Изучение генопротекторпых свойств препарата «Флараксин» в условиях повреждающего действия тетрахлорметана

Изучение генопротекторпых свойств препарата «Флараксин» в условиях повреждающего действия тетрахлорметана

Обнаружено наличие генопротекторных свойств у противоопухолевого препарата ра­стительного происхождения «Флараксин» в условиях повреждения ядерного хромати­на печени крыс тетрахлорметаном. По крайней мере частично данный эффект обус­ ловлен антиоксидантными свойствами препарата, что выражается в нор...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Datum:1995
Hauptverfasser: Губский, Ю.И., Левицкий, Е.Л., Кулик, И.А., Горюшко, А.Г., Примак, Р.Г., Саченко, Л.Г., Вистунова, И.Е.
Format: Artikel
Sprache:Russian
Veröffentlicht: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1995
Schriftenreihe:Биополимеры и клетка
Online Zugang:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155654
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Изучение генопротекторпых свойств препарата «Флараксин» в условиях повреждающего действия тетрахлорметана / Ю.И. Губский, Е.Л. Левицкий, И А. Кулик, А.Г. Горюшко, Р.Г. Примак, Л.Г. Саченко, И.Е. Вистунова // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 1. — С. 70-80. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-155654
record_format dspace
spelling irk-123456789-1556542019-06-18T01:27:16Z Изучение генопротекторпых свойств препарата «Флараксин» в условиях повреждающего действия тетрахлорметана Губский, Ю.И. Левицкий, Е.Л. Кулик, И.А. Горюшко, А.Г. Примак, Р.Г. Саченко, Л.Г. Вистунова, И.Е. Обнаружено наличие генопротекторных свойств у противоопухолевого препарата ра­стительного происхождения «Флараксин» в условиях повреждения ядерного хромати­на печени крыс тетрахлорметаном. По крайней мере частично данный эффект обус­ ловлен антиоксидантными свойствами препарата, что выражается в нормализации течения реакций переокисления липидов во фракциях транскрипционно активного и репрессированного хроматина. Некоторая коррекция структурно-функциональных свойств хроматина в условиях повреждения тетрахлорметаном, по всей вероятности, реализуется в результате связывания флараксина с функционально неодинаковыми участками хроматина, причем характер взаимодействия различен для данных участ­ков. Если в транскрипционно активной фракции взаимодействие обусловлено связы­ванием препарата главным образом с белками хроматина, то в репрессированном хроматине – с ДНК. Образование подобных комплексов флараксина с компонентами хроматина не препятствует реализации генетической информации, однако предохра­няет хроматин от повреждения свободными радикалами кислорода и тетрахлорметана. Виявлено наявність генопротекторних властивостей у протипухлинного препарату «Флараксин» за умов пошкодження хроматину тетрахлорметаном. Щонайменше част­ково цей ефект зумовлений антиоксидантними властивостями препарату, що виража­ється у нормалізації реакцій переокислення ліпідів у фракціях транскрипційно актив­ного та репресованого хроматину. Часткова корекція структурно-функціональних вла­стивостей хроматину за умов ушкодження тетрахлорметаном найімовірніше реалізу­ ється внаслідок зв'язування флараксину з функціонально неоднаковими ділянками хроматину, причому характер взаємодії відрізняється для різних ділянок. Якщо у транскрипційно активній фракції взаємодія обумовлена зв'язуванням препарату го­ловним чином з білками хроматину, то у репресованому хроматині – з ДНК. Утво­рення подібних комплексів флараксину з компонентами хроматину не перешкоджає реалізації генетичної інформації, однак запобігає ушкодженню хроматину вільними радикалами кисню та тетрахлорметану. The presence of genoprotective features of antitumour preparation «Flaraksin» in conditions of the rat liver nuclear chromatin damage by tetrachloromethane was revealed. At least partially this effect may be conditioned by antioxidant action of the preparation. This action is expressed as a normalization of the lipoperoxidation reactions in the transcriptionally active and repressed chromatin fractions. Partial correction of chromatin structural and functional characteristics in condition of chromatin damage by tetrachloromethane is realized probably in result of flaraksin bounding to functionally different chromatin sites. The character of this bounding is various in these sites. If in active fraction interaction is caused mainly by chromatin proteins, then in repressed one – DNA. Such chromatin-flaraksin complexes do not prevent the genetic information realization, however they protect the nuclear chromatin from damage by oxigen and tetrachloromethane free radicals. 1995 Article Изучение генопротекторпых свойств препарата «Флараксин» в условиях повреждающего действия тетрахлорметана / Ю.И. Губский, Е.Л. Левицкий, И А. Кулик, А.Г. Горюшко, Р.Г. Примак, Л.Г. Саченко, И.Е. Вистунова // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 1. — С. 70-80. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0003D6 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155654 613, 357.631:577.157 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
description Обнаружено наличие генопротекторных свойств у противоопухолевого препарата ра­стительного происхождения «Флараксин» в условиях повреждения ядерного хромати­на печени крыс тетрахлорметаном. По крайней мере частично данный эффект обус­ ловлен антиоксидантными свойствами препарата, что выражается в нормализации течения реакций переокисления липидов во фракциях транскрипционно активного и репрессированного хроматина. Некоторая коррекция структурно-функциональных свойств хроматина в условиях повреждения тетрахлорметаном, по всей вероятности, реализуется в результате связывания флараксина с функционально неодинаковыми участками хроматина, причем характер взаимодействия различен для данных участ­ков. Если в транскрипционно активной фракции взаимодействие обусловлено связы­ванием препарата главным образом с белками хроматина, то в репрессированном хроматине – с ДНК. Образование подобных комплексов флараксина с компонентами хроматина не препятствует реализации генетической информации, однако предохра­няет хроматин от повреждения свободными радикалами кислорода и тетрахлорметана.
format Article
author Губский, Ю.И.
