Механизмы перекисного окисления липидов фракций хроматина печени крыс
Показана способность к переокислению липидов, входящих в состав фракций транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени интактных крыс. По ряду характеристик (отношение к индукторам и ингибиторам, временная кинетика накопления конечных продуктов) процессы липопереокисления в хроматине...
Збережено в:
| Дата: | 1993 |
|---|---|
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1993
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156244 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Механизмы перекисного окисления липидов фракций хроматина печени крыс / Ю.И. Губский, Е.Л. Левицкий // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 5. — С. 34-43. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-156244 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1562442019-06-19T01:31:13Z Механизмы перекисного окисления липидов фракций хроматина печени крыс Губский, Ю.И. Левицкий, Е.Л. Структура и функции биополимеров Показана способность к переокислению липидов, входящих в состав фракций транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени интактных крыс. По ряду характеристик (отношение к индукторам и ингибиторам, временная кинетика накопления конечных продуктов) процессы липопереокисления в хроматине отличаются от таковых, происходящих в мембранах эндоплазматического ретикулума печени. Процессы липопереокисления более лабильны и протекают с большей интенсивностью в активной фракции хроматина, что может иметь решающее значение в механизмах повреждения ядерной ДНК. Если аскорбат-зависимое переокисление протекает исключительно с участием липидов хроматина, то остающаяся после липидной экстракции значительная интенсивность HАДФH-зависимого переокисления позволяет предположить участие в последнем процессе протяженных молекул нуклеиновых кислот и белков. Перекисное окисление липидов в хроматине рассматривается в качестве одного из ведущих механизмов повреждения ядерного генетического аппарата клетки. Показано здатність до переокислення ліпідів, що входять до складу фракцій транскрипційно активного та репресованого хроматину печінки інтактних щурів. За рядом ознак (відношення до індукторів та інгібіторів, кінетика накопичення у часі кінцевих продуктів) процеси ліпопереокислення у хроматині відрізняються від таких, що відбуваються у мембранах ендоплазматичного ретикулуму печінки. Процеси ліпопереокислення лабільніші та проходять з більшою інтенсивністю в активній фракції хроматину, що може мати вирішальне значення у механізмах пошкодження ядерної ДНК. Якщо аскорбат-залежне переокислення відбувається за участю виключно ліпідів хроматину, то значна частка НАДФН-залежного переокислення, що залишається після ліпідної екстракції, дозволяє припустити участь в останньому процесі подовжених молекул нуклеїнових кислот та білків. Перекисне окислення ліпідів у хроматині розглядається як один з головних механізмів пошкодження ядерного генетичного апарату клітини. Ability for peroxidation of lipids of transcriptionally and repressed chromatin fractions of intact rat livers was shown. According to some features (the relation to inductors and inhibitors, the time's kinetics of the terminal products accumulation) chromatin's lipids peroxidation processes distinguish from ones in the liver endoplasmatic reticulum membranes. The lipid peroxidation processes are more labiled and intensived in the active chromatin fraction. This may be important for the nuclear DNA damage mechanisms. The ascorbate-dependent lipid peroxidation processes are determined only by the chromatin lipids just as NADPH-dependent ones are related to stretched nucleic acids and proteins molecules. This suggestion is proved by the fact of the rather considerable resting of NADPH-dependent lipid peroxidation after lipid extraction in the chromatin. The chromatin lipid peroxidation processes are considered as important mechanism of the nuclear genetic apparatus damages. 1993 Article Механизмы перекисного окисления липидов фракций хроматина печени крыс / Ю.И. Губский, Е.Л. Левицкий // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 5. — С. 34-43. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00036F http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156244 615.357.631:577.157 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров |
| spellingShingle |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Губский, Ю.И. Левицкий, Е.Л. Механизмы перекисного окисления липидов фракций хроматина печени крыс Биополимеры и клетка |
| description |
Показана способность к переокислению липидов, входящих в состав фракций транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени интактных крыс. По ряду характеристик (отношение к индукторам и ингибиторам, временная кинетика накопления конечных продуктов) процессы липопереокисления в хроматине отличаются от таковых, происходящих в мембранах эндоплазматического ретикулума печени. Процессы липопереокисления более лабильны и протекают с большей интенсивностью в активной фракции хроматина, что может иметь решающее значение в механизмах повреждения ядерной ДНК. Если аскорбат-зависимое переокисление протекает исключительно с участием липидов хроматина, то остающаяся после липидной экстракции значительная интенсивность HАДФH-зависимого переокисления позволяет предположить участие в последнем процессе протяженных молекул нуклеиновых кислот и белков. Перекисное окисление липидов в хроматине рассматривается в качестве одного из ведущих механизмов повреждения ядерного генетического аппарата клетки. |
| format |
Article |
| author |
Губский, Ю.И. Левицкий, Е.Л. |
| author_facet |
Губский, Ю.И. Левицкий, Е.Л. |
| author_sort |
Губский, Ю.И. |
| title |
Механизмы перекисного окисления липидов фракций хроматина печени крыс |
| title_short |
Механизмы перекисного окисления липидов фракций хроматина печени крыс |
| title_full |
Механизмы перекисного окисления липидов фракций хроматина печени крыс |
| title_fullStr |
Механизмы перекисного окисления липидов фракций хроматина печени крыс |
| title_full_unstemmed |
Механизмы перекисного окисления липидов фракций хроматина печени крыс |
| title_sort |
механизмы перекисного окисления липидов фракций хроматина печени крыс |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1993 |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156244 |
| citation_txt |
Механизмы перекисного окисления липидов фракций хроматина печени крыс / Ю.И. Губский, Е.Л. Левицкий // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 5. — С. 34-43. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT gubskijûi mehanizmyperekisnogookisleniâlipidovfrakcijhromatinapečenikrys AT levickijel mehanizmyperekisnogookisleniâlipidovfrakcijhromatinapečenikrys |
| first_indexed |
2025-07-14T08:42:18Z |
| last_indexed |
2025-07-14T08:42:18Z |
| _version_ |
1837611131415298048 |
| fulltext |
11. Виноградова E. И., Фэйгина М. Ю., Алданова Н. А. и др. Первичная структура ци-
топлазматической аспартатаминотрансферазы из сердечной мышцы свиньи. Амино-
кислотная последовательность растворимых пептидов триптического гидролизата //
Биохимия — 1973.— 38, № 1.—С, 3>—21.
