Cis-элементы и trans-факторы в регуляции транскрипции у растений
Обзор современных литературных данных о механизмах регуляции транскрипции генов в растениях. Рассматривается структура наиболее исследованных промоторов, функционирующих в растениях: 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты, промотора малой субъединицы рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы / оксиген...
Збережено в:
| Дата: | 1993 |
|---|---|
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1993
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156241 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Cis-элементы и trans-факторы в регуляции транскрипции у растений / Н.Н. Доманский, А.П. Галкин // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 5. — С. 3-18. — Бібліогр.: 56 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-156241 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1562412019-06-19T01:31:13Z Cis-элементы и trans-факторы в регуляции транскрипции у растений Доманский, Н.Н. Галкин, А.П. Обзоры Обзор современных литературных данных о механизмах регуляции транскрипции генов в растениях. Рассматривается структура наиболее исследованных промоторов, функционирующих в растениях: 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты, промотора малой субъединицы рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы / оксигеназы, промоторов генов пататина. Обсуждаются новые сведения о структуре регуляторных белковых факторов и возможные механизмы их взаимодействий с промоторными регуляторними последовательностями. Огляд сучасних літературних даних про механізми регуляції транскрипції в рослинах. Аналізується структура найбільш вивчених промоторів, що функціонують у рослинах: 35S-промотора вірусу мозаїки цвітної капусти, промотора малої субодиниці рибулозо-1,5-діфосфаткарбоксилази / оксигенази, промоторів генів пататину. Обговорюються нові відомості про структуру регуляторних білкових факторів та можливі механізми їх взаємодії з промоторними послідовностями. This review decribes some of the recent progress in the understanding of transcriptional regulatory mechanisms in plants. The structure of best studied promoters directing transcription in plants such as 35S-promoter of cauliflower mosaic virus, promoter of the ribuloso-1,5-biphosphate carboxylase/oxygenase small subunit gene and patatin promoters is considered. The modern data about the structure of regulatory protein factors and possible mechanisms of their interaction with promoter sequences are discussed. 1993 Article Cis-элементы и trans-факторы в регуляции транскрипции у растений / Н.Н. Доманский, А.П. Галкин // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 5. — С. 3-18. — Бібліогр.: 56 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00036B http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156241 577.21 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Обзоры Обзоры |
| spellingShingle |
Обзоры Обзоры Доманский, Н.Н. Галкин, А.П. Cis-элементы и trans-факторы в регуляции транскрипции у растений Биополимеры и клетка |
| description |
Обзор современных литературных данных о механизмах регуляции транскрипции генов в растениях. Рассматривается структура наиболее исследованных промоторов, функционирующих в растениях: 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты, промотора малой субъединицы рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы / оксигеназы, промоторов генов пататина. Обсуждаются новые сведения о структуре регуляторных белковых факторов и возможные механизмы их взаимодействий с промоторными регуляторними последовательностями. |
| format |
Article |
| author |
Доманский, Н.Н. Галкин, А.П. |
| author_facet |
Доманский, Н.Н. Галкин, А.П. |
| author_sort |
Доманский, Н.Н. |
| title |
Cis-элементы и trans-факторы в регуляции транскрипции у растений |
| title_short |
Cis-элементы и trans-факторы в регуляции транскрипции у растений |
| title_full |
Cis-элементы и trans-факторы в регуляции транскрипции у растений |
| title_fullStr |
Cis-элементы и trans-факторы в регуляции транскрипции у растений |
| title_full_unstemmed |
Cis-элементы и trans-факторы в регуляции транскрипции у растений |
| title_sort |
cis-элементы и trans-факторы в регуляции транскрипции у растений |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1993 |
| topic_facet |
Обзоры |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156241 |
| citation_txt |
Cis-элементы и trans-факторы в регуляции транскрипции у растений / Н.Н. Доманский, А.П. Галкин // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 5. — С. 3-18. — Бібліогр.: 56 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT domanskijnn cisélementyitransfaktoryvregulâciitranskripciiurastenij AT galkinap cisélementyitransfaktoryvregulâciitranskripciiurastenij |
| first_indexed |
2025-07-14T08:42:10Z |
| last_indexed |
2025-07-14T08:42:10Z |
| _version_ |
1837611122469896192 |
| fulltext |
Обзоры
УДК 577.21
Η. Η. Доманский, A. П. Галкин
CIS-ЭЛЕМЕНТЫ И TRANS-ФАКЮРЫ
В РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ У РАСТЕНИИ
Обзор современных литературных данных о механизмах регуляции транскрипции ге-
нов в растениях. Рассматривается структура наисіолее исследованных промоторов, функ-
ционирующих в растениях: 358-промотора вируса мозаики цветной капусты, промотора
малой субъединицы рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы / оксигеназы, промоторов генов
пататина. Обсуждаются новые сведения о структуре регуляторных белковых факторов
и возможные механизмы их взаимодействий с промоторными регуляторними последо-
вательностями.
Современные исследования механизмов органоспецифической и регули-
руемой в процессе развития экспрессии генов в растительных клетках
свидетельствуют о том, что регуляция на уровне транскрипции являет-
ся важнейшим этапом в осуществлении контроля генной экспрессии.
Во многих случаях этот этап является первым, а то и единственным,
обусловливающим эффективность экспрессии определенного гена в
данный период развития организма [1, 2].
Известно, что способность РНК-полимеразы инициировать транс-
крипцию зависит главным образом от свойств промотора и прилегаю-
щих к нему регуляторных последовательностей [3].
Функциональный анализ промоторов проводят, исследуя эффектив-
ность экспрессии химерных маркерных генов, активность которых в
эукариотических клетках легко тестировать (обычно это бактериальные
гены хлорамфениколацетилтрансферазы, неомицинфосфотрансферазы и
др.), и сравнивая ее с транскрипционной активностью различных деле-
ционных вариантов изучаемого промотора. Используя этот подход, уда-
лось установить, что в большинстве случаев тканеспецифическая экс-
прессия генов в растениях контролируется отдельными участками по-
следовательности ДНК, называемыми содействующими или ^ - а к т и в -
ными элементами. Это означает, что данные участки Д Н К оказывают
влияние только на последовательности, расположенные на той же мо-
лекуле ДНК, на которой находятся они сами, и не могут влиять на го-
мологичные последовательности, расположенные в других местах.
Информация, необходимая для функциоінирования промотора и со-
действующих элементов, заложена в последовательности Д Н К и слу-
жит сигналом для инициации транскрипции или связывания различных
белковых факторов. Эти белковые факторы узнают и связываются с
последовательностями ДНК, расположенными рядом с промотором или
перекрывающимися с ним и, таким образом, влияют на эффективность
инициации транскрипции с данного промотора. А так как транскрипци-
онные белковые факторы оказывают влияние на гены независимо от
того, на какой молекуле Д Н К они расположены, их называют trans-
действующими или /ratts-активными факторами.
Промоторы структурных генов содержат практически все регуля-
торные элементы, необходимые и достаточные для осуществления пра-
вильной специфической экспрессии, причем каждый из них имеет уни-
кальную структуру этих элементов. Установлено, что cis-действующие
© Η. Н. Доманский, А. П. Галкин, 1993
ISSN 0233-7657 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb 5 2 — 3-705 3
элементы могут быть организованы в виде отдельных либо перекрыва-
ющихся модулей или блоков, ответственных за количественную и ка-
чественную (т. е. органоспецифическую или регулируемую в развитии)
экспрессию гена [4, 5].
Организация промоторов в виде отдельных регуляторных модулей
предполагает, что существует определенная комбинация взаимодейст-
вия /rans-действующих белковых факторов и ^^-действующих регуля-
торных элементов, которая и определяет уровень экспрессии данного
гена на той или иной стадии развития растительной клетки или ткани
[6]. При этом вопрос о том, каким образом клетка преобразует ин-
формацию, состоящую из линейно взаимодействующих с Д Н К транс-
крипционных факторов, остается пока невыясненным.
Практически все изложенные данные об организации и механиз-
мах регуляции транскрипции в эукариотических организмах были полу-
чены в экспериментах с клетками животных, а затем подтверждены и
на растительных клетках. Однако после того, как в качестве маркера
для определения эффективности функционирования промоторов в рас-
тительных клетках было предложено использовать бактериальный ген
β-глюкуронидазы (ГУЗ), появилась возможность при помощи метода
гистохимической локализации активности ГУЗ [7] анализировать экс-
прессию не только в различных растительных тканях, но и в отдель-
ных клетках этих тканей, что в экспериментах с животными клетками
пока невозможно. Естественно, что столь высокочувствительный метод
определения эффективности функционирования промоторов был немед-
ленно использован для исследования структуры и организации целого
ряда регуляторных последовательностей растительных генов.
