Влияние молекулярного кислорода на ферментативную активность НАДН-Зависимых дегидрогеназ

Установлен неизвестный ранее эффект – зависимость скорости ферментативной реакции превращения пировиноградной кислоты в молочную, катализируемой лактатдегидрогеназой (JIДГ ) в присутствии никотинамидадениндинуклеотида восстановленного (NADH) от концентрации растворенного в реакционной среде кислород...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1991
Автори:	Мостовников, В.А., Мостовникова, Г.Р., Плавский, В.Ю., Третьяков, С.А.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1991
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Теми:	Структура и функции биополимеров
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155831
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Влияние молекулярного кислорода на ферментативную активность НАДН-Зависимых дегидрогеназ / В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, В.Ю. Плавский, С.А. Третьяков // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 5. — С. 42-50. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-155831
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1558312019-06-19T01:28:29Z Влияние молекулярного кислорода на ферментативную активность НАДН-Зависимых дегидрогеназ Мостовников, В.А. Мостовникова, Г.Р. Плавский, В.Ю. Третьяков, С.А. Структура и функции биополимеров Установлен неизвестный ранее эффект – зависимость скорости ферментативной реакции превращения пировиноградной кислоты в молочную, катализируемой лактатдегидрогеназой (JIДГ ) в присутствии никотинамидадениндинуклеотида восстановленного (NADH) от концентрации растворенного в реакционной среде кислорода воздуха (O₂). Показано, что этот эффект обусловлен образованием комплекса динуклеотида с молекулами O₂. Установлено, что удаление молекулярного кислорода из раствора кофермента приводит к изменению пространственной структуры молекул NADH. Изменения, индуцируемые молекулярным кислородом, носят обратимый характер. Для реакции превращения лактата в пиру ват, катализируемой ЛДГ в присутствии NAD окисленного (NAD⁺), зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации растворенного кислорода не наблюдается. Не происходит и комплексообразования окисленной формы кофермента с молекулами O₂. Встановлено невідомий раніше ефект – залежність швидкості ферментативної реакції перетворення піровиноградної кислоти в молочну, що каталізується лактатдегідрогеназ ою (ЛДГ) в присутності нікотинамідаденіндинуклеотиду відтвореного (NADH) від концентрації розчиненого в реакційному середовищі кисню повітря (O₂). Показано, що цей ефект обумовлений утворенням комплексу динуклеотиду з молекулами O₂ . Встановлено, що видалення молекулярного кисню із розчину коферменту призводить до змін простірної структури молекул NADH. Зміни, викликані молекулярним киснем, мають зворотній характер. Для реакції перетворення лактату в піруват, що каталізується ЛДГ в присутності NAD окисленого (NAD⁺ ), залежності швидкості ферментативної реакції від концентрації розчиненого кисню не спостерігається. Не відбувається і комплексоутворення окисленої форми коферменту з молекулами O₂. A new effect, the dependence of the rate of the enzymatic biochemical reaction of pyruvate transformation to lactate catalyzed by lactatedehydrogenase (LDH) in the presence of reduced nicotinamidadeninedinucleotide (NADH) on the concentration of air oxygen (O₂) dissolved in the reaction medium, are reported. It is shoun that this effect is due to the dinucleotide with molecules O₂ complex formation. It is found that the molecular oxygen removal from the coenzyme solution lead to the NADH spatial structure change. Changes, induced by molecular oxygen, are reversible. The dependence of the rate enzymatic biochemical reaction on concentration of dissolved oxygen has not been observed in the case of lactate-pyruvate transformation reaction catalysed by LDH in the presence of nicotinamidadeninedinucleotide (NAD⁺). There have not been observed the NAD⁺ with O₂ molecules complexes. 1991 Article Влияние молекулярного кислорода на ферментативную активность НАДН-Зависимых дегидрогеназ / В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, В.Ю. Плавский, С.А. Третьяков // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 5. — С. 42-50. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0002F1 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155831 577.154+577.158 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Мостовников, В.А. Мостовникова, Г.Р. Плавский, В.Ю. Третьяков, С.А. Влияние молекулярного кислорода на ферментативную активность НАДН-Зависимых дегидрогеназ Биополимеры и клетка
description	Установлен неизвестный ранее эффект – зависимость скорости ферментативной реакции превращения пировиноградной кислоты в молочную, катализируемой лактатдегидрогеназой (JIДГ ) в присутствии никотинамидадениндинуклеотида восстановленного (NADH) от концентрации растворенного в реакционной среде кислорода воздуха (O₂). Показано, что этот эффект обусловлен образованием комплекса динуклеотида с молекулами O₂. Установлено, что удаление молекулярного кислорода из раствора кофермента приводит к изменению пространственной структуры молекул NADH. Изменения, индуцируемые молекулярным кислородом, носят обратимый характер. Для реакции превращения лактата в пиру ват, катализируемой ЛДГ в присутствии NAD окисленного (NAD⁺), зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации растворенного кислорода не наблюдается. Не происходит и комплексообразования окисленной формы кофермента с молекулами O₂.
