Молекулярно-генетические аспекты мышечной дистрофии Дюшенна

Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) – Х-сцепленное рецессивное заболевание, связанное с прогрессирующим поражением мышц. Встречается с частотой 1: 3500 детей мужского пола. В настоящем обзоре представлены современные данные о структуре и локализации гена МДД, спектре мутаций и характеристика его белко...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1995
Автори:	Гришко, В.И., Лившиц, Л.А.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1995
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155756
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Молекулярно-генетические аспекты мышечной дистрофии Дюшенна / В.И. Гришко, Л.А. Лившиц // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 3-4. — С. 5-23. — Бібліогр.: 116 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-155756
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1557562019-06-18T01:27:25Z Молекулярно-генетические аспекты мышечной дистрофии Дюшенна Гришко, В.И. Лившиц, Л.А. Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) – Х-сцепленное рецессивное заболевание, связанное с прогрессирующим поражением мышц. Встречается с частотой 1: 3500 детей мужского пола. В настоящем обзоре представлены современные данные о структуре и локализации гена МДД, спектре мутаций и характеристика его белкового продукта – дистрофина. Обсуждается методология ДНК-диагностики и подходы к генотерапии МДД. М'язова дистрофія Дюшенна (МДД) – Х-зчеплене рецесивне захворювання, пов'язане з прогресуючим ураженням м'язів. Зустрічається з частотою 1 : 3500 дітей чоловічої статі. У представленому огляді наведено сучасні відомості про структуру і локалізацію гена МДД, спектр мутацій, а також характеристика його білкового продукту – дистрофіна. Обговорюється методологія ДНК-діагностики і підходи до генотерапії МДД. Duchene muscular dystrophy (DMD) is the X-linked recessive disorder resulting in progressive degeneration of the muscle. It affects about 1 in 3500 male children. Present review represents the modern date about DMD gene structure and localization the spectrum of mutations of DMD gene ,and characteristics of its protein product – dystrophine. The methodology of DNA diagnostic and approaches to the therapy of DMD are discussed. 1995 Article Молекулярно-генетические аспекты мышечной дистрофии Дюшенна / В.И. Гришко, Л.А. Лившиц // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 3-4. — С. 5-23. — Бібліогр.: 116 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0003E8 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155756 577.213.3 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
description	Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) – Х-сцепленное рецессивное заболевание, связанное с прогрессирующим поражением мышц. Встречается с частотой 1: 3500 детей мужского пола. В настоящем обзоре представлены современные данные о структуре и локализации гена МДД, спектре мутаций и характеристика его белкового продукта – дистрофина. Обсуждается методология ДНК-диагностики и подходы к генотерапии МДД.
format	Article
author	Гришко, В.И. Лившиц, Л.А.
spellingShingle	Гришко, В.И. Лившиц, Л.А. Молекулярно-генетические аспекты мышечной дистрофии Дюшенна Биополимеры и клетка
author_facet	Гришко, В.И. Лившиц, Л.А.
author_sort	Гришко, В.И.
title	Молекулярно-генетические аспекты мышечной дистрофии Дюшенна
title_short	Молекулярно-генетические аспекты мышечной дистрофии Дюшенна
title_full	Молекулярно-генетические аспекты мышечной дистрофии Дюшенна
title_fullStr	Молекулярно-генетические аспекты мышечной дистрофии Дюшенна
title_full_unstemmed	Молекулярно-генетические аспекты мышечной дистрофии Дюшенна
title_sort	молекулярно-генетические аспекты мышечной дистрофии дюшенна
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1995
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155756
citation_txt	Молекулярно-генетические аспекты мышечной дистрофии Дюшенна / В.И. Гришко, Л.А. Лившиц // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 3-4. — С. 5-23. — Бібліогр.: 116 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT griškovi molekulârnogenetičeskieaspektymyšečnojdistrofiidûšenna AT livšicla molekulârnogenetičeskieaspektymyšečnojdistrofiidûšenna
first_indexed	2025-07-14T07:59:48Z
last_indexed	2025-07-14T07:59:48Z
_version_	1837608457167962112
fulltext	УДК 577.213.3 В. И. Гришко, Л. А. Лившиц МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЫШЕЧНОЙ ДИСТРОФИИ ДЮШЕННА Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) — Х-сцепленное рецессивное заболевание, свя занное с прогрессирующим поражением мышц. Встречается с частотой 1: 3500 детей мужского пола. В настоящем обзоре представлены современные данные о структуре и локализации гена МДД, спектре мутаций и характеристика его белкового продук та — дистрофина. Обсуждается методология ДНК-диагностики и подходы к генотера- пии МДД. Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД)—наиболее распространенное и наиболее тяжелое заболевание из группы наследственных нейромы- шечиых патологий, характеризующееся прогрессирующим течением и встречающееся с частотой 1 : 3000 — 1 : 3500 у новорожденных мальчи ков [I]. Впервые клинические особенности заболевания были описаны французским врачом Duchenne de Boulogne в 1860 и В. Говером в 1880 гг. Х-сцслленный характер наследования мышечной дистрофии этого типа был установлен при изучении популяций мормонов в шта те Юта (США) Ф. Стифенсом и Ф. Тайлером в 1951 г., а позже под твержден Д. Болтоном в 1954 [2, 3]. Первые признаки заболевания, в частности, гипертрофию мышеч ной ткани икроножных мышц можно наблюдать уже с рождения. Ча ще всего они обнаруживаются после 3—5 лет. У больных появляется характерная переваливающаяся походка, ослабевают двигательные функции конечностей, исчезают многие рефлексы нервной системы. При тяжелом характере заболевания снижаются функции мышц, участву ющих в процессе дыхания, что осложняет течение легочных инфекций, затрудняет дыхание. Зачастую (о чем свидетельствуют встречающиеся у 60—90 % пациентов аномальные показатели электрокардиографии) имеет место клиническая кардиомиопатия [4, 5]. Приблизительно у 40 % мальчиков, больных МДД, наблюдается ярко выраженная умст венная отсталость, причем важно отметить, что при этом нарушение интеллекта не прогрессируют, а в головном мозге не обнаруживаются патологические изменения [6]. В особую клиническую форму выделяется еще одно заболевание, сходное с МДД,— мышечная дистрофия Беккера (МДБ), встречающая ся приблизительно в 10 раз реже первой. Клинические симптомы сход ны, но начинают проявляться в более позднем возрасте. Умственная отсталость встречается гораздо реже. Кроме того, если практически все' пациенты с МДД умирают в возрасте 12—20 лет, то большинство та ковых с МДБ сохраняет до старости даже способность самостоятельно передвигаться [7]. В 50—70-е гг. было проведено множество исследований, в кото рых предпринимались попытки выявить на биохимическом уровне пато логию у больных МДД. Оказалось, что у 60—70 % больных наблюда ется аномально высокая активность фермента, участвующего в метабо лических процессах мышц,— креатинфосфокиназы, превышающая нор мальную активность в 100—1000 раз [8]. Тем не менее неоднозначность результатов, полученных при исследовании большого количества боль- © В. И. ГРИШКО, Л. А. ЛИВШИЦ, 1995 ISSN 0233'-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И • КЛЕТКА. 1995. Т. 11, № 3 -4 5 ных МДД, не позволяла утверждать, что именно нарушение активности креатинфосфокиназы является первичным биохимическим дефектом [9] В начале &0-х гг. появились первые работы по описанию женщин с типичным фенотипом, соответствующим МДД. Цитогенетический ана лиз каржшшз этих женщин показал наличие транслокаций района Хр21 на другие хромосомы человека. Так, Гринштейн с соавт. устано вили наличие реципрокной транслокации Хр21-11 [10]. Позже были описаны случаи транслокаций Хр21-21, Хр21-3, Хр21-1, Хр21-4 [11, 12]. Для объяснения этих фактов была выдвинута гипотеза об инактивации нормальной Х-хромосомы и развитии МДД-фенотипа в связи с тем, что Х-хромосома с утраченным в результате транслокации участком Хр21 (где, очевидно, мог локализоваться ген, ответственный за развитие МДД) оказывалась в гемизиготном состоянии [13]. В тех же 80-х годах в связи с бурным развитием методов генети ческой инженерии стало возможным создание геномных библиотек от дельных хромосом человека [14]. Такие библиотеки были получены и для Х-хромосомы [15, 16]. Сразу же из них были выделены уникальные последовательности, обнаруживающие так называемый полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) [17]. Наличие или отсут ствие уникального сайта узнавания определенной эндонуклеазой рест рикции в таких последовательностях наследовалось как менделирую- щий признак, и поэтому целым рядом специалистов было высказано предположение о том, что такие последовательности будут тем новым поколением маркеров, ПДРФ-маркеров на уровне генома, которые при условии тесной ассоциации с мутантными фенотипами и в случае их точной хромосомной локализации явятся отправной точкой для карти рования генов, ответственных за развитие тяжелых наследственных па тологии человека. В 1985 г. была опубликована работа Дэвис с соавт., в которой представлены данные о выявлении двух ПДРФ-маркерных последова тельностей из библиотеки Х-хромосомы человека, сегрегирующих с МДД [18]. Одна из них была анонимной и имела номер 754, другая — кДИК-последовательностью гена орнитинкарбамаилтрансферазы. Гене тическое расстояние между этими последовательностями и МДД-локу- сом было определено приблизительно в 10 сМ (2 кроссинговера в 26 мейозах), а порядок расположения локусов — как МДД-754-ОКТ. После гибридизации in situ эти маркерные последовательности были локали зованы в районе Хр21 короткого плеча Х-хромосомы человека. Позже были найдены и другие ПДРФ-маркеры, ассоциированные с МДД [19]. Нортон с