat lyase pelX of Erwinia chrysanthemi 3937 / / J. Bacteriol.-1999.-181, N 5.—P. 1652-1663. УДК 577.113.5 Надійшла до редакції 26.06.04 269 http://Bacteriol.-1999.-181

Дослідження експресії гена екзопектатліази реІХ Klebsiella oxytoca VN13

Institution

Ähnliche Einträge