В настоящем обзоре рассматриваются данные о структуре и меха-
низмах регуляции транскрипции некоторых наиболее изученных расти-
тельных генов, полученных, главным образом, с использованием мето-
да гистохимической локализации активности ГУЗ.
Организация as-действующих элементов в 35S-np0M0T0pe вируса
мозаики цветной капусты (ВМЦК). 35Б-промотор ВМЦК является од-
ним из наиболее изученных промоторов, контролирующих экспрессию
в растительных клетках. Установлено, что он функционирует как силь-
ный конститутивный промотор в большинстве органов трансгенных рас-
тений, причем направляемая им экспрессия не зависит от вирусных
/гаяя-действующих факторов [8, 9]. Последнее обстоятельство часто
используется в биотехнологии растений при конструировании экспрес-
сирующихся химерных генов.
С помощью метода делеционного анализа было выявлено, что в
последовательности ЗбБ-П'ромотора существует несколько блоков или
модулей, участвующих в регуляции эффективности экспрессии с дан-
ного промотора и, по-видимому, взаимодействующих с регуляторными
белками.
В частности, в каллусных клетках табака и листовой ткани деле-
ция промоторного участка Д Н К от —943 до —343 п. а. не приводила к
уменьшению экспрессии. (Положения оснований в промоторах нумеру-
ются в обоих направлениях от точки инициации транскрипции, обозна-
чаемой как + 1 . Позиции оснований, расположенных против хода транс-
крипции, обозначаются со знаком минус.) Однако делеция последова-
тельности до —105 п. о. снижала транскрипционную активность до
1/3 контрольного уровня, а делеция Д Н К до —46 п. о. уменьшала ее
до 1/2 по сравнению с контролем [7]. Эти результаты свидетельству-
ют о том, что в 35Б-промоторе между —343 и —105, а также между
—105 и —46 п. о. располагаются блоки последовательностей (или мо-
дули) , присутствие которых необходимо для активации транскрипции
Д л я того чтобы выяснить более точные границы ds-действующих
последовательностей в промоторе ВМЦК, были проведены эксперимен-
ты, в которых последовательность промотора делетировали с 3'- и 5'-
концов, постепенно увеличивая размеры делеций. Было показано, что
в случае удаления последовательности промотора от —208 до —46 п. о.
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb 5 2 — 3-705 4
эффективность транскрипции падала до 1/2 от контрольного уровня.
Однако при встраивании удаленной последовательности эффективность
транскрипции снова восстанавливалась, причем независимо от ориен-
тации вставки. Таким образом, установлено, что функционирование ре-
гуляторного участка Д Н К в ЗбБ-промоторе ВМЦК, расположенного в
пределах от —46 до —343 п. о., не зависит от его ориентации и рас-
стояния по отношению к точке инициации транскрипции, т. е. этот фраг-
мент Д Н К имеет свойства энхансера [10—12].
Кроме того, было выявлено, что комбинация из нескольких ds-дей-
ствующих элементов 35S-np0M0T0pa способна вызывать экспрессию в
тканях, в которых отдельные cis-действующие элементы из этой ком-
бинации транскрипции не инициируют. Так, участок 35Э-промотора от
—90 до + 8 п. о. не способен инициировать транскрипцию в листовой
ткани. Аналогичная картина наблюдается и при встраивании фрагмен-
та, содержащего последовательность от —343 до —208 п. о., перед ми-
нимальным 35S-npOMOTOpOM (от —46 до + 8 п. о.). Однако, когда фраг-
мент от —343 до —208 п. о. встраивают перед последовательностью от
—90 до + 8 п. о., экспрессия в листовой ткани восстанавливается [12].
Полученные результаты свидетельствуют о том, что в активации
транскрипции с 35S-np0M0T0pa задействовано несколько as-действую-
щих элементов. Так, когда участок от —90 до + 8 п. о. встраивают пе-
ред структурным геном хлорамфениколацетилтрансферазы (ХАТ),
активность фермента обнаруживается только в клетках корня,
но не в листовой ткани. Из этого следует, что отдельные участки
35S-np0M0T0pa могут направлять экспрессию в строго определен-
ных тканях.
Для выявления специфичности экспрессии промоторов в клетках
различных растительных тканей в качестве маркерного гена удобно
использовать бактериальный ген ГУЗ, что позволяет определить
экспрессию различных генноинженерных конструкций с этим геном
при помощи метода гистохимической локализации активности этого
фермента [7].
Встраивая различные фрагменты 35Б-промотора перед геном ГУЗ,
удалось установить, что вирусный энхансер 355-промотора в свою оче-
редь состоит из двух доменов, обозначенных А (от —90 до + 8 ) и В
(от —343 до —90), каждый из которых способен направлять тканеспе-
цифическую и регулируемую в развитии транскрипцию в трансгенных
растениях. Домен А, в состав которого входит ТАТА-блок, может на-
правлять транскрипцию главным образом в клетках корня и эмбрио-
нальных тканях, из которых образуются корни [13]. Наиболее сильная
экспрессия в корме наблюдается в меристематической ткани. Однако
небольшая активность фермента обнаруживается также в меристеме
стебля (особенно в проростках) и в васкулярных тканях стебля и листь-
ев. Тканеспецифичность транскрипции обеспечивается ds-действуюіцим
элементом, расположенным на участке от —63 до —83 п. о. Этот эле-
мент, названный «activation sequence of the cauliflower mosaic virus
35S enhancer» или «as-Ι» (последовательность, активирующая 35Б-эн-
хансер вируса мозаики цветной капусты), содержит в своем составе
тандемно расположенную повторяющуюся последовательность TGACG
и связывается с ядерным белком, получившим название ASF-I (от
«activation sequence factor» — фактор, активирующий последователь-
ность). Мутации в тандемном повторе интактного промотора приводят
к снижению экспрессии в корнях. В то же время встраивание as-Ι в
последовательность промотора, обычно функционирующего только в
фотосинтезирующих тканях, вызывает сильную экспрессию в корнях и
усиление транскрипции в листовой ткани [14].
Регуляторный белок ASF-I способен также связываться с с о д е й -
ствующими регуляторными элементами других промоторов, таких как
Hex-I1 в промоторе гена гистона НЗ пшеницы [15], nos-ly в промоторе
гена нопалинсинтазы 77-плазмиды [16] и osc паликдромной последова-
тельностью в промоторе гена октопинсинтазы 77-плазмиды [17, 18] .
5
Интересно, что уровень синтеза РНК, гибридизующейся с кДНК,
кодирующей обладающий способностью связываться с теми же после-
довательностями, что и ASF-I1 белок, в клетках корней в 5—10 раз вы-
ше, чем в листовой ткани. Таким образом, преимущественная экспрес-
сия в корнях, контролируемая доменом А, очевидно, определяется бо-
лее высокой концентрацией в корнях регуляторного фактора, взаимо-
действующего с as-1 [15].
Следует также отметить, что домен А участвует в регуляции экс-
прессии и в других тканях, а ядерный фактор ASF-I обнаруживается
не только в корнях.
Вторая регуляторная последовательность 35Б-промотора, обозна-
ченная как домен В, расположена на расстоянии от —90 до —343 п. о.
от точки инициации транскрипции. В отличие от домена А, эта регуля-
торная последовательность направляет экспрессию главным образом в
надземных частях растений. Особенно сильная экспрессия наблюдает-
ся в клетках васкулярной, эмидермальной и мезофильной тканей эм-
бриональных листьев и семядолей, а также в васкулярной ткани стеб-
ля. В корне экспрессия с домена В обнаруживается в основном в вас-
кулярной ткани и в корневом чехлике [19].
В случае комбинации из двух доменов А и В экспрессия выявля-
ется во всех тканях и на всех стадиях развития растения, что свиде-
тельствует о комбинаторном взаимодействии доменов.
Так как домен В способен направлять транскрипцию в клетках
многих растительных тканей, можно предположить, что его нуклеотид-
ная последовательность содержит несколько as-действующих элемен-
тов, т. е. состоит из отдельных модулей. Для выяснения структуры этих
модулей домен В был разделен на пять субдоменов, обозначенных от
Bl до В5.