12. Решетов П. Д., Честухина Г. Г., Махмудов С., Пышкин А. С. Хроматография в ТОН-
КИХ пленках полиамида//Химия природ, соединений.—1971.—№ ι . — с . 66—68.
13. Easley С. W. Combination of specific colour reactions usefullin the peptide mapping
technique // Biochim. et biophys. acta — 1965.— 107, N 3.—P. 386—388.
14. Алахов Ю. Б., Бунду лис Μ. Α., Бунду лис Ю. П. Первичная структура фактора элон-
гации G из Ε. coli. IV. Структура пептидов бромцианового расщепления молекулы
G-фактора // Биоорг. химия.— 1983.—9, № 3.—С, 304—314.
15. Козлов Э. А., Левитина Т. Л., Гусак Н. M., Серебряный С. Б. Некоторые физико-
химические свойства белка тел включений вируса ядерного полиэдроза и вируса гра-
нулеза озимой совки, Agrotis segetum // Биополимеры и клетка.— 1985.—1, № 3.—
С. 121 — 124.
16. Левитина Т. Л., Серебряный С. Б., Роднин Н. В., Козлов Э. А. Строение некоторых
триптических пептидов гранулина вируса гранулеза озимой совки, Agrotis segetum //
Там же.— 1986.— 2, JSfe 1.— С. 30—35.
17. Левитина Т. Л., Роднин Н. В., Серебряный С. Б., Козлов Э. А. Строение некоторых
химотриптических пептидов гранулина вируса гранулеза озимой совки, Agrotis se-
getum // Там же.— Nb 2.— С. 73—81.
18. Роднин Н. В., Левитина Т. Л., Гусак Н. M., Козлов Э. А. Реконструкция полипеп-
тидной цепи гранулина вируса гранулеза озимой совки, Agrotis segetum. Полнея
аминокислотная последовательность // Там же.— 1991.— 7, JSfe 1.— С. 87—93.
19. Epstein D. Α., Thoma J. A. Alkaline protease associated with the matrix protein of a
virus infecting the cabbage looper//Biochem. and Biophys. Res. Communs.— 1975.—
62, N 2.— P. 478—484.
20. Гусак Η. M., Козлов Э. Α., Овандер Μ. П., Серебряный С. Б. Триптические пептиды
белка тел включений вируса ядерного полиэдроза большой вощинной моли, Galleria
mellonella // Биоорг. химия.— 1981.—7, № 7 —С. 996—1007.
21. Козлов Э. А., Левитина Т. Л., Гусак Η. М. и др. Сравнение аминокислотных после-
довательностей белков тел включений вирусов ядерного полиэдроза тутового и не-
парного шелкопрядов и большой вощинной моли // Там же.— С. 1008'—1015.
22. Kozlov Ε. A., Rodnin Ν. V., Levitina Т. L. et al. The amino acid sequence determina-
tion of a granulin and polyhedrin from two baculoviruses infecting Agrotis segetum //
Virology.— 1992.—189.—P. 320—323.
23. Козлов Э. Α., Левитина Т. Л., Гусак Η. М. и др. Сравнительное биохимическое ис-
следование полиэдренных белков вирусов ядерного полиэдроза Il Биохимия.— 1978.—
43, No 12.—С, 2189—2195.
Ин-т молекул яр. биологии и генетики Получено 18.03.93
АН Украины, Киев
УДК 615.357.631:577.157
Ю. И. Губский, Е. Л. Левицкий
МЕХАНИЗМЫ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ
ФРАКЦИЙ ХРОМАТИНА ПЕЧЕНИ КРЫС
Показана способность к переокислению липидов, входящих в состав фракций транскрип-
ционно активного и репрессированного хроматина печени интактных крыс. По ряду ха-
рактеристик (отношение к индукторам и ингибиторам, временная кинетика накопления
конечных продуктов) процессы липопереокисления в хроматине отличаются от таковых,
происходящих в мембранах эндоплазматического ретикулума печени. Процессы липо-
переокисления более лабильны и протекают с большей интенсивностью в активной
фракции хроматина, что может иметь решающее значение в механизмах повреждения
ядерной ДНК. Если аскорбат-зависимое переокисление протекает исключительно с учас-
тием липидов хроматина, то остающаяся после липиднЬй экстракции значительная ин-
тенсивность HАДФH-зависимого переокисления позволяет предположить участие в по-
следнем процессе протяженных молекул нуклеиновых кислот и белков. Перекисное окис-
ление липидов в хроматине рассматривается в качестве одного из ведущих механизмов
повреждения ядерного генетического аппарата клетки.
Введение. Входящие в состав хроматина липиды обладают ярко выра-
женной специфичностью состава в интактных клетках и под действием
повреждающих факторов [1, 2]. Ранее нами показана способность ли-
© Ю. И. Губский, Et Л, Левицкий, 1993
34 ISSN 0233-7657 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Jft δ 34
пидов, входящих в состав фракций транскрипционно активного и ре-
прессированного хроматина (TAX и PX соответственно) печени крыс*
к спонтанному и индуцированному НАДФН и аскорбатом переокисле-
нию (ПОЛ) ί[3, 4]. Интенсивность реакций ПОЛ в PX и TAX может из-
меняться при повреждении хроматина химическими соединениями [5—
7]. Показано также неслучайное распределение молекул липидов во
фракциях хроматина с образованием мицеллярных либо бислойных
структур, подобных компонентам биомембран [8]. Структура таких
комплексов может изменяться в условиях индукции ПОЛ [9].
