Новые упаковочные клетки на базе адаптированного варианта вируса саркомы Рауса
Созданы новые упаковочные клетки F18/pJD, содержащие вирус-помощник на базе трансфсрмационно-дефектного мутанта адаптированного к уткам варианта пражского штамма вируса саркомы Рауса (td daPr-RSV-C), которые продуцируют репликативно-дефектный ретровирусный вектор с титром 10⁶ КОЕ/мл. Делетирование ц...
Збережено в:
| Дата: | 1999 |
|---|---|
| Автори: | , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1999
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155965 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Новые упаковочные клетки на базе адаптированного варианта вируса саркомы Рауса / И.В. Кайда, С.М. Серов, А.М. Михайлик, П.Н. Болтовец, В.И. Кашуба, А.В. Рындич // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 1. — С. 67-74. — Бібліогр.: 31 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-155965 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1559652019-06-18T01:30:41Z Новые упаковочные клетки на базе адаптированного варианта вируса саркомы Рауса Кайда, И.В. Серов, С.М. Михайлик, А.М. Болтовец, П.Н. Кашуба, В.И. Рындич, А.В. Вирусы и клетка Созданы новые упаковочные клетки F18/pJD, содержащие вирус-помощник на базе трансфсрмационно-дефектного мутанта адаптированного к уткам варианта пражского штамма вируса саркомы Рауса (td daPr-RSV-C), которые продуцируют репликативно-дефектный ретровирусный вектор с титром 10⁶ КОЕ/мл. Делетирование цис-активных последовательностей у упаковочной области и обращенных повторов Е, фланкирующих srcf адаптированного варианта ретровируса при создании конструкции вируса-помощника позволило получить пул векторного вируса, свободный от последовательностей вируса-помощника. Створено нові пакувальні клітини F18/pJD, які містять вірус-помічник на основі трансформаційно-дефектного мутанта адаптованого до качок варіанту празького штама вірусу саркоми Рауса (td daPr-RSV-C), що продукують реплікативнодефектний ретровірусний вектор з титром 10⁶ КУО/мл. Дилетування цис-активних послідовностей V пакувальної області та. обернених повторів (Е), фланкуючих src, адаптованого варіанту ретровірусу при створенні конструкції вірусу-помічника дозволим) отримати пул векторного вірусу без послідовностей вірусу-помічника. We have constructed a new transformation-defective mutant of duck-adapted variant of Rouse sarcoma virus Prague strains subgroup C (td daPr-RSV-C) – based packaging cell line. F18/pJD which produces replication-defective vector with a liter 10⁶ CfU/ml. Deletion of cis-acting sequences of packaging region and E (direct repeat flanking src) in the adapted variant of retrovirus allowed us to obtaine a pool of retrovirus vector without helper virus sequences. 1999 Article Новые упаковочные клетки на базе адаптированного варианта вируса саркомы Рауса / И.В. Кайда, С.М. Серов, А.М. Михайлик, П.Н. Болтовец, В.И. Кашуба, А.В. Рындич // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 1. — С. 67-74. — Бібліогр.: 31 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000508 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155965 517.15:516.858 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Вирусы и клетка Вирусы и клетка |
| spellingShingle |
Вирусы и клетка Вирусы и клетка Кайда, И.В. Серов, С.М. Михайлик, А.М. Болтовец, П.Н. Кашуба, В.И. Рындич, А.В. Новые упаковочные клетки на базе адаптированного варианта вируса саркомы Рауса Биополимеры и клетка |
| description |
Созданы новые упаковочные клетки F18/pJD, содержащие вирус-помощник на базе трансфсрмационно-дефектного мутанта адаптированного к уткам варианта пражского штамма вируса саркомы Рауса (td daPr-RSV-C), которые продуцируют репликативно-дефектный ретровирусный вектор с титром 10⁶ КОЕ/мл. Делетирование цис-активных последовательностей у упаковочной области и обращенных повторов Е, фланкирующих srcf адаптированного варианта ретровируса при создании конструкции вируса-помощника позволило получить пул векторного вируса, свободный от последовательностей вируса-помощника. |
| format |
Article |
| author |
Кайда, И.В. Серов, С.М. Михайлик, А.М. Болтовец, П.Н. Кашуба, В.И. Рындич, А.В. |
| author_facet |
Кайда, И.В. Серов, С.М. Михайлик, А.М. Болтовец, П.Н. Кашуба, В.И. Рындич, А.В. |
| author_sort |
Кайда, И.В. |
| title |
Новые упаковочные клетки на базе адаптированного варианта вируса саркомы Рауса |
| title_short |
Новые упаковочные клетки на базе адаптированного варианта вируса саркомы Рауса |
| title_full |
Новые упаковочные клетки на базе адаптированного варианта вируса саркомы Рауса |
| title_fullStr |
Новые упаковочные клетки на базе адаптированного варианта вируса саркомы Рауса |
| title_full_unstemmed |
Новые упаковочные клетки на базе адаптированного варианта вируса саркомы Рауса |
| title_sort |
новые упаковочные клетки на базе адаптированного варианта вируса саркомы рауса |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1999 |
| topic_facet |
Вирусы и клетка |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/155965 |
| citation_txt |
Новые упаковочные клетки на базе адаптированного варианта вируса саркомы Рауса / И.В. Кайда, С.М. Серов, А.М. Михайлик, П.Н. Болтовец, В.И. Кашуба, А.В. Рындич // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 1. — С. 67-74. — Бібліогр.: 31 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT kajdaiv novyeupakovočnyekletkinabazeadaptirovannogovariantavirusasarkomyrausa AT serovsm novyeupakovočnyekletkinabazeadaptirovannogovariantavirusasarkomyrausa AT mihajlikam novyeupakovočnyekletkinabazeadaptirovannogovariantavirusasarkomyrausa AT boltovecpn novyeupakovočnyekletkinabazeadaptirovannogovariantavirusasarkomyrausa AT kašubavi novyeupakovočnyekletkinabazeadaptirovannogovariantavirusasarkomyrausa AT ryndičav novyeupakovočnyekletkinabazeadaptirovannogovariantavirusasarkomyrausa |