Левицкий, Е.Л.
Кулик, И.А.
Горюшко, А.Г.
Примак, Р.Г.
Саченко, Л.Г.
Вистунова, И.Е.
spellingShingle Губский, Ю.И.
Левицкий, Е.Л.
Кулик, И.А.
Горюшко, А.Г.
Примак, Р.Г.
Саченко, Л.Г.
Вистунова, И.Е.
Изучение генопротекторпых свойств препарата «Флараксин» в условиях повреждающего действия тетрахлорметана
Биополимеры и клетка
author_facet Губский, Ю.И.
Левицкий, Е.Л.
Кулик, И.А.
Горюшко, А.Г.
Примак, Р.Г.
Саченко, Л.Г.
Вистунова, И.Е.
author_sort Губский, Ю.И.
title Изучение генопротекторпых свойств препарата «Флараксин» в условиях повреждающего действия тетрахлорметана
title_short Изучение генопротекторпых свойств препарата «Флараксин» в условиях повреждающего действия тетрахлорметана
title_full Изучение генопротекторпых свойств препарата «Флараксин» в условиях повреждающего действия тетрахлорметана
title_fullStr Изучение генопротекторпых свойств препарата «Флараксин» в условиях повреждающего действия тетрахлорметана
title_full_unstemmed Изучение генопротекторпых свойств препарата «Флараксин» в условиях повреждающего действия тетрахлорметана
title_sort изучение генопротекторпых свойств препарата «флараксин» в условиях повреждающего действия тетрахлорметана
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate 1995
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155654
citation_txt Изучение генопротекторпых свойств препарата «Флараксин» в условиях повреждающего действия тетрахлорметана / Ю.И. Губский, Е.Л. Левицкий, И А. Кулик, А.Г. Горюшко, Р.Г. Примак, Л.Г. Саченко, И.Е. Вистунова // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 1. — С. 70-80. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.
series Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv AT gubskijûi izučeniegenoprotektorpyhsvojstvpreparataflaraksinvusloviâhpovreždaûŝegodejstviâtetrahlormetana
AT levickijel izučeniegenoprotektorpyhsvojstvpreparataflaraksinvusloviâhpovreždaûŝegodejstviâtetrahlormetana
AT kulikia izučeniegenoprotektorpyhsvojstvpreparataflaraksinvusloviâhpovreždaûŝegodejstviâtetrahlormetana
AT gorûškoag izučeniegenoprotektorpyhsvojstvpreparataflaraksinvusloviâhpovreždaûŝegodejstviâtetrahlormetana
AT primakrg izučeniegenoprotektorpyhsvojstvpreparataflaraksinvusloviâhpovreždaûŝegodejstviâtetrahlormetana
AT sačenkolg izučeniegenoprotektorpyhsvojstvpreparataflaraksinvusloviâhpovreždaûŝegodejstviâtetrahlormetana
AT vistunovaie izučeniegenoprotektorpyhsvojstvpreparataflaraksinvusloviâhpovreždaûŝegodejstviâtetrahlormetana
first_indexed 2025-07-14T07:50:52Z
last_indexed 2025-07-14T07:50:52Z
_version_ 1837607895467819008
fulltext УДК Г.1.\357.631:577.157 Ю. И. Губский, Е. Л. Левицкий, И А. Кулик, А. Г. Горюшко, Р. Г. Примак, Л. Г. Саченко, И. Е. Виступові) ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОПРОТЕКТОРПЫХ СВОЙСТВ ПРЕПАРАТА «ФЛАРАКСИН» В УСЛОВИЯХ ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ТЕТРАХЛОРМЕТАНА Обнаружено наличие генопротекторных свойств у противоопухолевого препарата ра­ стительного происхождения «Флараксин» в условиях повреждения ядерного хромати­ на печени крыс тетрахлорметаном. По крайней мере частично данный эффект обус­ ловлен антиоксидантными свойствами препарата, что выражается в нормализации течения реакций переокисления липидов во фракциях транскрипционно активного и репрессированного хроматина. Некоторая коррекция структурно-функциональных свойств хроматина в условиях повреждения тетрахлорметаном, по всей вероятности, реализуется в результате связывания флараксина с функционально неодинаковыми участками хроматина, причем характер взаимодействия различен для данных участ­ ков. Если в транскрипционно активной фракции взаимодействие обусловлено связы­ ванием препарата главным образом с белками хроматина, то в репрессированном хроматине — с ДНК. Образование подобных комплексов флараксина с компонентами хроматина не препятствует реализации генетической информации, однако предохра­ няет хроматин от повреждения свободными радикалами кислорода и тетрахлорметана. Введение. Одним из ранних проявлений патологического процесса при отравлении животных тетрахлорметаном (ТХМ) является поврежде­ ние ядерного хроматина печени [1, 2] . Предположительно, основным молекулярным механизмом подобного повреждения является накопле­ ние свободных радикалов в результате модификации реакций перекис- ного окисления (ПОЛ) хроматин-связанных липидов [1—3]. Препара­ ты, оказывающие антиоксидантное действие1 в условиях данной пато­ логии, имеют выраженный защитный эффект по отношению к ядерно­ му хроматину печени, т. е. обладают генопротекторной активностью [4, 5] . В данной работе приведены результаты исследования генопро- тскторного действия препарата «Флараксин», разрабатываемого в Ин­ ституте фармакологии и токсикологии АМН Украины, Флараксин — это новое противоопухолевое соединение растительного происхождения фенольной природы, при получении которого использованы неоргани­ ческие добавки, в частности соли. Предклинические и клинические ис­ следования этого препарата показали, что в лечебных дозах у него от­ сутствует токсический эффект. В отличие от традиционных противо­ опухолевых химиотерапевтических средств, он не оказывает выражен­ ного побочного действия на жизненно важные органы и ткани, такие как кровь и