В настоящей работе описаны результаты исследований, характери-
зующих процессы ПОЛ во фракциях ядерного хроматина, различаю-
щихся по уровню транскрипционной активности.
Материалы и методы. В работе использовали крыс-самок линии
Вистар 3-месячного возраста (1501—200 г). Крыс декапитировали под
легким эфирным наркозом в утренние часы, учитывая периодичность
митотического цикла. Выделение фракций PX и TAX из печени, а так-
Рис. 1. Спектры поглощения продуктов ПОЛ во фракциях хроматина печени интакт-
ных крыс: а — диеновые конъюгаты, PX; б — малоновый' диальдегид, АЗП, TAX.
же анализ процессов ПОЛ проводили, как описано ранее [3—9]. Экс-
тракцию липидов из фракций хроматина осуществляли смесью «хлоро-
форм— метанол». Полученные данные обрабатывали с помощью мето-
дов непараметрической статистики [10].
Результаты и обсуждение. Липиды, входящие в состав исследован-
ных фракций хроматина, способны к переокислению как без предвари-
тельной индукции, так и в условиях активации процессов ПОЛ в
НАДФН- и аскорбат-зависимых системах липопереокисления. При этом
образуются типичные продукты переокисления липидов — диеновые
конъюгаты и малоновый диальдегид (МДА) и его производные, — ана-
логичные образующимся продуктам в мембранных структурах [11].
Эти данные представлены на рис. 1.
Без предварительной индукции накопление малонового диальде-
гида (нмоль МДА/мг белка за 2 ч) (п=4—5) составляло: во фракции
P X - 1 5 6 , 0 ; TAX —87,1 (ρ<0,05 по сравнению с PX); микросом—
2280,2 (р<0,05 относительно PX). Из этого следует, что интенсивность
липопереокисления в хроматине мала и в пересчете на единицу белка
составляет 3,8—6,8 % от аналогичной величины в микросомах. При ин-
дукции порцессов ПОЛ в условиях in vitro посредством добавления
прооксидантов — НАДФН и аскорбата — интенсивность ПОЛ во фрак-
циях хроматина возрастает (табл. 1 и 2), причем абсолютные величины
зависят от использованных препаратов НАДФН и аскорбиновой кис-
лоты. Величины индуцированного ПОЛ заметно выше во фракции TAX
по сравнению с PX (см. табл. 1), в особенности в пересчете на единицу
ДНК (см. табл. 2). Заметное расхождение в абсолютных величинах
индуцированного ПОЛ в исследованных фракциях хроматина (см,
табл. 1 и 2), по-видимому, обусловлено различиями в чистоте препара-
тов прооксидантов. Однако в целом изменение величин наведенного
ПОЛ гораздо больше выражено в TAX, что может быть связано с
ISSN 0233-7G57 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. JVb 5 3 * 35
большей лабильностью процессов липопереокисления в этой фракции
хроматина.
В целом интенсивность этих процессов заметно ниже в обеих
фракциях хроматина по сравнению с микросомами (табл. 2). Во фрак-
циях хроматина также заметно изменено относительно макросом Соот-
ношение между величинами НАДФН-зависимого ПОЛ, его термола-
бильной составляющей, а также ас-
корбат-зависимого ПОЛ. Если в
микросомах величины аскорбат-за-
висимого ПОЛ (АЗП) и термола-
бильной составляющей НАДФ-зави-
симого ПОЛ (НЗП, Δ) равны 90,4
и 57,3 % от величины НЗП, то во
фракциях хроматина они значи-
тельно ниже и составляют 67,5 и
9,3 % для PX и 40,5 и 8,1 % для
TAX (в пересчете на единицу бел-
ка). Обращает на себя внимание
факт гораздо большей концентра-
ции продуктов ПОЛ в пересчете на
единицу ДНК во фракции TAX по
сравнению с PX. Возможно, он име-
ет решающее значение для диффе-
ренциальной чувствительности ис-
следованных фракций хроматина к
повреждающим воздействиям [5—7].
При анализе величин содержания диеновых конъюгатов в пересче-
те на единицу белка во фракциях хроматина, а также в микросомах и
тканевых гомогенатах печени интактных крыс (табл. 3) выявлено не-
сколько большее их количество в гептановом экстракте микросом от-
носительно фракций хроматина. Однако в изопропанольном экстракте
(где их количество больше по сравнению с гептановым экстрактом во
всех исследованных субклеточных фракциях) концентрация их в мик-
росомах, PX и TAX приблизительно одинакова и выше аналогичной ве-
личины в гомогенате. Также отмечается гораздо большая концентрация
диеновых конъюгатов в пересчете на единицу ДНК в TAX по сравне-
нию с PX как в гептановой, так и в изопропанольной частях липидного
экстракта. Для всех исследованных субклеточных фракций характерна
большая концентрация диеновых конъюгатов в изопропанольном экс-
тракте относительно гептанового. Этот факт можно объяснить тем, что
фосфолипиды, являющиеся основным субстратом ПОЛ, экстрагируются
в изопропанольную фазу липидного экстракта, в то время как в геп-
тановую — нейтральные липиды и триглицериды. Для всех исследован-
ных субклеточных фракций характерна довольно низкая величина со-
держания промежуточных продуктов ПОЛ — диеновых конъюгатов
(спонтанное ПОЛ).