соавт., изучая транслокацию Хр21 у женщин с МДД-фено- типом, установили, что траислокационный сайт находится в блоке ге нов, кодирующих рибосомные РНК [20]. Зонды на основе генов рРНК были использованы для идентификации фрагментов генома, располо женных рядом с генами рРНК, среди которых предполагалось выявить и ген, ответственный за развитие МДД. Так, зонд на основе 28S рРНК обнаруживал ПДРФ, неравновесно сцепленный с МДД. В результате этих исследований из библиотеки Х-хромосомы был выделен клон, по лучивший название XI.1, тесно сцепленный с предполагаемым МДД-ге- ном и локализованный в DXS'206-локусе района Хр21 Х-хромосомы че ловека [21]. Наиболее важной для последующей тонкой хромосомной локализа ции гена МДД была работа Франке с соавт., описавших пациента с четырьмя наследственными заболеваниями: МДД, хроническим лимфо- грзнуломатозом, пигментным ретинитом и синдромом Мак-Леода [22]. Цитогенетический анализ хромосом этого пациента показал наличие протяженной делеции района Хр21 Х-хромосомы. Для выделения МДД-специфических последовательностей Канкель с соавт. предложили метод так называемой «вычитательной гибридиза- ции>- с использованием ДНК пациента с четырьмя наследственными за болеваниями и ДНК, выделенной из культуры соматических клеток человека с кариотипом 49, XXXXY (избыток Х-хромосом) [23]. Идея 6 ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, № 3 - 4 состояла в том, чтобы путем последовательной реассоциации гомологич ных последовательностей исследуемых образцов ДНК выявить нереассо- циирующие, среди которых должны были присутствовать и последова тельности, делетированные у мальчика с четырьмя наследственными патологиями, обследованного Франке с соавт. В результате прове денных исследований такие последовательности действительно были выделены и клонированы по ВатНІ-сактш в плазмиде pBR322. Ав торы предполагали, что полученная ими библиотека с высокой ве роятностью содержит фрагменты генома из района Хр21 Х-хромосомы человека. Последующий анализ состоял в гибридизации ДНК полученных клонов, используемых в качестве зондов, с ДНК клеточных линий, со держащих Х-хромосомы с делециями различной локализации и протя женности Один клон, названный pERT87 (phenol ethanol reassociation technique), не гибридизовался с ДНК клеточной линии, содержащей де- лецию района Хр21.-Этот зонд не гибридизовался и с ДНК пяти из 56 пациентов, т. е. последовательность в геноме этих пяти больных МДД, комплементарная последовательности pERT87, очевидно, также была делетирована [24]. На этом основании авторами был сделан вывод о том, что последовательность pERT87 входит в состав МДД-локуса. Она и послужила исходной точкой для тонкого физического картирования локуса МДД с использованием техники «прогулки по хромосоме» [25]. Каждый последовательно клонированный фрагмент тестировали на принадлежность к последовательностям, делетированным у разных МДД-больных, а также на ПДРФ, тесно сцепленный с заболеванием у этих больных. Прямые данные о размерах гена МДД были получены после по строения крупномасштабной рестрикционной карты МДД-локуса с при менением техники электрофореза в переменном электрическом поле, впервые описанной Шварцем и Кантором в 1984 г. [26]. Для такого анализа образцы ДНК больных МДД и нормальных индивидов гидро- лизовали ре^гриктазами, в сайты узнавания которых входят динуклео- тиды CpG; эти сайты метилируются и встречаются в геноме млекопи тающих с низкой частотой [27]. Большие трудности с построением по добной рсстрикцйонной карты для МДД-локуса свидетельствовали о том, что данный ген существенно метилирован. В результате разделения посредством электрофореза в переменном электрическом поле крупных фрагментов генома больных и нормальных индивидов с последующей гибридизацией с ДНК-зондами было установлено, что внутри ДНК- фрагменга размером 8 млн пар нуклеотидов (п. н.) имеются последова тельности, относящиеся к локусам, ответственным за развитие МДД, адрон-ллыюп гипоплазии и недостаточности глицерол'киназы [28]. Даль нейшее картирование генома МДД-пациентов с помощью электрофореза в переменном электрическом поле показало, что 54 % делеций было вы явлено в субфрагменте размером 1,5 млн п. н. [29]. Наконец, после идентификации тем же методом ДНК-фрагментов, содержащих сайты траислокации Х-хромосомы у женщин с МДД-фенотипом, и локализа ции их на физической карте Хр21-региона Х-хромосомы размер МДД- локуса был расширей приблизительно до 2,5 млн п. н. [30]. Длл клонирования специфических последовательностей генного ло куса МДД включающих делеционные точки разрыва, транслокацион ные сайты и т. д., были использованы геномные библиотеки на основе бактсриофаговых и космидных векторов. Однако вследствие маленького размера вставок в этих библиотеках было выделено менее 1/4 последо вательностей гигантского МДД-локуса. Благодаря появившейся в пос леднее время технологии клонирования больших фрагментов в искусст венных хромосомах дрожжей {УAC, yeast artifical chromosome) стало возможным проклонировать этот гигантский фрагмент генома [31]. В 1992 г. были опубликованы работы о получении контига 36 перекры вающихся УЛ С-клонов, полностью «покрывающих» МДД-ген [32, 33], что было доказано различными методами: идентификацией с помощью ISSN 023Э-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, № 3 - 4 7 полимеразной цепной реакции всех известных на сегодняшний день эк- зонов гена в УЛС-клонах, определением делеционных точек разрыва и их локализацией в полученных клонах и др. В настоящее время многие исследователи полагают, что вскоре посредством рекомбинации в дрож жах между искусственными хромосомами, содержащими перекрыва ющиеся фрагменты МДД-гена, будет сконструирована искусственная хромосома, включающая полный геномный локус МДД. До этого по добная работа была проделана для гена трансмембранного регулятор ного белка муковисцидоза, мутации в котором приводят к развитию му- ковисцидоза [34]. Таким образом, можно надеяться, что благодаря полному клониро ванию гена МДД станет возможным определение всей нуклеотидной последовательности этого гигантского локуса, а также выяснение при роды практически всех возможных нарушений, приводящих к разви тию МДД. Первым шагом в получении полной кДНК гена МДД было исполь зование уникальных последовательностей локусов DXS164 и DXS206 Хр21-региона Х-хромосомы для идентификации транскрибирующихся последовательностей исследуемого локуса. Предполагая, что ген, ответ ственный за развитие МДД, кодирует белковый продукт, выполняющий важные регуляторные функции, и имеет эволюционную консерватив ность, Монако с соавт. использовали несколько клонированных последо вательностей ПХ8164-локуса для выявления гомологии между челове ком и другими млекопитающими (цыплята, лемуры, крыса, мышь, бык) [35]. Одна из этих последовательностей, названная pERT87-25, была использована в качестве зонда при изучении РНК из скелетных мышц плода С ее помощью при гибридизации обнаружен транскрипт разме ром 16 тыс. п. н. Подобный транскрипт был выделен и у мышей, а соот ветствующий ему геномный локус был картирован на мышиной Х-хромо- соме. Практически одновременно Бургес с соавт. также описали после довательности из кДНК-библиотеки из мышц взрослого человека (их геномные аналоги были локализованы в ОХБ206-локусе), гибридизую- щиеся с РНК-транскриптом размером 16 тыс. п. н. из мышц взрослого человека [36]. Таким образом, было показано, что эти фракции мРПК являются продуктами транскрипции МДД-гена. Вскоре Кениг с соавт. представили результаты полного клонирова ния кДНК МДД-гена в виде восьми перекрывающихся фрагментов [37]. Размеры МДД-транскрипта были уточнены до 14,5 тыс. п. н. Было установлено, что в данном транскрипте имеется лишь одна протяженная открытая рамка считывания. Уточнен также размер самого гена и по казано, что геномные последовательности, комплементарные восьми пе- рекрырающимся МДД-кДНК-фрагментам, распределены более чем по 2,3 млн п. и. Хр21-региона Х-хромосомы человека. Клоны кДНК МДД- гена, полученные в нескольких лабораториях из библиотек эмбриональ ных мышц и мышц взрослого человека, были полностью секвенированы, определены локализация инициирующего кодона, а также положение консервативных GT- и AG-сайтов, по которым идет разрезание при сплайсинге [38]. Таким образом, стало возможным установление гра ниц экзонов и оказалось, что ген, ответственный за развитие МДД, со стоит по меньшей мере из 75 экзонов, каждый из которых имеет размер приблизительно от 100 до 550 п. н., величина интронов при этом состав ляет в среднем 35 тыс. п. н. Наиболее протяженным оказался один из интронов, достигающий в длину 105 тыс. п. н. В дальнейшем последовательности клонированной кДНК были ис пользованы для исследования мутаций МДД-пациентов. Приблизитель но у 70 % больных МДД были выявлены делеции различной природы и протяженности [39]. Применение кДНК-зондов значительно расширило, ускорило и упростило процедуру определения МДД-мутаций. Хоффманом с соавт. в серии исследований было оценено содержа ние МДД-транскрипта в различных тканях человека [40]. Экспрессия МДД-гена была установлена в скелетных мышцах взрослого человека, 8 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, № 3 - 4 скелетных мышцах, сердечной мышце, мозге и легких плода. Содержа- ние мРНК в этих тканях было оценено в 0,01—0,001 % от суммарной мРНК. Более низкий уровень экспрессии наблюдался в гладких мыш цах взрослого человека, печени, почках, яичниках. Оронзи-Скотт с со- авт. была исследована экспрессия МДД-гена 6 мышцах здорового чело века и больных МДД [41]. Было установлено, что в мышцах больных имеет место экспрессия мРНК измененного размера, связанная с деле циями или дупликациями различных частей гена. Экспрессию гена МДД изучали и в культуре мышечных клеток [42]. Системы культур клеток являются неоценимыми при анализе про цессов развития в таких тканях, как нервная или мышечная, которые подвергаются конечной дифференциации. Морфологическое созревание мышц в культуре сопровождается