format	Article
author	Мостовников, В.А. Мостовникова, Г.Р. Плавский, В.Ю. Третьяков, С.А.
author_facet	Мостовников, В.А. Мостовникова, Г.Р. Плавский, В.Ю. Третьяков, С.А.
author_sort	Мостовников, В.А.
title	Влияние молекулярного кислорода на ферментативную активность НАДН-Зависимых дегидрогеназ
title_short	Влияние молекулярного кислорода на ферментативную активность НАДН-Зависимых дегидрогеназ
title_full	Влияние молекулярного кислорода на ферментативную активность НАДН-Зависимых дегидрогеназ
title_fullStr	Влияние молекулярного кислорода на ферментативную активность НАДН-Зависимых дегидрогеназ
title_full_unstemmed	Влияние молекулярного кислорода на ферментативную активность НАДН-Зависимых дегидрогеназ
title_sort	влияние молекулярного кислорода на ферментативную активность надн-зависимых дегидрогеназ
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1991
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155831
citation_txt	Влияние молекулярного кислорода на ферментативную активность НАДН-Зависимых дегидрогеназ / В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, В.Ю. Плавский, С.А. Третьяков // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 5. — С. 42-50. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT mostovnikovva vliâniemolekulârnogokislorodanafermentativnuûaktivnostʹnadnzavisimyhdegidrogenaz AT mostovnikovagr vliâniemolekulârnogokislorodanafermentativnuûaktivnostʹnadnzavisimyhdegidrogenaz AT plavskijvû vliâniemolekulârnogokislorodanafermentativnuûaktivnostʹnadnzavisimyhdegidrogenaz AT tretʹâkovsa vliâniemolekulârnogokislorodanafermentativnuûaktivnostʹnadnzavisimyhdegidrogenaz
first_indexed	2025-07-14T08:03:38Z
last_indexed	2025-07-14T08:03:38Z
_version_	1837608698207272960
fulltext	УДК 577.154+577.158 B. А. Мостовников, Г. Р. Мостовникова, В. Ю. Плавский, C. А. Третьяков ВЛИЯНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО КИСЛОРОДА НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ НАДН-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ Установлен неизвестный ранее эффект — зависимость скорости ферментативной реак- ции превращения пировиноградной кислоты в молочную, катализируемой лактатде- гидрогеназой ( J I Д Г ) в присутствии никотинамидадениндинуклеотида восстановленно- го (NADH) от концентрации растворенного в реакционной среде кислорода воздуха (O2). Показано, что этот эффект обусловлен образованием комплекса динуклеотида с молекулами O2. Установлено, что удаление молекулярного кислорода из раствора кофермента приводит к изменению пространственной структуры молекул NADH. Из- менения, индуцируемые молекулярным кислородом, носят обратимый характер. Для реакции превращения лактата в пиру ват, катализируемой ЛДГ в присутст- вии NAD окисленного (NAD+), зависимости скорости ферментативной реакции от кон- центрации растворенного кислорода не наблюдается. Не происходит и комплексообра- зования окисленной формы кофермента с молекулами O2. Введение. При исследовании кинетики окислительно-восстановительной биохимической реакции превращения пирувата натрия в лактат, ката- лизируемой Л Д Г (L-лактат, N A D + - O K C H A редуктаза, К Ф 1 . 1 . 1 . 2 7 ) в при- сутствии N A D H : Л Д Г пируват Na + NADH <-> L-лактат Na + NAD + (1) установлен неизвестный ранее эффект — зависимость скорости этой реакции от концентрации растворенного в реакционной среде кислоро- да воздуха. Д л я реакции превращения лактата в пируват, катализируемой Л Д Г в присутствии NAD+ Л Д Г L-лактат Na + NAD + <-> пируват Na + NADH, (2) указанный эффект отсутствовал. В связи с тем, что рассматриваемые биохимические реакции отно- сятся к одним из важнейших звеньев обмена веществ в биологических системах, представляло интерес выяснить молекулярный механизм об- наруженного эффекта. Д а н н а я статья посвящена результатам упомянутых выше иссле- дований. Материалы и методы. В эксперименте использовали коммерческие препараты Л Д Г из средца быка и пируват натрия фирмы «Serva» ( Ф Р Г ) ; NAD+ и β-NADH фирмы «Reanal» (Венгрия); Dy L-лактат — «Реахим» (СССР) . Начальную скорость реакций определяли по уменьшению (реак- ция 1) или увеличению (реакция 2) оптической плотности (за проме- жуток времени с 10-й по 20-ю с с момента смешивания компонентов) при длине волны λ = 340 нм, соответствующей максимуму длинновол- новой полосы спектра поглощения NADH. Реакцию превращения пи- рувата в лактат проводили в 0,05 M фосфатном буфере при рН 7,2; в реакции превращения лактата в пируват применяли 0,05 M фосфатный буфер, рН 7,2, и 0,1 M глициновый буфер, рН 10,0 (точность контроля рН ± 0 , 0 5 ) . Реакцию запускали в спектрофотометрических