В целом выявлена гораздо меньшая способность к индукции ПОЛ
во фракциях хроматина по сравнению с микросомами на фоне неболь-
шой разницы в содержании продуктов спонтанного ПОЛ (диеновых
конъюгатов).
В пределах исследованных колебаний концентрации белка (на про-
бу) и величин индуцированного ПОЛ во фракциях хроматина, оцени-
ваемого по накоплению МДА, не выявлено корреляции между этими
двумя показателями за исключением АЗП во фракции TAX, где коэф-
фициент корреляции является значимым и свидетельствует о том, что
с ростом концентрации белка в исследованных пределах наблюдается
увеличение величины АЗП в этой фракции хроматина. Это, по-видимо-
му, подтверждает большую лабильность процессов ПОЛ во фракции
TAX по сравнению с PX (табл. 4).
На рис. 2 приведены результаты определения накопления продук-
тов ПОЛ во фракциях изолированного хроматина в зависимости от врс-
Т а б л и ц а 1
Накопление малонового диальдегида
и его производных в присутствии
прооксидантов во фракциях хроматина
печени интактных крыс (нмоль МДА/мг
белка за 2 ч), п = 20
Показатель
п о л PX TAX
НЗП
НЗП, Δ
АЗП
1895,0
290,6
552,5
3260,3*
832,8**
1288,2**
П р и м е ч а н и е . Здесь и в табл. 2—8:
*р<0,05; ** р<0,01 (по сравнению с PX);
НЗП—ПОЛ, зависимое от присутствия
НАДФН; НЗП, Δ — его составляющая,
зависимая от нагревания; АЗП — аскор-
бат-зависимое ПОЛ.
36 ISSN 0233-7657 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Jft δ 36
мени инкубации проб. В НАДФН-зависимой системе ПОЛ накопление
МДА и его производных завершается раньше во фракции TAX (при-
близительно 60 мин инкубации) относительно PX (120 мин). Та же за-
кономерность наблюдается и в случае АЗП. В TAX этот процесс завер-
шается в пределах 60 мин инкубации проб при 37 °С, в то время как в
PX накопление МДА и его производных отмечается и после 180 мин
Т а б л и ц а 2
Скорость накопления малонового диальдегида во фракциях изолированного хроматина
и микросомах печени интактных крыс (п=4—12)
Показатель
ПОЛ Микросомы PX TAX
НЗП 14279,8* (100) 711,4 (100) 642,5 (100)
— 931,5 (100) 5787,2* (100)
НЗП, Δ 8178,2* (57,3) 65,9 (9,3) 52,2 (8,1)
— 82,9 (8,9) 422,2* (7,3)
АЗП 12912,5* (90,4) 479,9 (67,5) 260,4 (40,5)
614,8 (66,0) 2144,6* (37,Ί)
П р и м е ч а н и е . Цифры в скобках — доля (%) НЗП, Δ и АЗП от НЗП; первая и вто-
рая строка — нмоль на мг белка и ДНК за 2 ч соответственно.
Т а б л и ц а 3
Содержание диеновых конъюгатов во фракциях хроматина, микросомах и тканевых
гомогенатах печени интактных крыс (п=14—28)
Слой липидного экстракта Гомогенат Микросомы PX TAX
Гептановый 55,4* 87,1* 18,4 29,9* 55,4*
— 24,4 259,4*
Изопропанольный 81,2* 170,0 193,1 105,8
— — 260,7 957,5**
П р и м е ч а н и е . Первая и вторая строка — нмоль на мг белка и ДНК соответственно.
инкубации. С учетом этих данных в дальнейшем пробы фракций хрома-
тина инкубировали в течение 120 мин при 37 °С, так как этот времен-
ной пормежуток наиболее информативно отражает прохождение про-
цессов ПОЛ в хроматине.
По сравнению с классическим объектом ПОЛ — микросомами —
скорость накопления МДА во фракциях хроматина заметно ниже /[12]
и, видимо, определяется структурными ограничениями (присутствие
спирали ДНК и нуклеосом), а также, вероятно, более низкими концен-
трациями ферментов и субстратов в хроматине относительно микросом.
Факт большей скорости накопления МДА в TAX по сравнению с PX1
очевидно, имеет сходную природу предположительно вследствие боль-
шей «открытости» структуры TAX в сравнении с PX.
Для анализа влияния прооксидантов на интенсивность процессов
ПОЛ во фракциях хроматина изучали эффект присутствия аскорбино-
вой кислоты и пирофосфата натрия на интенсивность накопления МДА
и его производных во фракциях PX и TAX. Результаты этих экспери-
ментов приведены в табл. 5. Величины ПОЛ в полной системе, содер-
жащей ионы двухвалентного железа, пирофосфат натрия, аскорбино-
вую кислоту и хроматин, были приняты за 100%. Отсутствие в среде
инкубации пирофосфата натрия снижает интенсивность накопления
МДА в обеих фракциях хроматина практически на одну и ту же вели-
чину— приблизительно на 45%. Отсутствие аскорбиновой кислоты в
среде инкубации оказывает гораздо более заметный ингибирующий эф-
фект на величину ПОЛ в хроіматине — в PX она снижается на 82,7 %,
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Jft δ 37
* в 1 Г н а 9 4 , 3 0у/Г°· Отсутствие же обоих компонентов (аскорбата и
пирофосфата) практически полностью ингибирует ПОЛ в PX В то же
время в TAX величина ПОЛ составляет 38,6 % от величины в полной
системе (рост на 32,9 % по сравнению с системой без экзогенного ас-
корбата, но с пирофосфатом). Учитывая факт присутствия эндогенного
аскорбата в Д Н К клеток печени [13, 14], можно предположить его
участие в исследованных процессах ПОЛ в хроматине.