развитием специфических биохими ческих изменений. В результате серии работ нескольких исследователь ских групп было показано, что экспрессия мышечноспецифических ге нов контролируется на многочисленных уровнях, включая как транс крипцию, так и трансляцию [43, 44]. Модулировать эту экспрессию можно с помощью взаимодействий с немышечными клетками, в част ности, иннервацией мышечной культуры кокультурой нейронов спинного мозга. При анализе РНК, выделенной из различных культур, было ус тановлено, что экспрессия МДД-гена тканеспецифична и имела месте только в клетках мышечной линии. Например, не было обнаружено экс прессии МДД-гена в культурах клеток спинного мозга нейробластомы- глиомы гибридных клеток, фибробластах кожи или мышц, лимфоблас- тах и т. д. [45]. Экспрессия МДД-гена, очевидно, специфична и в от ношении стадии развития мышечной культуры. Транскрипт не присут ствует в клетках миобластов, определить его оказалось возможным, лишь начиная со стадии формирования, миотрубочек [42]. Появление МДД-транскрипта в нормальных мышцах только после образования миотрубочек согласуется с гипотезой о том, что экспрессия гена стано вится важной лишь с началом конечной дифференцировки по аналогии с экспрессией других стадийспецифических генов, таких как гены ММ- изоформы креатинкиназы, тяжелой цепи миозина мышц взрослого чело века, ацетилхолинового рецептора [43, 44]. Точная стадия дифферен циации, на которой происходит и наиболее значима экспрессия МДД- гена, неизвестна. Кроме того, не было обнаружено никаких первичных мышечных дефектов в составе миобластов и миотрубочек, наблюдаемых в культурах, полученных от больных МДД, однако описаны миофиб- риллярные поражения в культуре миотрубочек после иннервации в те чение 2—4 последующих месяцев [46]. Помимо этого было замечено, что МДД-миобласты пролиферируют более медленно вследствие исто щения их пролиферирующей способности. Исследование возможной тканеспецифической экспрессии МДД-ге на позволило установить, что может иметь место как альтернативный сплайсинг мРНК гена МДД, так и альтернативная инициация транс крипции этого гена в мышцах и мозге. Последняя была связана с обна ружением двух типов промоторов: мышечноспецифического и мозгепе- цифического. Используя гибридизацию специфических 5'-концу гена кДНК-зондов с препаратами мРНК из мышц и мозга с последующим расщеплением негибридизующихся одноцепочечных участков РНК РНКазой А, Ньюдел с соавт. установили, что первый экзон мРНК от личается в исследуемых образцах [47]. Более детальный анализ с по мощью специфической амплификации посредством полимеразной цепной реакции иг кДНК-матрицах последовательностей, «покрывающих» пол ную кДНК гена МДД, был осуществлен Финером с соавт. [48]. Было обнаружено наличие стоп-кодона недалеко от инициирующего кодона, из чег:> следовало, что РНК-полимераза при транскрипции МДД-мРНК в мозге как бы «проскакивала» участок между стоп-кодоном и после дующим инициирующим кодоном. Позже было показано, что мозгепеци- фический промотор МДД-гена лежит проксимальнее мышечноспецифи ческого на І00 тыс. п. н. [49]. Этими же авторами был установлен факт JSSN 023Э-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, № 3 - 4 о альтернативного сплайсинга З'-конца МДД-мРНК. При специфической амплификации с помощью полимеразной цепной реакции кДНК-после- довательностей, соответствующих З'-концу МДД-транскрипта, наряд} с продуктами ПЦР ожидаемого размера было отмечено появление удли ненных и укороченных форм. Проведенный анализ показал, что вариа бельный район включает 2 тыс. п. н. кодирующей последовательности. Различные изоформы МДД-мРНК варьировали от ткани к ткани, хотя было замечено, что одни формы, более характерные для скелетных мышц, присутствовали и в препаратах мРНК из сердечной мышцы, в то время как другие чаще выявлялись в РНК из гладких мышц и/или мозга. Было также показано существование белкового продукта, получив шего название Dp71, с молекулярной массой 70 800, который кодирует ся дистальной частью МДД-гена. Он экспрессируется во многих типах клеток и тканей, 5'-нетранслируемый регион Dp71 транскрибируется с единственного экзона. Промотор для транскрипции этого мажорного продукта МДД-гена не имеет ТАТА-бокса и содержит GC-богатый учас ток, а также несколько потенциальных сайтов связывания Spl. Он рас положен более чем на 2000 тыс. п. н. за З'-концом мышечного и моз гового типов промоторов гена дистрофина и начинается за 150 тыс. п. н. до З'-конца этого гена. Показано, что у большинства больных МДД экспрессия Dp71 не нарушена [50]. Первые работы по идентификации белкового продукта гена, ответ ственного за развитие МДД, основывались на исследовании кДНК МДД и изучении гомологии с мышами в этом локусе, которая оказалась рав ной по крайней мере 90 % по ДНК- и аминокислотным последователь ностям [51]. Хоффман с соавт. выделили поликлональные антитела про тив гибридных (fusion) белков, полученных геноинженерным способом и кодируемых двумя определенными участками мышиной кДНК, гомо логичной кДНК МДД человека [52]. С помощью этих антител в нор мальных человеческих и мышиных скелетных и сердечных мышцах при иммуноблотинге был идентифицирован белок с относительной молеку лярной массой около 400 000. Еще до этих работ при анализе мРНК гена МДД было показано, что в ней находится лишь одна протяженная открытая рамка считывания, простирающаяся на 11 тыс. п. н. Установ ленная по последовательности мРНК аминокислотная последователь ность предполагает существование белка массой 427 000 [53]. Так^м образам, наблюдалось совпадение предсказанного и экспериментально установленного размера белкового продукта исследуемого гена. Кроме того, было предсказано, что этот белок состоит из четырех прилегающих доменов. Аминокислотная последовательность названного дистрофином про дукта гена МДД была проанализирована на гомологию с другими уже известными белками человека [54]. Оказалось, что 200 аминокис лот МИ-конца имеют сходство с высококонсервативным актинфилам ?н • тообразующим доменом в цитоскелетных мышцах цыплят и (у.-актипи- ном Dictyostelium. Подобная гомология может означать взаимодействие дистрофина с актиновыми филаментами в миофибриллах. Второй домен состоит из 26 повторов размером от 88 до 126 аминокислотных остатков, организованных в тандемы. Эти повторы также оказались сходными с таковыми, находящимися в цитоскелетных белках спектрина и а-акги- нине. Такие повторы предполагают а-спиральную структуру в спираль- спиральном взаимодействии, дающем 25 триплетных спиральных сегмен тов. Эти взаимодействия делают вероятной стержнеподобную структуру дистрофина длиной 125 нм. Третий цистеинобогащенный домен имеет существенное сходство с полными карбокситерминальными доменами а-актинина, найдено 24 % гомологии по 142 аминокислотным остаткам. Наконец, 420 аминокислотных остатков СООН-конца не обнаруживают сходства с другими опубликованными последовательностями. Количество дистрофина было оценено приблизительно в 0,001 — 0,002 % от общей массы белков скелетных мышц. Это хорошо коррели- 10 ISSN 023Э-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1996. Т. 11, № 3—4 рует с количество дистрофиновой мРНК в препаратах мРНК из мышц [55]. Большие сложности в выделении дистрофина, связанные с его низким содержанием в скелетных мышцах и большим размером, не поз воляли исследовать и описать его функции и особенности при использо вании традиционных биохимических методов. Поэтому для анализа бел кового продукта гена МДД были применены в основном косвенные ме тоды, прежде всего иммунологические. Первые исследования по распределению дистрофина в тканях были проведены на нормальных мышиных тканях. Результаты иммуноблотин га, в частности, показали, что дистрофии представлен в скелетных, сер дечной и гладких мышцах мышей и очень малое количество данного белка содержалось в мозге [56]. С другой стороны, он отсутствовал в мышцах mdx-ыышей, представляющих собой мышиную модель МДД [57]. Более детальный анализ тканевого распределения дистрофина у человека выявил наличие дистрофина в скелетных, сердечной и глад ких мышцах [58]. Хотя некоторое его количество было обнаружено по средством иммуноблотинга в нескольких немышечных тканях, это, как предпслснают многие авторы, может быть связано с проникновением дистрофика из стенок гладких мышц кровеносных сосудов в эти ткани. Исключением является мозг, где присутствие дистрофина в мень шем количестве может быть объяснено особенностями глиальных кле ток или нейронов, что было продемонстрировано при изучении куль тур ткани. Сравнение результатов иммуноблотинга скелетных и гладких мышц позволило предположить, что существуют различные изоформы дистро фина. Белок из скелетных мышц при электрофоретическом разделении мигрирует в зиде двух полос, одна из которых соответствует наблюда емой в препаратах из гладких мышц, а вторая имеет несколько большую молекулярную массу. Это хорошо согласуется с данными об альтерна тивном сплайсинге дистрофина в гладких мышцах. Точные функции дистрофина в настоящее время неизвестны. Однако многие исследователи полагают, что этот белок играет важную роль в формировании цитоскелета клетки [59]. В пользу этого предположения свидетельствует гомология отдельных доменов дистрофина с цитоске- летными белками а-актинином и спектрином. Кроме того, результаты электронной микроскопии при окраске золотом ультратонких срезов мышц продемонстрировали, что основное количество дистрофина рас пределено на поверхности плазматической мембраны, обращенной к цитоплазме в мышечных фибриллах [60]. Обнаружение при меченки мембран миофибрилл золотом регулярно повторяющихся структур дало возможность исследователям предположить, что дистрофиновые моле кулы образуют сетку в плазматической мембране. Полагают, что дист рофии играет важную роль в обеспечении механической прочности сар колеммы посредством якорного закрепления цитоскелета на плазмати ческой мембране. Следствием этого может быть тот факт, что при от сутствии дистрофина мышечные