Оказалось, что каждый из этих субдоменов по-разному направля-
ет экспрессию в растительных клетках, причем четыре из пяти субдо-
менов при встраивании перед минимальным промотором способны на-
правлять экспрессию по крайней мере в одном из типов растительных
клеток.
В частности, было показано, что домен В2 направляет экспрессию
только в одном типе клеток в составе флоэмных элементов стебля и
листьев, а также в корневом чехлике и корневых волосках.
Субдомен ВЗ обнаружил различные свойства в разных независи-
мых трансгенных растениях. В одних трансгенных растениях этот суб-
домен обеспечивал сильную экспрессию в ткани эндосперма у корне-
вого полюса семян, слабую экспрессию в основании семядолей и в при-,
мордиях листьев, образующихся из меристемы. В других — экспрессия
наблюдалась в семядолях эмбрионов и проростков, а также в корневом
кортексе и в большинстве клеток взрослого стебля.
Субдомен В4 направлял экспрессию в клетках васкулярной парен-
химы листьев и стебля, а субдомен В5 обеспечивал слабую экспрессию
только в участках ниже стеблевого апекса и листовых почках, образу-
ющихся из стебля.
Что касается субдомена Bi , то он не обнаружил способности на-
правлять экспрессию при встраивании перед минимальным промото-
ром ни в одном из типов растительных клеток [20].
Полученные результаты свидетельствуют о том, что в состав доме-
на В входят по крайней мере четыре ds-действующих элемента или
модуля. Однако, если суммировать характеристики экспрессии всех че-
тырех индивидуальных модулей, то оказывается, что в сумме они не
соответствуют экспрессии интактного домена В.
Существуют два возможных объяснения наблюдаемому несоответ-
ствию. Первое — при разделении последовательности домена В на от-
дельные модули происходит разрыв каких-то неидентифицированных
пока cis-регуляторных последовательностей, необходимых для обеспе-
чения специфических характеристик экспрессии; второе — специфич-
ность экспрессии обеспечивается синергическим взаимодействием от-
6 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb 5 2 — 3-705 6
дельных регуляторных модулей. Так как количество и структура cis-
регуляторных последовательностей в 35S-np0M0T0pe полностью пока не
выяснены, предположение о разрыве регуляторных последовательностей
исключить нельзя. Однако анализ экспрессии, направляемой комбина-
цией из нескольких индивидуальных субдоменов В, встроенных перед
доменом А, во многих случаях подтверждает синергичеекое взаимодей-
ствие отдельных регуляторных доменов, так как по крайней мере не-
которые недостающие характеристики экспрессии могут быть при этом
восстановлены.
К о м б и н а т о р н ы е с в о й с т в а с у б д о м е н о в 35S-n ρ о м о-
т о ρ а ВМЦК. Данные, свидетельствующие в пользу комбинаторного и
синергического взаимодействия субдоменов В, получены в эксперимен-
тах, в которых каждый из пяти субдоменов В по очереди, а также их:
комбинации встраивали перед химерным геном, содержащим домен А
и ген ГУЗ. При этом наблюдаемая в каждом случае экспрессия отли-
чалась по своей специфичности и эффектив'ности от таковой, направ-
ляемой только доменом А или индивидуальными субдоменами В. В ча-
стности, ни один из субдоменов не мог направлять экспрессию гена
ГУЗ в мезофильных клетках взрослых листьев, как это делает интакт-
ный домен В. Кроме того, генетическая конструкция, содержавшая ком-
бинацию из двух субдоменов В4 и В5, встроенных перед доменом А,
направляла экспрессию химерного гена ГУЗ в семенах и проростках,
тогда как ни один из этих субдоменов по отдельности не обеспечивал
экспрессии в этих органах [20, 21].
Синергический эффект различных комбинаций субдоменов прояв-
лялся только на определенных стадиях развития растения. Как уже
отмечалось выше, субдомен Bl при встраивании перед минимальным
промотором не способен направлять экспрессию в каких-либо тканях,
однако при встраивании его перед доменом А направляемая этой ком-
бинацией экспрессия гена ГУЗ обнаруживалась в семядолях семян и
проростков табака. Комбинация субдомена В2 и домена А, не изменяя
экспрессии в семенах и проростках (по сравнению с одним доменом А),
обеспечивала значительное ее усиление во флоэмных элементах листьев,
стеблей и корней взрослых растений.
Еще более сложная зависимость экспрессии от комбинации cis-ре-
гуляторных последовательностей обнаружена в клетках цветков таба-
ка. В этих клетках ЗбБ-промотор не очень активен и направляет экс-
прессию главным образом в васкулярных тканях и трихомах лепест-
ков, а также в клетках эпидермиса.
Для выяснения того, какие субдомены или их комбинации обеспе-
чивают специфичность экспрессии 35S-np0M0T0pa в исследуемых тка-
нях, авторы анализировали экспрессию гена ГУЗ, направляемую раз-
личными комбинациями индивидуальных субдоменов В с минимальным
промотором или с доменом А.
Оказалось, что во взрослых лепестках цветков табака специфич-
ность экспрессии ЗбЭ-промотора обеспечивается аддитивным взаимо-
действием отдельных регуляторных модулей, тогда как в развивающих-
ся бутонах при их взаимодействии наблюдается синергический эф-
фект [21].
В то же время во взрослых лепестках цветков петуньи, где 35S-
промотор функционирует значительно эффективнее, чем в аналогичных
клетках табака, наблюдается синергическое взаимодействие as-регуля-
торных последовательностей ЗбБ-промотора [13].
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что
в зависимости от вида растения, стадии развития и типа ткани меха-
низм воздействия c/s-регуляторных последовательностей Д Н К на эф-
фективность экспрессии ЗБЗ-промотора может быть различным. А так
как последовательность Д Н К ЗбБ-промотора во всех случаях была оди-
наковой, то подобные различия, по-видимому, связаны с тем, что в
каждом случае в растительных клетках существует набор специфиче-
ских /га/гя-действующих белковых факторов, которые при взаимодейсг-
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb 5 2 — 3-705 7
вии с ^-действующими последовательностями и обеспечивают специ-
фичность экспрессии в данной ткани.
Комбинаторные свойства промоторов растений. БОЛЬШИНСТВО иссле-
дованных промоторов растений содержит в своем составе сразу не-
сколько as-регуляторных последовательностей, обусловливающих спе-
цифичность транскрипции, инициируемую данным промотором. Инди-
видуальные модули обеспечивают количественные или тканеспецифиче-
ские характеристики экспрессии и необходимы для нормального функ-
ционирования промотора [3,22].
В настоящее время достаточно подробно изучена структура регу-
ляторных последовательностей всего нескольких растительных промо-
торов, среди которых промоторы генов белков, регулируемых светом,
а также промоторы генов пататина.
С т р у к т у р а и р е г у л я ц и я п р о м о т о р о в г е н о в rbcS.
Свет играет важную роль в регуляции роста растений и их развитии,
оказывая влияние на уровень экспрессии генов, регулируемых светом.
Воспринятый фоторецептором сигнал передается по неидентифициро-
ванной пока цепочке и посредством специфических /гбшз-действующих
факторов воздействует на экспрессию соответствующих «светочувстви-
тельных» генов [23—25].
Среди генов белков, регулируемых светом, особенно интенсивно ис-
следовались промоторы семейства генов малой субъединицы рибуло-
зо-1,5-дифосфаткарбоксилазы (rbcS). Гены этого семейства активно экс-
прессируются в клетках листьев, причем мРНК гена rbcS-ЗА состав-
ляет около 40 % от суммарной мРНК генов rbcS [26].
Чувствительность транскрипции гена rbcS-ЗА к свету определяется
наличием в составе промотора этого гена нескольких as-регуляторных
последовательностей, называемых светочувствительными элементами
(light-responsive elements, LRE). Идентифицировано несколько trans-
регуляторных белковых факторов, связывающихся с LRE [27]. При
этом один из таких факторов, названный GT-I1 связывался в промоторе
гена rbcS-ЗА в шести местах [29, 30]. Подобные последовательности
обнаружены и в промоторах других генов, регулируемых светом
[31—33].