Большая доступность компо-
нентов TAX по сравнению с PX для
прохождения реакций ПОЛ (вслед-
ствие более конденсированной
структуры последнего) обусловли-
вает большую доступность эндоген-
ного аскорбата во фракции TAX по
сравнению с фракцией PX. Воз-
можно, что пирофосфат натрия в
данной концентрации без экзоген-
ного аскорбата тормозит ПОЛ с
участием эндогенного аскорбата во
фракции TAX. Отсутствие пирофос-
фата снимает ингибирующий эф-
фект, что приводит к росту ПОЛ в
этой фракции хроматина.
Известно, то ионы двухвалент-
ного железа являются инициатора-
ми ПОЛ в мембранных структурах
клетки [11, 15]. Существует оптимум
концентрации ионов Fe2+, при котором скорость накопления МДА в
микросомах максимальна [И, 12]. Для исследования влияния ионов
Fe2+ на скорость накопления МДА во фракциях изолированного хрома-
тина образцы PX и TAX инкубировали в течение 120 мин при 37 °С в
присутствии различных концентраций Fe2+ в НАДФН- и аскорбат-за-
висимых системах переокисления. Параллельно сопоставляли процессы
ПОЛ в хроматине с аналогичными процессами в микросомах. Резуль-
таты этих экспериментов приведены на рис. 3, откуда следует, что при
отсутствии в среде инкубации ионов Fe2+ наблюдается фоновый уро-
вень НЗП и АЗП как в микросомах, так и во фракциях хроматина, од-
нако в микросомах он значительно выше. Вероятно, наличие определен-
ной величины ПОЛ при нулевом уровне экзогенного железа в среде
инкубации обусловлено присутствием эндогенного железа в микросо-
мах и во фракциях хроматина. При добавлении в среду инкубации
ионов Fe2+ в концентрации IOr-4 M отмечается максимальная величина
ПОЛ в микросомах, после чего с дальнейшим ростом концентрации
железа наблюдается резкое снижение уровня ПОЛ. В данном случае
оптимум концентрации Fe2+ для процессов ПОЛ в микросомах соответ-
ствует данным литературы /[11, 12]. Что касается влияния ионов Fe2+
на процессы ПОЛ во фракциях изолированного хроматина, то как в
случае PX, так и TAX происходит линейный рост НЗП и АЗП (более
резкий в случае АЗП) при увеличении концентрации Fe2+. Отсутствие
оптимума концентрации Fe2+, стимулирующей ПОЛ в хроматине, мо-
жет быть связано с повреждением ДНК в присутствии ионов железа
[16], с возможной последующей инициацией ПОЛ либо из продуктов
распада, либо высвобождением эндогенных липидов в результате по-
добного распада, ранее недоступных для перекисного окисления.
Известно, что ЭДТА связывает ионы двухвалентного железа, тем
самым подавляя порцессы ПОЛ в микросомах [11, 15]. В то же время
в некоторых случаях описаны комплексы ЭДТА с ионами железа, кото-
рые стимулируют ПОЛ в этом типе биомембран [17]. В табл. 6 пред-
ставлены результаты экспериментов по исследованию эффектов трех
концентраций ЭДТА (10~3,, IOr4 и 10~5 М) на скорость накопления
МДА во фракциях изолированного хроматина. В случае НЗП отсут-
Т а б л и ц а 4
Степень корреляции между изменениями
концентрации белка и количеством
образующегося малонового диальдегида
во фракциях хроматина печени
интактных крыс (п=68—81)
Показатель
PX п о л PX TAX
НЗП 0,2586 0,2153
НЗП, Δ 0,2574 0,0257
АЗП 0,3642 0,6749*
П р и м е ч а н и е . Приведены значения
коэффициента корреляции. Концентрации
белка колебались в пределах 0,099—
1,5 мг/мл реакционной смеси; количест-
во МДА в реакции 0,002—0,360 ОД535
нм.
38 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Jft δ 38
ствует сколько-нибудь заметное влияние как в PX, так и в TAX. Чув-
ствительный к нагреванию компонент НЗП, Δ практически полностью
подавляется при концентрации ЭДТА IO-3 M во фракции PX. Две дру-
гие концентрации оказывают слабый ингибирующий эффект. В TAX
ЭДТА, наоборот, вызывает зависимый от концентрации рост уровня
НЗП, Δ . Вероятно, это связано с принципиальным различием в меха-
Рис. 2. Скорость накопления МДА и его производных во фракциях хроматина печени
крыс при активации ПОЛ НАДФН и аскорбатом: а — НЗП; б — АЗП
Рис. 3. Влияние различных концентраций Fe2+ на скорость накопления МДА и его произ-
водных во фракциях хроматина и микросомах печени крыс: 1 — микросомы; 2 — PX;
3 — TAX (а — НЗП; б — АЗП)
низмах процессов НЗП в исследованных фракциях хроматина. В случае
АЗП наблюдается увеличение уровня переокисления как в PX, так и в
TAX с возрастанием концентрации ЭДТА, более выраженное в PX. Ве-
роятно, наличие ЭДТА наряду с ионами Fe2+, аскорбатом и субстратом
переокисления создает условия для возникновения комплексов ЭДТА
с ионами железа, являющимися мощными стимуляторами ПОЛ в
хроматине.
Таким образом, проведенные исследования позволили установить
определенную специфику порцессов ПОЛ во фракциях хроматина отно-
сительно аналогичных процессов в мембранах эндоплазматического
ретикулума. Аномальное поведение процессов ПОЛ в хроматине по
сравнению с биомембранами, по-видимому, связано с особым
устройством системы липопереокисления, существующей в компонен-
тах ядерного генома.