| first_indexed |
2025-07-14T08:09:52Z |
| last_indexed |
2025-07-14T08:09:52Z |
| _version_ |
1837609090319122432 |
| fulltext |
ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1999. Т. 15. № 1
Новые упаковочные клетки на базе
адаптированного варианта вируса саркомы Рауса
И. В. Кайда, С. М. Серов1, А. М. Михайлик, П. Н. Болтовец,
В. И. Кашуба, А. В. Рындич
Институт молекулярной биологии и генетики HAH Украины
252143, Киев, ул. Академика Заболотного, 150
Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта РАН
117984, Москва, ул. Вавилова, 32
Созданы новые упаковочные клетки F18/pJD, содержащие вирус-помощник на базе трансформаци-
онно-дефектного мутанта адаптированного к уткам варианта пражского штамма вируса
саркомы Рауса (td daPr-RSV-C), которые продуцируют репликативно-дефектньш ретровирусный
вектор с титром IO6 КОЕ/мл. Делетирование цис-активкых последовательностей -ψ упаковочной
области и обращенных повторов Е, фланкирующих src, каптированного варианта ретровируса
при создании конструкции вируса-помощника позволило получить пул векторного вируса, свобод-
ный от последовательностей вируса-помощникаι
Введение. Современные ретровирусные реплика-
тивно-дефектные системы для переноса генов дол-
жны иметь в своем составе упаковочные клетки,
несущие интегрированный провирус вируса-по-
мощника и продуцирующие репликативно-дефект-
ный рекомбинантный ретровирусный вектор с вы-
соким титром в отсутствие продукции вируса-по-
мощника (см. обзор [1]).
Суммируя данные, полученные для птичьих
ретровирусных репликативно-дефектных систем,
можно выделить две группы экспериментальных
проблем, на решение которых были направлены, в
основном, предыдущие исследования [3—7 ]:
а) повышение продуктивности упаковочных
клеток;
б) исключение продукции репликативно-ком-
петентного вируса-помощника на упаковочных
клетках.
Геном вируса-помощника модифицируют так,
чтобы максимально понизить вероятность упаковки
собственной РНК вируса-помощника на упаковоч-
ных клетках, делетируя биоактивные последова-
тельности, вовлеченные в процесс упаковки вирио-
© И. В. КАЙДА, С. М. СЕРОВ, А. М. МИХАЙЛИК,
П. Н. БОЛТОВЕЦ, В. И. КАШУБА, А. В. РЫНДИЧ, !999
на. У вируса саркомы Рауса (RSV) к ним относят:
хр упаковочные последовательности 5'-нек:одирую-
щей области ретровирусного генома [8 ]; обращен-
ные повторы Е, фланкирующие src [9 ]; последова-
тельности коротких открытых рамок считывания в
5'-некодирующей области провируса перед началом
gag [10]. Однако проблема заключаете^ в том, что
делетирование этих цые-активных последователь-
ностей полностью не исключает упаковки собствен-
ных последовательностей ретровируса, а приводит
лишь к снижению доли РНК вируса-помотника,
включенной в состав вириона [11—13]. Поэтому
помимо РНК репликативно-д ефектного векторного
вируса в продуцируемом на упаковочных клетках
вирусном пуле, как правило, детектируются РНК
дефектного по упаковочным последовательностям
вируса-помощника в малом количестве копий и
клеточная РНК [11, 14—17]. При совместной упа-
ковке РНК вируса-помощника и векторного вируса
в вирион на упаковочных клетках и последующей
обратной транскрипции возможна рекомбинация
между гомологичными последовательностями их
геномов. В этом случае у вируса-помощник;;. вос-
станавливается ір упаковочная область и возобнов-
ляется способность к репликации. По мере пасси-
рования такого смешанного пула на упаковочных
67
КАЙ ДА И В. И ДР
клетках происходит распространение вируса-по-
мощника. Наличие регогакативно-компетентного
чируса-помощника в пуле репликашвно-дефектно-
го вектора опасно тем, что может провоцировать
возникновение опухолей у трансгенных животных
[18].
Вероятность гомологичной рекомбинации ме-
жду последовательностями вируса-помощника и
векторного вируса можно снизить, уменьшая про-
тяженность участков гомологии между последова-
тельностями вектора и вируса-помощника путем
замены 3'LTR вируса-помощника polyA SV40 [4,
7] либо включая последовательности различных
вирусов в состав вируса-помощника [7 ]. Скорость
возобновления репликативио-компетентного вируса
пытались снизить за счет экспрессии вирусных
генов вируса-помощника в составе двух плазмид
|3, 4, 6, 7, 15]. Наличие разных транскриптов
gag-pol- и CTV--I енов копирует естественный процесс
сплайсинга первичного транскрипта ретровирусно-
ίο провируса в клетке и, по мнению авторов,
уменьшает вероятность взаимодействия гомологич-
ных последовательностей вектора и «расчлененно-
го» генома вируса-помощника. Такое глубокое мо-
дифицирование генома вируса-помощника приво-
дило к снижению уровня транскрипции вирусной
РНК и экспрессии вирусных генов по сравнению с
диким вирусом 14 |; титр продуцируемого упако-
вочными клетками репликативно-д ефектного век-
гора был на несколько порядков ниже титра дикого
вируса [3, 4, 7, 15]. Существенный вклад в сниже-
ние уровня транскрипции модифицированного ви-
руса-помощника может вносить делетирование
3'LTR, вовлеченного в регуляцию энхансерной ак-
тивности 5'LTR [19], а также цис-активных после-
довательностей из З'-некодирующей области, уча-
ствующих в специфическом взаимодействии с кле-
точными факторами [20].