кварцевых кюветах объемом 3 мл ( 1 X 1 X 3 см). Влияние молекулярного кислорода на скорость ферментативной реакции исследовали путем сравнения скоростей реакций при исполь- зовании кислородсодержащих и обескислороженных растворов фер- мент— кофермент. Д л я этого буферные растворы коферментов NADH © В. А. МОСТОВНИКОВ, г. Р. МОСТОВНИКОВА, в. Ю. ПЛАВСКИЙ, С. А. ТРЕТЬЯКОВ, 1991 42 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ1- S и NAD + освобождали от кислорода пропусканием инертного газа (в экспериментах использовали азот, аргон, гелий с содержанием посто- ронних газов не более 0,005 % или в результате вакуумирования. Затем к 100 мл кислородсодержащих (контрольный вариант) и обес- кислороженных (исследуемый вариант) растворов NADH (или NAD+) добавляли по 200 мкл кислородсодержащего раствора Л Д Г . Следует отметить, что добавление такого количества раствора Л Д Г в обескис- лороженные растворы NADH и NAD + (объемом 100 мл) приводило к ^практически несущественному увеличению концентріации O2 в получен- Ώ хЛ Рис . 1 Рис . 2 ных бинарных растворах NADH — ЛДГ и NAD + — Л Д Г по сравнению с исходными, прокаченными аргоном, растворами NADH и NAD+ . Пос- ле смешивания компонентов указанные растворы до запуска реакции выдерживали (во всех случаях, если не оговорено специально) в тече- ние 5 мин для образования комплекса фермент — кофермент. Биохимическую реакцию превращения пирувата в лактат (реак- ция 1) запускали внесением 1 мл кислородсодержащего (контрольный вариант) или обескислороженного (исследуемый вариант) раствора NADH — Л Д Г к 1 мл кислородсодержащего раствора пирувата. В ре- акции превращения лактата в пируват (реакция 2) 1 мл кислородсо- держащего (контрольный вариант) или обескислороженного (исследу- емый вариант) раствора NAD + — Л Д Г добавляли к 1 мл кислородсо- держащего раствора лактата (лактат готовили в глициновом буфере, рН 10,0). Таким образом, контрольные и исследуемые варианты ре- акций отличались только концентрацией молекулярного кислорода в бинарной смеси фермент — кофермент. Д л я исключения других арте- фактов контрольные и исследуемые эксперименты чередовали. К моменту начала ферментативной реакции концентрации (M) ис- пользуемых веществ были следующими. 3 реакции 1: Л Д Г — 3 - Ю - 9 , N A D H - 1 , 5 - I O - 4 , п и р у в а т — 1 , 9 · ΙΟ"4; в реакции 2: Л Д Г — 1,0· 10~9, N A D + - 5 , 0 - I O - 3 , лактат —2,5-IO" 3 . О комплексообразовании молекулярного кислорода с молекулами кофермента судили по изменению спектров электронного поглощения буферных растворов NADH и NAD + при увеличении парциального дав- ления кислорода. Измерения проводили на спектрофотометре Specord М40 UV VIS («Carl Zeiss», Г Д Р ) в специальных кюветах с базой 100 мм, позволяющих повышать давление газа над раствором до 150 атм. Об изменении конформации молекул NADH при удалении из ра- створа молекулярного кислорода свидетельствуют данные спектров флюоресценции, возбуждения флюоресценции и поляризации флюорес- ценции по возбуждению. Указанные люминесцентные измерения осу- ществляли на спектрофлюориметре SLM-4800 (США). Результаты и обсуждение. Исследования показали, что использо- вание обескислороженных растворов NADH — Л Д Г для запуска фер- ментативной реакции превращения пирувата в лактат приводит к 43 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ1- S уменьшению ее скорости (по сравнению с контрольными кислородсо- держащими растворами кофермента) на 30 %. На рис. 1 представ- лена кинетическая зависимость хода ферментативной реакции превра- щения пирувата в лактат (1—3) и лактата в пируват (4, 5) при ис- пользовании кислородсодержащих (/ , 4), обескислороженных (2, 5) и насыщенных кислородом воздуха после предварительного деаэрирова- ния (3) растворов фермент — кофермент. Как видно из рисунка, ско- рость исследуемого варианта реакции превращения пирувата в лак- тат значительно меньше, при этом кинетическая кривая хода фермен- тативной реакции отклоняется от линейной зависимости. Вероятно, от- клонение от линейности связано с тем, что в ходе реакции происходит частичное насыщение деаэрированного раствора NADH — Л Д Г кисло- родом (как уже отмечалось, реакция запускается кислородсодержащим раствором пирувата натрия) , приводящее к некоторому увеличению скорости реакции. Действительно, исследования показали, что если обескислороженный раствор NADH до смешивания с раствором Л Д Г повторно насыщался кислородом, то скорость реакции с участием это- го реагента соответствовала (была равна) скорости реакции контроль- ного варианта (рис. 1, кривая 3) . Данный факт позволяет сделать вы- вод о том, что