Способы защиты ДНК цианофага LPP-3 oт систем рестрикции – модификации цианобактерии Plectonema boryanum
Для проверки наличия модифицированных оснований в ДНК цианофага LPP-3 и цианобактерии P. boryanum использовали метод HPLC с помощью установки «System GOLD». Анализ профиля элюции гидролизатов позволил идентифицировать, кроме канонических оснований присутствие в ДНК P. boryanum 5-метилцитозина в конц...
Gespeichert in:
| Datum: | 1993 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1993
|
| Schriftenreihe: | Биополимеры и клетка |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156250 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Способы защиты ДНК цианофага LPP-3 oт систем рестрикции – модификации цианобактерии Plectonema boryanum / М.И. Менджул, С.А. Сырчин, А.А. Аверкиев, Б.А. Ребентиш // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 5. — С. 54-61. — Бібліогр.: 26 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-156250 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1562502019-06-19T01:31:22Z Способы защиты ДНК цианофага LPP-3 oт систем рестрикции – модификации цианобактерии Plectonema boryanum Менджул, М.И. Сырчин, С.А. Аверкиев, А.А. Ребентиш, Б.А. Структура и функции биополимеров Для проверки наличия модифицированных оснований в ДНК цианофага LPP-3 и цианобактерии P. boryanum использовали метод HPLC с помощью установки «System GOLD». Анализ профиля элюции гидролизатов позволил идентифицировать, кроме канонических оснований присутствие в ДНК P. boryanum 5-метилцитозина в концентрации 1,2 % и N-6-метиладенина — 4 5 %. ДНК LPP-3 содержит 0,8% 5-метилцитозина и не включает N-6-метиладенина. 5-Метилцитозин удалось обнаружить только модифицированным методом гидролиза, ДНК фтористоводородной кислотой. Для выявления сайтспецифического метилирования ДНК цианофага LPP-3 и ДНК P. boryanum подвергали ферментативному гидролизу рестриктазами-изошизомерами, по-разному реагирующими на метилирование остатков цитозина и аденина в сайтах узнавания. Установлено метилирование по аденину в GАТС-последовательностях ДНК P. boryanum и по второму иитозину CC(AIT )G G-последовательностей как в ДНК P. boryanum, так и в ДНК LPP-3. Делается вывод о наличии у P. boryanum систем рестрикции – модификации dam- и dcmІ -подобного типа. Защита вирусного генома от систем рестрикции-модификации хозяина осуществляется метилированием последовательности CmC(A/T)GG и контрселекцией по сайту BamHI. По данным, рестрикционного анализа, контр се лекции, очевидно, подвержена и последовательность GG(CIG)CC. Для перевірки наявності модифікованих основ у ДНК ціанофага LPP-3 і ціанобактерії P. boryanum використано метод HPLC за допомогою установки "System GOLD". Аналіз профілю елюції гідролізатів дозволив ідентифікувати, окрім канонічних основ, присутність у ДНК P. boryanum 5-мєтилцитозипу в концентрації 1,2% та N-6-метиладеніну – 4,5 %. ДНК LPP-3 містить 0,8% 5-метилцитозину і не включає N-6-метиладеніну. 