Представляемые нами упаковочные клетки на
основе перепелиных клеток QT6 содержат интегри-
рованный вирус-помощник ρ td daPr-RSV-Ce-PS~
Neo, созданный на основе трансформационно-де-
фекгного мутанта адаптированного к уткам вари-
анта пражского штамма вируса саркомы Рауса (td
(IaPr-RSV-C) [2]. Новые упаковочные клетки дол-
жны продуцировать репликативно-дефектный ре-
тровирусный вектор С-подгрупповой специфично-
сти в количестве, сопоставимом с титром исходного
адаптированного к уткам варианта Pr-RSV-C, в
отсутствие продукции вируса-помощника. При со-
здании конструкции вируса-помощника ρ td daPr-
RSV-Ce PS-Neo мы ограничились минимально не-
обходимыми изменениями в геноме адаптированно-
го генома ретровируса , предотвращающими
включение последовательностей вируса-помощника
в состав псевдотипированного вириона на упако-
вочных клетках. Делетировали цис-активные по-
следовательности гр упаковочной области 5'-неко-
дирующего района td daPr-RSV-C и короткие по-
вторы (E) , ф л а н к и р у ю щ и е src [2] .
Репликативно-дефектный вектор pJD214Hy несет
ген гигромицинфосфотрансферазы под контролем
промотора из 5'LTR вируса некроза селезенки
(SNV) и не имеет участков гомологии с вирусом-
помощником ρ td daPr-RSV-Ce~PS-Neo. Это снижа-
ет риск рекомбинаций между последовательностя-
ми репликативно-дефектного вектора и вируса-по-
мощника на упаковочных клетках. Публикуемые
данные свидетельствуют о том, что упаковочные
клетки F l 8 / p J D , содержащие интегрированный ви-
рус-помощник ρ td daPr-RSV-Ce -PSNeo, экспрес
сируют вирусные белки на уровне, характерном
для исходного daPr-RSV-C, продуцируют реплика-
тивно-дефектный вектор pJD214Hy с титром
IO6 КОЕ/мл, что аналогично продуктивности daPr-
RSV-C. Наличие вируса-помощника в продуцируе-
мом упаковочными клетками векторном пуле не
детектируется методом дот-блот-гибридизации.
Материалы и методы. Плазмиды: ρ td daPr-
RSV-Ce -PS -Neo содержит клонированный в составе
pUC19 геном вируса-помощника [2, 21 ] (рис. 1, 6;)
pJD214Hy несет последовательности реплика-
тивно-дефектного вектора на основе SNV, клониро-
ванные в составе pBR322 (рис. 1, в).
Ферменты. В работе использованы эндонукле
азы рестрикции («Boehringer Mannheim», ФРГ), Т4
ДНК-лигаза («Promega», США), фрагмент Кленова
ДНК-полимеразы I Escherichia coli («Boehringer
Mannheim»).
Клетки и среды. QT6 (клетки фибросаркоми
перепелки, свободные от эндогенных ретровирус-
ных последовательностей) [23 ] любезно предостав-
лены д-ром Г. Калоти (Институт Кюри, Франция
и д-ром Я. Гериком (Институт молекулярной гене
тики Чешской Академии Наук, Чехия). (^Тб-клет-
ки культивировали на среде DMEM/F10 (1:1) с
добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыво
ротки («Биопол», Россия) и 1 % куриной сыворот-
ки (Институт молекулярной генетики ЧАН). Гиб
ридомные клетки линии HY.21.6 (Е. Humfries),
продуцирующие anti-p27gag антитела, получены от
д-ра Я. Герика (Институт молекулярной генетики
ЧАН), культивировали на среде DMEM/F10 (1:1) с
добавлением 10 % телячьей сыворотки («Sigma»,
США).
Трансфекция. Плазмидную ДНК вируса-по-
мощника вводили в (^Тб-клетки методом электро-
порации [22]. Плазмидную ДНК pJD214Hy век-
68
НОВЫЕ УПАКОВОЧНЫЕ КЛЕТКИ HA ВАЗЕ ВИРУСА CAP SOMW РАУСА
Рис. 1. Схематическое изображение базовых ретровирусных
конструкций: а — провирус трансформационно-дефектного му-
танта адаптированного к уткам варианта пражского штамма
RSV (td daPr-RSV-C); б — вирус-помошник ρ td daPr-RSV-Ce"
PS -Neo; в — репликативно-дефектный вектор pJD2I4Hy. Коди-
рующие последовательности вирусных генов, а также концевых
повторов (LTR) и промотора вируса SV40 обозначены прямо-
угольниками. Стрелками показаны сайты узнавания эндонукле-
аз рестрикции, использованных при создании ретровирусных
конструкций
торного вируса вводили в упаковочные клетки с
помощью липофектинового реагента DOT АР: 2 ..г кг
плазмидной ДНК трансформировали 600—700 тыс.
упаковочных клеток (монослой 50—60 %) на чаш-
ке диаметром 60 мм («Costar», США). Затем клет-
ки селектировали на среде с добавлением гигроми-
цина В ( « B o e h r i n g e r M a n n h e i m » , Ф Р Г )
(50 мкг/мл). Индивидуальные клоны отбирали и
культивировали в течение 2—3 месяцев для опре-
деления титра продуцируемого репликативно-де-
фектного вектора.
Определение вирусных белков методом ELISА.
Продукцию вирусных белков детектировали мето-
дом твердофазного иммуноферментного анализа с
anti-p27gag антителами [24]. p27gag кодируется
геном gag и является капсидным белком вириона.
Anti-p27gag получали из гибридомы HY.21.6 [2].
Продукцию p27gag определяли в супернатан-
тах и клеточных лизатах упаковочных клеток ме-
тодом прямого ИФА [24 ] с anti-p27gag в количест-
ве 0,8 мкг на лунку. Биотинилированные антитела
кролика против IgG мыши («ДиаГен», Россия) и
авндин-пероксидазу («Sigma», США) в разведении
1:500 и 1:1500 соответственно применяли для опре-
деления p27gag в лизатах упаковочных клеток.
