Роль природних ретиноїдів у формуванні серцево-судинної системи птахів

Модель ретиноїдного нокауту використано для перевірки біологічної активності деяких природних ретиноїдів під час ембріонального розвитку серцево-судинної системи. Показано, що all-trans-, 9-cis-, 4-оксо- та дидегідро-ретиноєва кислоти, а також all-trans-ретинол здатні самостійно підтримувати її норм...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2005
Автори:	Костецька, К.В., Костецький, І.Є., Зіле, М.Г.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2005
Назва видання:	Біополімери і клітина
Теми:	Геном та його регуляція
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155606
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Роль природних ретиноїдів у формуванні серцево-судинної системи птахів / К.В. Костецька, І.Є. Костецький, М.Г. Зіле // Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, № 3. — С. 250-257. — Бібліогр.: 31 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-155606
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1556062019-06-18T01:26:33Z Роль природних ретиноїдів у формуванні серцево-судинної системи птахів Костецька, К.В. Костецький, І.Є. Зіле, М.Г. Геном та його регуляція Модель ретиноїдного нокауту використано для перевірки біологічної активності деяких природних ретиноїдів під час ембріонального розвитку серцево-судинної системи. Показано, що all-trans-, 9-cis-, 4-оксо- та дидегідро-ретиноєва кислоти, а також all-trans-ретинол здатні самостійно підтримувати її нормальний розвиток. Дефіцитні за вітаміном А ембріони розвивалися нормально лише за умови, якщо ретоноїди додавали на ранніх етапах ембріогенезу, не пізніше формування п'ятого соміту. Дефіцит вітаміну А протягом ембріонального розвитку суттєво знижує рівень експресії рецептора ретиноєвої кислоти RARβ₂ як у серці, так і в центральній нервовій системі. Всі використані нами ретиоїди індукують експресію RARβ₂ у вітамін А-дефіцитних ембріонів куріпок в тих же ембріональних структурах, що і в нормальних ембріонів, але на різному рівні. Таким чином, наші дані вказують на цілковиту залежність раннього ембріогенезу птахів від наявності відповідних ретиноїдів, а також їхніх рецепторів. Модель ретиноидного нокаута использовали для проверки биологической активности некоторых природных ретиноидов во время эмбрионального развития сердечно-сосудистой системы птиц. Показано, что all-trans-, 9-cis-, 4-оксо- и дидегидроретиноевые кислоты, а также all-trans-ретинол способны самостоятельно поддерживать ее нормальное развитие. Витамин A-дефицитные эмбрионы развивались нормально только при условии, если ретиноиды добавляли на ранних стадиях эмбриогенеза — не позднее формирования 5-го сомита. Дефицит витамина А во время эмбрионального развития существенно снижает уровень экспресии RARβ₂ как в сердце, так и в центральной нервной системе. Все использованные нами ретиноиды ндуцировали экспрессию RARβ₂ в тех же эмбриональных структурах, что и у нормальных эмбрионов, однако на разном уровне. Таким образом, наши данные указывают на полную зависимость раннего эмбриогенеза птиц от наличия ретиноидов, а также их рецепторов. The retinoid knockout model system was used to examine the biological activity of various natural retinoids in early cardiovascular development. We have demonstrated that all-trans-, 9-cis-, 4-oxo-, and didehydro-retinoic acids, and all-trans-retinol can maintain alone normal development of cardiovascular system. Vitamin A-deficient embryos developed normally only when retinoids were added during early stages of embryogenesis, not later than at 5-somite stage. Early in development the vitamin A deficiency downregulates the expression of the retinoic acid receptor RARβ₂ in the heart and in the developing central nervous system. All tested retinoids induced the expression of RARβ₂ in the same embryonic structures of the vitamin A-deficent quail embryos where RARβ₂ is normally expressed. But the level of induction differs for different retinoids. Therefore, our studies provide the strong evidence for the complete requirement of avian embryogenesis for retinoids and their receptor. 2005 Article Роль природних ретиноїдів у формуванні серцево-судинної системи птахів / К.В. Костецька, І.Є. Костецький, М.Г. Зіле // Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, № 3. — С. 250-257. — Бібліогр.: 31 назв. — укр. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0006EE http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155606 577.218 + 591.133.16 uk Біополімери і клітина Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Геном та його регуляція Геном та його регуляція
spellingShingle	Геном та його регуляція Геном та його регуляція Костецька, К.В. Костецький, І.Є. Зіле, М.Г. Роль природних ретиноїдів у формуванні серцево-судинної системи птахів Біополімери і клітина
description	Модель ретиноїдного нокауту використано для перевірки біологічної активності деяких природних ретиноїдів під час ембріонального розвитку серцево-судинної системи. Показано, що all-trans-, 9-cis-, 4-оксо- та дидегідро-ретиноєва кислоти, а також all-trans-ретинол здатні самостійно підтримувати її нормальний розвиток. Дефіцитні за вітаміном А ембріони розвивалися нормально лише за умови, якщо ретоноїди додавали на ранніх етапах ембріогенезу, не пізніше формування п'ятого соміту. Дефіцит вітаміну А протягом ембріонального розвитку суттєво знижує рівень експресії рецептора ретиноєвої кислоти RARβ₂ як у серці, так і в центральній нервовій системі. Всі використані нами ретиоїди індукують експресію RARβ₂ у вітамін А-дефіцитних ембріонів куріпок в тих же ембріональних структурах, що і в нормальних ембріонів, але на різному рівні. Таким чином, наші дані вказують на цілковиту залежність раннього ембріогенезу птахів від наявності відповідних ретиноїдів, а також їхніх рецепторів.
format	Article
author	Костецька, К.В. Костецький, І.Є. Зіле, М.Г.