изменения, индуцируемые удалением кислорода, носят обратимый характер. Как показали результаты исследований, скорость окислительно- восстановительной реакции превращения лактата в пируват, катали- зируемой Л Д Г в присутствии NAD+, не зависит от концентрации ра- створенного кислорода (см. рис. 1, кривые 4, 5). Установлено, что скорость реакции превращения пирувата в лак- тат во многом определяется условиями формирования комплекса NADH — Л Д Г и временем его инкубирования. Эксперимент проводи- ли следующим образом. Готовили четыре раствора (по 100 мл) буфе- ра. Два из них (исследуемые) прокачивали аргоном, а два находились при атмосферном давлении кислорода. Затем в один из сосудов с про- каченным буфером последовательно (с интервалом 30 мин) вносили по 100 мкл концентрированных растворов NADH и Л Д Г . В другой де- аэрированный сосуд с буфером вносили 200 мкл раствора NADH — Л Д Г (комплекс NADH — Л Д Г формировался в кислородсодержащей среде). Аналогично прибавляли компоненты в сосуды с кислородсодер- жащим буфером (контрольные растворы). На рис. 2 представлена за- висимость ферментативной активности Л Д Г от времени инкубировіа- ния комплекса NADH — Л Д Г в анаэробном (У, 2) и аэробном (<?, 4) буферах: при последовательном внесении в буфер концентрированных растворов NADH и Л Д Г (1, 3) и концентрированного комплекса NADH — Л Д Г , формирование которого производилось в кислородсо- держащих растворах (2, 4). Как следует из графика, уже после инку- бирования раствора Л Д Г с NADH в течение 5 мин (времени, необхо- димого для образования комплекса NADH — Л Д Г ) наблюдаются су- щественные различия в скорости ферментативной реакции при исполь- зовании кислородсодержащих и обескислороженных растворов. При этом наиболее низкое значение скорости ферментативной реакции на- блюдается при использовании комплекса NADH — Л Д Г (рис. 2, кри- вая 1), формирование которого проводилось в анаэробных условиях, т. е. при последовательном внесении в обескислороженный буфер NADH и Л Д Г . Если же комплекс NADH — Л Д Г формировался в при- сутствии кислорода, а затем его вносили в обескислороженный буфер,, то скорость реакции (рис. 2, кривая 2) мало отличалась от таковой при использовании контрольных растворов (кривые 3, 4). Необходима отметить, что для кислородсодержащих растворов скорость реакции не зависела от того, вносили в буфер предварительно сформированный комплекс NADH — Л Д Г (кривая 3) или кофермент и фермент после- довательно (кривая 4). Увеличение времени инкубирования комплекса NADH — Л Д Г как в кислородсодержащем, так и обескислороженном буфере приводит к 44 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ1- S потере ферментативной активности Л Д Г . Однако, если для кислород- содержащих растворов снижение ферментативной активности незначи- тельно (остаточная ферментативная активность спустя 2 ч составляет γ = 85 %) , то для деаэрированных растворов γ = 70 % в случае форми- рования комплекса NADH — Л Д Г в кислородсодержащих условиях и γ = 3·0 % при последовательном внесении в буфер NADH и Л Д Г . То есть с течением времени различия в остаточной ферментативной ак- тивности между кислородсодержащими и обескислороженными раство^ рами становятся все более существенными. Рис. 3 Следует отметить, что если после насыщения молекулярным кис- лородом растворов NADH — Л Д Г , предварительно инкубированных в течение 5 мин в анаэробных условиях, наблюдается практически пол- ное восстановление активности фермента, то насыщение кислородом растворов, инкубированных в анаэробных условиях в течение 2 ч, при- водит лишь к частичному восстановлению ферментативной активности Л Д Г . Определенную информацию о механизме ингибирования активнос- ти фермента можно получить из анализа зависимости скорости (V) ферментативной реакции от концентрации одного из субстратов {[S]) в отсутствие и присутствии ингибитора [1]. Однако нахождение зави- симости V = f[S] в условиях данного эксперимента сопряжено со зна- чительными трудностями вследствие изменения во времени активности фермента в анаэробных условиях. Д л я исключения указанного артефак- та измерения проводили через 2 ч после добавления Л Д Г к NADH, когда ферментативная активность уже практически не изменяется во времени (см. рис. 2, кривая 1). На рис. 3, а, представлена зависимость начальной скорости ферментативной реакции превращения пирувата в л а к т а т от концентрации пирувата (график Михаэлиса — Ментен) при использовании кислородсодержащих (кривая 1) и обескислороженных (кривая 2) растворов Л Д Г . Как видно, какой бы высокой ни была кон- центрация пирувата, максимальная скорость