Анализируя экспрессии делеционных вариантов промотора гена
rbcS-ЗА, удалось установить, что светочувствительные элементы нахо-
дятся на расстоянии от —55 до —166 п. о. от точки начала транскрип-
ции [34]. В этой последовательности обнаружены два регуляторных
модуля, обозначенных как блок II (Sr-GTGTGGTTAATATG-S7) и блок
III (5'-АТСАТТТТСАСТ-3'). Блок II расположен на расстоянии от
—152 до —138 п. о., а блок III — от —125 до —114 п. о. Делеция лю-
бого из них резко снижала эффективность транскрипции [34]. Однако,
когда в делетированном до —166 п. о. промоторе rbcS-ЗА вместо одно-
го из блоков встраивали две копии другого, уровень экспрессии был та-
ким же, как и в исходном промоторе, причем в обоих случаях чувстви-
тельность к регуляции экспрессии светом сохранялась. Интересно, что
уровень транскрипции при встраивании двух копий блока II был таким
же, как в исходном промоторе, а при встраивании двух копий блока
III — приблизительно в 20 раз меньше. 20-кратное различие наблюда-
лось и в экспериментах по конкурентному связыванию фрагментов:
ДНК, содержащих две копии блока II или блока III, с регуляторных
белком GT-I в присутствии фрагмента исходного промотора [28]. Та-
ким образом, блок III и GT-I1 скорее всего, слабо влияют на уровень
экспрессии, определяемой светочувствительными элементами.
Решающая роль блока II в регуляции экспрессии светом проде-
монстрирована в экспериментах, в которых его синтетический тетрамер
встраивали перед доменом А 35Б-промотора ВМЦК. В этом случае тет-
рамер блока II вызывал у гетерологичного 35S-np0M0T0p>a чувствитель-
ность к регуляции светом [35]. Однако, если тот же тетрамер встраи-
вали перед минимальным ЗбБ-промотором ВМЦК, то экспрессия не об-
наруживалась. ,
8 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb 5 2 — 3-705 8
В минимальном 35S-npoMorope ВМЦК по сравнению с доменом А
того же промотора отсутствует фрагмент от —46 до —90 п. о., который,
как уже упоминалось выше, содержит as-действующую регуляторную
последовательность as-Ι и тандемнъш повтор, связывающийся с trans-
действующим белковым фактором ASF-1. Исходя из этого логично пред-
положить, что чувствительность к регуляции светом обусловливается
взаимодействием /mfts-действующих факторов GT-I и ASF-I [36].
Эти исследования показывают, что связывание GT-I является не-
обходимым, но недостаточным условием для определения чувствитель-
ности транскрипции к свету. Кроме того, они однозначно указывают на
регуляторную роль участка блока II, связывающего фактор GT-Iy в
транскрипции, регулируемой светом.
Если фактор GT-I способен взаимодействовать с регуляторными
/rflns-действующими факторами в химерных промоторах, то вполне ве-
роятно, что он взаимодействует и с регуляторными факторками, взаимо-
действующими с промотором гена rbcS-ЗА. Эксперименты, проведен-
ные с делеционными вариантами промотора rbcS-ЗА, у которых удале-
ны фрагменты до —50 и до —135 п. о., подтверждают такую возмож-
ность. В частности, тетрамер блока II, встроенный перед обоими вари-
антами этого промотора, ни в том, ни в другом случае не направлял
экспрессии соответствующего гена [36].
Отсутствие экспрессии в случае с промотором rbcS-ЗА, делетиро-
ванным до —135 п. о., можно объяснить тем, что отрезок от тетрамера
блока II до регуляторных элементов блока III превышает то макси-
мальное расстояние, при котором еще возможна экспрессия [28]. Од-
нако отсутствие экспрессии при встраивании тетрамера блока II перед
промотором, делетированным до —50 п. о., позволяет предположить,
что фактор GT-I действует совместно с другими белковыми фактора-
ми, участки связывания которых делетированы, так как находятся в
пределах от —50 до —135 п. о. Как уже упоминалось, взаимодействие
GT-I с блоком III, расположенным в пределах от —114 до —125 п. о.,
не является обязательным для регулируемой светом экспрессии с про-
моторіа rbcS-ЗА. Это обстоятельство дало авторам основание для пред-
положения о том, что гипотетические белковые факторы взаимодейст-
вуют с c/s-регуляторными последовательностями, перекрывающими или
фланкирующими блок III.
Для локализации таких регуляторных последовательностей в про-
мотор rbcS-ЗА, делетированный до —166 п. о., были внесены дополни-
тельные сканирующие делеции, затрагивающие блок III и фланкирую-
щие его области, и проанализирована экспрессия, направляемая этими
делеционными вариантами. Кроме того, методом электрофореза ана-
лизировали подвижность фрагментов ДНК, содержащих эти последо-
вательности и обработанных экстрактами из листьев растений.
В результате оказалось, что области, фланкирующие блок III, дей-
ствительно необходимы для экспрессии, так как являются участками
связывания ранее неизвестных ^пшз-действующих белковых факторов.
Белок, связывающийся с 5'-концом последовательности Д Н К блока III,
был обозначен, как 3AF5, а с З'-концом — 3AF3. При этом подвижность
при электрофорезе комплексов фрагментов Д Н К с белками 3AF5 и
3AF3 из экстрактов листьев растений, выросших на свету, была ниже,
чем в случае экстрактов растений, выросших в темноте.
Удалось также установить, что обнаруженный эффект связан с
различной степенью фосфорилирования белковых факторов 3AF5 и
3AF3 в разных экстрактах. Причем предварительная обработка фосфа-
тазой экстрактов листьев, выросших на свету, приводила к увеличению
подвижности комплексов.
Фосфатазная обработка по-разному влияла на способность белко-
вых факторов связываться с соответствующей регуляторной последова-
тельностью. В случае фактора 3AF5 подобная обработка не снижала
его способности связываться с регуляторным фрагментом ДНК. В то
же время по мере удаления фосфатных остатков белка 3AF3 увеличи-
9
валась не только подвижность комплекса, но и уменьшалась возмож-
ность связывания 3AF3 с соответствующим фрагментом Д Н К [37].
Приведенные результаты свидетельствуют о необходимости фосфо-
рилированных форм 3AF5 и 3AF3 для светорегулируемой экспрессии
гена rbcS-ЗА. При этом механизмы их активации в ответ на воздейст-
вие света, по-видимому, различны.
С т р у к т у р а и р е г у л я ц и я п р о м о т о р о в г е н о в п а -
т а т и н а. Пататин—основной запасный белок клубней картофеля, об-
ладающий высокими питательными свойствами, которые определяются
его аминокислотным индексом, в большинстве случаев равняющимся
100 %. Пататин представляет собой семейство гликопротеинов, состав-
ляющих приблизительно 40 % растворимого белка в клубнях картофе-
ля. Молекулярная масса белков этого семейства, очищенных до гомо-
генности, находится в пределах 40000. В обычных условиях пататин
обнаруживается во всех культивируемых сортах картофеля только в
клубнях и в небольших количествах — в корнях, однако его синтез мож-
но индуцировать и в изолированных листьях или участках стебля кар-
тофеля, если их культивировать in vitro на среде с высокой концентра-
цией сахарозы [38, 39]j.
мРНК пататина в клубнях и в корнях приблизительно одинаковы
по размеру и имеют высокую гомологию. Основное отличие между ни-
ми состоит в том, что мРНК пататина в клубнях (как и соответствую-
щие гены) не имеет в 5'-нетранслируемой области вставки длиной
22 п. о. В связи с этим все гены и мРНК пататина такого типа относят
к классу I, а все гены и мРНК пататина с подобной вставкой — к клас-
су II [40].
В настоящее время из 20—40 генов, составляющих геном, описаны
и секвенированы лишь 5—6, а подробно изучена регуляция только двух
генов класса I. Один из них, обозначенный ВЗЗ, активно экспрессиру-
ется в клубнях. Кроме того, его экспрессию можно индуцировать в
листьях, увеличив концентрацию сахарозы в культивируемой среде до
7 % [38]. При исследовании этого гена было установлено, что клубне-
епецифичность и индуцируемость экспрессии сахарозой определяются
c/s-регуляторными элементами промотора, расположенными в пределах
фрагмента длиной около 1500 п. о. Анализ последовательности этого
фрагмента выявил две структуры, которые могут быть вовлечены в
регуляцию транскрипции изучаемого гена,— прямой повтор длиной
208 п. о. и АТ-богатую последовательность длиной 37 п. о., повторяю-
щуюся 3 раза [38].