author_facet	Костецька, К.В. Костецький, І.Є. Зіле, М.Г.
author_sort	Костецька, К.В.
title	Роль природних ретиноїдів у формуванні серцево-судинної системи птахів
title_short	Роль природних ретиноїдів у формуванні серцево-судинної системи птахів
title_full	Роль природних ретиноїдів у формуванні серцево-судинної системи птахів
title_fullStr	Роль природних ретиноїдів у формуванні серцево-судинної системи птахів
title_full_unstemmed	Роль природних ретиноїдів у формуванні серцево-судинної системи птахів
title_sort	роль природних ретиноїдів у формуванні серцево-судинної системи птахів
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2005
topic_facet	Геном та його регуляція
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155606
citation_txt	Роль природних ретиноїдів у формуванні серцево-судинної системи птахів / К.В. Костецька, І.Є. Костецький, М.Г. Зіле // Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, № 3. — С. 250-257. — Бібліогр.: 31 назв. — укр.
series	Біополімери і клітина
work_keys_str_mv	AT kostecʹkakv rolʹprirodnihretinoídívuformuvannísercevosudinnoísistemiptahív AT kostecʹkijíê rolʹprirodnihretinoídívuformuvannísercevosudinnoísistemiptahív AT zílemg rolʹprirodnihretinoídívuformuvannísercevosudinnoísistemiptahív
first_indexed	2025-07-14T07:48:43Z
last_indexed	2025-07-14T07:48:43Z
_version_	1837607759897427968
fulltext	I S S N 0233-7657. Біополімери і клітина. 2005. T. 21 . № З Г Е Н О М І Й О Г О РЕГУЛЯЦІЯ Роль природних ретиноїдів у формуванні серцево-судинної системи птахів К. В. Костецька, І. Є. Костецький, М. Г. Зіле1 Інститут молекулярної біології і генетики HAH України Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, 03143 , Україна E-mail: igork@imbg.org.ua 1 Мічіганський Державний Університет 234 FSHN будинок, Іст Дансинг, МІ 48824, США Модель ретиноїдного нокауту використано для перевірки біологічної активності деяких природних ретиноїдів під час ембріонального розвитку серцево-судинної системи. Показано, що all-trans-, 9-cis-, 4-оксо- та дидегідро-ретиноєва кислоти, а також all-trans-ретинол здатні самостійно підтримувати її нормальний розвиток. Дефіцитні за вітаміном А ембріони розвивалися нормаль но лише за умови, якщо ретоноїди додавали на ранніх етапах ембріогенезу, не пізніше формування п'ятого соміту. Дефіцит вітаміну А протягом ембріонального розвитку суттєво знижує рівень експресії рецептора ретиноєвої кислоти ЯАНвг як у серці, так і в центральній нервовій системі. ,Всі використані нами ретиоїди індукують експресію ЯАНвг у вітамін А-дефіцитних ембріонів куріпок в тих же ембріональних структурах, що і в нормальних ембріонів, але на різному рівні. Таким чином, наші дані вказують на цілковиту залежність раннього ембріогенезу птахів від наявності відповідних ретиноїдів, а також їхніх рецепторів. Ключові слова серцево-судинна система, ретиноїди, дефіцит вітаміну А, рецептор ретиноєвої кислоти, ранній ембріогенез. Вступ. Вітамін А відіграє важливу роль в ембріо генезі під час росту та диференціації. До основних подій, які регулюються ретино'щами, належать по діл тіла на передню і задню частини та утворення усіх кінцівок [1, 2] , розвиток центральної нервової системи [3, 4] , м'язів, хрящів [5] і серцево-судин ної системи (ССС) [6—8], яка формується однією з перших в ембріогенезі. Надмірна концентрація активних ретиноїдів, а також дефіцит вітаміну А викликають серйозні порушення розвитку серця. Серед останніх варто відзначити закриті судини серця, відсутність омфало-мезенхімних вен та екс- траембріональної системи кровообігу [9, 10]. До вітамін А-дефіцитного фенотипу належать також cardia bifida — подвоєння серця [9 ] та situs inver sus — розташування серця з протилежного боку © К. В. КОСТЕЦЬКА, І. Є. КОСТЕЦЬКИЙ, М. Г. ЗІЛЕ стосовно норми [11]. У щурів дефіцит ретиноїдів призводить до аномалій розвитку дуги аорти і міжшлункової перетинки у ембріонів [7] та ново народжених тварин [12]. Надлишок ретиноїдів (локальна обробка пере дсерцевої зони ретиноєвою кислотою) також спри чинює вади розвитку ССС, зокрема, переривається формування серцево-судинного півмісяця та утво рюється гроноподібне подвійне серце, cardia bifida [12]. Ці дослідження підтверджують важливу роль ретиноїдів у формуванні серця, а також вказують на чутливість ранніх стадій ембріогенезу до над лишку чи дефіциту ретиноїдів. У зв'язку з цим беззаперечним стає факт існування точного ме ханізму регуляції розподілу ретиноїдів та їхнього метаболізму упродовж раннього ембріогенезу. All-trans-ретиноєва кислота (at-RA) вважаєть ся активною формою вітаміну А [13], вона є 250 mailto:igork@imbg.org.ua РОЛЬ РЕТИНОЇДІВ У ФОРМУВАННІ СЕРЦЕВО-СУДИННОЇ СИСТЕМИ лігандом рецепторів ретиноєвої кислоти (RARs), які здатні до транлокацїї у ядро і виконують функції факторів транскрипції. Окрім at-RA, вияв лено ще декілька фізіологічних ретиноїдів, що впливають на ембріональний розвиток. Так, у за чатках кінцівок курячого ембріона знайдено ди- дегідро-ретиноєву кислоту (dd-RA) [14]. Основни