окислительно-восстанови- тельной реакции при использовании деаэрированных растворов NADH — Л Д Г значительно ниже, чем кислородсодержащих. Из линей- ной анаморфозы уравнения М и х а э л и с а — М е н т е н — зависимости Лай- нуивера — Берка \/V=f(l/[S]), представленной на рис. 3 ,6 , следует также, что замена кислородсодержащего раствора NADH — Л Д Г на обескислороженный приводит к увеличению константы Михаэлиса, т. е. к снижению степени сродства пирувата к субстратсвязывающему центру Л Д Г . Так как концентрация используемых реагентов, рН и температура кислородсодержащего и обескислороженного растворов оставались во время всего эксперимента постоянными, можно предположить, что из- менение скорости ферментативной реакции при удалении из раствора молекулярного кислорода обусловлено либо участием O2 в каталити- ческом переносе электронов [2, 3], либо изменением структуры компо- нентов биохимической реакции при удалении из раствора молекуляр- 45 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ1- S ного кислорода. Не отрицая возможной роли кислорода как переносчи- ка электрона в механизме окислительно-восстановительной реакции (что является предметом многочисленных дискуссий [2, 3 ] ) , мы попы- тались проверить, не связаны ли наблюдаемые эффекты с различием в пространственной структуре молекул NADH в присутствии и отсут- ствие молекулярного кислорода. Основанием для вывода об отличиях пространственной структуры молекул NADH в аэробных условиях являются наблюдаемые различия в: 1) спектрах возбуждения флюоресценции; 2) поляризационных спектрах флюоресценции по возбуждению; 3) интенсивности и спектральном расположении спектров флюоресценции растворов кофермента. Прежде чем представить результаты исследований, свидетельству- ющих об изменении пространственной структуры NADH при удалении молекулярного кислорода, кратко остановимся на структурных и спек- трально-люминесцентных характеристиках кофермента. Рис. 4 Рис. 5 Как известно [3, 4J, NAD образован двумя нуклеотидами, соеди- ненными пирофосфатной связью. В качестве оснований в одном нук- леотиде выступает аденин, во втором — дигидроникотинамид (пириди- новый нуклеотид). В растворе молекула NADH, как и ее окисленный аналог NAD+, существует в двух основных конформациях: вытянутой, в которой основания аденина и никотинамида удалены друг от друга примерно на 1,2 нм, и компактной, в которой два гетероцикла распо- лагаются параллельно друг под другом на расстоянии 0,34 нм [4] . Все эти конформации переходят одна в другую. Количественное соот- ношение между ними зависит от условий и свойств среды, в которой находится кофермент. Спектр поглощения буферного раствора NADH характеризуется наличием максимумов в области 260 нм (основной вклад вносит аде- ниновое основание) и 340 нм (определяется никотинамидным хромофо- ром) [4, 8]. Флюоресцентные свойства диьуклеотида обусловлены ос- нованием дигидроникотинамида (максимум спектра флюоресценции расположен в области 470 нм). В пользу этого свидетельствует тот факт, что флюоресценция аденина расположена в области 390 нм, ха- рактеризуется очень низким квантовым выходом ( ~ 1 0 ~ 5 ) и в спек- трах пиридиновых нуклеотидов не наблюдается [8]. Кроме того, в спектре возбуждения флюоресценции NADH присутствует полоса с максимумом в области 340 нм, соответствующая поглощению дигидро- никотинамида. Следует отметить, что при наличии в растворе значительного ко- личества молекул NADH в компактной конформации в спектре воз- буждения флюоресценции кофермента ( λ ρ θ Γ = 4 7 0 нм) регистрируется полоса с максимумом в области 260 нм. Как показывают многочислен- ные исследования [8—11], наличие указанной полосы обусловлено миг- рацией энергии от электронно-возбужденного аденина к дигидронико- 46 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ1- S тинамиду. Одним из доказательств внутримолекулярного переноса энергии является тот факт, что после обработки динуклеотида пиро- фосфатазой максимум в области 260 нм исчезает [9] . Учитывая, что эффективность переноса энергии электронного возбуждения сущест- венно зависит от расстояния между донором и акцептором, по измене- нию соотношения интенсивностей на длине волны 260 и 340 нм в спек- тре возбуждения флюоресценции NADH можно судить о степени раз- вернутости молекул динуклеотида [10]. Указанный факт и использо- вался нами как одно из доказательств изменения пространственной структуры кофермента при удалении из раствора молекулярного кис- лорода. На рис. 4 представлены нормированные спектры возбуждения (У, 2) (Я Р ег = 470 нм) и флюоресценции (3, 4) (λΒΟ36 = 340 нм) буфер- ного раствора NADiI в аэробном (7, 3) и анаэробном (2, 4) буферах. Как видно из рисунка, снижение концентрации растворенного кисло- рода в растворе кофермента приводит к возрастанию интенсивности коротковолновой полосы (при λ = 260 им) в спектре возбуждения NADH, что прямо указывает на изменение пространственной структу- ры последнего. Правомерность этого заключения подтверждается данными гто за- висимости степени поляризационных спектров флюоресценции (Xper = = 470 нм) от длины волны возбуждения для кислородсодержащего (1) и обескислороженного (2) растворов NADH, представленными на рис. 5. Как следует из рисунка, степень поляризации флюоресценции кофермента (/ = 20 °С) при возбуждении в длинноволновой области спектра практически не отличается от кислородсодержащего и обес- кислороженного растворов кофермента и составляет P = I l %· Со сме- щением длины волны возбуждения в коротковолновую область наблю- дается снижение степени поляризации [12], обусловленное миграцией энергии от аденина к никотинамиду. (Метод измерения поляризации флюоресценции при внутримолекулярном переносе энергии неоднократ- не использовался для исследования структурных перестроек белков, дипептидов и т. п. [13].) При этом деполяризация флюоресценции для деаэрированного раствора NADH (рис. 5, кривая 2) выражена в боль- шей степени, чем для кислородсодержащего (кривая 1). Учитывая, что перенос энергии в молекуле NADH обусловлен внутримолекулярными диполь-дипольными взаимодействиями [9], наблюдаемое на графике увеличение эффективности переноса энергии при удалении из раство- ра кислорода может быть связано либо с уменьшением расстояния донор — акцептор, либо с изменением угла между диполем донора и акцептора. Еще одним свидетельством конформационных превращений дигид- рсникотинамидадениндинуклеотида восстановленного является увели- чение (на 6 %) интенсивности и смещение в коротковолновую область спектра флюоресценции NADH при снижении парциального давления кислорода. Нормированные спектры кислородсодержащих и деаэриро- ванных растворов NADH представлены на рис. 4 (кривые 3 я 4 соот- ветственно). Можно было бы предположить, что увеличение квантово- го выхода флюоресценции при деаэрировании раствора NADH связа- но с уменьшением влияния кислорода как тушителя возбужденного со- стояния молекул кофермента. Однако при тушении флюоресценции должен наблюдаться коротковолновый сдвиг спектра флюоресценции [14], т. е. эффект, обратный наблюдаемому нами. Таким образом, совокупность представленных данных позволяет сделать вывод о том, что молекулярный кислород стабилизирует опре- деленную ориентацию основания и углеводного кольца, которая обес- печивает эффективное протекание окислительно-восстановительной ре- акции превращения пирувата в ліактат. Установлено, что причиной различий пространственной структуры NADH в аэробных и анаэробных условиях является образование рав- новесных комплексов динуклеотида с молекулами O2. Об образовании комплекса молекулярного кислорода с NADH свидетельствует измене- 47 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ1- S ниє спектра электронного поглощения буферного раствора кофермен- та при повышении парциального давления кислорода. Д л я примера на рис. 6 представлены спектры поглощения раствора NADH при кон- центрациях кислорода, соответствующих (по закону Генри) атмосфер- ной (кривая 1) и Р = 9 0 атм (кривая 2). Как видно из рисунка, при повышении парциального давления кислорода интенсивность полосы электронного поглощения (S(T-^Si) раствора NADH сильно возрастает. Следует отметить, что возрастание коэффициента экстинкции буферно- го раствора при увеличении концентрации растворенного кислорода обусловлено двумя составляющими: а) за счет образования комплек- са растворенного кислорода с буфером; б) вследствие связывания O2 Рис. 6 Рис . 7 с молекулами NADH. Вклад в общее увеличение интенсивности погло- щения составляющей, обусловленной комплексообразованием O2 — бу- фер, можно оценить из дифференциального спектра (рис. 7: дифферен- циальный спектр поглощения буфера ( / ) , буферных растворов NADH (2—5) и NAD+ (6) при давлении газа (O2 (1—4, 6) и Ar (5)) над раствором P = = 90 атм. Концентрация NADH: 0,6· IO-5 (2); 1,9· IO-5 (3); 2,28- Ю~5 {4,5); N A D + - 0,6· 10~5 M (6) ) . Как видно из рис. 7, воз- растание интенсивности поглощения при насыщении раствора кислородом в присут- ствии молекул NADH более значительное, чем для буфера, и наблюдается по всему спектру поглощения кофермента, монотонно падая со смещением в длинноволновую об- ласть. Причем прирост поглощения (по от- ношению к буферу) прямо пропорционален концентрации кофермента (рис. 8: зависи- мость прироста (по отношению к буферу) оптической плотности при длине волны 290 нм в дифференциальном спектре поглощения NADH и давлении кислорода P = 90 атм от кон- центрации кофермента) . Установлено, что наблюдаемые спектральные изменения не обу- словлены окислением молекул NADH растворенным кислородом. Об этом свидетельствует исчезновение полосы поглощения в дифференци- альном спектре раствора NADH при удалении (путем пропускания іар- гона) из него молекулярного кислорода. Окислительные же процессы становятся спектрально регистрируемыми в случае хранения раство- ров NADH при повышенном давлении кислорода ( Р ~ 90 атм) в тече- ние нескольких часов. В таких условиях наблюдается снижение ин- тенсивности поглощения в длинноволновом максимуме ( λ = 3 4 0 нм) и прирост поглощения в области λ = 2 6 0 нм. Таким образом, представленные данные являются прямым дока- зательством образования комплекса растворенного кислорода с моле- W 2,0 MDHJ-IO5M Рис. 8 48 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ1- S •пулами NADH. Восстановление спектральных характеристик кофер- мента при удалении из его раствора избытка кислорода свидетельству- ет о лабильности такого комплексообразования. В отличие от представленных результатов взаимодействие с кис- лородом окисленной формы кофермента (NAD+) не приводит к обр;а- зованию комплекса O2 — NAD+. Об этом, в частности, свидетельствует отсутствие различий в дифференциальных спектрах поглощения буфе- ра (см. рис. 7, кривая 1) и буферного раствора NAD+ (кривая 6) при одинаковом давлении (P = 90 атм) кислорода. То есть появление поло- сы поглощения в буферном растворе NAD+ при повышении давления кислорода обусловлено только образованием комплекса молекулярно- го кислорода с буфером, и растворение в нем NAD+ не приводит к до- полнительному связыванию кислорода. Заслуживает внимания и тот факт, что в отличие от результатов, полученных с кислородом, повы- шение парциального давления іаргона, азота или гелия в буфере или буферном растворе NADH практически не приводит к изменению их спектров поглощения и, значит, к появлению полосы поглощения в диф- ференциальных спектрах. Д л я примера на рис. 7 (кривая 5) показан дифференциальный спектр поглощения раствора NADH при давлении аргона 90 атм. Представленные данные также позволяют заключить, что измене- ние спектров поглощения NADH при повышении концентрации раство- ренного кислорода является не артефактом, а отражает результат комплексообразования кофермент — молекулярный кислород. Следует отметить, что косвенные данные о повышенном сродстве молекулярного кислорода к молекулам NADH содержатся в работах [15, 16]. Образование комплекса молекул O2 с моделями NADH по- стулируется в исследованиях [3, 17]. Авторы признательны С. В. Коневу (Институт фотобиологии АН Б С С Р ) за плодотворное обсуждение работы. Р е з ю м е В с т а н о в л е н о нев ідомий ран іше ефект — з а л е ж н і с т ь швидкост і ф е р м е н т а т и в н о ї реакц і ї перетворення п іровиноградно ї кислоти в молочну, щ о к а т а л і з у є т ь с я л а к т а т д е г і д р о г е н а - з о ю ( Л Д Г ) в присутност і н і к о т и н а м і д а д е н і н д и н у к л е о т и д у в ідтвореного ( N A D H ) в ід концентрац і ї розчиненого в реакц ійному середовищі кисню пов і тря ( O 2 ) . П о к а з а н о , щ о цей ефект обумовлений утворенням комплексу д и н у к л е о т и д у з м о л е к у л а м и O 2 . Встановлено , щ о в и д а л е н н я м о л е к у л я р н о г о кисню із розчину к о ф е р м е н т у п р и з в о д и т ь д о змін прост ірної с труктури м о л е к у л N A D H . Зміни, викликан і м о л е к у л я р н и м киснем, м а ю т ь зворотн ій х а р а к т е р . Д л я реакці ї перетворення л а к т а т у в п іруват , щ о к а т а л і з у є т ь с я Л Д Г в присут- ності N A D окисленого ( N A D + ) , з а л е ж н о с т і швидкост і ф е р м е н т а т и в н о ї реакц і ї в ід к о н ц е н т р а ц і ї розчиненого кисню не спостерігається . Н е в і д б у в а є т ь с я і комплексоут - в о р е н н я окисленої ф о р м и к о ф е р м е н т у з м о л е к у л а м и O 2 . S u m m a r y A n e w ef fec t , t he d e p e n d e n c e of the r a t e of t h e e n z y m a t i c b iochemica l r eac t i on of py- r u v a t e t r a n s f o r m a t i o n to l a c t a t e c a t a l y z e d b y l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e ( L D H ) in t he pre- s ence of r educed n i c o t i n a m i d a d e n i n e d i n u c l e o t i d e ( N A D H ) on the c o n c e n t r a t i o n of air o x y g e n (O 2 ) d i s so lved in t he r eac t ion m e d i u m , a re r epo r t ed . I t is s h o u n t h a t t