Известно, что липиды — основной субстрат переокисления в биоло-
гических объектах. При окислении их ненасыщенных жирнокислотных
остатков образуются перекиси, из которых на начальных этапах цепной
реакции формируются диеновые конъюгаты и другие промежуточные
продукты липопереокисления, а одним из конечных продуктов являются
МДА и его производные. Хроматин, в отличие от биомембран, содержит
относительно малое количество липидов и много белка. Кроме того, в
состав хроматина входят протяженные нити ДНК, определяющие его
структуру и функции. Все изложенное выше подтверждает специфич-
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Jft δ 39
ность процессов ПОЛ во фракциях хроматина. Для дальнейшего иссле-
дования процессов ПОЛ в хроматине были проведены эксперименты по
их моделированию во фракциях изолированного хроматина путем вклю-
чения в реакции ПОЛ коммерческих препаратов ДНК тимуса теленка,
БСА и искусственных смесей ДНК тимуса+БСА (отношение ДНК/бе-
л о к = ! ^ ) . При этом в препаратах фракций хроматина и модельных
системах определяли скорость накопления МДА в НАДФН- и аскор-
Т а б л и ц а 6
Влияние прооксидантов на скорость накопления малонового диальдегида во фракциях
изолированного хроматина печени интактных крыс (% от контроля, п—4)
Условия эксперимента PX TAX
Полная система (Fea+, пирофосфат натрия, аскорбиновая
кислота, хроматин)—контроль 100,0 100,0
Без пирофосфата натрия 54,7 54,8
Без аскорбиновой кислоты '17,8 5,7*
Без аскорбиновой кислоты и пирофосфата натрия 0 38,6*
П р и м е ч а н и е . Контрольные значения АЗП для PX: 387,9—507,0; для TAX: 54,9—
396,7 нмоль МДА/мг белка за 2 ч.
Т а б л и ц а 6
Влияние различных концентраций ЭДТА на скорость накопления малонового
диальдегида во фракциях изолированного хроматина печени интактных крыс
(% от контроля, п = 3)
Концентрация ЭДТА, M
Показатель
ПОЛ I O - 5 Ю - * I O - 4 10—5 Ю - * IO" 3
НЗП 105,3 86,3 85,8 133,3 98,1 104,8
НЗП, Δ 71,4 65,3 0* 114,0 153,3 200,4*
АЗП 162,3 411,2* 476,3* 134,3 '199,0 328,6*
П р и м е ч а н и е . * р < 0 , 0 5 (по сравнению с контролем); контрольные значения ПОЛ:
НЗП, P X - 702,7—1900,2; НЗП, TAX — 905,8—1262,1; НЗП, Δ, PX —Ί 12,2—572,4; НЗП,
A, TAX —41,8—110,1; АЗП, PX — 61,7—641,0; АЗП, TAX — 110,9—Ί 11,5 нмоль МДА/мг
белка за 2 ч.
бат-зависимых системах ПОЛ, а также содержание диеновых конъюга-
тов. Для установления роли липидного компонента в процессах пере-
окисления в хроматине осуществляли липидную экстракцию фракций
PX и TAX, а также искусственной смеси ДНК тимуса+белок. Скорость
накопления МДА регистрировали до и после липидной экстракции.
Результаты экспериментов представлены в табл. 7 и 8. Из приве-
денных данных видно, что ДНК, белок и искусственная смесь ДНК-f-
-f-БСА обладают первоначальным уровнем НЗП, сравнимым с таковым
во фракциях хроматина. Кроме того, из искусственной смеси экстраги-
руется определенное количество диеновых конъюгатов, правда, оно су-
щественно меньше, чем из препаратов PX и TAX. По всей вероятности,
этот факт может быть связан с наличием примесей в виде прочносвя-
занных липидов в коммерческих препаратах ДНК и белка. При этом
нельзя исключить и участия протяженных заряженных цепей биополи-
меров в процессах переноса зарядов при НЗП. Гипотезы подобного ро-
да высказывались также в ранних работах [18]. Однако следует обра-
тить внимание на то, что в данных коммерческих препаратах ДНК,
белка, а также в искусственных смесях ДНК+белок отсутствует чув-
ствительная к нагреванию составляющая НЗП, А (см. табл. 7), хотя
в других подобных препаратах она обнаруживается (см. табл. 8). Ве-
роятно, природу НЗП составляют как неидентифицированный фермент
40 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Jft δ 40
(или комплекс ферментов), так и структурное сочетание ДНК с бел-
ками, составляющее комплекс, участвующий в порцессах НЗП в ядер-
ном хроматине.
Экстракция липидов не приводит к существенному изменению ве-
личины НЗП в искусственной смеси Д Н К + Б С А и во фракциях хро-
матина (см. табл. 8). Одной из причин такого явления может быть на-
личие прочносвязанных липидов в этих модельных системах липопере-
окисления [19]. Однако липидная экстракция вызывает существенное
Т а б л и ц а 7
Моделирование переокисления различных субстратов в хроматине (п = 5)
МДА Диеновые конъюгаты
Субстрат переокисления
НЗП НЗП, Δ АЗП Гептановый
слой
Изоиропа-
нольный слой
ДНК тимуса — — — — —
теленка 1652,5 0* 5-10,2 — —
БСА 1050,0 0* 223,3* — —
ДНК тимуса те- 744,7* 0* 195,4* 9,6* 107,7*
ленка+БСА 738,6* 0* 200,5* 14,4 •161,6*
PX 1590,5 249,8 661,1 20,6 265,0
1918,4 295,9 795,5 24,7 318,0
TAX 581,3* 51,5* 935,1 19,3 175,0
4711,5* 407,2* 7410,7* 187,2* 1697,5*
П р и м е ч а н и е . Первая и вторая строка — нмоль на мг белка и ДНК за 2 ч соот-
ветственно.