ми метаболітами ретинолу у ембріонів Xenopus є 4-OKCO-RA, 9-cis-RA і at-RA [15, 16]. Дуже збага ченим ретиноїдами є Гензенський вузлик (Hen- sen's node) на пресомітній стадії розвитку пташи них ембріонів, у якому відбувається метаболізм ретинолу до ретиноєвої кислоти [17]. Нами пока зано, що під час нейруляції ембріон куріпок має фізіологічну кількість at-RA і dd-RA, а також містить ретинол і ретиналь, які є безпосередніми попередниками біологічно активних кислот, та ефі ри ретинолу, причетні до накопичення і зберігання вітаміну А [18 ]. Ці дослідження підтверджують той факт, що ранні пташині ембріони здатні повністю контролювати метаболізм і функцію вітаміну А. Загальновизнаним є свідчення стосовно того, що ретино'щи проявляють свою білогічну актив ність через відповідні рецептори, RAR або RXR (ретино'щ X рецептор) [19]. Ці рецептори після зв'язування відповідного ретиноїду переміщуються у клітинне ядро, де й виконують роль факторів транскрипції. На сьогодні відомо більше 200 генів, функція яких контролюється ретиноїдами. Тому можна очікувати, що ретино'вди та їхні рецептори відіграють важливу роль під час раннього розвитку хребетних, у тому числі кардіогенезу [20]. Ця думка отримала підтримку при дослідженні фено типу нокаутних за RAR та RXR генами мишей; у цих мишей виявлено аномалії, серед яких пору шення розвитку ССС, характерні для вітамін А-де- фіцитного фенотипу [21 ]. Таким чином, експресія ретиноєвих рецепторів в потрібній тканині у відповідний час є важливим чинником передачі сигналу від ретиноїдів протягом ембріогенезу. На жаль, інформація про розповсюд ження ретиноєвих рецепторів на стадії раннього ембріогенезу є досить обмеженою. У мишей віком від 7,5 до 8,5 днів RARa і RARy експресуються в усіх тканинах [22], у той же час експресія RARß обмежена латеральною мезодермою та нейроепіте- лієм. Подібну локалізацію RARß мРНК показано для ембріонів курей [7 ] і куріпок [23 ]. Враховую чи те, що ген RARß містить регуляторний елемент, який контролюється ретиноїдами [24], рівень екс пресії цього гена значно залежить від наявності ретиноїдів у тканинах ембріона. Зниження екс пресії RAR(32 в зоні формування серця у вітамін А-дефіцитних ембріонів [23] вказує на безумовну причетність згаданого гена до кардіогенезу. Важливі докази необхідності ретиноїдів для раннього ембріогенезу, зокрема, для розвитку ССС отримано нами при використанні дефіцитних за вітаміном А ембріонів куріпок. У зв'язку з цим перевірено широкий спектр натуральних ретиноїдів і всі вони виявили біологічну активність та здат ність компенсувати відсутність вітаміну А під час ранніх етапів ембріонального розвитку. Ці дані підтверджують припущення стосовно того, що ре- тиноєві рецептори можуть компенсувати відсут ність натуральних лігандів, використовуючи інші форми ретиноїдів. Не можна також знехтувати взаємоконверсією ретиноїдів у тканинах ембріона, яка призводить до появи фізіологічних концент рацій необхідних лігандів. Матеріали і методи. Модель досліджень. Для вивчення ролі ретиноїдів під час раннього ембріо генезу птахів використано дефіцитну за вітаміном А модель куріпок, створену, як описано в [10]. Суть її полягає в тому, що куріпок годували штучною їжею, яка не мала жодних ретиноїдів, окрім ІЗ-си-ретиноєвої кислоти (ІЗ-ш-RA). Ця кислота є похідним вітаміну А і здатна повністю підтримувати життєдіяльність організму, у тому числі репродуктивну функцію. Але, на відміну від вітаміну А, ІЗ-ds-RA не може проходити плацен тарний бар'єр і відповідно накопичуватися у жовт ку яйця [18]. Крім того, ретиноєві кислоти не відновлюються in vivo до ретинолу. Таким чином, куріпки, яких годували подібною дієтою, несуть вітамін А-дефіцитні яйця. Ембріони, що розвива ються з цих яєць, також є вітамін А-дефіцитними. Яйця збирали щоденно і зберігали при температурі 13 °С не більше 7 днів перед застосуванням. Ретиноїди. В експериментах використано ві тамін А (ретинол) та його біологічно активні по хідні (ретиноєві кислоти). All-trans-ретинол (at- ROH) і at-RA отримано від фірми «Sigma» (США); 13-ds-RA — від «Horfman-LaRoche» (США); 4-ок- со- і 3,4-dd-RA надано д-ром А. Баруа (Ун-т штату Айова), 9-cz's-RA — д-ром Дж. Гріппо (США). Пе ред використанням чистоту ретиноїдів перевіряли за допомогою хроматографії (ВЖХ) та УФ-спект- роскопії. Для запобігання ізомеризації ретиноїдів усі процедури здійснювали при жовтому світлі. 251 КОСТЕЦЬКА К. В., КОСТЕЦЬКИЙ І. Є.. ЗІЛЕ М. Г. Введення ретиноїдів in ovo. Яйця, розміщені в інкубаторі горизонтально, інкубували при темпера турі 38,5 °С і відносній вологості 98 % протягом 20—26 год. Відкривання яєць та ін'єкцію рети ноїдів проводили згідно з рекомендаціями [25]. Суміш для ін'єкції складалася з таких компонентів: 5 %-й розчин китайських чорнил (Pelikan fount India ink) у фосфатному буфері, 10 %-й гомогенат вітамін А-дефіцитних яєць і 10 нг відповідного ретиноїду. Така концентрація ретиноїдів має висо ку біологічну активність з незначним тератогенним ефектом. 