h i s e f - fec t is due to the d inuc leo t ide w i t h mo lecu le s O 2 c o m p l e x f o r m a t i o n . I t is f o u n d t h a t t h e m o l e c u l a r o x y g e n r e m o v a l f r o m the c o e n z y m e so lu t i on lead to t h e N A D H s p a t i a l s t r u c t u r e c h a n g e . C h a n g e s , i nduced by m o l e c u l a r o x y g e n , a re revers ib le . The d e p e n d e n c e of the r a t e e n z y m a t i c b iochemica l r eac t i on on c o n c e n t r a t i o n of d i s so lved o x y g e n h a s n o t been obse rved in t he case of l a c t a t e - p y r u v a t e t r a n s f o r m a t i o n r e a c t i o n c a t a l y s e d by L D H in t he p re sence of n i c o t i n a m i d a d e n i n e d i n u c l e o t i d e ( N A D + ) . The re h a v e no t been obse rved the N A D + wi th O - molecu les complexes f o r m a t i o n . ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 4—1-438 49 С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы 1. Березин И. В., Клесов А. А. П р а к т и ч е с к и й курс химической и ф е р м е н т а т и в н о й ки- н е т и к и . — М . : И з д - в о МГУ, 1 9 7 6 . — 3 2 0 с. 2. Зеленин С. E., Хидекель М. Л. К а т а л и т и ч е с к и й перенос электронов / / Успехи хи- м и и . — 1 9 7 0 . — 3 9 , № 2 . — С . 209—234. 3. Ясников А. А., Пономаренко С. П. М е х а н и з м реакций окисления моделей N A D H и ф е н и л г л и о к с а л я перекисью в о д о р о д а . Гипотеза о р а з д е л ь н о м переносе а т о м а в о д о р о д а и э л е к т р о н а в некоторых ф е р м е н т а т и в н ы х р е а к ц и я х с участием N A D H и N A D P H / / Б и о х и м и я . — 1976 .—41 , № 5 . — С . 891—897. 4. Мальцев Н. И. В з а и м о д е й с т в и е н и к о т и н а м и д а д е н и н д и н у к л е о т и д о в с а п о ф е р м е н т а - ми д е г д и р о г е н а з / / К о ф е р м е н т ы . — М. : Медицина , 1973.— С. 13—67. 5. Jacobus J. C o n f o r m a t i o n of py r id ine d inuc leo t ides in so lu t ion / / B iochemis t ry .— · 1971 ,—10, N 1 , — P . 161—164. 6. Conformation of N A D + in so lu t ion , in h o l o e n z y m e s and in the c r y s t a l l i n e L i + - c o m p - Iex / W. S a e n g e r , B. S. Reddy , K. M u h l e g e r , G. W e i m a n n / / P y r i d i n e nuc leo t ide -de - p e n d e n t d e h y d r o g e n a s e s / Ed . H. S u n d . - New York, 1 9 7 7 . — P . 222—236. 7. Зенгер В. П р и н ц и п ы структурной организации нуклеиновых кислот .— М. : Мир , 1987 ,—С. 212—215. 8. Юденфренд С. Флюоресцентный анализ в биологии и медицине.— М. : Мир, 1965.— 484 с. 9. Weber G. I n t r a m o l e c u l a r t r a n s f e r of e lec t ron ic e n e r g y in d i h y d r o d i p h o s p h o p y r i d i n e n u c l e o t i d e / / N a t u r e . — 1957.— 180, N 1 2 , — P . 1409. 10. freed S., Neyfakh Ε. A., Tumerman L. A. I n f l u e n c e of s o l v e n t s on the i n t r a m o l e - cu l a r e n e r g y t r a n s f e r in N A D H and N A D P H / / B i o c h i m . et b iophys . ac ta .— 1967.— 143, N 2 , — P . 432—434. 11. Shifrin SKaplan N. O. S t r u c t u r e of d i h y d r o d i p h o s p h o p y r i d i n e n u c l e o t i d e / / N a t u r e . — 1959 _ 183, N 4 6 7 4 . — P . 1529. 12. Emission p r o p e r t i e s of N A D H . S t u d i e s of f l u o r e s c e n c e l i f e t imes and q u a n t u m ef f i - c iencies of N A D H , A c P y A D H , and s impl i f i ed syn the t i c m o d e l s / T . S. Sco t t , R. D. Spence r , N. J . L e o n a r d , G. W e b e r / / J . Amer . Chem. S o c . - 1970 .—92, N 3,— P . 687—695. 13. Конев С. В. Э л е к т р о н н о - в о з б у ж д е н н о е состояние б и о п о л и м е р о в . — М и н с к : И з д - в о Бел . ун-та, 1965.— 346 с. 14. Лакович Дж. Основы флюоресцентной спектроскопии.— М. : Мир, 1986.— 496 с. 15. Bernofsky С., Wanda S.-Y. С. F o r m a t i o n of r educed n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d inuc leo- t ide p e r o x i d e / / J . Biol . C h e m . — 1982 .—257 , N 1 2 , — P . 6809—6817. 16. Умрихина А. В., Луганская A. H., Красковский А. А. С в е т о и н д у ц и р о в а н н ы е сигна- лы Э П Р в водных р а с т в о р а х N A D H и N A D P H / / Д о к л . А Н С С С Р , — 1989 .—304 , № 6 . — С . 1485—1489. 17. Фотосинтез. Химические модели и м е х а н и з м ы / А . А. Ясников, А. И. Вовк, А. Б . Узиенко и др .— Киев : Н а у к , д у м к а , 1989 ,—С. 114—128. Ин-т физики им. Б . И. С т е п а н о в а А Н Б С С Р , Минск Получено 01.11.90 50 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ1- S

Влияние молекулярного кислорода на ферментативную активность НАДН-Зависимых дегидрогеназ

Репозитарії

Схожі ресурси