Структурно-функциональный анализ промоторной области гена алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha

Исследовано влияние делеций в промоторе гена алкогольоксидазы (ЛОХ) на экспрессию генов lacZ Escherichia coli и ЛОХ Н. polymorpha. Показано, что область между –403 п. о. и кодоном ATG промотора АОХ абсолютно необходима для транскрипции гена и ее регуляции в метилотрофных дрожжах. Установлено прис...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1995
Автори:	Витвицкая, О.П., Злочевский, М.Л., Бебуров, М.Ю.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1995
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155664
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Структурно-функциональный анализ промоторной области гена алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha / О.П. Витвицкая, М.Л. Злочевский, М.Ю. Бебуров // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 2. — С. 39-45. — Бібліогр.: 27 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-155664
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1556642019-06-18T01:27:18Z Структурно-функциональный анализ промоторной области гена алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha Витвицкая, О.П. Злочевский, М.Л. Бебуров, М.Ю. Исследовано влияние делеций в промоторе гена алкогольоксидазы (ЛОХ) на экспрессию генов lacZ Escherichia coli и ЛОХ Н. polymorpha. Показано, что область между –403 п. о. и кодоном ATG промотора АОХ абсолютно необходима для транскрипции гена и ее регуляции в метилотрофных дрожжах. Установлено присутствие в промоторе участков, активирующих экспрессию. Обнаружены различия в регуляции экспрессии гена, находящегося под контролем промотора АОХ, в дрожжах Н. polymorpha и Saccharomyces cerevisiae. Досліджено вплив делецій в промоторі гена АОХ на експресію генів lac Z Escherichia coli і АОХ Н. polymorpha. Показано, що область між –403 п. о. і кодоном ATG про мотора АОХ абсолютно необхідна для транскрипції гена і її регуляції у метилотрофних дріжджах. Встановлено присутність у промоторі ділянок, активуючих експресію. Виявлено відмінності в регуляції експресії генів, що знаходяться під контролем промотора АОХ, у дріжджах Н. polymorpha і Saccharomyces cerevisiae. The influence of deletions in the AOX promoter on the Escherichia coli lacZ and the H. polymorpha AOX gene expression has been studied. It was shown, that the region between –403 bp and ATQ codon is absolutely necessary for gene transcription and its regulation in the methylotrophic yeasts. The upstream activating sequences (UASS) of the AOX promoter have been determined. The differences of gene expression regulation under the control of the AOX promoter in the yeast H. polymorpha and Saccharomyces cerevisiae have been found. 1995 Article Структурно-функциональный анализ промоторной области гена алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha / О.П. Витвицкая, М.Л. Злочевский, М.Ю. Бебуров // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 2. — С. 39-45. — Бібліогр.: 27 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0003DE http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155664 575.224:582.282.23 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
description	Исследовано влияние делеций в промоторе гена алкогольоксидазы (ЛОХ) на экспрессию генов lacZ Escherichia coli и ЛОХ Н. polymorpha. Показано, что область между –403 п. о. и кодоном ATG промотора АОХ абсолютно необходима для транскрипции гена и ее регуляции в метилотрофных дрожжах. Установлено присутствие в промоторе участков, активирующих экспрессию. Обнаружены различия в регуляции экспрессии гена, находящегося под контролем промотора АОХ, в дрожжах Н. polymorpha и Saccharomyces cerevisiae.
format	Article
author	Витвицкая, О.П. Злочевский, М.Л. Бебуров, М.Ю.
spellingShingle	Витвицкая, О.П. Злочевский, М.Л. Бебуров, М.Ю. Структурно-функциональный анализ промоторной области гена алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha Биополимеры и клетка
author_facet	Витвицкая, О.П. Злочевский, М.Л. Бебуров, М.Ю.
author_sort	Витвицкая, О.П.