Супернатанты упаковочных клонов тестировали
меченными пероксидазой конъюгированными анти-
телами кроль—антимышь в разведении 1:800 [2].
Обратную транскриптазу определяли в тече-
ние 1 ч при температуре 42 °С в 25 мкл образца,
содержащего I мкмоль водного раствора [3H [ТТР
(5-10" имп-мин"1-мл -1) («Amersham», Англия);
5 мкг poly (г A) -pdTI2__18 («Promega», США); IO мМ
трис-HCl, рН 7,4; 10 мМ DTT (дитиогреитол);
5 мМ MgCl2; 0,05 %-й Triton X-100 («Merck»,
ФРГ); 15 мкл супернатанта упаковочного клона.
[ H ]ТТР, включенный в состав oligo(dT), отделяли
от несвязавшегося [ 3 Н]ТТР нанесением на бумагу
DE 81 («Whatman», США) и последующей сгмыв-
кой 5 %-м раствором гидрофосфата натрия [25].
Определение титра рекомбинантного ретро-
вирусного вектора. Титр репликативно-дефектного
векторного вируса pJD214Hy, несущего ген устой-
чивости к гигромицину В (HmB), определяли, ин-
фицируя <ЗТ6-клетки серийными разв едениями ви-
русных стоков, продуцируемыми упаковочными
клетками (200 мкл разведенного стока на чашку
Петри диаметром 6 мм), по методике, описанной в
работе 126]. Селекцию зараженных клеток вели на
среде с HmB (50 мкг/мл).
Стоки репликативно-дефектного векторного
вируса pJD214Hy собирали каждые двое суток
после добавления свежей среды, центрифугировали
(1500 об/мин) в течение 5 мин для удаления
дебриса, хранили при -70 °С.
Выделение вирусной РНК и дот-блот-гибриди-
зация. Вирусную РНК репликативно-дефектного
вектора pJD214Hy выделяли из 70 мл вирусного
стока. Вирионы осаждали ультраценгрифугирова-
нием (35 000 об/мин, «Beckman» SW 40) при
температуре 4 °С в течение 2 ч. Осадок растворяли
в 200 мкл воды и выделяли РНК по методике [27 ].
Пробы вирусной векторной РНК и РНК Pr-RSV-C
количестве 150, 80, 40 и 20 нг наносили на
нейлоновую мембрану и гибридизовали с соответ-
ствующим зондом. Дот-блот-гибридизацию с плаз-
мидными зондами осуществляли, как описано [3 ],
и с п о л ь з у я н е й л о н о в ы е ф и л ь т р ы Hybond
(«Amersham») для переноса РНК и [32P] random
priming kit для синтеза зондов с последовательно-
стями плазмиды ρ td daPr-RS V-Ce- и SacI- фраг-
ментом (hygro) pJD214Hy (110° имп'мшТ1 -мл-1).
Для определения гомологии между последова-
тельностями вируса-помощника td Pr-RSV-Ce-PS-
Neo и репликативно-дефектного вектора pJD2l4Hy
пользовались нуклеотидными последовательностя-
ми из Gene Bank и программой Genepro «Riverside
Scientific» (СІЛА).
Результаты и обсуждение. Трансформа и,ион-
69
КАЙДА. И Il И ДР.
но-дефектный мутант адаптированного варианта
Pr-RSV-C (td da Pr-RSV-C) [28 ] использован как
основа для создания вируса-помощника (рис. 1 , а ) .
Модифицирование исходною лровируса td daPr-
RSV-C при создании конструкции вируса-помощ-
ника td daPr-RSV-Ce~PS~Neo направлено на сни-
жение вероятности включения собственной геном-
ной РНК в состав ретровирусной частицы на
упаковочных клетках. Делетирование сигналов
упаковки ψ проводили, и с о ю ч а я BstII-PstI-фраг-
мент 5'-иекодирующей области вируса-помощника
[2]. Е-елемент [29] делегировали, исключая MstII-
Яаь'-фрагмент из исходного провируса td daPr-
RSV-C (рис. 1, а), как описано ранее [2]. Nhe-
£соД/-фрагмент рВR322SV40Neo с последователь-
ностями н е о м и ц и н ф о с ф о т р а н с ф е р а з ы под
н Pii уюте ром вируса SV40 включили в состав виру-
са-помощника по SacI [2 ]. Это позволяет вести
селекцию упаковочных клонов в культуре клеток
(рис. 1, в).
Экспрессию структурных генов ретровирусов
gag, рої, env получили введением в культуру пере-
пелиных клеток QT6 клонированного в составе
бактериальной плазмиды pUCI9 провируса вируса-
помощника ρ ltd daPr-RSV-Ce_PS~Neo, как описано
ранее [2 ]. Интегрированный в геном QT6-клеток
дефектный по упаковочным последовательностям
провирус вируса-помощника должен продуциро-
вать вирусные белки Gag, Pol, Env в отсутствие
продукции полноценных вирусных частиц. 18 ин-
дивидуальных клонов упаковочных клеток тес-
тировали на p27gag методом твердофазного имму-
ноферментного анализа — ELISA (табл. 1). p27gag
обнаружили и в клеточном лизате, л в супернатан-
те упаковочных клонов. Данные табл. 1 свидетель-
ствуют о том, что клоны упаковочных клеток F5,
F9, Fl 6, F18 способны продуцировать p27gag на
уровне, сопоставимом с таковым у клеток, содер-
жащих последовательности полного провируса
daPr-RSV-C (QT6-daPR-RSV-C, табл. 1), и необхо-
димом для упаковки репликативно-дефектного ре-
грозирусного вектора.