волокна у больных МДД подвергают ся большому физическому стрессу ввиду сильной чувствительности к дефициту дистрофина, в результате чеко можно ожидать разрыва плаз матической мембраны и наблюдаемых при этом последующих мышеч ных некрозов [61]. Обследование пациентов с МДД и МДБ показало полное отсут ствие дистрофина у лиц с тяжелыми формами заболевания, что может быть связано с наличием мутаций, приводящих к образованию стоп-ко- дона в последовательности мРНК. Дистрофии измененного размера (возможно, вследствие делеции или дупликаций в мРНК) наблюдался у пациентов с более мягкими формами миодистрофии [62]. В настоящее время изучение дистрофина находит применение, наряду с анализом мутаций на ДНК- и РНК-уровне, и в диагностике данного заболевания. Кроме тогоч точное выяснение функции дистрофина могло бы пролить свет не только на природу патогенеза при МДД и подходы к терапии ISSN 023Э-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, № 3-4 Ц заболевания, но и на процессы нормального развития и конечной диф- фереицировки мышечной ткани. Блаюдаря работам по картированию гена, ответственного за раз витие МДД, и по клонированию его кДНК, стало возможным опреде лить и охарактеризовать различные виды мутаций, приводящих к ма нифестации заболевания. Анализ большого количества пациентов в раз личных странах мира (США, Канада, страны Европы, Япония, Китай, Латинская Америка) показал, что преобладающим типом нарушений геча являются делеций различной протяженности. Первое исследование такого рода было проведено в лаборатории Канкеля, когда при гибри- дизационном скрининге 1346 МДД-пациентов зондом pERT87 (дерзая проклонированная последовательность гена дистрофина) в 6,5 % слу чаев было обнаружено отсутствие соответствующих гибридизационных полос, что свидетельствовало о наличии делеций в локусе DXS164 изу чаемого гена [24]. Позже, когда для ДНК-анализа пациентов были использованы зонды на основе последовательностей второго описанного локуса гена МДД DXS206, процент выявленных у этих же пациентов делеций возрос до 17 [63]. Последующее использование иных геномных ДНК-зондов (XJ.l, J-Bir и др.) позволило обнаруживать наличие де леций у 50 % пациентов [64]. Когда в качестве зондов для выявления делеций были использованы клонированные последовательности кДНК гена дистрофина, число это возросло до 75 % [65]. Оказалось, что де леций гена дистрофина очень гетерогенны по размеру и по локализа ции. В настоящее время описано около 300 различных типов делеций, простирающихся в длину от 5—6 до 1000 тыс. п. н. [66]. Процент интра- генных делеций и их размер не кажется таким уж высоким по отноше нию к подобному локусу генома человека. Приведенные выше резуль таты сравнимы с таковыми, полученными для других локусов Х-хромо- сомы. Так, например, для гена VII фактора свертывания крови разхме- ром 186 тыс. и. н. показано наличие 9 % делеций от общего количества мутаций, до 10 % нуклеотидных последовательностей может быть деле- тировано в гене орнитинкарбамаилазы размером 30 тыс. п. н., для ло куса гуанинфосфорибозилтрансферазы размером 44 тыс. п. н.— те же 10 % [67, 68] .У пациентов с Х-сцепленным рецессивным ихтиозом обна ружено непропорционально высокое количество делеций — 95 % (от всех типов мутаций) в 146 тыс. п. н.-локусе гена стероидсульфатазы, что является, вероятно, следствием локализации гена около X—Y-парного региона дистального конца Х-хромосомы, в котором возможен абер рантный X—Y-обмен в мейозе мужчин [69]. Однако сравнение относи тельного геномного размера с процентом делеционных мутаций обычно предполагает случайное появление делеций вдоль геномной последова тельности. Форрест с соавт. на основании собственных данных и данных, полу ченных в других лабораториях, описали регион, наиболее богатый деле- циячы, примыкающий к центральной части гена, где концентрируется около 70 % от общего числа этого типа мутаций [70]. Примерно в цо же время Кениг с соавт. описали другой район в 5'-области гена дист- 'рофнна, также богатый делециями, где, по их данным, концентрирова лось около 20% от всех обнаруженных на тот момент делеций [71]. Оба этих региона охарактеризованы как районы «горячих точек» деле ций, поскольку здесь концентрируются точки разрыва абсолютного боль шинства делеций. Очень информативным для многих больных МДД оказался ДНК-анализ с использованием геномного зонда Р20 (DXS208), комплементарного одной из последовательностей гигантского интрона гена дистрофина размером 105 тыс. п. н. Оказалось, что в некоторых группах до 40 % проанализированных пациентов имели начальные точ ки делеций в этом интроне, расположенные в направлении З'-конца гена [72]. Парадоксальным является тот факт, что делеций некоторых экзс- нов гена дистрофина мог>т иметь место и у фенотипичес^и здоровых мужчин. Витиллоу с соавт. описали здорового 36-летнего мужчину с 12 ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, № 3 - 4 делецией 45—53-го экзонов гена дистрофина [73]. Также интересным представляется то обстоятельство, что делеции могут затрагивать толь ко интроиные области гена. Кевин с соавт., изучая структуру гена дист рофина ъ двух неродственных семьях с МДД, у двух здоровых мужчин из разных семей при использовании зонда XYcdna выявили однотипные делеции в 5 -концевой области гена дистрофина [74]. Эти делеции были расположены внутри протяженного интрона и не захватывали экзонных участков. У больных из этих семей также обнаружены внутригенные делеции, которые, помимо интронных, захватывали и экзонные области. Вероятно, иепроявляющиеся, так называемые «молчащие», делеции могу: быть причастны к образованию летальных делеции. Очевидно, что особенно важно учитывать возможность существования подобных «молчащих» делеции при пренатальной диагностике заболевания. Как известно, приблизительно треть миодистрофий Дюшенна пред ставляет собой мутации de novo. Различными^ авторами получены очень противоречивые данные о частоте делеции при спорадических и семей ных случаях МДД. Так, данные, приведенные в работе Пассос-Бьено с соавт., свидетельствуют о том, что из 35 больных, у которых были об наружены различные делеции Cf23a-, Cf56a-, Cf 115-зонлами, 73 % были из семей со спорадическим типом заболевания и 27 % — из семей с на следственной формой [75]. В работе других авторов было показано, что делеции в спорадических и семейных случаях встречались с одина ковой частотой [76]. Окончательно вопрос о частоте мутаций de novo может быть решен только на основании статистического анализа об ширной группы семей с МДД на протяжении нескольких поколений. Нужно отметить, что до недавнего времени процедура определения делеции являлась довольно продолжительной и трудоемкой. Блот-гибри- дизацил с уникальными последовательностями занимала много времени, и часто требовалось не менее 30—40 гибридизаций с различными зон дами для выявления мутации в гене, ответственном за развитие МДД. Значительно расширились возможности тестирования этих мутаций, ког да были разработаны методы гибридизации с препаратами гидролизо- ванмой некоторыми рестриктазами ДНК, разделенной посредством элек трофореза в переменном электрическом поле [77]. При этом в опреде ленных выборках частота выявленных делеции возросла на 20—30%. Большие перспективы для анализа экзонных делеции появились перед исследователями, когда был описан метод специфической амплифика ции ДНК in vitro с помощью полимеразной цепной реакции [78]. По скольку границы экзонов и интронов были точно установлены при сек- венировании кДНК гена дистрофина, стало возможным подобрать оли- гонуклеотидные праймеры, фиксирующие границы экзонов, и разрабо тать системы мультилокусной полимеразной цепной реакции, при кото рой сразу несколько экзонов анализируются на наличие делеции по средством одновременной амплификации их последовательностей [Г9]. Этот метод значительно ускоряет и упрощает процедуру определения МДД-делеции, имеющих место на геномном уровне. Важнейшим аспектом в исследованиях наследственных заболева ний является клиническая гетерогенность последних, т. е. как те или иные нарушения генотипа реализуются в виде тех или иных фенотипов. Очень актуальна данная проблема и для МДД-МДБ, поскольку наряду с многообразием различных мутаций гена существует и многообразие клинических типов заболевания; ср-еди МДД и МДБ выделяют легкие, тяжелые и промежуточные формы. Поэтому уже в первых работах по определению мутаций в гене дистрофина были предприняты попытки соотнести тот или иной тип делеции с определенным фенотипом [80]. Было установлено, что размер и локализация делеции не влияют на ма нифестацию заболевания. Монако с соавт. проводили анализ точек раз рыва части интрагенных делеции в проксимальной области МДД-локуса при отборе больных МДД и МДБ [81]. Ими было показано, что деле ции у МДД-больных приводят к сдвигу рамки считывания с немедлен ным образованием стоп-кодонов в конечных точках делеции в последе- ISSN ОШ-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. II, № 3-4 13 вательности мРНК. Предсказанная терминация трансляции этих мРНК, по предположению, приводит к образованию дистрофина с существен ными нарушениями структуры. С другой стороны, в случае пациентов с МДБ исследуемые делеции не нарушают, как правило, открытой рам ки считывания, при этом образуется белковый продукт, по-видимому, хоть и измененного размера, но частично функционально активный [82]. Подтверждает подобное предположение и то, что описаны паци енты с протяженными делециями в гене дистрофина, затрагивающими до одной трети гена, обладающие, тем не менее, клиническим феноти пом средней тяжести [83]. Несмотря на то, что для большинства обследованных пациентов описанная выше корреляция имеет место, существуют случаи несовпа дения с предложенной гипотезой о делециях «в рамке» и «со сдвигом рамки считывания». Для объяснения наблюдаемых отклонений Эмери одним из первых выдвинул гипотезу о том, что средовые и генетические факторы, отличные от делеций экзонов, могут влиять на развитие МДД [1]. Более