title	Структурно-функциональный анализ промоторной области гена алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha
title_short	Структурно-функциональный анализ промоторной области гена алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha
title_full	Структурно-функциональный анализ промоторной области гена алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha
title_fullStr	Структурно-функциональный анализ промоторной области гена алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha
title_full_unstemmed	Структурно-функциональный анализ промоторной области гена алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha
title_sort	структурно-функциональный анализ промоторной области гена алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей hansenula polymorpha
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1995
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155664
citation_txt	Структурно-функциональный анализ промоторной области гена алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha / О.П. Витвицкая, М.Л. Злочевский, М.Ю. Бебуров // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 2. — С. 39-45. — Бібліогр.: 27 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT vitvickaâop strukturnofunkcionalʹnyjanalizpromotornojoblastigenaalkogolʹoksidazymetilotrofnyhdrožžejhansenulapolymorpha AT zločevskijml strukturnofunkcionalʹnyjanalizpromotornojoblastigenaalkogolʹoksidazymetilotrofnyhdrožžejhansenulapolymorpha AT beburovmû strukturnofunkcionalʹnyjanalizpromotornojoblastigenaalkogolʹoksidazymetilotrofnyhdrožžejhansenulapolymorpha
first_indexed	2025-07-14T07:51:23Z
last_indexed	2025-07-14T07:51:23Z
_version_	1837607926886301696
fulltext	УДК 575.224:582.282.23 О. П. Витвицкая, М. Л. Злочевский, М. Ю. Бебуров СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ HANSENULA POLYMORPHA Исследовано влияние делеций в промоторе гена алкогольоксидазы (ЛОХ) на экспрес сию генов tacZ Escherichia coll и ЛОХ Н. polymorpha. Показано, что область меж ду —403 п. о. и кодоном ATG промотора АОХ абсолютно необходима для транскрип ции гена и ее регуляции в метилотрофных дрожжах. Установлено присутствие в про моторе участков, активирующих экспрессию. Обнаружены различия в регуляции экспрессии гена, находящегося под контролем промотора АОХ, в дрожжах Н. poly morpha и Saccharomyces cerevlslae. Введение. В последнее время за рубежом широко ведутся работы по созданию штаммов—продуцентов гетерологичных белков на базе ме тилотрофных дрожжей [1—3]. Главное преимущество их перед тради ционными сахаромицетами состоит в наличии сильных промоторов уни кальных генов, кодирующих ферменты метаболизма метанола. Так, промотор гена алкогольоксидазы (рАОХ) — первого фермента окисле ния метилового спирта — способен обеспечить синтез алкогольоксидаз- ного белка в количестве, равном 30% общего белка клетки [4]. Кро ме того, он является строгорегулируемым промотором, осуществляю щим репрессию/дерепрессию и индукцию транскрипции сцепленного гена [5]. Изучение структурно-функциональных характеристик промоторов дрожжевых генов занимает значительное место в выяснении механиз мов регуляции их транскрипции. Довольно хорошо изучены промото ры таких дрожжевых генов, как CYC1 и CYC7 [6], GAL1 — GAL10 [7], ADH2 [8] и др. Так, для многих из них установлено наличие UAS-последовательностей, связывающихся с позитивными факторами регуляции (активаторами), и URS-последовательностей, участвующих в репрессии [9—11]. Структурная часть гена АОХ Н. polymorpha вместе с 5'-некодиру- ющей областью клонированы в 1985 г.; установлена их нуклеотидная последовательность [12]. Но структура промотора, его роль в регу ляции изучены еще недостаточно. Пока в литературе было единствен ное сообщение о картировании регуляторных последовательностей про мотора АОХ [13]. В представленной работе сделана попытка методом делеционного анализа