Чтобы определить продуктивность упаковоч
ных клеток, 10 упаковочных клонов трансформи-
ровали гілазмидой pJD214Hy с последовательностя-
ми репликативно-дефектного вектора. Индивиду-
альные клоны клеток F n I p J D культивировали в
течение двух месяцев для определения ретровирус-
ного вектора. О наличии ретровируса судили по
присутствию обратной транскриптазы в суперна-
•гантах упаковочных клеток. Из 75 культивирован -
ных индивидуальных клонов только в пяти клонах
F18 IpJD выявлена стабильная ретровирусная про -
дукция (табл. 2).
Титр продуцируемого ретровирусного вектор-
ного вируса определяли заражением 0>Т6-клеток.
Для индивидуальных клонов Fl 8 I p J D показана
сходная ретровирусная продукция и почти одина-
ковый титр (табл. 2). Однако, судя по показателям
полимеразной активности при определении обрат-
ной транскриптазы, клоны № № 1, 2 F18 IpJD
показывают более стабильную продукцию ретрови-
русного вектора на уровне, характерном для исход-
ного daPr-RSV-C. Зависимость между включением
[ jH ]ТТР в полимеразной реакции при определении
обратной транскриптазы и количеством вирионов
ретровируса, находящихся в тестируемом образце,
т а к о в а , что р а д и о а к т и в н о с т ь 1500—
16000 имп/мин. соответствует наличию 10—10''
вирионов ретровируса в 1 мл тестируемого клеточ-
ного супернатанта [25]. Поэтому клоны № № 3, 4,
имеющие более низкий в сравнении с клонами
№ № 1, 2 уровень радиоактивности при определе-
нии обратной транскриптазы, не показали значи-
тельной разницы в титре вируса, определенного
вследствие заражения QT6 (табл. 2).
Продуктивность новых упаковочных клеток
F l 8 I p J D по сравнению с аналогичными (на основе
QT6) упаковочными клетками QenvA, содержащи-
ми вирус-помощник на базе BH-RSV штамма RSV
[3], выше в 10—100 раз и сопоставима с наиболее
высокопродуктивными птичьими упаковочными
клетками «Isolde» [4, 5], созданными на основе
вируса птичьего лейкоза (ALV). Титр продуцируе-
мого F18 IpJD псевдотипированного pJD214Hy ана-
логичен титру daPr-RSV-C. Это свидетельствует о
удачном сочетании типа клеток, последовательно-
стей вируса-помощника и вектора, обеспечиваю-
щем высокую продуктивность системы.
В процессе культивирования упаковочных кле-
ток, продуцирующих рекомбинантный репликатив-
но-дефектный вектор, уже в течение первых двух-
трех недель часто детектируется репликативно-
компетентный вирус [15—17]. Он появляется в
пуле продуцируемого векторного вируса в резуль-
тате рекомбинаций с вирусом-помощкиком либо г
эндогенными ретровирусными последовательностя-
ми Ц6, 17].
Чтобы предупредить рекомбинации, мы ис-
пользовали в своей работе (^Тб-клетки, свободные
от эндогенных ретровирусных последовательно
стей, а также репликативно-дефектный вектор, п,
имеющий участков гомологии с вирусом-помощни-
ком. Для детекции вируса-помощника в продуци-
руемом пуле ретровирусного вектора мы посчитали
необходимым длительное (более трех месяцев)
культивирование вектор-продуцирующих клеток
для распространения чужеродного вируса.
70
НОВЫЕ УПАКОВОЧНЫЕ КЛЕТКИ HA ВАЗЕ ВИРУСА CAP SOMW РАУСА
Таблица 1
Продукция p27gag индивидуальными клонами упаковочных клеток
р27т
в клеточном лизате (OD405)* в клеточном сугіернатанте (OD405)*
F5 2,497 2,230
F9 2,507 —
F16 2,100 1,350
F18 3,050 1 ,520
F19 1 900 2,400
F20 1,508 2,250
F 25 1,703 2,200
F26 1,823 2,300
F28 1,670 2,250
F34 1,413 1.600
QT6 1,480 1,100
QT6-daPr-RSV*** 2,341 2,601
JICA** 0,172 0 ,132
П р и м е ч а н и е . *Определяли методом ELISA; **JICA — лошадиный сывороточный альбумин, использованный как
отрицательный контроль; ***QT6-daPr-RSV — QT6, трансформированные исходным daPr-RSV.
Таблица 2
Продукция ретровирусного вектора pJD214Hy индивидуальными клонами упаковочных клеток
Полимеразная активность супернатантов упаковочных клонов. радиоактивность, имп/мин
Титр векторного
вируса на QT6,
КОЕ/мл
Клон Номер пассажи
Титр векторного
вируса на QT6,
КОЕ/мл
2-й 3-й 4-й 5-й 6-й 7-й 8-й 9-й [0-й
Fl 8 IpJD
1 920 420 1276 4000 2108 12970 10408 3088 3188 5,4· ю"
2 — — 2514 8392 2502 18886 27556 9090 2322 4,8 • 106
3 1122 184 623 1696 968 986 — 856 370 4,9- J Ob
4 — — 1055 4132 1005 910 — 996 445 4,4pl Ob
5 — — 1908 5004 1678 4610 — 10440 695 5,1-IO6
F SlpJD 164 — — — — — — — — —
V9lpJD 170 — · - — — — — — —
Fl 6 IpJD 166 — — — — — — — — —
Fl 9 /рЛ> 138 — — — — — — —
. . . . —
VliiIpJD 114 — — — — — — — — —
F2 5/pJD 110 — — — — — — —
F26 IpJD 126 — — — — — — — — —
F28 IpJD 225 — — — — — — — — —
F34./ pJD 238 — — — — — — — — —
QT6 18- — — — - - — — — — —
daPr-RSV-C — — 16090 — — — — — — I 1 MO l i ,
БОЕ/мл*
П р и м е ч а н и е . Полимеразная активность супернатантов упаковочных клонов выявлена по включению [ 3 H] TTP в реакции
обратной транскрипции. Титр ретровирусного вектора pJD214Hy определяли, заражая клетки QT6 серийными разведениями
супернатантов клонов упаковочных клеток Fl 8 I p J D . *БОЕ — бляшкообразующие единицы
71
Клон
КАЙ ДА И В И ДР.