Т а б л и ц а θ
Влияние липидной экстракции на степень переокисления фракций хроматина
и искусственной смеси ДНК + БСА (п = 5)
Без экстракции Экстракция
Субстрат
переокисления НЗП НЗП, Δ АЗП НЗП НЗП, Δ АЗП
Д Н К + Б С А 1261,0 217,6* 300,5 2029,7 (161) 46,3* (21,3) 105,6 (35,0)
1635,2 372,2* 251,0* '1068,9 (65) 176,9* (48) 191,7 (76)
PX 1494,2 87,2 298,1 1178,8 (79) 0 ( 0 ) 149,0 (50)
1515,6 118,7 477,1 892,0 (59) 0 (0) 168(2) (35)
TAX 1212,4 151,5 759,5* 971,3 (80) 16,2* ( И ) 132,6 (20)
7682,2* 844,1* 5306,8* 6875,5* (90) '191,4* (23) 638,0* (12)
П р и м е ч а н и е . Цифры в скобках — доля ПОЛ (%) от контроля; первая и вторая
строка — нмоль МДА на мг белка и ДНК за 2 ч соответственно.
снижение величины НЗП, Δ в смеси ДНК+белок и во фракциях хро-
матина, особенно резко выраженное во фракции PX. Эти данные поз-
воляют предположить определяющее влияние липидного компонента
хроматина на формирование величины чувствительного к нагреванию
компонента НЗП. Кроме того, они показывают различие в молекуляр-
ных механизмах, формирующих процессы ПОЛ в исследуемых фрак-
циях хроматина. Что касается АЗП, то липидная экстракция приводит
к существенному снижению этого показателя во всех исследован-
ных системах ПОЛ, причем наибольшее снижение наблюдается во
фракции TAX.
Таким образом, представленные данные позволяют сделать вывод
о решающем значении липидного компонента хроматина в процессах
АЗП и чувствительных к нагреванию процессах НЗП. При этом они
дают возможность предположить участие протяженных нуклеосомных
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Jft δ 4 1
группировок хроматина в порцессах переноса зарядов, происходящих
при НЗП, и подтверждают различия в действии механизмов ПОЛ в
в исследуемых фракциях хроматина.
В данной работе изложены результаты экспериментов, свидетель-
ствующие о возможности протекания процессов ПОЛ во фракциях PX
и TAX и впервые приведена характеристика этих процессов. По неко-
торым показателям (индукция ПОЛ при добавлении в среду инкубации
прооксидантов — ионов Fe2+, пирофосфата натрия, аскорбата,
НАДФН) процессы ПОЛ во фракциях хроматина сходны с аналогич-
ными процессами в классическом объекте изучения ПОЛ — микросо-
мах. Прежде всего это касается природы образующихся продуктов
ПОЛ. Однако по целому ряду признаков эти процессы существенно
различаются. В первую очередь, это относится к уровню ПОЛ: он на-
много ниже в хроматине по сравнению с микросомами. Накопление
МДА и его производных во времени также происходит медленнее в хро-
матине. Уровни НЗП и АЗП в микросомах заметно не отличаются, в
то время как в хроматине интенсивность НЗП гораздо выше, чем АЗП.
При этом НЗП, Δ составляет основную долю НЗП в микросомах, в
хроматине же она существенно ниже. Различие в уровне ПОЛ в хро-
матине и микросомах особенно резко выражено при индукции ПОЛ
прооксидантами. В микросомах существует четко обозначенный опти-
мум концентрации Fe2+, при котором наблюдается максимум индукции
ПОЛ. В хроматине уровень ПОЛ линейно возрастает с увеличением
концентрации этих ионов в среде инкубации. Добавление ЭДТА к изо-
лированным микросомам приводит к ингибированию процессов ПОЛ.
В хроматине же, наоборот, это соединение вызывает стимуляцию не-
которых реакций липопереокисления.
Возможно, различие между процессами ПОЛ в микросомах и хро-
матине обусловлено присутствием специфических структурных элемен-
тов (ДНК, РНК) и особенностями структурной упаковки хроматина
(нуклеосомный уровень организации). Вполне вероятно, что липидный
компонент в хроматине, являющийся субстратом ПОЛ, структурно ор-
ганизован иначе по сравнению с микросомами. В самом хроматине
реакции ПОЛ различаются в зависимости от структурно-функциональ-
ной организации последнего. В TAX, где уровень транскрипционной
активности выше, чем в PX, их интенсивность также несколько выше
(в особенности в пересчете на единицу ДНК). Этот факт имеет важное
значение для дифференциальной чувствительности фракций хромати-
на к действию повреждающих агентов [5—7]. Отличие процессов ПОЛ
во фракциях хроматина, различающихся по уровню транскрипционной
активности, по целому ряду других характеристик позволяет предпо-
ложить их неодинаковую защищенность по отношению к эндогенным
свободным радикалам, которые накапливаются в хорматине при его
повреждении. В пользу этого предположения свидетельствуют данные,
показывающие связь между интенсивностью процессов ПОЛ во фракциях
хроматина и их эндогенной ДНК-полимеразной активностью, где уста-
новлено ее снижение при активации ПОЛ [20].
Р е з ю м е . Показано здатність до переокислення ліпідів, що входять до складу
фракцій транскрипційно активного та репресованого хроматину печінки інтактних щу-
рів. За рядом ознак (відношення до індукторів та інгібіторів, кінетика накопичення у
часі кінцевих продуктів) процеси ліпопереокислення у хроматині відрізняються від таких,
що відбуваються у мембранах ендоплазматичного ретикулуму печінки. Процеси ліпопе
реокислення лабільніші та проходять з більшою інтенсивністю в активній фракції хро-
матину, що може мати вирішальне значення у механізмах пошкодження ядерної ДНК.