установить области промотора гена АОХ, отвечающие за ак тивацию и репрессию транскрипции гена р-галактозидазы, на модели pAOX-/acZ, а также в хромосомном локусе гена АОХ. Материалы и методы. В работе использовали штаммы дрожжей Н. polymorpha CBS4732 8v (Ieu2), НРБ (ade2, his3, trp2. aox~) и S. cerevisiae 146a (ura3, his3, trp2, 1еи2); бактерий E. colt C600 (p~, thi-1, tgr-1, leuB6, lacYl, tonA21, supE44, X~) и JM103 (Д/lac pro/, thi, strA, supE, endA, sbcB, hsdR", F' , traD36, proAB, lacJ^, ZAM15). Дрожжи, выращивали в стандартных средах YPD или YNB с до бавлением аминокислот (50 мг/л) и источника углерода (как указано в тексте). Бактерии выращивали в среде LB с добавлением, если это © О. П. ВИТВИЦКАЯ, М. Л. ЗЛОЧЕВСКИЙ, М. Ю. БЕБУРОВ, 1995 ISSN (ШЗ-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11. № 2 QQ необходимо, ампициллина (100 мг/л) [14]. Культивирование проводи ли либо на чашках Петри, либо в колбах на качалке при 37 °С для Е. coli и Н. polymorpha, или 28 °С для S. cerevisiae. Плотные среды со держали агар — 20 г/л. Плазмид'ную ДНК из Е. coli выделяли по методу [15]; ДНК дрож жей— согласно методу [16]. Бактерии трансформировали по методике с СаС12 [17], а дрож жи— в присутствии ионов Li+ [18]. Гибридизацию дрожжевой ДНК с меченым зондом осуществляли по Саузерну. Зонд получали ник-трансляцией, как описано там же [14]. Активности ферментов р- і аблица і галактозидазы и АОХ опреде- Активность ^-галактозид азы в дрожжах „„„„ „ „«^WM^n tTv т^тт^т™ в присутствии разных источников углерода л я л и в дрожжевых колониях Источник углерода на чашках Петри [19, 20] или Активность, н м о л ь - м и н - ' X В бесклеточных экстрактах хмг белка-1 [21, 22]. При этом были про- н. Poiymorpha\ s.cerevisiae анализированы, как минимум, два клона. Экстракты получа- Глюкоза (2 %) 0 310±30 ли разрушением клеток при Без углерода 2500±150 1060±50 помощи стеклянных шариков Глицерин (2 %) 950±50 3080±50 На вибраторе. Удельные ак- & / № 1300l0±80° X S ° o ™в«ос™ Ф е Р м е н т о в . - .ража-. ли в нмоль продукта (субстра- Примечание. Дрожжи выращивали в ере- та)> образованного (расходо- де с глюкозой до середины log-фазы и затем ванного) 1 мг белка за 1 мин. инкубировали в среде указанного состава в те- Белок определяли по Лоури с ч е н и е 1 5 4 - со авт. [23]. В работе использовали рестриктазы, нуклеазу ВаІЗІ, ДНК-лигазу, ДНК-полимеразу I произ водства НПО «Фермент» (Вильнюс). Результаты и обсуждение. Для изучения влияния делеций на экс прессию гена, находящегося под контролем промотора АОХ в плазми- де, был сконструирован вектор pMG, содержащий pAOX-lacZ конструк цию. Исходная плазмида YEp356R включала ген lacZ E. coli, кодирую щий р-галактозидазу, ген URA3 S. cerevisiae, 2 мкм ДНК, фрагмент бактерийной плазмиды, содержащий ген устойчивости к ампициллину и о/ч-сайт [24]. Вектор pMG получили вставкой в полилинкер плазми ды YEp356R HindiII-ЕсоR1-фрагмента 5'-некодирующей области гена АОХ [25] и гена LEU2 S. cerevisiae. Частота трансформации плазми- дой pMG дрожжей была 50—100 Ьеи+ колоний на 1 мкг ДНК. Все трансформанты содержали р-галактозидазу. Стабильность их после вы ращивания на протяжении 10 генераций в неселективных условиях со ставляла 90 % для Н. polymorpha и 75 % для S. cerevisiae. В клетках метилотрофных дрожжей экспрессия гена lacZ под кон тролем промотора АОХ регулировалась так же, как и экспрессия соб ственного гена АОХ, т. е. глюкозной и этанольной репрессией/дерепрес- сией и метанольной индукцией (определяли по окрашиванию колоний на чашках Петри, содержащих разные источники углерода). В отли чие от Н. polymorpha, в клетках S. cerevisiae глюкоза полностью не репрессировала синтез р-галактозидазы, а глицерин и этанол индуци ровали его (табл. 1). Эти данные указывают на различия в механиз мах экспрессии генов под контролем промотора АОХ в метилотрофных и пекарских дрожжах. В работе [12] высказано предположение о том, что регуляторные элементы промотора АОХ расположены между Ps/Z-сайтами, посколь ку эта область содержит последовательности двойной симметрии, спо собные образовывать петельные структуры. Поэтому план исследова ний заключался в последовательном делетировании ^//-фрагментов промотора и изучении влияния делеций на активность р-галактозида зы. Плазмида pMGA2 с делецией двух /^//-фрагментов была получе на расщеплением плазмиды pMG рестриктазой PstI с последующим 40 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11. М . 