кроветворение. Это позволяет применять препарат в край­ нє запущенных случаях злокачественных меланом, при лечении кото­ рых наблюдается выраженный терапевтический эффект. Материалы и методы. В работе использовали крыс-самцов линии Вистар 3-месячного возраста (150—200 г). Животных декапитпровали в утренние часы под легким эфирным наркозом, учитывая периодич­ ность митотического цикла. Фракции транскрипционно активного (TAX) и репрессированного (РХ) хроматина печени выделяли, как описано ранее [1, 2 ] . Структурно-функциональное состояние фракций, а также интенсивность реакций ПОЛ в них определяли по [1—5]. Сте­ пень ПОЛ регистрировали также спектрофотометрнчески как отноше­ ние оптической плотности диеновых конъюгатов £)2зз (продуктов ПОЛ) £ IO. И. Губский. Е. Л. Левицкий, И. Л. Кулик, А. Г. Горюшко, Р. Г. Примак, Л. Г. Саченко, И. Е. Вистунова, 1995 7Q J§SN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ, И КЛЕТКА. 1ЭД5. Т. П. ,№ | и неокисленной формы липида Д>і5 [6]. Для этого в суспензию липо- сом из фосфатидилхолина (Сфо|с/фььипЧай==0)25 мг/мл) вводили раствор флараксина (С = 0,06 мг/мл) и после перемешивания на магнитной мешалке в течение 10 мин записывали спектры поглощения. Затем ра­ створы инкубировали при 37 °С, отбирая пробы для спектрофотометри- ческого анализа через определенные промежутки времени. ТХМ вво­ дили внутрибрюшинно в дозе 1,75 мл/кг массы тела животного. Дли­ тельность интоксикации составляла 2 ч — период, после которого на­ блюдается пик генотоксических изменений в хроматине [1—3]. Для изучения влияния флараксина на процессы ПОЛ, а также на структур­ но-функциональную организацию хроматина животным вводили это вещество в физиологическом растворе в хвостовую вену одновременно с ТХМ, как правило, в дозе 4 мг/кг массы тела (в некоторых эксперт ментах — 40 мг/кг) . В исследованиях in vitro флараксин добавляли в среду инкубации до конечной концентрации 0,2 и 7,5 мг/мл. В работе использовали коммерческие препараты бычьего сыворо­ точного альбумина (БСА), ДНК фирмы «Serva» (Германия); лецитин- стандарт (10 %-й раствор в спирте) Харьковского предприятия по про­ изводству бактериальных препаратов. Липосомы из лецитина готови­ ли, как описано в [7] , на диспергаторе УЗДН-2 (22 кГц, 10 мин). Антирадикальную активность флараксина исследовали по методи­ ке [8] , применяя в качестве стабильного радикала трифенилвердазил (ТФВ) в спиртовом растворе (СТФВ = 10~4 М) в области полос погло­ щения 402 и 740 нм. Долю нейтрализованного свободного радикала при добавлении в раствор флараксина определяли как отношение /S.D/D0, где AD — изменение оптической плотности (при 402 или 740 нм), D0 — оптическая плотность исходного раствора ТФВ. Собственную флюоресценцию препаратов хроматина изучали в диапазоне 300—450 нм, регистрируя интенсивность спектральной по­ лосы при 320 нм. Структурные изменения в хроматине анализировали с помощью флюоресцентных зондов пирена (перекристаллизованиого из метанола) и 1-анилинонафталин-8-сульфоната аммония (1,8-АНС) фирмы «Serva» (Германия), а также явлений индуктивно-резонансно­ го переноса энергии (ИРПЭ) с белковых флюорофоров на пирен в со­ ответствии с [9, 10]. При регистрации ИРПЭ флюоресценцию измеря­ ли при длине волны возбуждения 386 нм и Спіфек'а = 2-10~6 М. Состоя­ ние поляризации среды определяли с помощью потенциалчувствитель- ного флюоресцентного зонда diS C3-5 [11]. Флюоресцентные измере­ ния осуществляли на спектрофлюориметре «Hitachi MPF-4» (Япония) в кварцевых кюветах (1 см) при 20 °С. Спектры поглощения хрома-і тина изучали в области 210—370 нм с помощью спектрофотометра' «Shimadzu MPS-5000» (Япония) при 20 °С. Тепловые эффекты взаимо­ действия флараксина с фракциями хроматина и модельными система­ ми регистрировали с использованием микрокалориметра «LKB-2107» (Швеция) в режиме смешения при 26 °С. Т а б л и ц а 1 Влияние флараксина на скорость накопления МДА (нмоль/мг белка за 2 ч) в гомогенатах печени интактных крыс в условиях in vivo (n= 12) Показатель ПОЛ Контроль Флараксин, мг/кг 4 40 НЗП 12417,9 3049,3* 13535,! НЗП, Д 6819,6 5226,0 9520,9* АЗП 6335,3 5429,5 4277,3 Неинициированный контроль 0 0 195,9* П р и м е ч а н и е , Здесь и в табл. 2 НЗП — НАДФН-зависимое ПОЛ; НЗП, Д — его составляющая, зависимая от нагревания; АЗП — аскорбат-завиеимое ПОЛ. * р<0,05 (по сравнению с контролем). ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11. № 1 71 Статистическую обработку полученных данных проводили метода­ ми непараметрической статистики [12]. Результаты и обсуждение. Учитывая важную роль модификации процессов ПОЛ в механизмах повреждения клетки ТХМ и его мета­ болитами [1, 2, 9, 13], представляло интерес изучение влияния флар­ аксина на эти процессы (табл. 1—5). Данный препарат обладает вы­ раженным антиоксидантным эффектом при определении величины ПОЛ в различных модельных системах in vivo (табл. 1, 3, 5) и in vitro (табл. 2, 4). Введение экспериментальным животным флараксина в Т а б л и ц а 2 Влияние флараксина на скорость накопления МДА (нмоль/мг белка за 2 ч) в гомогенатах печени интактных крыс в условиях in vitro (n=4) Показатель ПОЛ Контроль Флараксин, мг/мл 0,2 7,5 НЗП 6689,4 2614,3* 2800,0* НЗП, Д 4628,7 132,3* 716,7* АЗП 5808,6 181,1* 96,0* Неиницииро­ ванный контроль 623,5 397,4* 804,9* ва дооавлениого флараксина . дозе 4 мг/кг массы тела приводит к заметному ингибированию НАДФН- индуцированного ПОЛ в гомогенатах печени (табл. 1). Большая доза препарата (40 мг/кг массы тела), наоборот, оказывает прооксидант- ный эффект на процессы ПОЛ, индуцируемые НАДФН и зависимые от нагревания. При этом увеличивается также интенсивность ПОЛ в неинициированном контроле. При инкубации гомогенатов печени в ус­ ловиях индукции ПОЛ добавление в среду флараксина (табл. 2) до конечной концентрации 0,2 и 7,5 мг/мл приводит к достоверному сни­ жению скорости накопления МДА. Эффект выражен в гораздо боль­ шей степени, чем in vivo (табл. 1), и четче проявляется в случае мень­ шей концентрации препарата. При этом обнаружено ингибирование как индуцированного НАДФН, так и аскорбатом ПОЛ, а также липо- переокисления в неинициированном контроле. Отравление животных ТХМ с последующим определением уровня промежуточных продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов) в гомогенатах печени (табл. 3) сопро­ вождается увеличением интенсивности ПОЛ (нейтральных липидов, которые экстрагируются в гептановую фазу липидного экстракта). Вследствие одновременного введения животным флараксина (4 мг/кг массы тела) наблюдается некоторое снижение уровня ПОЛ как ней­ тральных липидов, так и фосфолипидов (выделяющихся при экстрак­ ции в изопропанольную фазу липидного экстракта, табл. 3). Количест­ во этих промежуточных продуктов ПОЛ значительно уменьшается при инкубации липосом с флараксином в условиях стимуляции липопере- окисления in vitro (табл. 4). Исследование антирадикальной активнос­ ти флараксина показало, что он может служить «ловушкой» стабиль­ ного радикала ТФВ (рис. 1). Это полностью соответствует результа­ там биохимических исследований. При изучении процессов спонтанного и индуцированного ПОЛ во фракциях РХ и TAX в условиях интоксикации животных ТХМ и вве­ дения флараксина было обнаружено следующее (табл. 5). Введение ТХМ вызывает угнетение процессов как спонтанного, так и индуциро­ ванного НАДФН ПОЛ во фракции TAX. Столь парадоксальный, на первый взгляд, факт может быть связан как с изменением жирнокис- лотного состава этой фракции хроматина в результате интоксикации [13], так и с изменением ее физико-химических свойств [14], в резуль- 72 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 15УЗ. Т. II. №. 1 тате чего, в'озможно, снижается доступность жирнокислотных остатков хроматин-связанных липидов действию окисляющих (повреждающих) агентов, в качестве которых могут быть свободные радикалы ТХМ и кислорода. Во фракции низкоактивного хроматина введение ТХМ вызывает стимуляцию ПОЛ, индуцированного внесением в среду инкубации ас- корбата. Подобная разнонаправлснность изменений интенсивности ре­ акций ПОЛ во фракциях хроматина при однократном введении ТХМ может быть обусловлена различными вариациями жирнокислотного состава и физико-химических свойств этих фракций под влиянием ин­ токсикации [13, 14]. Одновременное с ТХМ введение животным фла- оаксина оказывает нормализующий эффект на течение процессов ПОЛ в обеих фракциях хроматина. По всей вероятности, антиоксидантный и прооксидантный эффекты флараксина по отношению к различным фракциям хроматина могут быть реализованы вследствие изменения (нормализации) структурно-функциональных свойств хроматина, на­ рушенных в результате интоксикации ТХМ. Подобное предположение подтверждается результатами исследований, представленных в табл. 6 и 7 и на рис. 2—5. В табл. 6 приведены интегральные биохимические параметры структурной организации РХ и TAX в условиях интокси­ кации ТХМ и введения флараксина. При введении ТХМ отмечается увеличение доли TAX и соответственно снижение РХ, а также увели­ чение отношения белок/ДНК во фракции TAX. Введение животным флараксина нормализует данные параметры структуры хроматина. Подобные изменения структуры фракций хроматина не сопровождают­ ся увеличением их транскрипционной активности в условиях in vitro (табл. 6), что позволяет предположить наличие нарушений структур- Т а б л и ц а 3 Влияние флараксина в условиях in vivo (4 мг/кг массы тела) на содержание диеновых конъюгатов (нмоль/мг белка) в гомогенатах печени крыс при отравлении ТХМ (п=10—12) Фаза липидного экстракта Гептановая Изогаропа- нольная Контроль ТХМ ТХМ+ -(-флара- ксин 55,9 122,7* 113,4* 833,0 794,3 561,8* Т а б л и ц а 4 Величины индекса ПОЛ при инкубации липосом в среде с флараксином (п=4) Условия эксперимента Время инкубации, ч 24 0,239 0,281 48 0,655* Липосом ы ЛИ1ПОСОМЫ + +флараксин 0,283 0,332 0,187* *р<0,05 (по сравнению с контролем). * р<0,05 (по сравнению с 1-ч инкуба­ цией) Т а б л и ц а 5 Показатели ПОЛ во фракциях хроматина печени крыс в условиях интоксикации ТХМ и введения флараксина (п=4) Показатель ПОЛ нзп НЗП, А АЗП Неинициированный контроль Диеновые конъюгаты: гептановая фаза липидного экстракта изопропанольная фаза липидного экстракта Контроль 889,4 0 422.1 258,6 0 146,8 РХ ТХМ 1298,3 0 653,0* 250,9 0 132,6 ТХМ + + фларак- син 1279,5 0 442,3 225,0 0 159,5 Контроль 459,5 : 14,7 62,0 55,9 0 272,8 TAX ТХМ >74,6 1,0* 68,2 17,8* 0 146,8* ТХМ + + фларак* син 317,0 10,5 78,4 41,6 0 248,7 * ,р<0,05 (по сравнению с контролем). ISSN 0233-7037. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11. № 1 73 но-функциональной организации хроматина в результате интоксика­ ции ТХМ. ТХМ вызывает изменение функциональной активности хроматина, которой выражается в резком угнетении РНК-полимеразнэй активнос­ ти в РХ и TAX. При этом наблюдается снижение эндогенной актив­ ности как фракции ферментов, обогащенной РНК-полимеразой I, так и фракции, обогащенной РНК-полимеразой II. Введение флараксина оказывает частичный нормализующий эффект на функциональную ак­ тивность хроматина, в особенности репрессированного. Во фракции РХ лП Of 1,0 ff 2ft f/Cfg tOs,*w/ib/a Рис 2. Изменение оптической плотности раствора флараксина (ДО) при инкубации в среде лнпосом (/) и ЧСА (2) РИС. 3. ЗавИСПМОСТЬ І/ДО — 1/Сфлараксина генопротекторный эффект препарата связан с резкой стимуляцией ак­ тивности фракции, обогащенной РНК-полимеразой I. Вследствие это­ го, хотя активность фракции, обогащенной РНК-полимеразой II, и ос- тєется сниженной по сравнению с контролем в печени животных, ко­ торым вводили ТХМ и флараксин, тем не менее, тотальная РНК-поли- меразная активность достоверно не отличается у них по сравнению с контрольными значениями. Во фракции TAX введение флараксина оказывает незначительный генопротекторный эффект на эндогенную РНК-полимеразную активность хроматина, который проявляется в большей степени по отношению к активности фракции ферментов, обо­ гащенной РНК-полимеразой I. Т а б л и ц а 6 Структурно-функциональные характеристики фракционированного хроматина печени крыс в условиях интоксикации ТХМ и введения флараксина (п = 4) Показатель Доля фракции, % Отношение белок/ДНК Активность эндогенных РНК-полимераз (расп/мин на 1 мг ДНК): тотальная РНК-полимераза I РНК-поліимераза II Контроль 88,4 1,4 489413 34333 465080 РХ ТХМ 82,5* 1,6 233288* 1.1630* 221658* ТХМ+ + фларак- син 85,7 1,5 365725 119438* 246288* і Контроль 11,7 11,0 2723581 689796 1997758 TAX ТХМ 17,5* 13,0* 949952* 270769* 512693* ТХМ + + фларак- син 14,3 12,2 1055011* 327847* 596649* * р < 0 , 0 5 (по сравнению с контролем) 74 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11. № 1 В целом действие флараксина на эндогенную РНК-полимеразную активность фракций РХ и TAX в условиях интоксикации ТХМ прояв­ ляется в гораздо меньшей степени, чем таковое по отношению к про­ цессам ПОЛ. Этю позволяет предположить, помимо свободнорадикаль- ных механизмов повреждения хроматина ТХМ, также .наличие допол­ нительных механизмов нарушения функций генома, которые реализу­ ются, например, в результате связывания ТХМ с РХ и TAX [2]. По­ следнее способно вызывать изменение структуры двойной спирали ДНК в хроматине, что, в свою очередь, может искажать процесс транс- U, та Рис. 4. Кинетические кривые тепловыделения .реакции флараксина ( С = 13,3 мкг/.мл) с биосубстратами в 0,01 SSC: / — РХ (0,13 мг/мл по белку); 2 — TAX (0,28 мг/мл по белку); 6' — липосомы (0,67 ,мг/,мл); 4 — БОА (0,53 мг/мл); 5 — ДНК (0,53 мг/мл) крппции. Возможно также нарушение процесса считывания генетиче­ ской информации на этапе трансляции в клетках отравленных живот- пых [15], сопровождающееся синтезом функционально неполноценных молекул РНК-полимераз и, как следствие, искажением синтеза м- и рРНК. При этом нельзя исключить того, что корригирующий эффект на процессы трансляции у флараксина отсутствует. Итак, представленные результаты биохимических исследований свидетельствуют о нарушении функциональной активности фракциони­ рованного хроматина печени под влиянием ТХМ. Частично этот эффект обусловлен модификацией свободнорадикальных реакций переокиелс- иия хроматин-связанных липидов. Предположительно, интоксикация изменяет таким образом структуру фракций хроматина, что в РХ про­ является индуцирующий эффект аскорбата на процессы ПОЛ, в то время как в TAX жирнокислотные остатки хроматин-связанных липи­ дов становятся в результате интоксикации менее доступными проок- сидантному действию НАДФН по сравнению с контролем. Искажение структуры хроматина под влиянием действия ТХМ может также яв­ ляться одним из факторов, обусловливающих изменение его эндоген­ ной РНК-полимеразной активности. Можно предположить, что частич­ ный корригирующий эффект флараксина на течение процессов ПОЛ Т а б л и ц а 7 Относительная интенсивность полос поглощения в спектрах фракций РХ и TAX в условиях интоксикации животных ТХМ и введения флараксина (п — 4) Условии эксперимента Дгю/Дїво ДкоІДгт РХ Контроль 2,54 0.78 ТХМ 2,57 0,79 ТХМ+флг- раксин 2,53 0,77 Условия эксперимента -^гю/Лгео Дгяо'Дыо TAX Контроль 3,20 2 0 ТХМ 3,26 2,31* ТХМ+фла- раксин 3,44 2,05 * р<0,05 (по сравнению с контролем). ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1995. Т. П. № ) 7 5 в хроматине и на его РНК-синтезирующую активность может быть также обусловлен структуриой реорганизацией хроматина под влияни­ ем введения данного препарата. Для проверки изложенных предпо­ ложений 6ЫЛИ Проведены эксперименты, в которых определяли структурное состояние фракций хроматина в условиях интоксикации животных ТХМ и введения флараксина, а также эффекты непосредст­ венного взаимодействия флараксина с фракциями РХ и TAX in vitro физико-химическими методами. Результаты этих экспериментов пред­ ставлены в табл. 7 и на рис. 2—5. В 'исследуемой области спектров поглощения хроматина наблюда­ ются полосы, обусловленные хромофорами молекул ДНК, белков, а Рис. 5. Зависимость интенсивности флюоресценции 1,8-АНС (С = 10~5 М) во фракциях РХ (а) и TAX (б) от их концентрации по белку: /—контроль; 2 — ТХМ; 3—- ТХМ+ 4-флараксин также липидов, структура и организация которых при интоксикации могут нарушаться [4, 14]. В табл. 7 приведены спектральные парамет­ ры— относительные оптические плотности D/D2eo (A, 210 и 230 нм), от­ ражающие изменения в белковых или липидных участках хроматина (отношения белок/липид) при повреждениях хроматина, вызванных интоксикацией ТХМ, а также в условиях введения флараксина. Из представленных данных следует, что интоксикация ТХМ мало сказы­ вается на спектральных характеристиках фракц'ии РХ, в то время как в спектрах TAX наблюдается увеличение D23o/D2SO, свидетельствующее о возможном возрастании содержания липидов (белков) во фракции в условиях интоксикации. Введение животным1 флараксина нормализу­ ет данный показатель. Отношение D2W/D26o не изменяется существен­ ным образом при интоксикации ТХМ и введении флараксина ни в РХ, ни в TAX, что подтверждает неизменность суммарного содержания не- окисленных фосфолипидов во фракциях. Методами спектрофотометрии и микрокалориметрии была исследована способность флараксина к комплексообразованию с РХ и TAX. Как показало' спектрофотомётри- ческое титрование растворов хроматина (Сбелка = 22,8 и 20,7 мкг/мл для TAX и РХ соответственно) раствором флараксина, при весовых соотношениях флараксина и белка менее 1 : 1 наблюдается гиперхром- ный эффект при Х=290 нм; при больших — снижение оптической плот­ ности, что может указывать на межмолекулярное взаимодействие фла­ раксина с хроматином (данные не приведены). Регистрируемые изме­ нения оптической плотности малы и недостаточны для расчета констант равновесия реакций. Поэтому для выяснения вопроса о месте лока- 76 ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1»Э5. Т. II. № 1 Лизацик флараксина в хроматине было проведено спектрофотометрії- ческое титрование флараксином модельных систем — лецитиновых ли­ посом (U,2o мг/мл) и человеческого сывороточного альбумина (HOA, U,Uo мг/мл) . На рис. 2 приведены зависимости AD—Сфлараксина, где &D = Di—D0 {Di и D0— оптическая плотность флараксина при длине волны z/й и 29U нм без и в присутствии субстрата соответственно). При инкубации флараксина в среде липосом в его спектре поглощения наолюдается возрастание оптической плотности при 2Уи нм (кривая J) и снижение при 3oU нм, в то время как в растворе, содержащем Ч О А , отмечается снижение оптической плотности в данной ооласти (^278, кривая г), что может указывать на различные механизмы взаимодействия фларакси­ на с фосфолипидным оислоем и белковыми молекулами. hta основании данных спектрофотометрии в соответствии с [ ioj были построены зависимости i/au—і/с (рис. 6) для липосом к р и ­ вая 1) и чСА (кривая 2), из которых оыли оценены константы равно­ весия их реакции с флараксином, равные соответственно: (o.u^to.o; • ю* и (2,4±и,э) • 1U-* М - ' - л . Одинаковый порядок величин г\р свидетельст­ вует оо ооразовании флараксином прочных комплексов как с - ю л , так и с липидным компонентом хроматина (на основании его связывания с липосомами), что, вероятно, свидетельствует о наличии конкуренции за места связывания с этими ооразованиями in vivo, изаимиденсшие флараксина с хроматином и его компонентами, подтверждают также микрокалориметрические исследования, п а рис. 4 приведены кине іи- ческие криьые тепловыделения реакции флараксина с г л ^кривая і) и І А Л (кривая 2). л а к можно видеть, кинетика тепловыделения и ин­ тенсивность различны для и К и і л л : в первом случае максимум теп­ лового эффекта наолюдается через '2—6 мин после смешивания раство­ ров, во втором — через ь—1U мин. Для выяснения природы взаимо­ действия исследованных реагентов эти данные оыли сопоставлены с результатами, полученными для модельных систем: фосфатидилхоли- новых липосом (рис. 4, кривая о), оычьего сывороточного альоумина ( о ь л , кривая 4) и Д ш \ (кривая о), д л я реакции с Р Л характер за­ висимости олизок к дгіі\-взаимодеиствию, £ то время как во фракции і АЛ кинетические кривые аналогичны таковым для липосом или DL.A. Величины теплового эффекта взаимодействия флараксина с Т А Л И ЬОА близки, что дает возможность предположить доминирующий вклад в этот процесс иелкового компонента хроматина, іакое предпо­ ложение подтверждается полученными данными при исследовании ИРИС в системах хроматин — пирен и хроматин — флараксин — пи­ рен! В соответствии с | У ] , в присутствии пирена при возбуждении бел­ ковой флюоресценции хроматина (28Ь нм) имеет место JKIFHC>( С бел­ ковых флюорофоров на акцептор — флюоресцентный зонд пирен. По результатам тушения флюоресценции оыли рассчитаны вероятности и/ переноса энергии с оелдовых флюорофоров РА и Т А Х на пирен (U,4U и 0,18 соответственно). При инкубации хроматина в присутствии фла­ раксина (5 мкг/мл) наблюдается еще оолее зфіфективное тушение оел- ковой флюоресценции хроматина. Оцененные вероятности переноса энергии в таких системах оказались равными для РХ и ТАЛ 0,/1 и 0,82 соответственно. Ьолее высокие значения W в присутствии фла­ раксина