10 мкл цієї суміші вводили мікрошприцем під бластодерму. Таким чином створювали на півпрозорий фон чорного кольору, який дозволяв визначати морфологічні особливості розвитку емб ріонів та стадію їхнього розвитку без додаткового забарвлення. Далі яйця закривали і продовжували їхню інкубацію додатково ще 6—48 год. Морфологічні критерії оцінки розвитку емб ріонів. Стадію ембріонального розвитку визначали згідно з критеріями, запропонованими в [4 ]. Таким чином, сьома стадія ембріонального розвитку пта хів відповідає появі першого соміту, на восьмій стадії з'являються ембріони зі сформованими 2—4 сомітами, ембріони дев'ятої стадії мають 5—8 сомі- тів. Соміти — це первинні сегменти тіла, продукт розділення мезодерми у ембріона, що розвивається. Після 72 год інкубації ми використовували такі параметри для оцінки розвитку ембріонів: форма і розміри серця, наявність зовнішньої системи крово обігу і циркуляції крові, кількість і розміри сомітів, форма і ступінь загибу голови, рівень розвитку центральної нервової системи. Повернення до нор мального стану вітамін А-дефіцитних ембріонів після інкубації їх з ретиноідами оцінювали, порів нюючи морфологічні ознаки таких ембріонів з відповідними ознаками нормальних, а також віта мін А-дефіцитних ембріонів, що розвивалися за відсутності ретиноїдів. Поверненим до норми вва жався ембріон, який мав усі характеристики нор мального розвитку. Морфологічні зміни у емб ріонів, які є результатом розвитку при відсутності вітаміну А, оцінювали окремо від порушень ембріо нального розвитку, спричинених тератогенною ді єю ретиноїдів чи пов'язаних з in vitro маніпуля ціями. До останніх ми відносили диспропорційний розвиток окремих частин тіла, втрату або аномалії у розвитку серця, сомітів і центральної нервової системи, які відрізняються від вітамін А-дефіцит- ного фенотипу. Гібридизація in situ. Вітамін А-дефіцитним ембріонам на сьомій стадії ембріонального розвитку вводили відповідний ретиноїд і продовжували інку бацію яєць. Через 6 год ембріони досягали стадії 8+ розвитку, їх вилучали з екстраембріональної мемб рани, промивали холодним фосфатним буфером і фіксували у 4 %-му параформальдегіді протягом ночі при 4 °С. Після дегідратації у збільшуваній концентрації метанолу ембріони використовували для аналізу або зберігали при температурі -20 °С. Гібридизацію in situ проводили із застосуван ням цілих ембріонів, як описано раніше [23]. Ембріони промивали розчином PBS/0,1 % твін-20, потім — 6 %-м розчином перекису водню, далі обробляли протеїназою К, фіксували у розчині 4 %-й параформальдегід/0,2 %-й глутаровий аль дегід і гібридизували з міченою діоксигеніном про бою при температурі 65 °С протягом ночі. Сенс- і антисенс-рибопроби синтезували з використанням відповідного фрагмента кДНК курячого RARfi2 (nt 1—202) [27]. Далі ембріони відмивали у розчині 0,5 % SSC/1 % SDS (70 °С) і інкубували з антидіоксигеніновими антитілами, з'єднаними з луговою фосфатазою. Після інтенсивного проми вання у PBS ембріони фарбували відповідним суб стратом (nitroblue tetrazolium і X-phosphate) і фо тографування на стереомікроскопі. Результати і обговорення. Вплив ретиноїдів на розвиток ССС птахів. Дефіцит вітаміну А під час раннього ембріогенезу птахів спричинює появу цілої низки серйозних аномалій. Після 72 год інкубації нормальний ембріон має такі основні характеристики: £/-подібна форма серця, яке з'єд нане з судинами зовнішнього кровообігу, наявність циркуляції крові, голова загнута у напрямку тіла, закінчений поворот тіла (рис. 1, а). На відміну від нормальних серце вітамін А-дефіцитних ембріонів має кулькоподібну форму збільшених розмірів; во но зачинене у місці венозного синусу і не з'єдну ється з судинами зовнішнього кровообігу і в при близно 75 % випадків знаходиться з протилежного боку (situs inversus). У них також спостерігається порушення розвитку центральної нервової системи, деформована форма голови, зменшена кількість сомітів, затриманий у цілому ембріогенез (рис. 1, б). Таким чином, ембріональний розвиток птахів знаходиться під цілковитим контролем вітаміну А. Мета наших досліджень полягала у вивченні здат ності екзогенних ретиноїдів відновлювати нормаль ний розвиток у таких ембріонів. 252 Р О Л Ь Р Е Т И Н О Ї Д І В У Ф О Р М У В А Н Н І С Е Р Ц Е В О С У Д И Н Н О Ї С И С Т Е М И Рис. 1. Ембріони куріпок на 3-й і 6-й день розвитку in ovo: а, д — нормальні ембріони після 3 і 6 днів розвитку відповідно; б — вітамін А-дефіцитний ембріон після 3 днів розвитку; в, г, е — вітамін А-дефіцитниі ембріони після ін'єкції at-ROH (в, е) і at-RA (г) на 3-й (в, г) та 6-й (е) дні розвитку. Стрілки вказують на нормальну судинну систему Нами показано, що введення 10 нг ретиноїду на один ембріон є найефективнішим для нор малізації вітамін А-дефіцитного фенотипу і має мінімальний тератогенний ефект для всіх дослід жуваних ретиноїдів. Ін'єкція 1 нг ретиноїдів мала мінімальний біологічний ефект (даних не наведе но) і була вилучена з подальшого аналізу. При використанні 