2 сшиванием «липких» концов ДНК-лигазой. Плазмиду pMGAl получи ли в результате встраивания первого Ps^-фрагмента, элюированного из геля, в Pstl-саит вектора pMGA2. Для исследования области промото ра, расположенной справа от Ps/7-сайтов, плазмиду pMGA2, расщеп ленную PstI, обрабатывали в течение разного времени нуклеазой Bal3L При этом получили набор векторов с делециями промотора разной дли ны (pMGA3 — pMGA7). Вектор 47R с укороченным до 98 п. о. промо тором образован в результате замены HindiII-EcoRl-фрагмента плаз- миды pMG на Есо473-ЕсоЯ1-фрагмепт промотора с последующей встав кой гена LEU2. Набором полученных векторов трансформировали штамм 8v. Влияние делеций на экспрессию гена lacZ изучали по ак тивности р-галактозидазы (табл. 2). Из данных, представленных в табл. 2, следует, что полученные нами делеций в промоторе АОХ сни жают активность р-галактозидазы в условиях дерепрессии и метаноль- ной индукции, но не влияют на глюкозную репрессию. Удаление одно го из двух /^/-фрагментов приводило к некоторому снижению уровня экспрессии гена lacZ, в то время как делетирование области между —403 и —98 п. о. сопровождалось резким падением активности (3-га- лактозидазы. Поскольку ген lacZ находился в плазмиде, можно было допустить влияние иных факторов (не только делеций) на его экспрессию. Что бы исключить это, мы получили делеций промотора в хромосомном ло- Та&/шца2 Влияние делеций в промоторе АОХ на жсоресси/о гена lacZ? кодирующего J3- галах/пазидазу £. сои \| Вен тор 1 рма і \pMGA1 і рМ0А2 \pMBAd \pMGA4 \pM6A5 1 \рШ6 хр№А7 I \47R Схема промотора АОХ и его делеционных яроизбодных р р Р Р _J L Р __1 чооо — Р EA7J і Р 1 Р 1 -40J -д50 -ъю -280 -270 -260 -38 Актибность р-галактозидащ нмоль-тш '• мг&елка'1 \ Оіюкоза О 0 0 0 0 0 0 0 О • -С \Метанол \ 2500150\WO0i8001 J000t150\ 3500500 \ 700 ±50 ,5500100 \ /00*2 \| - ' 325 і - I 535 \| - I 303 \| - I 201 \| - 1 w±i \| ! I П р и м е ч а н и е . Дрожжи выращивали в среде ,с глюкозой ('2%) и затем инкубировали в среде с метанолом (1 %) или без источника уг лерода (—С) в течение 15 ч. Прочерк означает отсутствие активности при качественном определении на чашках Петри. ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11. № 2 41 file:///pMGA1 file:///pMBAd file:///pMGA4 file:///pM6A5 кусе гена АОХ с помощью ряда интегративных векторов. Интегратив- ные векторы были сконструированы на базе гена АОХ Н. polymorpha. Они содержали структурную часть гена АОХ вместе с его фланкиру ющими последовательностями. В 5'-области векторов pHPMl и рНРМ2 располагался дополнительно ген HIS3 Н. polymorpha, встроенный із StuI- (pHPMl) или Sphl-сайт (рНРМ2) промотора гена АОХ. На 3'- конце всех интегративных векторов находился ген TRP2, делетирован- ный в хромосомном локусе AOX-TRP2 реципиентного штамма НРВ. Делеции промотора АОХ в составе интегративного вектора рМ полу чали аналогично таковым в плазмиде pMG. В случае трансформации штамма НРВ векторами pHPMl и рНРМ2 большинство клонов имело фенотип His+Trp+Aox+, а в случае вектора рМ и его делеционных про изводных — фенотип Тгр+Аох+. Методом гибридизации по Саузерну было доказано, что вектор pHPMl интегрировал в хромосомный локус AOX-TRP2 Н. polymorpha. Влияние инсерций и делеций и а экспрессию гена АОХ изучали по активности АОХ (табл. 3). Эти данные подтверж дают результаты, полученные на