Последовательности вируса-помощника в пуле
продуцируемого F 18/р/D-клетками векторного ви-
руса pJD214Hy определяли дот-блот-гибридиза-
цией. РНК репликативно-дефектного вектора
pJD214Hy, продуцируемою клонами № № 1—5
упаковочных клеток F l 8 I p J D , тестировали на на-
личие последовательности вируса-помощника гиб-
ридизацией с плазмидным зондом ρ Id daPr-RSV-
Ce" (рис. 2, Б). Зонд, содержащий 5ас/-фрагмент
pJD214Hy— последовательности гигромицинфот-
рансферазы (hygro), использовали для определения
последовательностей репликативно-дефектного
вектора pJD214Hy в вирусной РНК (рис. 2, А). В
образцах вирусной РНК из стоков, продуцируемых
упаковочными клонами NeNe 1—5 F18 IpJD, заре-
гистрирован положительный сигнал в гибридиза-
ции с зондом hygro и не обнаружен сигнал в
гибридизации с зондом, несущим последовательно-
сти вируса-помощника. Это свидетельствует о том,
что пул продуцируемого клонами № № 1—5 упако
вочных клеток F l 8 I p J D репликативно-дефектного
вектора pJD214Hy не содержит последовательно-
стей вируса-помощника. Условия реакции позволя-
ют получить четкий положительный сигнал при
связывании 10 нг РНК Pr-RSV-C с последователь-
ностями вируса-помощника (рис. 2, Б). Отсутствие
положительного сигнала в гибридизации 150 нг
РНК вирусного вектора дает основание предполо-
жить, что возможное недетектируемое дот-блот-
гибридизацией содержание в этих стоках РНК
вируса-помощника составляет менее 10 нг. Это
соответствует менее 6 % исходного пула ретрови-
русного вектора pJD214Hy. Аналогичные данные в
гибридизации РНК ретровирусного вектора с по-
следовательностями вируса-помощника, продуци-
руемого упаковочными клетками гр2 на базе мыши-
ного вируса лейкоза Молони (M-MuLV), получены
в работе [30]. Показательно, что при создании
конструкции вируса-помощника авторы использо-
вали ту же стратегию минимального модифициро-
вания генома M-MuLV и делегирования гр упако-
вочной области.
Использованный нами подход, заключающийся
в минимальном модифицировании генома адапти-
рованного варианта ретровируса при создании кон-
струкции вируса-помощника, оказался плодотвор-
ным. Упаковочные клетки F l 8 I p J D продуцируют
репликативно-дефектный ретровирусный вектор с
высоким титром, не загрязненный последователь-
ностями вируса дикого тина. Новые упаковочные
клетки показали продукцию вирусных белков на
уровне QT6, инфицированных daPr-RSV-C. Высо-
кий уровень экспрессии вирусных генов упаковоч-
ными клетками свидетельствует о том, что делети-
рование цггс-активных последовательностей гр упа-
ковочной области и коротких повторов E генома td
daPr-RSV-C не оказало существенного влияния на
транскрипцию вируса-помощника. Продуктивность
упаковочных клеток F18 IpJD, несущих вирус-по-
мощник на базе RSV, в 10—100 раз выше по
сравнению с СЗ, DSN и DAN [7 ], имеющими
SNV-последовательности в качестве вируса-помощ-
ника, и одинакова с продуктивностью исходного
daPr-RSV-C на QT6. Такие показатели описаны
для наиболее широко используемых упаковочных
клеток на основе M-MuLV [30] и вируса птичьего
лейкоза (ALV) «Isolde» [5]. Упаковочная линия
«Haydee» [6] продуцирует ретровирусный вектор
С - п о д г р у п п о в о й с п е ц и ф и ч н о с т и с титром
IO3 КОЕ/мл, что в 1000 раз уступает продуктивно
сти нашей упаковочной линии F lSIp jD.
Детальное изучение процесса сборки ретрови-
русной частицы показало, что геномная РНК виру
са, имеющая определенную вторичную структуру в
упаковочной области, включается в состав вириона
в процессе взаимодействия с белком Gag 131 ].
Участие различных продуктов гена gag RSV в
«узнавании» геномной РНК ретровируса было
предметом пристального внимания исследователей.