100 нг ретиноїду на ембріон спо стерігалося зростання ембріональних аномалій, від мінних від вітамін А-дефіцитного фенотипу, при цьому ефективність нормалізації вітамін А-дефі цитного фенотипу зменшувалася у переважної кількості ретиноїдів. Таким чином, усі подальші досліди виконували з використанням 10 нг ретиноїдів для ін'єкції. Біологічна активність ретинолу при цьому була схожою з такою дидегідроретиноєвої кислоти (рис. 2) , його основного метаболіту. Це свідчить про присутність у вітамін А-дефіцитних ембріонах фер ментів, здатних метаболізувати вітамін А до його активних компонентів. На відміну від аІ-ЯА і сіа-гсА, які містяться у нормальних пташиних емб ріонах на ранніх стадіях ембріогенезу [18], 4-оксо- ЯА і 9 - т -ЯА за норми у цей період розвитку відсутні. Незважаючи на це, ефективність нор малізації вітамін А-дефіцитного фенотипу після введення 4-оксо-ЯА і 9-сгх-Ь£А несуттєво відріз няється від ефективності, пов'язаної з ін'єкцією інших метаболітів вітаміну А (рис. 2). Останнє засвідчує, що в умовах дефіциту природних ліган дів ретиноєві рецептори здатні використовувати інші форми ретиноїдів і при цьому ефективно функціонувати. Не виключена також можливість конверсії 9- а'«-І?А в іншу її ізоформу, аІ-ІЇА. Що ж стосується 4-оксо-1сА, то ймовірність метаболізму її до аі-ЯА форми здається незначною через відсутність від повідних ферментних систем. Вітамін А-дефіцитним ембріонам, обробленим ретинолом, надали можливість розвиватися до 6 днів (рис. 1, ґЗ, е ) , а обробленим кислотами, —до стадії 2 або 3 днів інкубації (рис. 1, в , г ) . Серед нормалізованих ембріонів ми не зустрічали таких, які б відрізнялися за морфологічними ознаками після інкубування. На відміну від ретиноєвих кис лот, ретинол може довше підтримувати нормаль ний розвиток вітамін А-дефіцитних ембріонів. Це можна пояснювати тим, що після ін'єкції частина ретинолу окислюється до активних метаболітів, а решта перетворюється в ефіри ретинолу, які збе рігаються у клітині і при потребі метаболізуться. У той же час ретиноєва кислота (усі відомі форми) не здатна відновлюватися до ретинолу. Тому одразу ж після ін'єкції вона функціонує з високою ефек тивністю, оскільки є активною формою вітаміну А, а далі ця активність знижується внаслідок дегра- 253 КОСТЕЦЬКА К. В., КОСТЕЦЬКИЙ І. Є., ЗІЛБ м. г. Рис. 2. Біологічна активність природних ретиноідів, оцінена за їхньою здатністю підтримувати нормальний розвиток вітамін А-дефіцитних ембріонів: / — а.-кОН; 2 — гІа-ІЇА; З — 9 - ш - ЯА; 4 — аМїА; 5 — 4-оксо-кА; (по осі у — ембріони з нормаль ним розвитком серцево-судинної системи; по осі х — стадія ембріонального розвитку при ін'єкції) дації кислоти. Через деякий час концетрація рети- ноєвої кислоти падає нижче фізіологічного рівня, за рахунок чого ембріони знову опиняються у середовищі, дефіцитному за вітаміном А, і зупиня ють нормальний розвиток. Біологічна активність ретиноідів (здатність за безпечувати розвиток вітамін А-дефіцитних емб ріонів) залежала від стадії ембріонального розвит ку, на якій здійснювали ін'єкцію ретиноідів. Так, аІ-ЯОН виявив найвищу біологічну активність з мінімальним тератогенним ефектом за умови, якщо його вводили на стадії 2—3 сомітів (рис. 2). На стадії 4—5 сомітів активність а ^ О Н починає зни жуватися і різко падає, якщо його вводити на пізніших стадіях ембріонального розвитку. Дія ре- тиноєвих кислот на стадії 2—3 сомітів дещо відріз нялася між собою, але в цілому їхня біологічна активність була нижчою, ніж у ретинолу (рис. 2). Це пояснюється вищим порівняно з ретинолом рівнем аномалій ембріонального розвитку. Очевидно, ранні пташині ембріони є дуже чутливими до рівня концентрації і типу присутніх ретиноідів. Тому надлишок ретиноєвої кислоти і викликає тератогенну дію. У той же час метаболізм ретинолу на цих стадіях знаходиться під контролем ферментних систем ембріона [22], що виключає появу надлишку біологічно активних ретиноідів і можливість тератогенної дії. На відміну від ретино лу, біологічна активність кислот несуттєво зміню ється на стадії 2—5 сомітів, а на стадії 6 сомітів їхня активність також зменшується і практично не відрізняється від ретинолу. Жоден з ретиноідів не був здатний врятувати вітамін А-дефіцитний фено тип, якщо його вводили на стадії 7 сомітів або пізніше. Ці дані свідчать про існування вітамін А-за- лежного етапу ембріонального розвитку, який збі гається з формуванням п'ятого соміту у ембріонів. Висока біологічна активність ретинолу на цій ста дії, яка відповідає активності його природних мета болітів, засвідчує високу швидкість перетворення ретинолу у його біологічно активні форми. Таким чином, усі перевірені нами природні ретиноїди здатні повністю нормалізувати розвиток вітамін А-дефіцитних ембріонів за умови, якщо ці ретиноїди привносилися не пізніше стадії утворен ня п'ятого соміту у ембріонів. Згадана стадія є критичною для формування серця і центральної нервової системи. Зокрема, на ній починається формування серцевої трубки за рахунок