модели pAOX-lacZ, о том, что уда ление Ps/7-фрагментов промотора АОХ сопровождается снижением уровня экспрессии сцепленного гена. Это позволяет предположить на личие в пределах Ps/7-фрагментов промотора АОХ последовательнос тей, играющих роль UAS-ов, активирующих транскрипцию. Наши дан ные согласуются с сообщением [13], указывающим на наличие пози тивно действующих элементов в промоторе гена АОХ Н. polymorpha. Изучив влияние делеций на экспрессию гена р-лактамазы, сцепленно го с промотором АОХ, а также метилирование различных областей про мотора, авторы утверждают, что UAS1 расположен между —505 и —472 п. о. и содержит последовательность TCCTTGCACCGCAA, а Таблица3 Влияние инсерций. и делеций б промоторе АОХ на жслрессию гена алкогольоксидазы 1 1 1 вектор Wt(8v) рНРМ1 \pHPMZ \| РМ I pMAf I ршг рМДЭ і р . • Г" I Р Р 1 И 1 Схема промотора АОХ интеграживного вектора H1SJ HIS3 р . _и^ ь Р 1 р 1 р 1 р 9Р і І Р 1 Р [ Р I Р [ Р Р 1 Р 1 Р 1 Р 1 1 Ашибность I алмеолбохсидазб/, \ н/иоль -лш7-м2 &елка~г \ Глюкоза о \ 0 1 0 1 о 1 ° \ ° 1 ° Метанол і 46335 1 34220 36020 ' 40525 ! 1 27318 \| \| m±fff \| 272 \| П р и м е ч а н и е . Дрожжи выращивали в среде со смесью глицерина (2 %) и метанола (I %) до середины log-фазы. 42 ISSN 02G3-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 19Є5. Т. 11. № 2 file:///pHPMZ UAS2 локализован в рамках —732 715 п. о. и состоит из TCGAGGTCGTGG. UASl-подобная последовательность (с единственной заменой 5-го Т на С) обнаружена в гене каталазы (CAT) Н. polymorpha в положении от —415 до —401 п. о. [26]. Поскольку экспрессия генов АОХ и CAT регулируется также кислородом, было высказано предпо ложение о том, что UAS1 также участвует в 02-зависимой регуляции этих генов [13]. Из данных табл. 2 следует, что участок промотора между —403 и —98 п. о. имеет существенное значение для транскрипции, так как де- леции в этой области приводят к резкому падению уровня экспрессии сцепленного гена, а промотор длиной 98 п. о. (вектор 47R) почти не способен обеспечить экспрессию. Одним из возможных объяснений это го факта может быть предположение, высказанное авторами работы [12], о том, что роль ТАТА-бокса в гене АОХ играет последователь ность ТАААТТ, расположенная в позиции —171, а не Golberg-Hogness- последовательность, которая находится в позиции —56 [12]. Это пред положение базируется на данных Si-картирования промотора, указы вающих на размещение точки инициации транскрипции на 105 п. о. влево от ATG. Большую значимость области промотора АОХ, расположенной меж ду UAS-последовательностями и ТАТА-боксом, можно объяснить ис ходя из модели, предложенной в работе [10], согласно которой ДНК между ТАТА-боксом и UAS-ми образует петлю. Это обеспечивает сте- рическое взаимодействие активаторов, связанных с UAS-ми, с транс крипционными факторами, связанными с РНК-полимеразой, необходи мое для инициации транскрипции. Возможно, последовательность про мотора АОХ вправо от —403 п. о. существенна для образования такой петельной структуры. Иным объяснением важной роли этой последо вательности промотора может быть наличие в ее пределах сайтов свя зывания с факторами, непосредственно активирующими транскрипцию в условиях дерепрессии и/или индукции. Для другого вида метилотрофных дрожжей P. pastoris было уста новлено, что последовательность, локализованная на 180 п. о. влево от ТАТА-бокса гена АОХ, абсолютно необходима для высокого уровня экспрессии в среде с метанолом, а также глюкозной репрессии. Эта же последовательность, независимо от ориентации и расстояния, вызывала метанольную индукцию и глюкозную репрессию гена HIS3 P. pas toris [27]. В работе [13] возможный сайт связывания промотора АОХ Н. po lymorpha с репрессором постулирован между —925 и —895 п. о. Полу ченные нами данные о делеции этой области отрицают высказанное предположение. По-видимому, сайты связывания с репрессором промо тора АОХ расположены