5-Метилцитозии вдалося виявити лише модифікованим методом гідролізу ДНК фтористоводневою кислотою. Для виявлення сайтспсцифічпого метилювання ДНК ціанофага LPP-3 і ДНК P. boryanum піддавали ферментативному гідролізу рестриктазами-ізошизомерами, по-різному реагуючими на метилювання залишків цитозину і аденіну в сайтах пізнавання. Встановленно метилювання по аденіну в GATC-послідовностях ДНК P. boryanum та по другому цитозину GC (А/Т) GG-послідовностей як у ДНК P. boryanum, так і в ДНК LPP-3. Зроблено висновок про наявність у P. boryanum систем рестрикції – модифікації dam- і dcml-подібного типу. Захист вірусного генома від систем рестрикції – модифікації хазяїна здійснюється метилюванпям послідовності CmC (А/Т) GG і контрселекцією за сайтом BamHI. Коптрселекції, скоріш за все, піддається і послідовність GG(C/G)CC, що підтверджується даними рестрикційного аналізу. HPLC method was used to study some peculiarities of cyanobacterium Plecloneina boryanum and cyanophage LPP-3 DNA composition. The elution profile analysis of the products of DNA acid hydrolysis enable to identify in DNA P. boryanum apart of canonical bases the presence of 4.5 % N-6-melhyladenine and 1.2 % 5-methyl-cytosine, DNA LPP-3 have 0,8 % 5-methyIcytosine and no N-6-methyladenine. The presence of 5-methylcytosine was detected only due to the application of the modified hydrolysis method HF. The restriction endonucleases-isoshisomers, DNA hydrolysis of which depend on presence of methylated bases in the recognition sites, were used to detect site-specific methylation. The comparison of the products of the DNA LPP-3 and P. boryanum fermentative hydrolysis by Mspl and Hpall; Sau3A, Mbol and Dpnl; Apyl and Mval restrictases enable to determined that DNA LPP-3 and P. boryanum has a high methylation degree of the inner cytosine in the CC(A/T)GG site and P. boryanum on the adenine in the GATC site; CCGG site wasn't methylated in both DNA. Proceeding from the data obtained a conclusion can be drown on the presence of dam- and dcml-like restriction–modification systems in P. boryanum. Defence of viral DNA against host R-M systems occur by cytosine methylation in sequence CmC(A/T)GG and counter-selection BamHI sites. 1993 Article Способы защиты ДНК цианофага LPP-3 oт систем рестрикции – модификации цианобактерии Plectonema boryanum / М.И. Менджул, С.А. Сырчин, А.А. Аверкиев, Б.А. Ребентиш // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 5. — С. 54-61. — Бібліогр.: 26 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000372 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156250 578.2.81 1:577.113 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров |
| spellingShingle |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Менджул, М.И. Сырчин, С.А. Аверкиев, А.А. Ребентиш, Б.А. Способы защиты ДНК цианофага LPP-3 oт систем рестрикции – модификации цианобактерии Plectonema boryanum Биополимеры и клетка |
| description |
Для проверки наличия модифицированных оснований в ДНК цианофага LPP-3 и цианобактерии P. boryanum использовали метод HPLC с помощью установки «System GOLD». Анализ профиля элюции гидролизатов позволил идентифицировать, кроме канонических оснований присутствие в ДНК P. boryanum 5-метилцитозина в концентрации 1,2 % и N-6-метиладенина — 4 5 %. ДНК LPP-3 содержит 0,8% 5-метилцитозина и не включает N-6-метиладенина. 5-Метилцитозин удалось обнаружить только модифицированным методом гидролиза, ДНК фтористоводородной кислотой. Для выявления сайтспецифического метилирования ДНК цианофага LPP-3 и ДНК P. boryanum подвергали ферментативному гидролизу рестриктазами-изошизомерами, по-разному реагирующими на метилирование остатков цитозина и аденина в сайтах узнавания. Установлено метилирование по аденину в GАТС-последовательностях ДНК P. boryanum и по второму иитозину CC(AIT )G G-последовательностей как в ДНК P. boryanum, так и в ДНК LPP-3. Делается вывод о наличии у P. boryanum систем рестрикции – модификации dam- и dcmІ -подобного типа. Защита вирусного генома от систем рестрикции-модификации хозяина осуществляется метилированием последовательности CmC(A/T)GG и контрселекцией по сайту BamHI. По данным, рестрикционного анализа, контр се лекции, очевидно, подвержена и последовательность GG(CIG)CC. |