детальное объяснение этих явлений было получено, когда стало возможным проанализировать препараты РНК пациентов с мы шечной дистрофией с использованием амплификации, полученной в ре зультате обратной транскрипции кДНК с помощью полимеразной цеп ной реакции [84]. Олигонуклеотидные праймеры для полимеразной цеп ной реакции были подобраны таким образом, чтобы полная кДНК была представлена в виде 12 перекрывающихся фрагментов, содержащих все экзбны гена дистрофина. Роберте с соавт., исследовав препараты РНК 26 пациентов с различными формами МДД/МДБ, установили, что от клонения от гипотезы о мутациях, сохраняющих и нарушающих откры тую рамку считывания, могут быть связаны с альтернативным сплай сингом некоторых экзонов гена дистрофина. Так, например, делеция 44-го экзона в геномной последовательности очень часто может быть связана с исчезновением в последовательности мРНК 45-го экзона, при этом делеция 44-го экзона не нарушала открытой рамки считывания, в то время как такое нарушение наблюдалось при отсутствии 44-го и 45-го экзонов. Интересным представляется тот факт, что у 50 % изученных па циентов было выявлено отсутствие 9-го экзона гена дистрофина в после довательности мРНК. Как показали исследования, при этом не нару шается открытая рамка считывания, и поскольку авторы не располага ли данными с подобном анализе здоровых индивидуумов, то вполне ве роятно, что такой альтернативный сплайсинг может иметь место и для нормального гена. Использование предложенного подхода — специфиче ской амплификации мРНК тканеспецифических генов в суммарных пре паратах кДНК уже сегодня является очень информативным для анали за мутаций во многих генах: фактора VIII свертывания крови, р-гло- бина, фенилаланингидроксилазы и др. [85, 86]. В настоящее время исследование мутаций в гене дистрофина про водится во многих лабораториях мира. Это связано с сильной распро страненностью данного заболевания, многообразием клинических про явлений, а также с высокой частотой спонтанных мутаций, отмеченной для МДД. Сейчас описаны уже около 300 различных делеций в гене дистрофина, а также выявлены и другие типы мутаций. Нами были по лучены результаты по распределению делеций в гене дистрофина у больных МДД в Украине. Процент делеций в исследованных экзонах (28,6 %) оказался ниже, чем у больных из других регионов мира [124]. Так, например, Малышевой с соавт. получены данные, свидетельству ющие о выявлении делеций у 50 % обследованных МДД-пациентов из России. Евграфов с соавт. выявили те же мутации у 40 % проанализи рованных больных из разных регионов бывшего Советского Союза [125, 126]. Аналогичные данные были получены и в других лаборато риях мира: от 45 до 60 % для Англии, Франции и других стран [127, 128]. Вероятной причиной такого отклонения могут быть популяцион- ные или этнические особенности в характере мутаций, преобладающих в данном регионе. 14 ISSN ШЗ-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, № 3—4 Несмотря на то, что делеции различной протяженности являются преобладающим типом мутаций, приводящих к развитию МДД, имеется небольшой процент и других нарушений гена дистрофина, выявляемых у пациентов с этим видом заболеваний. Так, например, несколькими ав торами были обнаружены частичные дупликации гена дистрофина. Гу с соавт., изучая 72 неродственных индивидуума с МДД, не обнаружили делеций, однако у 14 % из них выявили дупликации гена с помощью точного количественного анализа интенсивности полос при гибридиза ции с полным набором кДНК-зондов [92]. Кроме того, как результат дупликаций у 6 из 10 пациентов было обнаружено появление новых ре- стрикционных фрагментов при гибридизации с кДНК-зондами. Позже этими же авторами была предпринята попытка выявить происхождение дупликаций с помощью ПДРФ-анализа семей [93]. Семейный анализ показал, что дупликации во всех случаях возникли в зародышевых клет ках дедов пробандов. Как предполагалось ранее, вероятным механиз мом появления дупликаций является неравный сестринский? хроматид- ный обмен между хроматидами-одной Х-хромосомы. Авторы, предложи ли гипотезу образования дупликаций в гене дистрофина у мужчин. Воз можно, внутри некоторых интронов гена дистрофина расположены дис пергированные повторяющиеся элементы ДНК, например Л/м-повторы. Известно, что такие повторы могут вызывать неравный кроссинговер. Для проверки этой гипотезы необходимо клонировать и секвенировать границы дупликаций у больных МДД. Наконец, Беттекен и Мюллер обнаружили инсерцию размером 220 тыс. п. н. в гене МДД в семье с атипичным течением заболевания [94]. Эта инсерция была выявлена при гибридизации S/17-рестрициро- ванных фрагментов ДНК пациента с зондом J-Bir из-за появления од ного фрагмента аномальной длины, в то время как смежные фрагменты имели нормальный размер. За последние годы стали накапливаться данные о возможной роли транспозонных элементов в возникновении мутаций в геноме человека, приводящих к развитию наследственных заболеваний. Подобное пред положение было высказано и для объяснения некоторых атипичных случаев МДД Затцем с соавт. при изучении нескольких семей [95]. Из вестно, что около 75 % конечных точек всех охарактеризованных деле ций в гене дистрофина располагаются в двух регионах, классифициро ванных как «горячие точки» мутаций. Первый находится около 7-го эк- зона и второй — около 44-го экзона [96]. По мнению многих исследо вателей, молекулярной основой нестабильности генома в таких районах в числе других причин может быть и особенность первичной структуры. Безусловно, данные по секвенированию ДНК могли бы пролить свет на мутационные механизмы в таких «горячих точках». Пизутти с соавт. в 1992 г. опубликовали работу о секвенировании последовательностей ДНК размером около 50 тыс. п. н. в районе 44-го экзона гена дистро фина [97]. Оказалось, что в состав этого региона входит транспозоно- подобный элемент, который был по гомологии нуклеотидных последо вательностей отнесен к семейству ретротранспозонов человека ТНЕ-1. Этот элемент, названный THE-43D,— первая транспозонная последова тельность, вовлеченная в мутационные события, являющиеся причиной генетического заболевания человека. Среди важнейших аспектов в изучении генома человека можно вы делить анализ индивидуальной изменчивости нуклеотидной последова тельности ДНК. Такие исследования в настоящее время органично до полняют широко развернувшиеся во всем мире работы по тотальному секвенированию генома человека. Очевидно, изучение полиморфизма ДНК генома человека и особенно его некодирующих областей в попу ляциях представляет большой интерес для ответа на вопрос о том, ка кая доля генетической изменчивости между популяциями определяется действием отбора, а какая — случайным дрейфом. Важное место здесь принадлежит изучению полиморфизма последовательностей такого ги гантского гена, как ген дистрофина. К настоящему времени описано ISSN ОШ-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, № 3-4 15 большое количество маркеров полиморфизма ДНК этого гена разной природы [98, 99]. К их числу относятся многочисленные внутригенные и фланкируюшие (ПДРФ-маркеры), полиморфные варианты различных коротких тандемных повторов в нетранслируемых последовательностях гена дистрофика и др. Особенно значимым представляется тот факт, что благодаря успехам в картировании и изучении гена дистрофина извест на локализаиия этих последовательностей и, таким образом, по данным популяционных исследований возможно будет оценить, какие из функ ционально различных последовательностей попадают под действие от бора, а какие представляют собой так называемые «нейтральные» вариации. Кроме того, анализ полиморфизма последовательностей гена дист рофина до сих пор остается актуальным для исследования семей с вы соким риском МДД. В настоящее время разработаны эффективные сис темы диагностики этого заболевания, основанные на сцеплении опреде ленных ва\|Тиантов полиморфных маркеров с мутантными фенотипами. Важной характеристикой таких диагностических систем является уро вень гетерозиготности по ним в популяции. Необходимо это потому, что при Х-.сцепленных заболеваниях мать пробанда должна иметь так на зываемый «гетерозиготный» ПДРФ-генотип, т. е. ее Х-хромосомы долж ны быть маркированы разными полиморфными вариантами изучаемой последовательности. В этом случае легко проследить передачу той или иной Х-хромосомы больному ребенку и определить, таким образом, ка кая и У них несет МДД-мутацию. В историческом плане первыми маркерами гена дистрофина были маркеры ПДРФ pERT-локуса, которые и в настоящее время широко используются для семейного ДНК-анализа сцепления, а также в попу ляционных исследованиях. Это обусловлено, кроме всего прочего, еще и -тем, что подобный анализ проводится специфической амплификацией in vitro посредством полимеразной цепной реакции [100]. Также нахо дит применение ПДРФ-анализ с помощью блот-гибридизации и с ис пользованием в качестве зоадов. последовательностей J-Bir, Л.1., р754, Р2#идр . Во многих странах мира в настоящее время уже получены данные по распределению полиморфных вариантов этих последовательностей в различных популяциях [101, 102]. Много информативных ПДРФ было обнаружено при использовании в качестве зондов клонированных после довательностей кДНК гена дистрофина [103, 104]. Очень эффективно в применении ПДРФ-маркеров при диагностике МДД сочетание ана лиза внутригекных и фланкирующих ген дистрофина последовательнос тей, поскольку для многих из них высока вероятность внутригенного кроссинговера, обусловленного, прежде всего, гигантским размером гена [105]. В результате такого кроссинговера МДД-мутация и маркиру ющая ее полиморфная последовательность могут оказаться на различ ных Х-хромосомах и вследствие этого привести к ошибкам в диагности ке, в том числе и, что наиболее тяжело, в пренатальной. В последнее время описан другой класс полиморфных маркеров гена дистрофина, представляющих собой тандемные повторы коротких последовательностей разной длины. Так, группой американских авторов недавно были описаны