справа от —403 п. о., но они не могли быть картированы с помощью нашей модели из-за отсутствия в делеционных производных, обработанных нуклеазой ВаІЗІ, UAS-ов, необходимых для инициации транскрипции. Сайты связывания с репрессором (URS) между UAS-последовательностями и ТАТА-боксом установлены для генов GAL-системы (GAL1 и GAL4) [11]. Выводы. Таким образом, в результате делеционного анализа про мотора гена АОХ установлено, что последовательность между —403 п. о. (от ATG) и точкой инициации трансляции (ATG) играет важную роль в транскрипции сцепленного гена в условиях дерепрессии/индук- ции, а также глюкозной и этанольной репрессии в дрожжах Н. poly morpha. Слева от этой области до —1000 п. о., очевидно, расположены UAS-последовательности, активирующие экспрессию гена. URS-сайты, участвующие в репрессии, нами не обнаружены. Высказано предполо жение о том, что они находятся справа от —403 п. о. Авторы благодарны проф. А. А. Сибирному за обсуждение резуль татов работы. ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11. № 2 43 О. П. Витвицька, М. Л. Злочевський, М. Ю. Бебуров СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ АНАЛІЗ ПРОМОТОРНОЇ ОБЛАСТІ ГЕНА АЛКОГОЛЬОКСИДАЗИ МЕТИЛОТРОФНИХ ДРІЖДЖІВ HANSENULA POLYMORPHA Р е з ю м е Досліджено вплив делецій в промоторі гена АОХ на експресію генів lac Z Escherichia coli і АОХ Н. polymorpha. Показано, що область між —403 п. о. і кодоном ATG про мотора АОХ абсолютно необхідна для транскрипції гена і її регуляції у метилотроф- них дріжджах. Встановлено присутність у промоторі ділянок, активуючих експресію. Виявлено відмінності в регуляції експресії генів, що знаходяться під контролем промотора АОХ, у дріжджах Н. polymorpha і Saccharomyces cerevisiae. О. P. Vitvitskaya, M. L. Zlochevskii, M. Yu. Beburov STRUCTURAL AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF METHYLOTROPHIC YEAST HANSENULA POLYMORPHA ALCOHOL OXYDASE GENE PROMOTER S u m m a r y The influence of deletions in the AOX promoter on the Escherichia coli lacZ and the # . polymorpha AOX gene expression has been studied. It was shown, that the region between —403 bp and ATG codon is absolutely necessary for gene transcription and its regulation in the methylotrophic yeasts. The upstream activating sequences (UAS5) of the AOX promoter have been determined. The differences of gene expression regu lation under the control of the AOX promoter in the yeast H. polymorpha and Saccha romyces cerevisiae have been found. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Cregg J. M., Vedvick T. S., Raschke W. C. Recent advances in the expression of the foreign genes in Pichia pastoris (Review) // Bio/Technology.—1993.—11.— P. 905—910. 2. Janovich A. Z., Melber K., Merckelbach A. et al. Simultaneous expression of the S and L surface antigens of hepatitis B, and formation of mixed particles in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // Yeast.— 1991.— 7.— P. 431—443. 3. Veale R. A., Guiseppin M. L. F., Van Eijk H. M. J. et al. Development of a strain of Hansenula polymorpha for the efficient expression of guar a-galactosidase // Ibid.—1992.—8.—P. 361—372. 4. Veenhuis M., Van Dijken J. P., Harder W. The significance of peroxisomes in the metabolism of one-carbon compounds in yeast // Adv. Microbiol, and Physiol.— 1983.—24.—P. 1—82. 5. Roggenkamp R., Janovicz Z., Stanikowsky В., Hollenberg C. P. Biosynthesis and regulation of the peroxisomal methanol oxidase from the methylotrophic yeast Han senula polymorpha // Мої. and Gen. Genet.—1984.—194.—P. 489—493. 6. Pfeiffer K.t Prezant Т., Guarente L. Yeast HAP1 activator binds to two upstream activation sites of different sequence // Cell.— 1987.— 49.— P. 19. 7. West G. R. W., Yocum R. R.t Ptashne M. Saccharomyces cerevisiae GAL1-GAL10 divergent promoter region: location and function of the upstream activating sequence UASs // Мої. and Gen. Biol.