злиття пари серцевих зачатків, а також завершується закривання нервової трубки. Отже, стадія ембріо нального розвитку, яка відповідає стадії утворення п'ятого соміту у пташиних ембріонів, є ретиноїд- залежним періодом ембріогенезу. Нормальний емб ріогенез після цієї стадії можливий лише за наяв ності біологічно активних ретиноідів та їхніх ре цепторів. Індукція ретиноїдами експресії RARfi2. На мо лекулярному рівні біологічну активність ретиноідів порівнювали, аналізуючи їхню здатність до регу ляції експресії генів. Наявність RARE (retinoic acid response element) у промоторі RARf32 робить цей ген першим кандидатом для подібного аналізу. Експресію RARB2 у нормальних, вітамін А-дефі цитних та індукованих ембріонів вивчали на стадії 4—5 сомітів за допомогою гібридизації in situ цілих ембріонів. Рецептори ретиноєвої кислоти (RARs і RXRs) активно експресуються в ранніх ембріонах птахів [23, 28 ]. Зокрема, на стадії первинного формуван ня серця (1—8 сомітів) RARR2 локалізується у нейроепітелії, передсерцевому полі, сомітах і лате ральній мезодермі (рис. З, б). Дефіцит вітаміну А призводить до практично повної відсутності екс пресії RARf32 у цих структурах (рис. З, а). Ін'єкція ретиноідів на ранніх стадіях ембріогенезу спричи нює швидку індукцію експресії цього гена, детекція 254 Р О Л Ь Р Е Т И Н О Ї Д І В У Ф О Р М У В А Н Н І С Е Р Ц Е В О - С У Д И Н Н О Ї С И С Т Е М И Рис. 3. Локалізація КМф2 мРНК у цілих ембріонів куріпки: а — вітамін А-дефіцитний ембріон; б — нормальний ембріон; в—є — вітамін А-дефіцитні ембріони пі сля обробки сМ-ьїА (б), 9 - с ; і - К А (г) , т-№Н « ) , аькА іе), 4- оксо-ИА (є) RARß2 мРНК можлива вже через 5 год після введення відповідного ретиноїду. При цьому різні ретиноїди неоднаково впливають на рівень екс пресії і локалізацію RARß2 мРНК. Зокрема, введен ня ембріонам a t - R A та d d - R A на стадії формування 1-го соміту призводить до відновлення експресії RARß2 в усіх структурах, де цей ген у нормі експресується (рис. З, е, е). При цьому рівень експресії RARß2 м Р Н К в індукованих ембріонів був близьким до норми, підвищення експресії спо стерігалося лише в латеральній мезодермі у емб ріонів, оброблених d d - R A (рис. З, ß). У той же час обробка ембріонів 9-cis-RA і 4 - o k c o - R A призводила до надлишкової експреси RARß2 мРНК у передсер цевій зоні (рис. З, г, є), зате експресія цього гена в нейроепітелії та сомітах індукованих ембріонів була значно нижчою, ніж у нормальних. Наведені дані підтримують ідею стосовно того, що різні за походженням і структурою ретиноїди виконують різні функціі у клітині. Це може бути пов'язано з коливаннями в афінності використаних нами ретиноїдів до різних типів ретиноєвих рецеп торів [29 ]. Зокрема, 9 -c i s -RA з високою ефек тивністю зв 'язується як з R A R , так і з R X R рецепторами і індукує утворення активних гомоди- мерів R X R / R X R і гетеродимерів R X R / R A R , тоді як a t - R A і d d - R A зв 'язуються лише з R A R рецептора ми з утворенням R A R / R A R гомодимерів. Оскільки R A R і R X R рецептори мають різні ділянки роз пізнавання на Д Н К [ЗО], то і спектр регульованих ними генів також відрізняється. Більше того, активований 9-c¿s-RA рецептор R X R може утворювати активні комплекси з ін шими факторами транскрипції, що належать до родини стероїдних рецепторів, зокрема, з T H R (thyroid hormone receptor) або V D R (vitamin D 3 receptor) [ 3 1 ]. Такі комплекси здатні до регуляції транскрипції генів, що знаходяться відповідно під контролем T H R або V D R . Ми також не виклю чаємо наявності різних механізмів метаболізму і утилізації для різних ретиноїдів, що призводить до неоднакової стабільності ретиноїдів у клітині, а також можливості взаємної ізомеризації (переходу a t - R A в 9 -c i s -RA і навпаки) . Однак останнє здаєть ся малоймовірним, оскільки місця локалізації RARß2 мРНК, індукованої a t - R A або 9 -c i s -RA, відрізняю ться між собою. Також неможливим є перехід 4 - o k c o - R A та d d - R A до їхнього попередника — 255 КОСТЕЦЬКА К. В., КОСТЕЦЬКИЙ І. Є., ЗІЛЕ М. Г. at-RA [22], що також повинно обумовлювати спе цифічність їхньої дії. Таким чином, ефективність індукції RARf32 мРНК різними формами ретиноєвої кислоти у віта мін А-дефіцитних ембріонів корелює з їхнього здатністю відновлювати нормальний ембріогенез. Так, найближчими до норми були локалізація і рівень експресії RARf32 мРНК після індукції емб ріонів at-RA і dd-RA тими формами вітаміну А, які за норми присутні на цій стадії ембріогенезу птахів [16, 18]. Але на сьогодні не встановлено ло калізації цих ретиноїдів на рівні тканин ембріона; більше того, вона не обов'язково повинна збігатися з такою у тканинах, де експресується RARf32. У той же час в наших експериментах ретиноїди після ін'єкції потрапляють у клітини ембріонів шляхом пасивної дифузії, тобто вони здатні проникати практично в усі тканини. Проте ми не спостерігали ектопічної експресії RARfi2 мРНК при використанні природних ретиноїдів. Останнє свідчить