динуклеотидные СА-повторы, обладающие высо кой степенью полиморфизма и перспективные для анализа сцепления [106]. Эти повторы могут встречаться по соседству с кодирующими ре гионами генов,> в интронах внутри генов или внутри нетранслирующихся районов. Такие повторы обнаружены в З'-нетранслируемом регионе гена дистрофина. Интересно то, что некоторые из них, в частности, МР1Р- и MPlQ-тандемные повторы в З'-нетранслируемом регионе ге на дистрофина могут быть использованы для анализа кроссинговера в семьях [107] Важной вехой в изучении МДД явилось создание моделей заболева ния на животных. Первой такой моделью стали так называемые mdx- мыши, впервые описанные Булфилдом с соавт. [108]. Несмотря на раз ів ISSN 02331-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. П, Jfe 3 - 4 сличающиеся у человека и mdx-мышей клинические проявления заболе вания, некоторые симптомы оказались довольно схожими, в частности, был выявлен аномально высокий уровень активности в крови креатин- фосфокииазы, что является в настоящий момент одним из основных биохимических тестов на МДД. Геномные и кДНК-зонды человека были использованы для детекции и картирования мышиного гомолога чело веческого МДД-гена. Эти работы завершились картированием мышино го гена МДД в том же регионе мышиной Х-хромосомы, что и ранее идентифицированный локус т^я-мутаций, а отсутствие рекомбинации между этими локусами позволило установить, что речь идет об одном и том же участке генома [109]. Молекулярно-биологический и биохими ческий анализы подтвердили описанные выше данные. Было показано, что у нормальных мышей дистрофии экспрессируется в поперечно-поло сатых мышцах и мозге, тогда как у mdx-мышеи в этих тканях дистро фина обнаружено не было. Это отсутствие идет вразрез с наблюдением экспрессии транскрипта размером 14 тыс. п. н. у mdx-мышей в преде лах от 16 до 21 % по сравнению с нормальными мышами [ПО]. Сле довательно, тЛс-мутации могут представлять собой точечные мутации или маленькие делеции в результате преждевременной терминации трансляции, что позже было подтверждено экспериментально [111]. Несмотря на то, что мышиная модель МДД по многим признакам является сходной с человеком, тем не менее значительные клинические различия (отсутствие обширных некрозов, сохранение большей части нормальной мышечной массы, отсутствие обширной пролиферации со седних с мышечными тканей, и прежде всего соединительной) и гене тические признаки (наличие частичной экспрессии гена и др.) не позво ляют считать эту модель адекватным аналогом МДД. Купер с соавт. в результате проведенных исследований представи ли потенциальную модель МДД у собак [112]. Х-сцепленная мышечная дистрофия у собак проявляется в виде сходных с МДД клинических симптомов. На молекулярном уровне показано, что имеется гомолог МДД-локуса у собак, который экспрессируется с образованием 14 тыс. и. н.-транскрипта. Антитела к дистрофину человека идентифицируют у собак белок с молекулярной массой около 400 000 при иммуноблотипге суммарных белков мышц. Кроме того, дистрофии и МДД-подобные транскрипты не обнаружены у собак с МДД-подобной дистрофией, хотя другие мышечные белки и РНК-маркеры у них представлены. Эти дан ные дали возможность предположить, что Х-сцепленная дистрофия со бак является более адекватной моделью МДД. Тем не менее, очевидно, что обе эти модели важны для понимания того, как первичный биохимический дефект дефицита дистрофина мо жет приводить к изменениям клинического фенотипа, и могут быть ис пользованы в разработке стратегии терапии заболевания. Успехи в развитии методов молекулярной биологии и генной инже нерии явились той предпосылкой, благодаря которой стало возможным поднять вопрос о генной терапии наследственных заболеваний человека. В случае МДД довольно долго применение генной терапии заболевания вообще н> рассматривалось, поскольку огромная величина гена, боль шой размер его мРНК не позволяли осуществлять геноинженерные ма нипуляции в имеющихся на тот момент системах клонирования. Некоторые исследователи предлагали использовать геноинженер ные конструкции, несущие не полноразмерную, а усеченную молекулу кДНК дистрофина. Поводом к этому послужили работы, в которых бы ли описаны пациенты с МДД, имевшие очень мягкий клинический фено тип, но при этом у них были выявлены гигантские делеции гена [83]. Так, в одной из таких семей имелись два брата, оба больные, которые дожили дс преклонного возраста; результаты исследований показали типичные дистрофические поражения мышц, а также наличие делеции 30 экзонов гена дистрофина (с 17-го по 48-й). Результаты иммунобло- тинга суммарных мышечных белков продемонстрировали наличие у этих пациентов дистрофина с молекулярной массой 200 000. Это свидетельст- ISSN ШЭ-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 19G5. Т. И, № 3-42—5-835 17 вует о том, что, очевидно, конформация практически вдвое уменьшенно го полипептида, между тем, обеспечивает практически нормальное вза имодействие с другими компонентами цитоскелета мышц. В последние годы благодаря развитию работ по генной терапии на- следственных заболеваний, а также разработке новых систем клонішо- вания появились и новые подходы к генной терапии МДД. В настоящий момент эти исследования развиваются в двух направлениях: введение в организм векторов, несущих полную кДНК дистрофина, и инъекция реципиентам нормальных миобластов, способных продуцировать дист рофии обычного размера. Первоначально стратегия переноса дистрофина в мышцы МДД-па- циентов посредством трансплантации миобластов была опробована в экспериментах на грызунах [113]. Эти опыты показали, что инъециро ванные миобласты способны проникать в тонкую базальную пластинку мышечных волокон реципиента и случайным образом сливаться с ними, становясь неотъемлемой частью зрелых мышечных волокон реципиен та, в качестве которых выступали нормальные и дистрофические живот ные. Подобные эксперименты были выполнены и на пациентах с МДД. Показано, что инъекция миобластов приводила к продуцированию нор мального дистрофина по крайней мере в течение месяца после инъекции, что было подтверждено данными анализа^ мышечных биопсий, взягых вблизи места введения. Вторым путем генной терапии стало введение в организм модель ных животных, в частности mdx-мышеи, геноинженерных векторов, не сущих полную или усеченную кДНК гена дистрофина. В первых экс периментах в качестве векторов были использованы плазмиды на ос нове pUCIS [114]. Аксади с соавт. было показано, что после введения таких экспрессирующихся плазмид mdx-мышгм в сарколемме и цито плазме их мышечных клеток был обнаружен дистрофии человека при близительно в 1 % миофибрилл. В настоящее время для облегчения переноса векторной ДНК используются аденовирус — трансферрин — векторная ДНК-комплексы, как это было показано Пайпером с соавт. на mdx-мышах и С2С12-линии мышечных клеток [115]. Кроме этого, другими авторами полноразмерная и усеченная кДНК-Дистрофина были клонированы в ретровирусные векторы, и рекомбинантные ретровирусы были инъецированы mdx-мышам. Экспрессия дистрофина человека была выявлена в 10 % миофибрилл мышей и определялась в течение 9 ме сяцев после инъекции [116]. Приведенный далеко не полный обзор данных о природе гена дист рофина и его белкового продукта, использовании анализа мутаций на званного гена для пренатальной диагностики и выявления гетерозигот ного носительства МДД и о подходах к генной терапии данного забо левания свидетельствует о существенных успехах, достигнутых за пос леднее десятилетие в поисках путей эффективной профилактики и ле чения МДД. Работа финансировалась по проекту 1.01.01/055-92 Госкомитета Украины по вопросам науки и технологий. В. I. Гришко, Л. А. Лівшиць МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНІ АСПЕКТИ М'ЯЗОВОЇ ДИСТРОФІЇ ДЮШЕННА Р е з ю м е М'язова дистрофія Дюшенна (МДД) — Х-зчеплене рецесивне захворювання, пов'язане з прогресуючим ураженням м'язів. Зустрічається з частотою 1 : 3500 дітей чоловічої статі. У представленому огляді наведено сучасні відомості про структуру і локаліза цію гена МДД, спектр мутацій, а також характеристика його білкового продукту — дистрофіна. Обговорюється методологія ДНК-діагностики і підходи до генотерапії МДД. 18 ISSN 0233--7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. И, № 3 - 4 V. I. Grishko, L. A. Livshits MOLECULAR AND GENETIC ASPECTS OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY S u m m a r y Duchene muscular dystrophy (DMD) is the X-linked recessive disorder resulting in pro gressive degeneration of the muscle. It affects about I in 3500 male children. Present reviw represents the modern date about DMD gene structure and localization the spectrum of mutations of DMD gene ,and characteristics of its protein product — dystrophine. The me thodology of DNA diagnostic and approaches to the therapy of DMD are discussed. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Emery A. E. H. Muscular Duchenne dystrophy. Oxford monographs on medical ge netics.— Exford : Univ. press, 1987.—Vol. 15.— 338 p. 2. Stephens F. E., Tyler F. H. Studies in disorders of muscle. The inheritance of child hood progressive muscular dystrophy in 33 kindress / / Amer. J. Hum. Genet.— 1951.—3.—P. 111 — 131. 3. Wotion J. AT., Nattrass F. J. On the classification natural history and treatment of the myopaties / / Brain.—1954.—77.— P, 169—177. 4. Dubowitz W. Screening for Duchenne muscular dystrophy / / Arch. Dis. Child.— 1976.—51.—P. 249—251. 5. Brooke AL #., Fenichel G. M.t Griggs R. C. et al. Clinical investigation in Duchenne dystrophy / / Muscle and Nerve.—1983.—6.—P. 91—102. 6. Emery A. E., H., Clack E. R., Simons & et al. Detection of carriers of benign X- linked muscular dystrophy / / Brit. Med. J.—1967.—4.—P. 522—523". 7. Fenichel G. M. On the pathogenesis of Duchenne and Becker muscular dystrophy / / Develop. Med. Child. Neurol.—1975.—17.—P. 527—537. 8. Drummond L. M. Creatine phosphokinase levels in. the newborn and their use in screening for Duchenne muscular dystrophy//Arch. Dis. Child.