обусловлены, по-видимому, пертурбациями в структуре белко­ вых флюорофоров хроматина, сопровождающимися уменьшением рас­ стояния между донором: и акцептором энергии. Подобные изменения возможны как в условиях более компактной структуры белков хрома­ тина, модифицированной флараксином, так и при большей вероятности встраивания пирена в липидную составляющую хроматина при сни­ жении ПОЛ (учитывая антиоксидантное действие флараксина) . Ьоль* шее значение W в случае TAX по сравнению с, РХ в присутствии фла­ раксина согласуется с предположениями, сделанными нами о природе его взаимодействия с РХ и TAX на основании данных микрокалори­ метрии. Было показано, что взаимодействие флараксина с TAX про- ISSN 02S3-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11. jVs 1 7? исходит пр-еимущёственнд с участием белковых структур. Не столь зна­ чительное возрастание W (менее чем в 2 раза) в случае РХ связано, очевидно, со взаимодействием флараксина с ДНК в этой фракции хроматина. Более того, фларакснн может в ИРПЭ выступать в качестве посредника между донором и акцептором ввиду того, что энергетиче­ ский уровень флараксина (Л.фЛЮоресценции=350 нм) является промежу­ точным между триптофанилом (ЯфЛюоресценции = 330 нм) и пиреном (/^флюоресценции = 3 7 0 НМ И В Ы Ш е ) . Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что внедрение флараксина в структуру хроматина приводит к струк­ турно-динамическим изменениям в глубинных гидрофобных участках хроматина. Изменения поверхностных свойств хроматина под влиянием фла­ раксина изучали с помощью анионного зонда 1,8-АНС. На рис. 5 приве­ дены зависимости интенсивности флюоресценции зонда от концентра­ ции хроматина (по белку) для фракций РХ и TAX. В РХ при интокси­ кации ТХМ значительно снижается способность зонда к встраиванию (кривая 2), что может быть как результатом возрастания отрица­ тельного заряда поверхности липидного компонента хроматина, так и уплотнениям поверхности в результате структурных пертурбаций. Вве­ дение животным флараксина способствует нормализации данного па­ раметра: встраивание АНС происходит более интенсивно (кривая 3), чем в контрольных образцах (кривая / ) . В отличие от РХ, в TAX 'ин­ токсикация животных ТХМ приводит к возрастанию встраивания зон­ да (кривая 2), что может свидетельствовать об уменьшении отрица­ тельного заряда поверхности липидного компонента хроматина либо о ее разрыхлении. Инъекция животным флараксина несколько снижа­ ет этот эффект (кривая 3), приближая значения интенсивности свече­ ния зонда к контролю (кривая 1). Следует учесть, однако, что опреде­ ленный вклад в рассматриваемые процессы встраивания АНС может вносить различное содержание белка в РХ и TAX. По-видимому, вза­ имодействие флараксина с ДНК во фракциях РХ в условиях in vivo модифицирует его поверхность, повышает эффект встраивания зонда, в отличие от TAX, где количество белков значительно выше. Поэтому образование комплекса белок — флараксин способствует уплотне­ нию поверхности, вследствие чего возможность встраивания зонда уменьшается. Следовательно, в настоящей работе показано, что флараксин вы­ зывает изменение свойств как внутренних глубинных (гидрофобных) участков, так и поверхности хроматина благодаря своей способности образовывать межмолекулярные комплексы с белками, липидами, а также с ДНК хроматина. Поскольку РХ и TAX отличаются по белко­ вому, липидному составу, а также по содержанию ДНК [17], на­ блюдаются значительные различия в кинетике их взаимодействия с флараксином. Суммируя изложенное выше, можно заключить, что в результате изучения влияния препарата «Флараксин» на структурно-функциональ­ ную организацию ядерного хроматина печени крыс в условиях инток­ сикации ТХМ было обнаружено наличие у этого препарата генопро- текторных свойств. По крайней мере частично, данный эффект обуслов­ лен антиоксидантными свойствами препарата, что находит свое выражение в нормализации течения реакций переокисления хроматин- связанных липидов. Выявленное в экспериментах на модельных систе­ мах связывание препарата с ДНК в РХ и белками и липидами в TAX может лежать в основе реализации его генопротекторного эффекта, препятствуя, таким образом, свободнорадикальному повреждению ком­ понентов ядерного хроматина либо изменяя конформацию этих компо­ нентов, вследствие чего они становятся невосприимчивыми к действию свободных радикалов, либо связывая свободные радикалы и, значит, предохраняя структуру хроматина от повреждения. 