про те, що експресія RARfi2 у ранніх ембріонів знаходиться під суворим генетичним контролем. Однак ми не вик лючаємо можливості, що деякі інші гени, які ма ють RARE у своєму промоторі, будуть активувати ся відмінно від норми — за рахунок доступності ліганда (at-RA або dd-RA) в тих тканинах, де вони за норми відсутні. На противагу біологічно активним формам ві таміну А (ретиноєвих кислот) ретинол потребує більше часу для активації відповідних рецепторів. Це пов'язано з необхідністю конверсії ретинолу до відповідних форм та ізомерів ретиноєвої кислоти. Тому рівень індукції RARB2 мРНК ретинолом був дещо нижчим, ніж при використанні ретиноєвих кислот, і меншим за норму (рис. З, д, е). Незважа ючи на це, експресія RARf32 мРНК спостерігалася в усіх структурах, що свідчить про нормальну біоло гічну функцію ретинолу, а також про наявність на цій стадії ембріогенезу відповідних ферментних систем, які здатні окислювати ретинол до його активної форми. Звичайно, ми не виключаємо можливості утворення більш ніж однієї форми ре тиноєвої кислоти. Не викликає сумніву також, що конверсія ретинолу до активних метаболітів від бувається координовано і контрольовано, тобто ли ше у тих тканинах і клітинах, де вона здійснюється в нормі. Висновки. Таким чином, наведені нами дані підтверджують і розширюють наші попередні спо стереження стосовно того, що: 1) ретиноїди регу люють експресію RARfi2 під час раннього форму вання серця у птахів; 2) RARf32 пов'язаний з раннім розвитком серцево-судинної системи, зокре ма, з розвитком задніх сегментів серця; 3) RARf32 є важливим чинником нормального розвитку цент ральної нервової системи і м'язів. Важливим також є те, що нами встановлено період ембріонального розвитку, який є вітамін A-залежним. Критичною для нормального ембріогенезу є стадія утворення 5—6-го соміту, протягом якої (і далі) активна форма вітаміну А є абсолютно необхідною. Е.. V. Kostetskaia, І. Е. Kostetskii, М. Н. Zile The role of natural retinoids in the formation of avian cardiovascular system Summary The retinoid knockout model system was used to examine the biological activity of various natural retinoids in early cardio vascular development. We have demonstrated that all-trans-, 9-cis-, 4-OXO-, and didehydro-retinoic acids, and all-trans-retinol can maintain alone normal development of cardiovascular system Vitamin A-deflcient embryos developed normally only when reti noids were added during early stages of embryogenesis, not later than at 5-somite stage. Early in development the vitamin A deficiency downregulates the expression of the retinoic acid receptor RARB2 in the heart and in the developing central nervous system. All tested retinoids induced the expression of RARfi2 in the same embryonic structures of the vitamin A-deficent quail embryos where RARf}2 is normally expressed. But the level of induction differs for different retinoids. Therefore, our studies provide the strong evi dence for the complete requirement of avian embryogenesis for retinoids and their receptor. Key words: cardiovascular system, retinoids, vitamin A- deficiency, retinoic acid receptor, early embryogenesis. E. В. Костецкая, И. E. Костецкий, M. Г. Зиле Роль природных ретиноидов в формировании сердечно-сосудистой системы птиц Резюме Модель ретиноидного нокаута использовали для проверки био логической активности некоторых природных ретиноидов во время эмбрионального развития сердечно-сосудистой системы птиц. Показано, что all-trans-, 9-cis-, 4-оксо- и дидегидрорети- ноевые кислоты, а также all-trans-ретинол способны самосто ятельно поддерживать ее нормальное развитие. Витамин A-дефицитные эмбрионы развивались нормально только при условии, если ретиноиды добавляли на ранних стадиях эмбри огенеза — не позднее формирования 5-го сомита. Дефицит витамина А во время эмбрионального развития существенно снижает уровень экспресии RARfi2 как в сердце, так и в центральной нервной системе. Все использованные нами рети ноиды индуцировали экспрессию RARf¡2 в тех же эмбриональ ных структурах, что и у нормальных эмбрионов, однако на разном уровне. Таким образом, наши данные указывают на полную зависимость раннего эмбриогенеза птиц от наличия ретиноидов, а также их рецепторов. 256 РОЛЬ РЕТИНОЇДІВ У ФОРМУВАННІ СЕРЦЕВО-СУДИННОЇ СИСТЕМИ Ключевые слова: сердечно-сосудистая система, ретиноиды, дефицит витамина А, рецептор ретиноевой кислоты, ранний эмбриогенез. ПЕРЕЛІК ЛІТЕРАТУРИ 1. Dersh Я., Zile М. Н. Induction of normal cardiovascular development in the vitamin A-deprived quail embryo by natural retinoids / / Develop. Biol.—1993.—160.—P. 424—433. 2. Dong D., Zile M. H. Endogeneous retinoids in the early avian embryo / / Biochem. and Biophys. Res. Communs.—1995.— 217.—P. 1026—1031. 3. Setleck M. A. J. Culture and microsurgical manipulations of the early avian embryo / / Meth. Cell Biol.—1996.—51.—P. 1 — 22. 4. Hamburger V., Hamilton H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo / / J. Morphol.—1951.— 88.