— 1979.— 54.— P. 362—366. 9. Moser H., Emery A. E. H. The manifesting carrier in Duchenne muscular dystro phy / / Clin. Genet.—1980.—5.—P. 271—284. 10. Greenstein R. AL, Readon AL P., Chan T. S. An X-autosome translocation in a girl with DMD: evidence for DMD gene localization // Radiat. Res.— 1977.—14.— P. 457. 11. Saito F., Tonomura A., Kimura S. et al. High resolution banding study of an X/4 translocation in a female with Duchenne muscular dystrophy / / Hum. Genet.— 1985.—71.—P. 370—371. 12. Emanuel B. S., Zackai E. H., Tucker S. Further evidence for Xp21 location of Du chenne muscular dystrophy locus: X-9 translocation in a female with DMD (Ab stract) / / Amer. J. Hum. Genet.—1981.—33.—P. 103. 13. Verellen C, Markovic V., De Meyer R. et al. Expression of an X-finked muscular dystrophy in a female due to non-random inactivation of the normal X chromoso me / / Hum. Genet.—1986.—67.—P. 115—119. 14. Botslein D., White R. L., Skolnik AL, Davis R. W. Construction of a genetic linka ge map in man using restriction framgent length polymorphism / / Amer. J. Hum. Genet.—1980.—32.—P. 314—331. 15. Drayna D., White R. The genetic linkage map of the human X chromosome// Sci ence.— 1985.—230.— P. 753—768. 16. Muller O. J., Drayna D., Goodfeltow R. Report of the committee on the genetic construction of the X and Y chromosomes / / Human Gene Mapping Conference VII.—1985.—P. 176—204. 17. Donis-Ketler #., Green P., Helms С et al. The genetic linkage map of the human genome / / Cell.—1987.—51.—P. 319—337. 18. Davies K. E., Speer A., Herrmann F. et al. Human X chromosome markers and Duchenne muscular dystrophy / / Nucl. Acids Res.—1983.—13, N 10.—P. 3419— 3426. 19. Dor kins H.} Junien C, Mandel J. L. et al. Segregation analysis of a marker locali sed Xp21.2-Xp21.3 in Duchenne and Becker muscular dystrophy families / / Hum. Genet.—1985.—71.—P. 103—107. 20. Worton R. G., Duff C, Sylvester J E. et al. Duchenne muscular dystrophy invol ving translocation of the dmd gene next to ribosomal RNA genes / / Science.— 1984.—224.—P. 1447—1449. 21. Ray P. N., Belfall В., Duff С et al. Cloning of the breakpoint of an X-21 trans location associated with DMD / / Nature.—1985.—-318.—P. 672—675. 22. Francke U., Ochs H. D.t de Maftinyille B. et al. Minor Xp21 chromosome deletion in a male associated with expression of Duchenne muscular dystrophy, chronic gra nulomatous disease, retinitis pigmentosa and McLeod syndrome / / Amer. J. Hum Genet.—1985.—37.—P. 250—267. 23. Kunkel L. M., Monaco A. P., Middlesworth W. et al. Specific cloning of DNA frag ments absent from the DNA of a male patient with X chromosome deletion / / Proc Nat. Acad. Sci. USA.—1985.—82.—P. 4778—4782. ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1996. Т. И, № 3-4 2 24. Kunkel К. M. Analysis of deletions in DNA from patients with Becker and Duchen ne muscular dystrophy / / Nature.—1986.—322.—P. 73—77. 25. Monaco A. P., Bertelson C. J., Colletti-Feener C. et al. Localization and cloning of deletion breakpoint in Xp21 involved in muscular dystrophy / / Hum Genet.— 1987.—75.—P. 221—227. 26. Schwartz D. C, Cantor С R. Separatism of yeast chromosome-sized DNAs by pul sed field gradient gel / / Cell.—1984.—34.—P. 76—80. 27. Brown W. R. A., Bird A. P. Long-range restriction site mapping of mammalian ge nomic DNA / / Nature.—1986.—322.—P. 477—481. 28. Burmeister M., Lehrach H. Long-range restriction map around the Duchenne mus cular dystrophy gene / / Ibid.— 324.— P. 582—585. 29. Den Dunnen J. Т., Bakker E., Klein Bretelen E. G. et al. Direct detection of more than 50 % of the Duchenne muscular dystrophy mutations by field inversion gels / / Ibid.—1987.—329.—P. 640—642. 30. Meitinger Т., Boyd Y., Anand R. et al. Mapping of Xp21 translocation breakpoints in and around the DMD by pulsed field gel electrophoresis / / Genomics.—1988.— 3.—P. 315—322. 31. Burke D. Т., Carle G. F., Olson M. V. Cloning of large DNA segments of exo genous DNA into yeast by means of artifical chromosome vectors / / Science.— 1987.—236.— P. 806--812. 32. Monaco A., Walker A. P., Millwood J. et al. A yeast artifical chromosome conting containing the complete Duchenne muscular dystrophy gene / / Genomics.—1992.— 12, N 3.—P. 465—474. 33. Coffey A. J., Roberts R. G., Green E. D. et al. Construction of a 2,6-Mb contig in yeast artifical chromosomes spannig the human dystrophin gene using an STS based approach / / Ibid.— P. 474—485. 34. Anand R., Ogilvie D. J., Butler R. et al. A yeast artifical chromosome contig en compassing the cystic fibrosis locus / / Ibid.—1991.—9.— P. 124—130. 35. Monaco A. P., Neve R. L., Colletti-Feenec C. et al. Isolation of candidae cDNAs for portions of the Duchenne muscular dystrophy gene / / Nature.—1986.—323.— P. 646—650. 36. Burghes A. H. M., Logan C, Xiuyuan Ни et al. A cDNA clone from the Duchen- ne/Becker muscular dystrophy gene / / Ibid.—1987.—328.— P. 434—436. 37. Koenig M., Hoffman E. P., Bertelson C. J. et at. Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals / / Cell.—1987.—50.—P. 509—517. 38. Koenig M., Bertelson C. J., Monaco A. P. et al. Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy cDNA and an analysis of the entire DMD locus / / Amer. J. Hum. Genet.—1987.—41.—P. A222. 39. Hart K. A., Hodgson S., Walker A. et al. DNA deletion in mild and severe Du- chenne/Becker muscular dystrophy / / Hum. Genet.—1987.—75.—P. 281—285. 40. Hoffman E. P., Monaco A. P., Feener С. С et aL Conservation of the Duchenne muscular dystrophy gene in mice and humans / / Science.—1987.—238.— P. 347— 350. 41. Oronzi-Skott M., Sylvester J. E., Heiman-Patter son TV et al. Duchenne muscular dystrophy gene expression in normal and diseased human muscle / / Ibid.—1988.— 239,—P. 1418—1420. 42. Lev A. A., Treenet S. C, L. M. Kunkel eb al. Expression of the Duchenne muscular dystrolhy gene in cultural muscle cells / / J. Biol. Chem.—1987.—262, N 39.— P. 15817—15820. 43. Endo Т., Nadal-Ginard B. Study of expression some muscle-specific genes in cul ture of cells / / Exp. Neur.—1972.—36.—P. 136—159. 44. Jasin R., Walsh F. S., London D. S. et al. Expression of different forms of crea- tinkinase in cultural muscle cells / / J. Neur. Sci.—1983.—58.—P. 315—334. 45. Dickson G., Pizzey J. A., Elson V. E. et al. Distinct dystrophin mRNA species are expressed in embryonic and adult skeletal muscle / /FEBS lett.—1989.—247.— P. 47—52. 46. Chetly J., Kaplan J. C, Maire P. et al. Transcription of the dystrophin gene in hu man muscle and non-muscle tissues / / Nature.—1988.—333.— P. 858—860. 47. Nudel V.t Zuk D., Paz E. et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain / / Ibid.—1989.—337, N 6202.—P. 76—79. 48. Feener C. A.. Koenig M., Kunkel L. M. Alternative splising pf human dystrophin mRNA generates isoforms at the carboxy terminis//Ibid.— 1989.— 238, G215.— P. 509—512. 49. Boyce F. M., Beggs A. H., Feener С A. et al. Dystrophin is transcribed in brain from a distant upstream promoter / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA,—1991.—88.— P. 1276—1280. 50. Lederfein D., Yaffe D., Nudel U. A housekeeping type promoter, located in the 3' region of the Duchenne muscular dystrophy gene, controls the expression of Dp71, a major product of the gene / / ' Hum. Мої. Gen.—1993.—2.—P. 1883—1888. 51. Koenig M., Monako A. P., Kunkel L. M. The complete sequence of dystrophin, pre dicts a rod-shaped cytosceletal protein//Cell.—1988.—53.—P. 219—228. 52. Hoffman E. P., Flschbeck K. H., Brown R. H. et al. Dystrophin characterization in muscle biopsies from Duchenne and Becker muscular dystrophy / / N. Engl. J. Med.—1988.—318.—P. 1363—1368. 20 ISSN ШЗ-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. П, К? 3 - 4 53. Rosenthal A., Speer A., Billwitz H. et al. Nucleotide and corresponding amino acid sequence of human adult and fetal cDNA coding for portions of the Duchenne mus cular dystrophy (DMD) gene / / Biomed. and biochim acta.—1987.—47.—P. K13— K15. 54. Hoffman E. P., Brown R. H., Kunkel L. M. Dystrophin: The portein product of the Duchenne muscular dystrophy locus / / Cell.—1987.—51.—P. 919—928. 55. Hoffman E. P., Knudson C. M., Campbell K. P. et al. Subcellular fractionation of dystrophin to the triads of skeletal muscle//Nature.—1987.—330.—P. 754—758. 56. Hoffman E. P., Hudecki M. S., Rosenberg P. A. et al. Cell and fiber-type distri bution of dystrophin / / Neuron.—1988.—1.—P. 411—420. 57. Chamberlain J. S., Pearlman J. A., Muzny D. M. et al. Expression of the murine Du chenne muscular dystrophy gene in muscle and brain//Science.— 1988.— 239.— p. 1416—1418. 58. Miranda A. F., Bonilla £., Martucci G. et al. An immunocytochemical study of dyst rophin in muscle cultures from patients with Duchenne muscular dystrophy and unaffected controls / / Amer. J. Pathol.—1988.—132.—P. 410—416. 59. Campbell K. P., Kahl S. D. Association of dystrophin and an integral membrane protein / / Nature.—1989.—338.—P. 259—262. 60. Bonilla E., Samitt С. Е., Miranda A. F. et al. Duchenne muscular dystrophy: De ficiency of dystrophin at the muscle cell surface//Cell.— 1988.— 54.— P. 447—452. 452. 61. Hoffman E. P., Kunkel L. M. Dystrophin abnormalities in Duchenne and Becker muscular dystrophies / / Neuron.—1989.—2.—P. 1019—1029. 62. Hoffman E. P., Kunkel L. M., Angelini С et al. Improved diagnosis of Becker mus cular dystrophy via dystrophin testing / / Neurology.—1989.—45.— P. 560—565. 63. Galuzzi G., Di Rienzo A., Colombo B. et al. Detection of DNA deletions in DMD by DNA probes / / «Biotech. RIA'88. mol probes: technol. med. appl.» : Proc. Int. symp. (Florence, 1988, Abstr. Book).—New York, 1988.—P. 61. 64. Love D. R., Forrest S. M.t Smith T. J. et al. Molecular analysis of Duchenne/Be- ckcr muscular dystrophy / / Brit. Med. Bull.—1989.—45, N 3.—P. 659—680. 65. Kevin H. A., Abbs S., Wapenaar M. et al. Molecular deletions in the Duchenne-Bec- ker muscular dystrophy gene / / Clin. Genet.—1989.—35, N 4.—P. 251—260. 