Подробный анализ роли отдельных участков белка
Gag в процессе сборки вириона показал, что деле-
тирование различных функциональных участков
gag не приводит к значительному снижению уровня
упаковки собственной РНК ретровируса [13, 14]. А
наличие единичных незначащих точечных замен в
gag ретровируса в сочетании с полной утратой гр
упаковочной области генома сопряжено с увеличе-
нием включения чужеродных последовательностей
в состав ретровирусной частицы [11, 14]. Так, у
варианта SE21Qlb RSV единичные незначащие
точечные замены в gag, накопленные з процессе
пассирования на перепелиных эмбриональных фиб-
робластах, сочетаются с полным отсутствием по-
следовательностей упаковочной области гр. Показа-
но, что чужеродная (клеточная) РНК включалась
в состав ретровирусных частиц, продуцируемых
этими природными упаковочными клетками, в го-
раздо большем количестве, чем собственная. РНК
SE21Qlb детектировалась лишь в 1 % продуциру-
емого этими природными упаковочными клетками
вируса [11]. Накопление незначащих точечных
замен в gag адаптированного daPr-RSV-C происхо -
дило при пассировании его на утиных эмбриональ-
ных фибробластах [21 ]. При создании конструкции
вируса-помощника ρ td daPr-RSV-Ce PS Neo мы
полностью делегировали цис-активные последова-
тельности гр упаковочной области и обращенные
повторы Е. Этого оказалось достаточно для предэт-
72
НОВЫЕ УПАКОВОЧНЫЕ КЛЕТКИ HA ВАЗЕ ВИРУСА CAP SOMW РАУСА
Рис. 2. Дот-блот-гибридизация вирусной
РНК вектора pJD2I4Hy. РНК реплика-
тивно-дефектного вектора, который про-
дуцируется индивидуальными кпонами
№№ 1—5 упаковочных клеток F I S / p / D
(6—с). В и р у с н у ю РНК пражского
штамма вируса саркомы Рауса (Pr-RSV-
С) использовали как позитивный конт-
роль (а) , клеточную РНК змбриональ-
ного мозга человека (ж) использовали в
качестве негативного контроля. Бяот ги-
бридизовали с плазмицными зондами:
А — hygro- 5ас/-фрагмент pJD214Hy с
последовательностями тагромицинфос-
фотрансферазы; R — ρ id daPr-RSV-Ce~
— с последовательностями вируса-по-
мощника
вращения включения РНК вируса-помощника в
состав ретровирусной частицьт на упаковочных
клетках F18 / pJD: дот-блот-гибридизация не выя-
вила присутствия RSV-последовательностей в ви-
русных стоках репликативно-дефектного вектора
pJD214Hy (рис. 2, Б). Упаковочные клетки на
основе JaPr-RSV-C — адаптированного варианта
RSV наряду с SE21 Qlb являют собой еще один
пример того, что утрата упаковочной области гр и
накопление незначащих точечных замен в гене gag
ретровируса, происходящее в процессе пассирова-
ния на клетках неспецифического хозяина, играют
существенную роль в способности ретровируса
включать чужеродную РНК в состав ретровирусной
частицы.
т о т факт, что адаптированные варианты ре-
тровирусов, дефектные по упаковочным последова-
тельностям, включают собственную геномную РНК
в состав вириона в ничтожно малом, недетектиру-
емом количестве, открывает новые возможности
для решения проблемы возобновления репликатив-
но компетентного вируса-помощника в ретровирус-
ных репликативно-дефектных системах. Примене-
ние адаптированного варианта ретровируса в каче-
стве основы для создания вируса-помощника в
новых упаковочных клетках позволило ограни-
читься минимальными изменениями генома вируса
дикого типа при создании конструкции вируса-по-
мощника. Это обеспечило высокую продуктивность
системы и дало возможность избежать возобновле-
ния репликативно-компетентного вируса-помощни-
ка.
Новые упаковочные клетки на базе адаптиро-
ванного варианта Pr-RSV-C (Fl 8IpJD) в состоянии
продуцировать ретровирусный векторный вирус
pJD214Hy С-подгрупповой специфичности с тит-
ром IOh КОЕ/мл. В процессе длительного пассиро-
вания этих упаковочных клеток не было выявлено
последовательностей вируса-помощника в пуле
продуцируемого векторного вируса. Репликативно-
дефектный ретровирусный вектор pJD214Hy, «оде-
тый» на упаковочных клетках F l 8 I p J D в Env
С-подгрупповой специфичности может быть ис-
пользован для переноса генов как в культуре кле-
ток, так и in vivo.
Авторы выражают глубокую благодарность
A. Евсикову за помощь в оформлении иллюстра-
тивного материала, статьи.
/ . В. Каііда, С. М. Серов, А. А. Михайлик, П. М. Полтавець,
B. I. Кашуба, А. В. Риндич
TiOBi пакувальні клітини на основі адаптованого варіанта вірусу
саркоми Payca
Резюме
Створено нові пакувальні клітини FISIpJО, які містять
вірус-помічник на основі, трансформаційно-дефектного мутан-
та адаптованого до качок варіанту празького штама вірусу
саркоми Payca (td. daPr-RSV-C), що продукують реплікативно-
дефектний ретровіруааіи вектор з титром IO КУО/мл.
Дилетування цис-активних послідовностей ψ пакувальної об
73
НАЙДА И. В И ДР.
ласті та обернених повторів (Ε), фланкуючих src, адаптова-
ного варіанту ретровірусу при створенні конструкції вірусу-
іюмічника дозволило отримати пул векторного вірусу без
послідовностей вірусу-помічшіка.
I. V. Kaida, S. М. Serov, A. A. Michailik, P. М. Boltovets,
У. 1. Kashuba, Α. V. Rynditch
New packaging cells based on Ihe adapted variant of the Rous
sarcoma virus
Summary
We have constructed a new transformation-defective mutant of
duck-adapted variant of Rouse sarcoma virus Prague straine sub-
group C (td daPr-RSV-C) — based packaging cell line. F18IpJD
which produces replication-defective vector with a titer 10 CFU/mi-
Deletion of cis-acting sequences of-ψ packaging region and E (direct
repeat flanking srcJ in the adapted variant of retrovirus allowed us
to obtaine a pool of retrovirus vector without helper virus sequences.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Кайда И. В., Рындич А. В. Применение ретровирусных
векторов для целенаправленного переноса генов у птиц / /
Биополимеры и клетка.—1997.—13, № 1.—С. 5—13.
2. Кайда И. В., Цыба Л. Б., Болтовец 17 H., Кашуба В. И.
Создание системы для ретровирусного переноса генов по-
средством векторного вируса на основе Pr-RSV-C с рас-
ширенной хозяйской специфичностью / / Там же .—№ 5.—
С. 408—416.
3. Boerkoel С. F., Federspiel M., Salter LX W. et al. A new
retroviral system based on the Bryan Strain of Rous Sarcoma
Virus / / J. Virol.—1993.—195.—P. 669—679.
4. Savatier P., Bagnis C., Thoraval P. et aL Generation of a
helper cell line for packaging avian leucosis virus-based vectors
/ / Ibid.—1989.—63.—P. 513—522.