Учитывая расположение прямого повтора, 1500-парный фрагмент
промотора ВЗЗ был разделен на четыре модуля, расположенных в пре-
делах от —1512 до —951 п. о. (№ 4), от —930 до —736 п. о. (№ 3), от
—736 до—339 п. о. (№ 2) и от —339 до + 4 8 (№ 1). Модуль № 2 был
в свою очередь разделен на участки от —736 до —509 п. о. и от —509
до —339 п. о. Для анализа модуля № 1 использовали метод ступенча-
тых делеций с 5'-конца этого фрагмента.
Модули №№ 2—4 встраивали в различных комбинациях перед мо-
дулем № 1 и исследовали их роль в определении тканеспецифичности,
индуцибельности и эффективности экспрессии гена ГУЗ, направляемой
промотором ВЗЗ.
Оказалось, что модуль № 1 может направлять клубнеспецифиче-
скую экспрессию, хотя уровень ее был в 20 раз ниже, чем у исходного
промотора. Делеции с 5'-конца этого модуля до .—228 и до —195 п. о.
также направляли клубнеспецифическую экспрессию, тогда как деле-
ция до —103 п. о. вызывала прекращение экспрессии. Из этого следует,
что регуляторные элементы, обеспечивающие клубнеспецифическую
экспрессию промотора ВЗЗ, расположены в пределах от —195 до
— 103 п. о. [41].
В состав этого участка входит одна из трех копий высококонсерва-
тивных повторяющихся 37-парных АТ-богатых последовательностей.
Причем анализ рестрикционного фрагмента от—249 до —105 п. о. при
10 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb 5 2 — 3-705 10
помощи метода замедления подвижности фрагмента в геле показал, что
с ним связывается ядерный белковый фактор, присутствующий как в
листовых, так и в клубневых экстрактах. Интересно, что анализируемые
нуклеопротеидные комплексы в зависимости от экстракта имели не-
сколько различную подвижность, что может служить аргументом в поль-
зу предположения о том, что в листьях и в клуб'нях присутствуют раз-
личные белковые факторы.
Аналогичные белковые комплексы образовывались и с другими
фрагментами, содержавшими АТ-богатый повтор. При этом ни после-
довательность плазмиды pUC18y ни фрагмент 35Б-промотора от + 8 до
—90 п. о. с этими факторами не связывались, из чего можно сделать
вывод о том, что участком связывания белкового фактора или факто-
ров является АТ-богатая консервативная последовательность в промо-
торе пататина [41].
Анализируя экспрессию различных делеционных вариантов промо-
тора пататина, авторы обнаружили в его составе три различных пози-
тивно действующих регуляторных элемента — A1 В и С. Элемент А
располагается в модуле № 1 на расстоянии от —228 до —195 п. о. Дуп-
ликация фрагмента ДНК, содержавшего этот элемент, приводила к
4—5-кратному увеличению экспрессии.
Элемент В входит в состав модуля № 2, так как при делеции по-
следовательности этого модуля от —736 до —509 п. о. экспрессия па-
дает до уровня, который обеспечивает элемент Л. В то же время деле-
ция всего домена № 2 из интактного промотора не приводила к изме-
нению его экспрессии. Однако образовавшуюся конструкцию можно
рассматривать и как встраивание модуля № 4 перед модулями №№ 1
и 3. В этом случае у/ровень направляемой ею экспрессии превышает та-
ковой, который обеспечивают модули №№ 1 и 3, в 4 раза. Из этого
следует, что модуль № 4 должен содержать третий позитивно действу-
ющий регуляторный элемент—С. Тем не менее, встраивание ни од-
ного из этих элементов перед дел'етированным до1 —90 п. о. 35Б-промо-
тором ВМЦК не оказывало никакого влияния на его экспрессию [41].
В данной серии экспериментов авторы не смогли разделить дейст-
вие клубнеспецифических и индуцируемых сахарозой регуляторных
элементов, хотя ими установлено, что элементы, обеспечивающие ин-
дукцию сахарозой, располагаются в промоторе гена ВЗЗ в области от
—228 до —1 п. о.
Регуляторные элементы, обеспечивающие промотору пататина ин-
дуцируемость сахарозой, удалось локализовать в промоторе другого
гена пататина — РАТ21 [41], Промотор гена РАТ21 был клонирован
как HindIII-Dral-фрагмент длиной около 3500 п. о. (от —3500 до
fc+24), который затем укорачивали, используя участки узнавания раз-
личных рестриктаз и экзонуклеазу ExoIIL
Экспрессию гена ГУЗ, направляемую различными делеционными
вариантами этого промотора, анализировали как в клетках трансген-
ных растений, так и в срезах их междоузлий, содержавших пазушные
почки, которые культивировали in vitro на среде с концентрацией са-
харозы 2 и 10 %.
Авторы установили, что промотор гена PAT21, делетированный до
—119 п. о., не способен направлять экспрессию в срезах независимо от
концентрации сахарозы в среде. Делеционный вариант до —369 п. о.
при низкой концентрации сахара также обеспечивает только очень сла-
бую экспрессию ГУЗ, но при ее увеличении эффективность экспрессии
возрастала в 4 раза.
Промоторный фрагмент с делецией до —957 п. о. при низкой кон-
центрации сахарозы обеспечивал уровень экспрессии приблизительно
в два раза ниже, чем делеционный вариант до —674 п. о., однако при
увеличении сахарозы в среде уровень направляемой им экспрессии был
только немного ниже, чем у последнего.
Интересно, что при низком содержании сахара уровень экспрессии
варианта с делецией до —2164 был даже ниже, чем в случае делеции
11
до —674 п. о., а уровень экспрессии исходного промотора ниже, чем в
вариантах с делециями до —2164, —957 и —674 п. о. Аналогичная кар-
тина наблюдалась и на среде с увеличенным содержанием сахара.
Таким образом, оказалось, что in vitro минимально необходимый
фрагмент промотора РАТ21, который еще обеспечивает индуцируемость
экспрессии сахарозой, должен содержать не менее 369 п. о., а более
длинный фрагмент до —674, по-видимому, включает регуляторный
элемент, стимулирующий экспрессию при любой концентрации са-
харозы [43].
Похожая картина наблюдалась и при анализе экспрессии тех же
вариантов промотора в различных тканях трансгенных растений. Де-
леционный вариант до —119 п. о. был практически так же неактивен,
как и в экспериментах in vitro. Вариант с делецией до —369 п. о. обес-
печивал относительно высокий уровень экспрессии ГУЗ в стебле и кор-
нях, но в целом уровень направляемой им экспрессии в клубнях был
значительно ниже, чем у более длинных вариантов промотора. Промо-
тор с делецией до —2164 и исходный фрагмент обеспечивали очень вы-
сокий уровень экспрессии главным образом в клубнях, однако уровень
направляемой ими экспрессии в стебле и листьях был ниже, чем в слу-
чае варианта с делецией до —367 п. о.
Для выяснения того, какие же фрагменты промотора РАТ21 содер-
жат регуляторные элементы, обеспечивающие индукцию сахарозой и
клубнеспецифичность, различные фрагменты пататинового промотора
встраивали перед 35Б-промотором ВМЦК, укороченным до —90 п. о.
При встраивании фрагмента от —40 до —409 п. о. экспрессия гена
ГУЗ в клубнях увеличивалась в 80 раз по сравнению с экспрессией в
листьях независимо от ориентации встроенного фрагмента. При этом
абсолютный уровень экспрессии был выше в случае прямой ориента-
ции, а таковой в клубнях был намного выше, чем экспрессия укоро-
ченного 355-промотора.
Встраивание более длинного фрагмента (от —40 до 957 п. о.) при-
водило к 100-кратному увеличению активности ГУЗ в клубнях по срав-
нению с активностью в клетках листьев, однако в обратной ориентации
фрагмента этот эффект был менее выражен. При встраивании более
дальних фрагментов промотора пататина (от —270 до —957 и от —409
до —957 п. о.) перед укороченным ЗбБ-промотором также наблюдалось
увеличение активности ГУЗ в клубнях, но в этом случае разница по
сравнению с активностью ГУЗ в листьях была значительно меньше [43].
Суммируя изложенное, можно предположить, что регуляторные по-
следовательности, определяющие клубнеспецифичность экспрессии про-
мотора гена пататина, локализованы в пределах от —40 до —369 п. о.,
что, в принципе, согласуется с результатами предыдущей работы. Эти
элементы, похоже, обладают свойствами энхансеров, так как функцио-
нируют независимо от ориентации по отношению к кодирующему участ-
ку гена. Кроме того, судя по тому, что фрагмент от —270 до —957 п. о.