66. Forrest S. M., Cross G. S., Flint T. et at. Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies / / Genomics.—1988.—2.— P. 109— 114. 67. Gitschier J. Maternal duplication associated with gene deletion in sporadic hemo philia / / Amer. J. Hun. Genet.—1988.—43.—P. 274—279. 68. Wilson J. M., Stoout J. Т., Patella T. D. et al. A molecular survey of hypoxanthine- guanine phosphoribosyltransferase deficiency in man / / J. Clin. Invest.—1986.— 77.—P. 188—195. 69. Davies K. E., Briand P., Jonasescu V. et al. Gene for OTC: characterization and linkage to Duchenne muscular dystrophy // Nucl. Acids Res.— 1985.— 13.— P. 155— 165. 70. Forrest S. M., Cross G. S., Speer A. et at. Preferential deletion of exons in Duchen ne and Becker muscular dystrophies / / Nature.—1987.—329.—P. 638—640. 71. Koenig M., Beggs A. H., Moyer M. et at. The molecular basis for Duchenne versus Becker muscular dystrophy: correlation of severity with type deletion / / Amer. J. Hum. Genet.—1989.—45.—P. 498—506. 72. Vitiello L., Giro E.t Mostacciuolo M. L. et al. Deletions in the distal half of the DMD-BMD locus revealed by the intragenic probe P20 (DXS269) / / Atti Ass. genet. ita!.—1989.—35.—P. 387—388. 73. Vitiel'lo L., Nicoletti L., Schiavon F. et al. Deletion screening by cDNA in a series of 81 patients affected by Duchenne or Becker muscular dystrophy//Ibid.— 1990.— 36.—P. 391—392. 74. Kevin H. F., Abbs S., Dobrov M. Pathogenic and non-pathogenic deletions in two families with Duchenne muscular dystrophy / / Amer. J. Med. Genet.—1989.—33„ N 1.—P. 145—152. 75. Passos-Bueno M. R., Rapaport D., Love D. et al. Screening of deletions in the dy strophin gene with the cDNA probes Cf23a, Cf56a, Cf 115 / / J. Med. Genet A- 1990.—27, N 3.—P. 145—150. 76. Luncuof M., Kiuru A., Kaariainen H. et at. Gene deletions in X-linked muscular dystrophy//Amer. J. Hum. Genet.—1989.—44, N 4.—P. 496—503. 77. Den Dunnen J. Т., Crootscholten P. M., Bakker E. et at. Topography of the Duchen ne muscular dysUophy (DMD) gene: FIGE and cDNA analysis of 194 cases re veals 115 deletions and 13 duplications//Ibid.—45.—P. 835—847. 78. Saiki R. K, Gelfand D. H., Stoffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase//Science.—1988.—239.—P. 487— 491. 79. Chamberlain J. C, Gibbs R. A., Ranier J. E. et al. Multiplex PCR for diagnosis of Duchenne muscular dystrophy / / PCR protocols and applications — a laboratory manual / Eds M. Innis, D. Gelfand, J. Snin-ski, T. White.— New York: Acad, press, 19«9._p. 272—281. 80. Darras В. Т., Blattner P., Harper J. R. et al. Intragenic deletions in 21 Duchenne muscular dystrophy/Becker muscular dystrophy families studied with the dystrophin cDNA: location of breakpoints on Hindi 11 and В gill exon-containing fragment maps, ISSN 023Э-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, № 3-4 21 meiotic and mitotic origin of mutations / / Amer. J. Hum. Genet.—1988.—43.— P. 620—629. 81. Monaco A. P., Bertelson C. J., Liechti-Gallati S. et al. An explanation for the phe- notypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus // Genomics.— 1988.— 2.— P. 90—95. 82. Baumbach L. L., Chamberlain J. S„ Ward P. A. et al. Molecular and clinical corre lations of deletions leading to Duchenne and Becker muscular dystrophies / / Neuro logy.—1989.—39.—P. 465—474. 83. England S. В., Nickolson L. V. В., Johnson M. A. et al. Very mild muscular dyst rophy associated with the deletion of 4) % of dystrophin // Nature.—1990.—342, N 6254.—P. 180—182. 84. Roberts R. G., Barby T. F. M.t Manners E. et al. Direct detection of dystrophin ge ne rearrangements by analysis of dystrophin mRNA in peripheral blood lymphocy tes / / Amer. J. Hum. Genet—1991.—49.—P. 298—310. 85. Berg L. P., Wieland K., Millar D. S. et al. Detection of a novel point mutation causing haemophilia A by PCR/direct sequencing of ectopically-transcribed factor VIII mRNA / / Hum. Genet.—85.— P. 655—658. 86. Baserga S. J., Benz E. J. Nonsense mutations in the human beta-globin gene affect mRNA metabolism / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1988.—85.—P. 2056—2060. 87. Гришко В. И., МалярчукС. Г., Лившиц Л. А. Распределеиие некоторых делений в гене дистрофина у больных мышечной дистрофией Дюшенна в Украине / / Цито логия и генетика.—1993.—27, № 2.—С. 68—71. 88. Малышева О. В., Горбунова В. Н., Красильников В. В., Баранов В. С. ПДРФ-ана лиз и скрининг делеций в семьях больных миодистрофией Дюшенна / / Биополи меры и «летка.—1991.—7, № 2.—С. 98—102. 89. Евграфов О. В. Картирование и изучение тонкой структуры некоторых генов че ловека и разработка на этой основе ДНК-диагностики наследственных заболева ний: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук.— М., 1992.—35 с. 90. Covone А. Е., Caroli F., Romeo G. Screening Duchenne and Becker dystrophy pa tients for deletions in 30 exons of the dystrophin gene by three-multiplex PCR / / Amer. J. Hum. Genet.—1992.—51.—P. 675—676. 91. Abbs S., Yau S. C.K Clark S. et al. A convenient multiplex PCR dystrophin gene deletions: a comparative, analysis with cDNA hybridisation shows mistypings by both methods / / J. Med. Genet—1991.—28.—P. 304—31L 92. Ни X., Burghes A. H. M., Ray P. N. et al. Partial gene duplication in Duchenne and Becker muscular dystrophy / / Ibid.—1988.—25.—P. 369—376. 93. Van Ommen C. J. В., Bertelson В., Ginjaar H. B. et al. Long range genomic map of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene: Isolation and use of J66 (DXS268), a distal intragenic marker / / Genomics.— 1987.— 1.— P. 329—336. 94. Bettecken Т., Muller C. R. Identification of a 220-kb insertion into the Duchenne gene in a family with an atypical course of muscular dystrophy//Ibid.— 1989.— 4.— P. 592—596. 95. Malhorta S. В., Hart K. A., Klamut H. J. et al. Frame shift defetions in patients with Duchenne and Becker muscular dystrophies / / Science.—1988.—242.— P. 755— 759. 96. Zatz M., Passos-Bueno M. R., Rapaport D. et al. Familial occurence of Duchenne dystrophy through paternal lines in four families//Amer. J. Med. Genet.— 1991.— 38.— P. 80—84. 97. Pizzuti A., Pieretti M., Fenwick R. G. et al, A transposon-like element in the dele tion-probe region of the dystrophin gene // Genomics.— 1992.—13.— P. 594—600. 98. Prior T. W., Friedman K. /., Silverman L. M. RFLP for HingdIII at the Duchenne muscular dystrophy gene / / Nucl. Acids Res.—1989.—17.—P. 2167—2168. 99. Bakker E., Bonten E. /., De Lange L. F. et al. DNA probe analysis for carrier de-, tection and prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy: a standard diag nostic procedure / / J. Med. Genet.—1986.—23, N 6.—P. 573—580. 100. Defesche J. C, de Visser M., Bakker E. et al. DNA restriction fragment length poly morphisms in differential diagnosis of genetic diseases//Hum. Genet.—1989.—82, N 1.—P. 55—58. 101. Kelly E. D., Graham С. А., ШЦ A. J. et al. Carrier estimations in Duchenne mus cular dystrophy families in Nothern Irealand using RFLP analysis / J Med. Ge net.—1990.—27, N 2.—P. 101—/104. 102. Wilcok I. E.t Affara N. A., Yates J. R. et al. Linkage studies of X linked muscular dystrophy in the west of Scotland using four short arm X chromosome DNA poly morphisms / / Ibid.—1984.—21, N 4.—P. 298. 103. Wagner M., Reiss J., Hentemann M. et al, Mspl RFLP for Duchenne muscular dy strophy cDNA subclone / / Nucl. Acids Res.—1989.—17, N 8.—P. 3328. 104. Laing N. G., Akkari P. A., Chandler D. C. et al. Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene cDNA 8 PstI and TaqI polymorphisms involve exon 51 of the Hindi 11 map / / Ibid.—1990.—18, N 1.—P. 4284. 105. Fischbeck K. H., Kunkel L. M., Bertelson С et at. Recombination with pEDT87 (DXS164) in families with X-linked muscular dystrophy / / Amer. J. Med. Genet.— 1986.—25, N 4.—P. 709—710. 106. Oudet C, Heiling R., Mandel J. L. An informative polymorphism detectable by polymerase chain reaction at the 3' end of the dystrophin gene / / Hum. Genet.— 1990.—84, N 3.—P. 283—285. 22 ISSN 023Э-7667, БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, J№ 3—4 107. Roberts R. G., Montandon A. L, Bobrow M. et al. Detection of novel genetic mar kers by mismatch analysis / / Nucl. Acids Res.—1989.—17, N 15.—P. 5961—5971. 108. Buifield G.f Siller W. G., Weight P. A. L. X-chromosome linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse / /Proc . Nat. Acad. Sci. USA.—1984.—81.—P. 1189—1192. 109. Cavanna J. S., CouHon G., Morgan J. E. et al. Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus//Genomics.—1988.—3.—P. 337—441. 110. Hoffman E. P., Monaco A. P., Feener С. С. et al. Conservation of the Duchenne muscular dystrophy gene in mice and humans / / Science.—1987.—238, N 4825.— P. 1238—1241. 111. Sicinski P., Geng Y., Ryder-Cook A. S. et al. The molecular basis of muscular dy strophy in the mdx mouse: a point mutation / / Ibid.— 1989.— 244, N4912.— P. 1578—1580. 112. Cooper B. J., Wlnand N. J., Stedman H. et al. The homol-ogue of the Duchenne of locus in defective in X-linked muscular dystrophy * of dogs//Nature.— 1988.— 334.—P. 154—156. 113. Gussoni E., Pavlath G. K.t Lanctot A. M. et al. Normal dystrophin transripts detec ted in Duchenne muscular dystrophy latients after myoblast transplantation / / Ibid.— 1992.—356.—P. 435—438. 114. Ascadi G., Dickson G., Love D. R. et al. Human dystrophin expression in mdx mice after intramuscular injection of DNA constructs//Ibid—1991.— 352.—P. 815— 818. 115. Piper Т., Cotten M., Birnstiel M. L. et al. Dystrophin gene transfer using Adenovi- rus-Transferrin-DNA complexes//Abstr. of XVII Int. Congr. of Genet.— Birmin gham : Oxforod Univ. press, 1993.— P. 203. 116. Dunckley M. G., Wells D. J.. Walsh F. S. et al Retroviral transfer of dystrophin minigene into mdx muscle in vivo / / Ibid. Ин-т молекуляр. биологии и генетики HAH Украины, Киев Получено 23.02.95 ISSN 023Э-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1996. Т, И, № 3-4 23

Молекулярно-генетические аспекты мышечной дистрофии Дюшенна

Репозитарії

Схожі ресурси