—P. 49—92. 5. Kostetskii I., Linask К К, Zile M. H. Vitamin A deficiency and the expression of retinoic acid receptors during early cardlogenesis in quail embryo / / Roux's Arch. Develop. Biol.—1996.—205.—P. 260—271. 6. Noji S., Nohno Т., Koyama E., Muto K, Ohyama K, Aoki Y„ Tamura К, Ohsugi К, Ide H., Tanigushi S., Saito T. Retinoic acid induces polarizing activity but is unlikely to be a morphogen in the chick limb bud / / Nature.—1991.—350.— P. 8 3 - 8 6 . 7. Hoffman C, Eichele G. Retinoids in development / / The retinoids: biology, chemistry and medicine / Eds M. B. Sporn, A. B. Roberts, D. S. Goodman.—New York: Raven press, 1994.—P. 382—441. 8. Durston A. J., van der Wees J., Pijnappel W. W. M., Schilthuis J. G., Godsave S. F. Retinoid signaling and axial patterning during early vertebrate embryogenesis / / Cell. Mol. Ufe Sci.—1997.—53.—P. 339—349. 9. Maden M., Gale E., Kostetskii I., Zile M. Vitamin A-deficient embryos have half hindbrain and other neural defects / / Curr. Biol.—1996—6.—P. 417—426. 10. Maden M., Gale E., Zile M. H. The role of vitamin A in the development of the central nervous system / / J. Nutr.— 1998.—128.—P. 471—475. 11. Chen Y. P., Soiursh M. The determination of myogenic and cartilage cells in the early chick embryo and the modifying effect of retinoic acid / / Roux's Arch. Develop. Biol.—1991.— 2 0 0 . - P . 162—171. 12. Smith S. M., Dickman E. D. New insights into retinoid signaling in cardiac development and physiology / / Trends Cardiovasc. Med.—1997.—7.-P. 53—58. 13. Smith S. M., Dickman E. D., Power S. C , Lancman J. Retinoids and their receptors in vertebrate embryogenesis / / J. Nutr.—1998.—128.—P. 467-470 . 14. Zile M. H. Vitamin A and embryonic development: An overview / / J. Nutr.—1998.—128.—P. 455S—458S. 15. Heine U. I., Roberts А. В., Muñoz E. F., Roche N. S., Sporn M. B. Effects of retinoid deficiency on the development of the heart and vascular system in the quail embryo / / Vlrchows Arch. В.—1985.—50.—P. 135—152. 16. Zile M. H., Kostetskii I., Yuan S., Kostetskaia E., Amand T. R., Chen Y., Jiang W. Retinoid signaling is required to complete the vertebrate cardiac left/right asymmetry pathway / / Develop. Biol.—2000.—223.—P. 323—328. 17. Dickman E. D., Smith S. M. Selective regulation of car- diomyocyte gene expression and cardiac morphogenesis by retinoic acid / / Develop. Dyn.—1996.—206.—P. 39—48. 18. Ross S. A., McCaffery P. Y, Drager U. C, de Luca L M. Retinoids in embryonic development / / Physiol. Rev.—2000.— 80.—P. 1021—1054. 19. Thaller C, Eichele G. Isolation of 3,4-didehydro-retinoic acid, a novel morphogenic signal in the chick wing bud / / Nature.— 1990.—345.—P. 815—819. 20. Pijnappel W. W. M., Hendrics H. F. J., Folkers G. E., van der Brink С. E., Dekker E. J., Edelenbosch С. V., van der Saag P. Т., Durston A. J. The retinoid ligand 4-oxo-retinoic acid is the highly active modulator of positional specification / / Nature.—1993.—366.—P. 340—344. 21. Creech Kraft J., Schuh Т., Juchau M., Kimelman D. The retinoid X receptor ligand, 9-cis-retinoic acid, is the potential regulator of early Xenopus development / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1994.—91.—P. 3067—3071. 22. Hogan B. L, Thaller C, Echele G. Evidence that Hensen's node is a site of retinoic acid synthesis / / Nature.—1992.— 359.—P. 237—241. 23. Aranda A., Pascual A. Nuclear hormone receptors and gene expression / / Physiol. Rev.—2001.—81.—P. 1269—1304. 24. Brand T. Heart development: molecular insights into cardiac specification and early morphogenesis / / Develop. Biol.— 2003.—258.—P. 1—19. 25. Lee R. Y., Luo J., Evans R. M., Giguere V., Sukov H. M. Compartment-selective sensitivity of cardiovascular morpho genesis to combination of retinoic acid receptor gene mutations / / Circ. Res.—1997.—80.—P. 757—764. 26. Ulven S. M., Gundersen Т. E., Weedon M. S., Landaas V. O., Sakhi A. K, Fromm S. H., Geronimo B. A., Moskauq J. O., Blomhoff R. Identification of endogeneous retinoids, enzymes and receptors during early postimplantation development in mouse: important role of retinal dehydrogenase type 2 in synthesis of all-trans-retinoic acid / / Develop. Biol.—2000.— 220.—P. 379—391. 27. Chambon P. A decade of molecular biology of retinoic acid receptors / / FASEB J.—1996.—10—P. 940—954. 28. Zile M. H. Function of vitamin A in vertebrate embryonic development / / J. Nutr.—2001.—131.—P. 705—708. 29. Bachmair F., Hoffmann R., Daxelbichler G, Longer T. Studies on structure-activity relationships of retinoic acid receptor llgands my means of molecular modeling / / Vitam. Horm.—2000.—59.—P. 159—215. 30. Pfahl M. Signal transduction by retinoid receptors / / Skin Pharmacol.—1993.—6.—P. 8—16. 31. Carlberg C. Lipid soluble vitamins in gene regulation / / Biofactors.—1999.—10.—P. 91—97. УДК 577.218 + 591.133.16 Надійшла до редакції 28.11.03 257

Роль природних ретиноїдів у формуванні серцево-судинної системи птахів

Репозитарії

Схожі ресурси