Якщо аскорбат-залежне переокислення відбувається за участю виключно ліпідів хро-
матину, то значна частка НАДФН-залежного переокислення, що залишається після лі-
підної екстракції, дозволяє припустити участь в останньому процесі подовжених моле-
кул нуклеїнових кислот та білків. Перекисне окислення ліпідів у хроматині розглядаєть-
ся як один з головних механізмів пошкодження ядерного генетичного апарату клітини.
42 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Jft δ 42
S u m m a r y . Ability for peroxidation of lipids of transcriptionally and repressed
chromatin fractions of intact rat livers was shown. According to some features (the re-
lation to inductors and inhibitors, the time's kinetics of the terminal products accumula-
tion) chromatin's lipids peroxidation processes distinguish from ones in the liver endo-
plasmatic reticulum membranes. The lipid peroxidation processes are more labiled and
intensived in the active chromatin fraction. This may be important for the nuclear DNA
damage mechanisms. The ascorbate-dependent lipid peroxidation processes are determined
only by the chromatin lipids just as NADPH-dependent ones are related to stretched
nucleic acids and proteins molecules. This suggestion is proved by the fact of the rather
considerable resting of NADPH-dependent lipid peroxidation after lipid extraction in the
chromatin. The chromatin lipid peroxidation processes are considered as important mecha-
nism of the nuclear genetic apparatus damages.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Казначеев Ю. С., Кулагина Т. П., Маркевич Л. Η. и др. О метаболизме липидов
хроматина печени и тимуса крыс//Молекуляр. биология.— 1984.— 18, № 3·.—
С. 607—612.
2. Казначеев Ю. С., Коломийцева И. К., Кулагина Т. П. и др. Обновление хроматин
связанных и мембранных липидов печени и тимуса γ-облученных крыс // Биохимия.—
Ю84.—49, No 12.—С. 2008—2011.
3. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Гольдштейн Н. Б. и др. Перекисное окисление ли-
пидов фракций хроматина печени крыс // Докл. АН УССР. Сер. Б.— 1989.— № 2.—
С. 70—72.
4. Губский Ю. #.. Левицкий Е. Л., Чабанный В. Н. и др. Перекисное окисление липи-
дов и параметры термоденатурации фракций хроматина печени крыс//Укр. биохим
журн.— 1990.— 62, No. 2 С . 76—82.
5. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Гольдштейн Н. Б. и др. Функциональная актив-
ность фракционированного хроматина печени крыс при однократном введении тет-
рахлорметана // Вопр. мед. химии.— 1989.— 35, № 4.— С. 119—124.
6. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Гольдштейн Н. Б. и др. ДНК- и РНК-полимераз-
ные активности фракций хроматина печени крыс при химическом повреждении мем-
бран гепатоцитов//Докл. АН УССР. Сер. Б.— 1988 — № 3,—С. 75—77.
7. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Примак Р. Г. и др. Изменение структуры и реак-
ций переокисления хроматина печени под влиянием 0,0-диметил-0-2,2-дихлорвинил-
фосфата // Укр. биохим. журн.— 1992.— 64, № 5 — С. 89—91.
8. Губский Ю И., Левицкий Е. Л., Примак Р. Г. и др. Конформационные характери-
стики и упаковка эндогенных липидов фракций транскрипционно активного и ре-
прессированного хроматина // Там же.— 1991.— 63, № 2.— С. 83—8Θ.
9. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Примак Р. Г. Изменение структурного состояния
фракционированного хроматина печени при активации перекисного окисления липи-
дов // Биополимеры и клетка.— 1991.— 7, № 3.— С. 89—94.
10. Ашмарин И. П.. Васильев Н. П., Амбросов В. А. Быстрые методы статистической
обработки и планирование экспериментов.— Л. : Изд-во ЛГУ, 1975.— 78 с.
11. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических
мембранах.— М. : Наука, 1972.— 252 с.
12. Губский Ю. И. Регуляция перекисного окисления липидов в биологических мембра-
нах // Биохимия животных и человека.— Киев : Наук, думка, 1978.— Т. 2.— С. 72—84.
13. Гольдштейн Б. И. Клеточный митоз и регуляция биосинтеза ДНК в клетке // Вопр.
биосинтеза», структуры и функций биополимеров.— Киев : Наук, думка, 1967.—
С. 84—105.
14. Гольдштейн Б. И., Герасимова В. В., Рудь С. Г. и др. О денатурации и фрагмента-
ции дезоксирибонуклеиновой кислоты в клетках с интенсивной митотической актив-
ностью в зависимости от возраста//Механизмы старения.— Киев : Медгиз, 1963.—
С. 31—42.
15. Губский Ю. И. Коррекция химического поражения печени.— Киев: Здоров'я, 1989.—
168 с.
16. Shires Т. К. Iron-induced DNA damage and synthesis in isolated rat liver nuclei //
Biochem. J.— 1982.—205, N 2.—P. 321—329.
17. Tien M., Morehouse Μ. A., Bucher J. K et at. The multiple effects of ethylenediamine
tetraacetate in several models lipid peroxidation systems // Arch. Biochem. and Bio-
phys.—1982.—218, N 2.—P. 450—458.
18. Гайцхоки В. С., Киселев О. И., Кузьмина С. И. и др. О цепи переноса электронов в
изолированных ядрах и в ядерных оболочках печени крысы//Биохимия.— 1973.—
38, No 5.— С. 909—914.
19. Збарский И. Б. Организация клеточного ядра.— М. : Медицина, 1988.— 368 с.
20. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Гольдштейн Н. Б. и др. Перекисное окисление ли-
пидов и эндогенная ДНК-полимеразная активность фракций изолированного хро-
матина печени крыс//Бюл. эксперим. биологии и медицины.— 198Θ.— 57, № 3.—
С. 296—298.
Укр. НИИ фармакологии и токсикологии Получено 12.03.93
МЗ Украины, Киев
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Jft δ 43
|