также способен обеспечивать определенную специфичность экспрессии,
регуляторные элементы, определяющие индуцируемость сахарозой,
должны находиться и в этом фрагменте.
Всем этим требованиям удовлетворяют прямые повторы, обнару-
женные в промоторах всех генов пататина класса 1 и располагающие-
ся в области от —154 до —224 и от —471 до —579 п. о. в промоторе
PAT21. Вероятно, что в ближайшее время могут появиться и непосред-
ственные доказательства в пользу этого предположения.
Структура //чтя-действующих белковых факторов. Современные
представления о структуре trans-действующих регуляторных факторов
в основном основаны на исследованиях, выполненных на клетках жи-
вотных, амфибий, а также дрожжей, поскольку о структуре регулятор-
ных факторов растений известно пока немного. Тем не менее получен-
ные данные позволяют предположить, что в основе ДНК-белковых вза-
имодействий у растений лежат те же механизмы, которые обнаружены
в клетках животных.
12 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb 5 2 — 3-705 12
Согласно модели, предложенной Лэндшульцем и соавт. для регу-
ляторного белка клеток печени крысы С /ЕВР , связывающегося в виде
димера как с энхансерами, так и с ССААТ-блоками промоторов многих
генов, участок взаимодействия между двумя мономерами содержит по-
следовательность аминокислотных остатков, в которой через регуляр-
ные промежутки располагаются остатки лейцина, так называемая «лей-
ииновая застежка-молния» (leucine zipper). Рядом с этим участком на-
ходятся кластеры основных аминокислот, обеспечивающие связывание
с регуляторным фрагментом Д Н К [43].
Обнаруженная структура («лейциновая застежка»+домен из ос-
новных аминокислот), обеспечивающая димеризацию регуляторного
фактора и связывание с ДНК, оказалась очень консервативной и в на-
стоящее время выявлена не только в составе многих транскрипционных
факторов класса B-ZIP (basic-zipper, т. е. основной домен-«застежка»),
но и в неядерных белках [44].
Исследования, осуществленные на делеционных вариантах белков
и на синтетических пептидах, не только подтвердили предложенную мо-
дель, но и позволили создать модель узнавания белками класса B-ZIP
регуляторных последовательностей ДНК, названную «сжимание нож-
ницами» (scissors-grip) [45],.
rrans-действующие факторы растений также интенсивно изучают-
ся в последнее время. Эти факторы локализуются главным образом в
ядре, где взаимодействуют с соответствующими as-регуляторными по-
следовательностями генов. Д л я характеристики специфичности взаимо-
действия регуляторных факторов обычно используют методы замедле-
ния подвижности фрагмента Д Н К в геле и ДНКазных отпечатков с
применением клеточных либо ядерных экстрактов.
На основании результатов таких экспериментов in vitro сделан вы-
вод о том, что 5'-регуляторные последовательности растительных генов
содержат участки связывания сразу для нескольких ядерных регуля-
торных факторов [27, 28, 46]. Более того, в некоторых случаях один и
тот же регуляторный фактор может взаимодействовать с регуляторны-
ми последовательностями в нескольких промоторах.
Примером подобного регуляторного фактора может быть ядерный
белок ASF-I [14], взаимодействующий с as-7-последовательностью 35S-
промотора ВМЦК и с ci's-регуляторными последовательностями hex-1
в промоторе гена гистона НЗ пшеницы [15], nos-Ι в промоторе нопа-
линсинтазы [16] и osc в промоторе октопинсинтазы [17].
Этот регуляторный фактор был исследован очень подробно после
того, как с помощью последовательности hex-Ι в качестве зонда уда-
лось идентифицировать клон кДНК табака, кодирующий белок класса
B-ZIP, названный TGAla [15]. Специфичность связывания этого белка
была такой же, как и у фактора ASF-I1 что предполагает идентичность
этих белков. В то же время оказалось, что в геноме присутствуют по
крайней мере четыре гена семейства TGAla. Один из них, обозначен-
ный как G13, был выделен и детально проанализирован [47].
Показано, что белок, кодируемый геном G13, высокогомологичен
по аминокислотной последовательности с TGAla1 причем степень гомо-
логии особенно высока в области B-ZIP. Основной домен белка гена
G13 оказался идентичным таковому в TGAla1 что подтверждает дан-
ные о связывании этих белков in vitro с одинаковыми последователь-
ностями Д Н К . Участок «лейциновой застежки» также обнаружил вы-
сокую консервативность, в связи с чем можно предположить возмож-
ность образования гетеродимера этих белков in vivo. Интересно, что
«лейциновая застежка» и основной домен кодируются в гене G13s от-
дельными небольшими экзонами. Это согласуется с гипотезой Гилбер-
та о том, что экзоны кодируют отдельные домены белков [48].
В промоторе гена G13 был также обнаружен участок последова-
тельности ДНК, связывающийся с факторами TGAla1 белком собствен-
но гена G13, а также с ASF-I1 из чего следует, что, возможно, как и в
случае регуляторных факторов из других организмов [49], экспрессия
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb 5 2 — 3-705 11
гена G13 регулируется (по крайней мере частично) по типу авторе-
гуляции [47].
Основной домен белков типа TGAlay по-видимому, участвует не
только в узнавании специфической последовательности ДНК. Есть так-
же основания полагать, что этот домен содержит в своем составе пеп-
тид, определяющий транспорт факторов, родственных TGAla, в ядро,
так как при встраивании фрагмента ДНК, кодирующего основной до-
мен TGAlai перед геном ГУЗ активность фермента обнаруживалась
главным образом в ядре [50].
В настоящее время в клетках растений обнаружено уже несколь-
ко белковых факторов класса B-ZIP, которые связываются с промотор-
ными последовательностями растительных генов [15, 51—56]. Роль не-
Рис. 1. Сравнение амииокислотных последовательностей основных доменов (а) и леи-
цнновых повторов (б) растительных белков класса bZip [51]. Консервативные амино-
кислоты взяты в рамку. Лейциновые остатки повторов отмечены звездочкой
которых из них в регуляции транскрипции пока ещ*е не установлена,
однако сравнение их аминокислотных последовательностей подтверж-
дает высокую степень гомологии их основных доменов и «лейциновых
застежек» (рис. 1).
Модель комбинаторного взаимодействия as-регуляторных элемен-
тов в промоторах генов растений. Приведенные данные о механизмах
регуляции транскрипции некоторых растительных генов, а также ре-
зультаты исследований механизмов регуляции транскрипции других
эукариотических генов свидетельствуют о том, что комбинация из не-
скольких ci's-регуляторных элементов способна направлять экспрессию
в клетках тех тканей, в которых индивидуальные элементы этой ком-
бинации экспрессии не направляют.
Для объяснения этого факта исследователи из Рокфеллеровского
университета Нью-Йорка Бенфи и Чуа предложили две модели воз-
можного механизма регуляции транскрипции [22]. Эти модели в виде
схемы представлены на рис. 2.
Первая из них (а) предполагает кооперативное взаимодействие
между гетерологичными /rims-действующими регуляторными фактора-
ми. Происходит это следующим образом. В том случае, когда концент-
рация одного из регуляторных факторов достаточно высока (I и II) ,
он связывается с регуляторным участком Д Н К и таким образом ак-
14 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 5
тивирует транскрипцию. Когда же концентрации обоих факторов слиш-
ком низки для активации транскрипции, происходит их взаимодейст-
вие между собой, в результате чего активируется транскрипция только
тех генов, которые содержат в промоторах участки узнавания для обо-
их факторов (III) .
Вторая модель (б) основывается на наличии в клетке еще одного
белкового фактора-мишени, взаимодействующего более чем с одним
регуляторным фактором. При этом с фактором-мишенью должно быть
связано несколько регуляторных факторов, образующих комплекс, обес-
печивающий взаимодействие с соответствующими ds-регуляторными по-
следовательностями ДНК- В том случае, когда концентрация актив-
ного фактора достаточно высока, происходит активация транскрипции
Рис. 2. Модели взаимодействий между as-регуляторными элементами [22]: а — коопе-
ративное взаимодействие между гетерологичными //-ims-действующими факторами; б—•
синергизм, опосредованный кооперативным взаимодействием с фактором-мишенью
(I и II) . Однако, если концентрации активных факторов недостаточно
высоки для заполнения всех мест связывания фактора-мишени, экс-
прессии тех генов, промоторы которых содержат Cis-регуляторные эле-
менты только одного типа, не происходит (III, два верхних промотора).