—1984.—4.—P. 2467. 8. Beier D. В., Sledziewski A., Young E. T. Deletion analysis identifies a region, upstream of the ADH2 gene of Saccharomyces cerevisiae, wich is required for ADRJ-mediated derepression // Ibid.— 1985.—5.—P. 1743—1749. 9. Bram R. /., Kornberg R. Specific protein binding to far upstream activating sequen ces in polymerase II promoters // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1985.— 82.— P. 43, 10. Guarente L. UASS and enhancers: common mechanism of transcriptional activation in yeast and mammals // Cell.—1988.—52.— P. 32. 11. Nehlin J.O., Cartberg N1., Ronne H. Control of yeast GAL genes by MIG1 repre ssor: a transcriptional cascade in the glucose response // EMBO J.— 1991.— 10, N 11.—P. 3373—3377. 12. Ledeboer A. M., Maat J., Visser C. et a/. Molecular cloning and characterization of a gene coding for methanol oxidase in Hansenula polymorpha Ц Nucl. Asids. Res.— 1985.— 13.— P. 3063—3082. 13. Godecke S., Hollenberg C. P. In vitro and in vivo DNA: protein interactions at the MOX-promoter of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha 11 Abstr. of 15th Int. conf. on yeast genet, and mol. biol.—Banff, 1990.—P. 280. 14 Maniatis Т., Fritsch E. F., Sambrook /. Molecular cloning. A laboratory manual.— New York: Cold Spring Harbor Lab, 1982.—250 p. 44 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11. № 2 15. Ish-Horowicz D., Burke J. F. Rapid and efficient cosmid vector cloning // Nucl. Asids Res.— 1981.— 9,— P. 2989. 16. Sherman F., Fink G. R., Hicks J. B. Methods in yeast genetics, a laboratory ma nual.—New York : Cold Spring. Harbor Lab., 1986.—280 p. 17. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning. A Laboratory manual.— Ibid, 1989. 18. I to H., Fukuda Y., Murata K., Kimura A. Transformation of intact yeast cells trea ted with alkali cations // J. Bacterid.— 1983.— 153.— P. 163—168. 19. Rose M., Botstein D. Construction and use of gene fusion to lacZ (bGal) that are expressed in yeast // Meth. Enzymol.—1983.—101.—P. 167—181. 20. Сибирный А. А., Титоренко В. И. Метод качественного определения алкогольок- сидазы и каталазы в дрожжевых колониях // Укр. биохим. журн.— 1986.— 58, № 5.— С. 65—68. 21. Miller J. L. Experiments in molecular genetics.— New York: Cold Spring Harbor Lab., 1972.—324 p. 22. Sibirny A. A., Titorenko V. L, Efremov B. D., Tolstorukov I. I. Multiplicity of mechanisms of carbon catabolite repression involved in the synthesis of alcohol oxidase in the methylotrophic yeast Pichia pinus // Yeast.— 1987.— 3.— P. 233. 23. Lowry O. H., Rosebrough N. L, Farr A. L.} Randall R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem.—1951.—193.—P. 265—275. 24. Myers A. M., Tzagoloff A., Kinney D. M.t Lusty C. J. Yeast shuttle and integrative vectors with multiply cloning sites suitable for construction of lacZ fusion // Gene.— 1986.—45.—P. 299—310. 25. Грачева В. В., Михайловер В. М., Щедрин А. В. и др. Предпосылки к созданию системы экспрессии генов в метилотрофных дрожжах Hansenuta polymorpha. Кло нирование гена метанолоксидазы // Биотехнология — медицине и народному хо зяйству : Сб. науч. тр. ВНИИСЭНТИ.— М. ; 1990 — С. 5—12. 26. Didion Т., Roggenkamp R. Deficiency of peroxisome assembly in a mutant of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // Curr. Gen.— 1990.— 7.— P/ 113—117. 27. Buckholz R., Lin Y.-C, Koutz P. Upstream sequences required for methanol/glucose regulation of the P. pastoris alcohol oxidase gene // Abstr. of 13th Int. conf. on yeast gen. and mol. biol.— Banff, 1986.—Vol. 2.—P. 45. Отд-ние регулятор, систем клетки Ин-та биохимии Получено 18.10.94 им. А. В. Палладина НАН Украины, Львов KSSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11. № 2 45

Структурно-функциональный анализ промоторной области гена алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha

Репозитарії

Схожі ресурси