78 ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛПТКЛ. 1093. Т. П. № 1 Наличие по отношению к ядерному хроматину защитного эффекта у препарата «Флараксин» коррелирует со снижением смертности жи­ вотных в результате интоксикации ТХМ (68,9 % без флараксина и 33,3 % с препаратом, р<0,05). Ю. І. Губський, Є. Л\ Левицький, I. О. Кулик, Г. Г. Горюшко, Р. Г. Примак, Л. Г. Саченко, І. Є. Вістунова ВИВЧЕННЯ ГЕНОПРОТЕКТОРНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ПРЕПАРАТУ «ФЛАРАКСИН» ЗА УМОВ ПОШКОДЖУЮЧОЇ Ді ї ТЕТРАХЛОРМЕТАНУ Р е з ю м е Виявлено наявність генопротекторних властивостей у протипухлинного препарату «Флараксин» за умов пошкодження хроматину тетрахлорметаном. Щонайменше част­ ково цей ефект зумовлений антиоксидантними властивостями препарату, що виража­ ється у нормалізації реакцій переокислення ліпідів у фракціях транскрипційно актив­ ного та репресованого хроматину. Часткова корекція структурно-функціональних вла­ стивостей хроматину за умов ушкодження тетрахлорметаном найімовірніше реалізу­ ється внаслідок зв'язування флараксину з функціонально неоднаковими ділянками хроматину, причому характер взаємодії відрізняється для різних ділянок. Якщо у транскрипційно активній фракції взаємодія обумовлена зв'язуванням препарату го­ ловним чином з білками хроматину, то у репресованому хроматині — з ДНК. Утво­ рення подібних комплексів флараксину з компонентами хроматину не перешкоджає реалізації генетичної інформації, однак запобігає ушкодженню хроматину вільними радикалами кисню та тетрахлорметану. Yu. I. Gubskiy, Е. L. Levitsky, I. A. Kulick, A. G. Goryushko, R. G. Pritnak, L. G. Sachenko, I. E. Vistunova STUDY OF GENOPROTECTIVE FEATURES OF PREPARATION «FLARAKSIN» IN CONDITIONS OF TETRACHLOROMETHANE DAMAGE ACTION S u m m a r y The presence of genoprotective features of antitumour preparation «Flaraksin» in con­ ditions of the rat liver nuclear chromatin damage by tetrachloromethane was revealed. At least partially this effect may be conditioned by antioxidant action of the prepara­ tion. This action is expressed as a normalization of the lipoperoxidation reactions in the transcriptionally active and repressed chromatin fractions. Partial correction of chromatin structural and functional characteristics in condition of chromatin damage by tetrachloromethane is realized probably in result of flaraksin bounding to functionally different chromatin sites. The character of this bounding is various in these sites. If in active fraction interaction is caused mainly by chromatin proteins, then in repressed one — DNA. Such chromatin-flaraksin complexes do not prevent the genetic information realization, however they protect the nuclear chromatin from damage by oxigen and tetrachloromethane free radicals. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Левицкий Е. Л., Фальковская Е. И. Ранние изменения а хроматине печени при интоксикации тетрахлорметаном // Фармакология и токсикология. Респ. межведом­ ств. сборник.— Киев : Здоровья, 1992.— С. 32—35. 2. Губский 10. И., Левицкий, Е. Л., Жила В. А. и др. Молекулярные механизмы повреждения фракционированного хроматина печени тетрахлорметаном // Вопр. мед. химии.— 1992.— 38, № 3.—С. 54—58. 3. Губский 10. И., Левицкий Е. Л. Механизмы перекисного окисления липидов фрак­ ций хроматина печени крыс // Биополимеры и клетка.— 1993.— 9, № 5.— С. 34—43. 4. Губский 10. И., Левицкий Е. Л., Примак Р. Г. и др. Влияние витамина Е на структурно-функциональную организацию хроматина печени в условиях поврежде­ ния тетрахлорметаном // Биополимеры и клетка.— 1993.— 9, № 3.— С. 27—34. 5. Губский 10. И., Левицкий Е. Л., Холодова Ю. Д. и др. Механизмы генопротек' торного действия препарата на основе фитоэкдистероидов (БТК-8Л) в условиях повреждения хроматина тетрахлорметаном // Укр. биохим. журн — 1993 — 65, № 6.— С. 75—83. ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т, 11, № 1 79 t>. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. ПереКЙсноё окисление липидбв в биологических' мембранах.— М. : Наука, 1972.— 252 с. 7. Лебедь О. И., Стефанов А. В., Примак Р. Г. Влияние условий ультразвуковой обработки на характеристики формирующихся липосом // Укр. биохим. журн.— 1989 — 61, № 3.—С. 96—101. 8. Мельничук В. А., Починок Т. В., Портнягина В. А. и др. Антиокислительная актив­ ность некоторых лекарственных средств растительного происхождения // Фарма­ кология и токсикология. Респ. межведомст. сборник.— Киев : Здоровья, 1988.— С. 79-ЯЗ. 9. Владимиров Ю. А., Добрецов Г. Е. Флюоресцентные зонды в исследовании биоло­ гических мембран.— М. : Наука, 1980.— 320 с. 10. Добрецов Г. Е. Флюоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липо- протеинов.— М. : Наука, 1989'.— 277 с. 11. Постное Ю. В., Орлов С. Н. Первичная гипертензия как патология клеточных мембран.— М.: Медицина, 1987.— 192 с. 12. Ашмарин И. П., Васильев Н. Н., Амбросов В. А. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов.— Л. : Изд-во ЛГУ, 1975.— 78 с. 13. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Волков Г, Л. Жирнокислотный состав фракций хроматина печени крыс в условиях стимуляции перекисного окисления липидов // Укр. биохим. журн—1991.—63, № 1.— С. 87—91. 14. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Примак Р. Г. и др. Изменение структурного со­ стояния фракционированного хроматина печени при активации перекисного окис­ ления липидов // Биополимеры и клетка.— 1991.— 7, № 3.— С. 89—94. 15 Губский Ю. И. Коррекция химического поражения печени.— Киев : Здоров'я, 1989.— 168 с. 10. Свердлова О. В. Электронные спектры в органической химии.— Л. : Химия, 1985.—• 248 с. Г.". Левицкий Е. Л., Губский Ю. И., Чабанный В. Н. и др. Биохимическая характери­ стика фракций транскрипционно активного и репрессированного хроматина пе­ чени крыс // Биополимеры и клетка.—1993.— 9, № 6.— С. 11—21. И.І т фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев Получено 14.06.94 ВО iSSN 02S3-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11. № І

Ähnliche Einträge