Все же те промоторы, которые содержат комбинацию различных cis-
регуляторных элементов, способны в этих условиях направлять транс-
крипцию, поскольку с фактором-мишенью взаимодействуют оба регуля-
торных фактора (III, нижний промотор).
Конечно, ни одна из моделей не может объяснить всего многооб-
разия механизмов регуляции транскрипции эукариотических генов. Тем
не менее эти модели удовлетворительно поясняют экспрессию многих
уже известных промоторных последовательностей, поддаются экспери-
ментальной проверке и дают возможность вносить те или иные кор-
рективы.
Заключение. Исследование регуляторных механизмов, контролиру-
ющих транскрипцию растительных генов, исключительно важно не
только для понимания процессов, происходящих в растениях, но и для
биотехнологических целей, особенно в тех случаях, когда необходимо
экспрессировать какой-либо ген в строго определенном типе клеток и
на определенной стадии развития. К сожалению, пока неизвестно, мож-
но ли предсказать экспрессию гена на основании знания нуклеотидной
последовательности его промотора. Тем не менее некоторые необходи-
мые параметры, обусловливающие эффективность и специфичность
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb 5
2 — 3-705 15
транскрипции с данного промотора, уже определены: это а) количест-
во и вид c/s-регуляторных последовательностей; б) их сродство к trans-
действующим факторам и в) концентрация регуляторных факторов в
клетке. Для понимания того, как клетка использует информацию, со-
держащуюся в нуклеиново-белковом взаимодействии, для регуляции
экспрессии генов необходимы дальнейшие исследования структуры и
экспрессии промоторов, содержащих различные комбинации ds-pery-
ляторных элементов, как природных, так и сконструированных.
Однако, несмотря на информативность такого метода на данном
этапе исследований, в дальнейшем искусственное разделение промотор-
ных последовательностей на изолированные фрагменты и анализ эф-
фективности их функционирования, скорее всего, отойдут на второй
план, поскольку с помощью такого подхода невозможно выяснить роль
отдельных нуклеотидных остатков в белково-нуклеиновых взаимодей-
ствиях. Следующим этапом исследования промоторных последователь-
ностей, по-видимому, будет внесение точечных мутаций в структуру
промотора методом сайт-направленного мутагенеза, что позволит перей-
ти к установлению точного соответствия между отдельным нуклеотид-
ным остатком и его значением в регуляции активности гена.
Вполне вероятно, что для изучения механизмов регуляции транс-
крипции можно будет использовать и обратный подход — внесение то-
чечных мутаций в ген регуляторного белка с последующим исследова-
нием взаимодействия мутантного регуляторного фактора с интактным
или же мутантным промотором. Такой способ мог бы выявить роль от-
дельных аминокислотных остатков в пространственной организации
trans-факторов и их функциональном поведении. Кроме того, он от-
крывает путь для биомемитической технологии, которая занимается кон-
струированием белков, предназначенных для выполнения определенных
функций. Это значит, что в будущем будет возможно направленно кон-
струировать trans-факторы, обеспечивающие определенную специфич-
ность регуляции транскрипции генов.
Р е з ю м е . Огляд сучасних літературних даних про механізми регуляції тран-
скрипції в рослинах. Аналізується структура найбільш вивчених промоторів, що функ-
ціонують у рослинах: 35Б-промотора вірусу мозаїки цвітної капусти, промотора малої
субодиниці рибулозо-1,5-діфосфаткарбоксилази / оксигенази, промоторів генів пататину.
Обговорюються нові відомості про структуру регуляторних білкових факторів та мож-
ливі механізми їх взаємодії з промоторними послідовностями.
S u m m a r y . This review decribes some of the recent progress in the understanding
of transcriptional regulatory mechanisms in plants. The structure of best studied promo-
ters directing transcription in plants such as 35S-promoter of cauliflower mosaic virus,
promoter of the ribuloso-l,5-biphosphate carboxylase/oxygenase small subunit gene and
patatin promoters is considered. The modern data about the structure of regulatory pro-
tein factors and possible mechanisms of their interaction with promoter sequences are
discussed.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kuhlenmeier C., Green P., Chun N.-H. Regulation of gene expression in higher plants//
Ann. Rev. Plant Physiol.— 1987.—38.—P. 221—257.
2. Schwarz-Sommer Z., Huijser P., Nacken W. et al. Genetic control of flower develop-
ment by homeotic genes in Antirrhinum majus IJ Science.— 1990.— 250, N 4983 —
P. 931—936.
3 Walden RSchell J. Techniques in plant molecular biology-progress and problems //
Eur. J. Biochem.— 1990.— 192, N 2.— P. 563—576.
4. Dynan W. S. Modularity in promoters and enhancers 11 Cell — 1989.—58, N 1.—
P. 1—4.
5 Mitchell P. /., Tjian R. Transcriptional regulation in mammalian cells by sequence-
specific binding prote ins / / Science.— 1989.—245, N 4917.—P. 371—378.
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb 5 2 — 3-705 16
6. Yamamoto К. R. Steroid receptor regulated transcription of specific genes and gene
ne tworks / /Ann . Rev. Genet.— 1985.— 19.—P. 209—252.
7. Jefferson R. A., Kavanagh Τ. A., Bavan M. W. GUS fusions: beta-glucuronidase as
a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants // EMBO J.— 1987.—6,
N 13.—P. 3991—3907.
8. Odell J. T., Nagy F., Chua N.-H. Identification of DNA sequences required for acti-
vity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter / / Nature.— 1985.— 313, N 6005.—
P. 810—812.
9. Jensen J. S., Marcker K. A., Oiten L., Schell J. Nodule-specific expression of a chima-
ric soybean/ / Ib id .— 1986.—321, N 6071.—P. 669—674.
10. Kay R., Chan A., Daly M., MacPherson J. Duplication of CaMV 35S promoter sequen-
ces creates a strong enhancer for plant genes /J Science.— 1987.— 236, N 4806.—
P. 1299—1302.
11. Nagy F., Boutry M., Hsu M.-Y. et al. The 5'-proximal region of the wheat Cab-I ge-
ne contains a 268-bp enhancer-like sequence for phytochrome response // EMBO J.—
1987.—6, N 9.— P. 2537—2542.
12. Fang R.-X., Nagy F., Sivasubramaniam SChua N.-H. Multiple cis regulatory ele
ments for maximal expression of cauliflower mosaic virus 35S promoter in transgenic
p l a n t s / / P l a n t Cell.— 19β9.— 1, N 1.—P. 141 — 150.
13. Benfey P. N., Chua N.-H. Regulated genes in transgenic plants // Science.— 1989.—
244, N 4901,—P. 174—181.
14. Lam E., Benfey P. N., Gilmartin P. M. el al. Site-specific mutat ions alter in vitro
factor binding and change promoter expression pattern in transgenic plant // Proc.
Nat. Acad. Sci. USA.— 1989.—86, N 20.—P. 7890—7894.
15. Katagiri F., Lam E., Chua N.-H. Two tobacco DNA-binding proteins with homology
to the nuclear factor CREB/ /Na tu re .— 1989.—340, N 6236.—P. 727—730.
16. Lam E., Katagiri F., Chua N.-H. Plant nuclear factor ASF-I binds to an essential re-
gion of the nopaline synthase promoter // J. Biol. Chem.— 1990.— 265.— N 17.—
P. 9909—9913.
17. Fromm H., Katagini F., Chua N.-H. An octopine synthase enhancer element directs
tissue-specific expression and binds ASF-I1 a factor from tobacco nuclear extracts //
Plant Cell.— 1989.— 1, N 8 .—P. 977—Θ84.
18. Bouchez D., Tokushiba J. G., Llewellyn D. J. et al. The osc-element is a component
of the promoters of several T-DNA and plant viral genes // EMBO J.— 1989.— 8,
N 13.—P. 4197—4204.
19. Benfey P. N., Ren L., Chua N.-H. The CaMV 35S enhancer contains at least two do-
mains which can confir different developmental and tissue-specific expression pat-
terns // Ibid.—N 8 .—P. 2195—2202.
20. Benfey P. N., Ren L., Chua N.-H. Tissue-specific expression from CaMV enhancer sub-
domains in early stages of plant development // Ibid — 1990 — 9, N 6 — P . 1677—1684
21. Benfey P. N., Ren L., Chua N.-H. Combinatorial and synergistic properties of CaMV
35S enhancer subdomains // Ibid.— P. 1685—1696.