5. Cosset F-L., Legras C., Savaiier P. et al. /V new avian leucosis
virus-based packaging cell line that uses two separate trans-
compleoientin helper genomes / / Ibid. — 1 9 9 0 . — 6 4 . —
P. 1070—1078.
6. Cosset F.-L, Ronfort C., Molina R.M. et al. Packaging cells
for avian leucosis virus-based vectors with various host ranges
/ / Ibid.—1991.—66.—P. 5671—5676.
7. Dougherty J., Wisniewski R., Yang S. et al New retrovirus
helper cell line with almost no nucleotide sequence homology
to retrovirus vectors / / Ibid.—1989.—63.—P. 3209—3212.
8. Katz R., Terry R., Skalka Α. Λ conserved as-acting sequence
in the 5' leader of Avian Sarcoma Virus RNA is required for
packaging / / Ibid.—1986.—59.—P. 163—167.
9. Sorge J., Ricci W., Hugnes S. Cis-actin RNA packaging locus
in the 115-nucleotide direct repeal of RSV virus / / Ibid.—
1983.—48.—P. 667—675.
10. Donzs O , Spahr P.-F. Role of Ihe open reading frames of RSV
leader RNA in translation and. genome packaging / / EMBU
J.—1992.—11 —P. 3747—3757.
11. Anderson D. J., Lee P., Levine K. L. et al. Molecular cloning
and characterization of the RNA packaging defective retrovirus
SE2101Qlb I I I . Virol.—1992.—66.—P." 204—216.
12. Aronoff R., JJnial M. Specificity of retroviral RNA packaging
/ / Ibid.—1991.—65.—P. 71—80.
13. Aronoff R., Hajjar A. M., IJnial M. Avian retroviral RNA
encapsidation: reexamination of functional 5' RNA sequences
and the role of nucleocapsid Cys-His motifs / / Ibid. —1993.—
67.—P. 178—188.
14. Sakalian M., Wills J. W., Vogt V. Efficiency and selectivity of
RNA packaging by RSV gag deletion mutant / / Ibid. —1994.—
68.—P. 5969—5981.
15. Hu S., Bruszewski J., Nicolson M. et al. Generation of
competent virus in the REV helper cell line C3 / / Virology.—
1987.—159.—P. 446-449.
16. Girod A , Drynda A., Cosset F.-L· et al. Homologous and
nonhomologous retroviral recombinations are both involved in
the transfer by infectious particles of defective ALV-derived
transcomplementing genomes / / J. Virol.—1996.—70, N 8.—
P. 5651—5657.
17. Ronfort C., Girod F., Cosset F. et al. Defective retroviral
endogenous RNA is efficiently transmitted by infectious par-
ticles produced on an avian retroviral packaging cell line / /
Virology. — 1995. —207.—P. 271 —275.
18. Donahue R., KeSsler S., Bodine D. et al. Helper virus induccd
T cell lymphoma in nonhuman primates after retroviral media-
ted gene transfer / / J. Exp. Med.—1992,—176.—P. 1125
19. Norton P. A., Coffin J. M. Characterization of RSV sequences
essential for viral gene expression / / J. Virol. —198/ .—61.—
P. 1171 — 1179.
20. Molina R.-M., Chebloune Y., Verdier G. et aL Influence of
expression and cts-acting sequences from ALVs on stability of
(ALV)-based retrovirus vectors / / Life Sci. —1995.—3)8.
P. 541—551.
21. Кашуба В. И., Кавсан В. M., Рындич А. В. и др Полна·!
нуклеотидная последовательность адаптированного к клеї
кам уток варианта вируса Рауса / / Молекуляр. био-
логия.—1993.—27.—С. 436—450.
22. Погребной П., Серов С., Кленчин В. и др. Экспрессия геї.а
трансформирующего фактора роста типа L, перенесенного
ретровирусным вектором в клетки Λ431 / / Там же.—
С. 833—838.
23. Moscovici С., Moscovici H., Jimenez Μ. et aL Continuous
tissue culture cell lines derivated from chcmically induced
tumors of Japanese guail / / Cell.—1977 —11 —P. 95—103.
24. Clark D., Dougherty R. Detection of avian oncovirus group
specific antigenes by the enzyme-linked immunosorbent assay
/ / J. Gen. Virol.—1980.—47.—P. 283—291.
25. Tereba A., Murti K. A very sensitive biochemical assay for
detecting and quantitating avian oncornaviruses / / Virology.—
1977.—P. 166—176.
26. Svoboda J., Hlozanek I., Machala O. et al. Rescue of Rous
sarcoma virus in mixed cultures of virogenic mammalian and
chicken cells, treated and untreated with Sendai virus and
detected by focus assay / / J. Gen. Virol.—1968 —2,—P 461.
27. Hajkova V., Kristek J., Geryk J. et al. Characterization of
mutant of the Pr-RSV-C inducing fusiform transformation of
avian fibroblasts in vitro Il Fo!. biol. (Praha).—1982,—28.—
P. 160—176.
28. Кашуба В. И., Зубак С. В., Рындич А. В. и др. Структура
нового трансформационно-дефектного мутанта вируса сар-
комы Рауса / / Докл. Акад. Наук СССР —1989 —304 —
С. 206—208.
29. Kashuba К, Zubak S., Rynditch A. et al. The nucleotide
sequence of the region of src gene deletion in transformation-
defective RSV adapted to semi-permissive host cells / / Nucl.
Acids Res.—1989,—17.— P. 3294.
30. Mann R., Mulligan R., Baltimor D. Construction of retrovirus
packaging mutant and its use to produce helper-free defective
retrovirus Il Cell .—1983.—33.—P. 153—159.
31. Knigt J., Zhi Hai Si, Stoltzfus M. A base-paired structure in
the avian sarcoma virus 5' leader is required for efficient
encapsidation of RNA / / J. Virol. —1994.—68, N 7 —
P. 4393—4402.
УДК 517.15:516.858
Поступила в редакцию 28.01.98
74
|