22. Benfey P. N., Chua N.-H. The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial
regulation of transcription in plants // Science.— 1990.—250, N 4983.—P. 959—966.
23. Kuhlemeier C., Strittmatter G., Ward KChua N.-H. The pea rbcS-ЗА promoter me-
diates light responsiveness but not organ specificity // P lant Cell.— 1989.— 1, N 4.—
P. 471—478.
24. Jenkins G. Photoregulation of gene expression in plants // Photochem. and Photobiol.—
1988.—48, N 8 .—P. 821—832.
25. Nagy F., Kay S. A., Chua N.-H. Gene regulation by phytochrome // Trends Genet.—
1988.—4, N 1,—P. 37—42.
26. Flur R., Moses P., Morelli G. et al. Expression dynamics of the rbcS multigene family
and organ distribution of the transcripts /y EMBO J.— 1986.—5, N 9 .—P. 2063—2071.
27. Gilmartin P. M., Chua N.-H. Localization of phytochrome responsive element within
the upstream region of pea rbcS-ЗА // Мої. and Cell. Biol.— 1990.— 10, N 11.—
P. 5565—5568.
28. Gilmartin P. M., Chua N.-H. Spacing between GT-I binding sites within a light-respon-
sive element is critical for transcriptional ac t i v i t y / /P l an t Cell.— 1990.— 2, N 5.—
p. 447—455.
29. Green P. J., Kay S. A., Chua N.-H. Sequence-specific interactions of a pea nuclear fac-
tor with light-responsive elements upstream of the rbcS3-3A g e n e / / E M B O J.— 1987.—
6, N 9.— P. 2543—2549.
30. Green P. J., Yong M.-H., Cuozzo M. et al. Binding site requirements for pea nuclear
protein factor GT-I correlate with sequences required for light-dependent transcriptio-
nal activation of the rbcS3-3A gene 11 Ibid — 1988.— 7, N 13.—P. 4035—4044.
31. Stockhaus J., Eckes P., Roeha-Sosa M. et al. Analysis of as -ac t ing sequences involved
in the leaf-specific expression of a potato gene in transgenic plants // Proc. Nat. Acad.
Sci, USA.— 1987,— 84, N 22.— P. 7943—7947.
32. Dean C., Pichersky E., Dunsmuir P. Structure, evolution and regulation of rbcS ge-
nes in higher plants // Ann. Rev. Plant Physiol.— 1989.—40.—P. 415—439.
33. Lawton Μ. A., Dean S. M., Dron M. et al. Silencer region of a chalcone synthase pro-
moter contains multiple binding sites for a factor, SBF-1, closely related to GT-I Ц
Plant and Мої. Biol.— 1991.— 16, N 2.— P. 235—249.
34. Kuhlemeier C., Cuozzo M., Green P. et al. Localization and conditional redundancy
of regulatory elements in rbcS3-3A, a pea gene encoding the small subunit of ribu-
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb 5 2 — 3-705 17
lose-biphosphate carboxylase / / Proc. Nat. Acad. Sci. U S A — 1988.— 85 N 13 —
p . 4662—4666.
35. Davis M. C., Yong M.-H., Gilmartin P. M. et al. Minimal sequence requirements fos
the regulated expression of rbcS3-3A from Pisum sativum in transgenic tobacco
p lan t s / /Pho tochem. and Photobiol — 1990 . -52 , N 1 — P . 43—50.
36. Sarokin L. P., Chua N.-H. Binding sites for two novel phosphoproteins, 3AF5 andi
3AF3, are required for rbcS3-3A expression / / I b i d . - 1 9 9 2 . - 4 , N 4 , — P . 4 7 3 - 4 8 3 .
37. Rocha-Sosa M., Sonnewald U., Frommer W. et al. Both developmental and metabolic
signals activate the promoter of a class I patatin gene / / EMBO J — 1989 — 8, N 1 —
P. 23—29.
38. Wenzler H. C., Mignery G. A., Fisher L. M., Park W. D. Analysis of a chimeric class-I
patat in-GUS gene in transgenic potato plants: High-level expression in tubers and
sucrose-inducible expression in cultured leaf and stem explants // Plant and Мої. Biol —
1989.— 12, N 1.—P. 41—50.
39. Mignery C. A., Pikaard C. S., Park W. D. Molecular characterization of the patat in
multigene family of p o t a t o / / G e n e — 1988 —62, N 1.—P. 27—44.
40. Liu X. J., Prat S., Willmitzer L., Frommer W. B. Cis regulatory elements directing tu-
ber-specific and sucrose-inducible expression of a chimeric class I patatin promoter F
GUS-gene fusion / /Мої . and. Gen. Genet.— 1990 — 223, N 3 .—P. 401—406.
41. Bevan M. W., Barker R., Goldsbrough A. et al. The structure and transcription start
site of a major potato tuber protein gene // Nucl. Acids Res.— 1986.— 14, N 11.—
P. 4625—4638.
42. Jefferson R., Goldsbrough A., Bevan M. Transcriptional regulation of a patatin-1 ge-
ne in p o t a t o / / P l a n t and. Мої. Biol.— 1990 — 14, N 6 .—P. 995—1006.
43. Landschulz W. H., Johnson P. F., MeKnight S. L. The leucine zipper: a hypothetical
structure common to a new class of DNA binding proteins // Science.— 1988.— 240,
N 4860.—P. 1759—1764.
44. Busch S. J., Sasone-Corsi P. Dimers, leucine zippers and DNA-bidning domains / /
Trends Genet.— 1990.—6, N 2 .—P. 36—40.
45. Vinson C. R., Sigler P. B., MeKnight S. L. Scissors-grip model for DNA recognition
by a family of leucine zipper proteins // Science — 1989 — 246, N 4932 — P . 911—916.
46. Schnindler U., Cashmore A. R. Photoregulated gene expression may involve ubiquitous
DNA binding proteins // EMBO J.— 1990.—9, N 11.—P. 3415—3427.
47. Fromm H., Katagiri F., Chua N.-H. The tobacco transcription activator TGAla binds
to a sequence in the 5'upstream region of a gene encoding a TGA/α-related pro te in / /
Мої. and Gen. Genet.— 1991.—229, N 1.—P. 181—188.
48. Gilbert W. Why genes in pieces?/ /Nature .— 1978.—271.—P. 501—503.
49. Serfling E. Autoregulation — a common property of eukaryotic transcription fac to r s? / /
Trends Genet.— 1989.— 5, N 2.— P. 131—133.
50. Van der Krol A. R., Chua N.-H. The basic domain of plant B-ZIP proteins facilitates
import of a reporter protein into plant nuclei // Plant Cell.— 1991.— 3, N 7.— P. 667—
675.
51. Oeda K., Salinas J., Chua N. H. A tobacco bZip transcription activator (TAF-I) binds
to a G-box-like motif conserved in plant genes // EMBO J.— 1991.— 10, N 7.—
P. 1793—1802.
52. Guiltinan M. J., Mareotte W. R., Jr, Quatrano R. S. A plant leucine zipper protein
that recognizes an abscisic acid response element/ /Science.— 1990.— 250, N 4978.—
P. 267—271.
53. Tabata T., Takase IT., Takayama S. et al. A protein that binds to as -ac t ing element
of wheat histone genes has a leucine zipper mot i f / / Ib id .— 1989.— 245, N 4921.—
P. 965—967.
54. Singh K., Dennis E. S., Ellis J. G. et al. OCSBF-1, a maize Ocs enhancer binding fac-
tor: isolation and expression during development // Plant Cell.— 1990.—2, N 9.—
P. 891—903.
55. Hastings H., Maddaloni M., Lazzaroni N. et al. The 0 2 gene which regulates zein de-
position in maize endosperm encodes a protein with structural homologies to trans-
criptional activators // EMBO J.— 1989.—8, N 10.—P. 2795—2801.
56. Schmidt R. J., Burr F. A., Aukerman M. J., Burr B. Maize regulatory gene opaque-2
encodes a protein with a «leucine-zipper» motif that binds to zein DNA // Proc. Nat .
Acad. Sci. USA.— 1990.—87, N 1.—P. 46—50.
Ин-т биоорг. химии и нефтехимии Получено 27.01.93
АН Украины, Киев
18
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Ns 5
|