| format |
Article |
| author |
Менджул, М.И. Сырчин, С.А. Аверкиев, А.А. Ребентиш, Б.А. |
| author_facet |
Менджул, М.И. Сырчин, С.А. Аверкиев, А.А. Ребентиш, Б.А. |
| author_sort |
Менджул, М.И. |
| title |
Способы защиты ДНК цианофага LPP-3 oт систем рестрикции – модификации цианобактерии Plectonema boryanum |
| title_short |
Способы защиты ДНК цианофага LPP-3 oт систем рестрикции – модификации цианобактерии Plectonema boryanum |
| title_full |
Способы защиты ДНК цианофага LPP-3 oт систем рестрикции – модификации цианобактерии Plectonema boryanum |
| title_fullStr |
Способы защиты ДНК цианофага LPP-3 oт систем рестрикции – модификации цианобактерии Plectonema boryanum |
| title_full_unstemmed |
Способы защиты ДНК цианофага LPP-3 oт систем рестрикции – модификации цианобактерии Plectonema boryanum |
| title_sort |
способы защиты днк цианофага lpp-3 oт систем рестрикции – модификации цианобактерии plectonema boryanum |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1993 |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156250 |
| citation_txt |
Способы защиты ДНК цианофага LPP-3 oт систем рестрикции – модификации цианобактерии Plectonema boryanum / М.И. Менджул, С.А. Сырчин, А.А. Аверкиев, Б.А. Ребентиш // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 5. — С. 54-61. — Бібліогр.: 26 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT mendžulmi sposobyzaŝitydnkcianofagalpp3otsistemrestrikciimodifikaciicianobakteriiplectonemaboryanum AT syrčinsa sposobyzaŝitydnkcianofagalpp3otsistemrestrikciimodifikaciicianobakteriiplectonemaboryanum AT averkievaa sposobyzaŝitydnkcianofagalpp3otsistemrestrikciimodifikaciicianobakteriiplectonemaboryanum AT rebentišba sposobyzaŝitydnkcianofagalpp3otsistemrestrikciimodifikaciicianobakteriiplectonemaboryanum |
| first_indexed |
2025-07-14T08:42:35Z |
| last_indexed |
2025-07-14T08:42:35Z |
| _version_ |
1837611148925468672 |
| fulltext |
3. Бондаренко Л. Б., Яхимович Р. И., Гогоман И. В., Бауман В. К. Влияние Зр-фторви-
т а м и н a D 3 и Ι α -25 -диоксивитамнна D3 на аминокислотный состав коллагена к о ж и
ц ы п л я т / / Д о к л . А Н Украины,— 1 9 9 2 , — № 3 . — С . 122—127.
4. Trelslad R. L., Calanese V. MRubin D. Т. Col lagen fract ionation-separation of native
tvpcs I, I I , a n d I I I b y d i f f e r e n t i a l p r e c i p i t a t i o n / / A n a l . B i o c h e m — j976 — 71, N 1
P. 114—118.
5. Троицкий Г. В., Ажицкий Б. Ю. Изоэлектрическое ф о к у с и р о в а н и е белков в самоорга -
низующихся и искусственных рН-градиентах .— Киев : Наук , д у м к а , 1984.— 215 с.
6. Органическая электрохимия / П о д ред. M Бейзера , X. Л у н д а . — М. : Химия, 1988.—
Т. 1 — 469 с.
7. Бондаренко JI. БЯхимович Р. ИБауман В. К. Влияние Ι α - о к с и в и т а м и н а D3 и
24 ,25-диоксивитамина D3 на к о л л а г е н ы кости, к о ж и и х р я щ а ц ы п л я т // Биополиме-
ры и клетка ,— 1992,— 8, М> 5 , — С . 38—43.
Ин-т биоорг. химии и нефтехимии Получено 09.10.92
АН Украины, Киев
УДК 578.2.81 1:577.113
М. И. Менджул, С. А. Сырчин, А. А. Аверкиев, Б. А. Ребентиш
СПОСОБЫ ЗАЩИТЫ ДНК ЦИАНОФАГА LPP-3
от С И С Т Е М РЕСТРИКЦИИ — МОДИФИКАЦИИ
ЦИАНОБАКТЕРИИ PLECTONEMA BORYANUM
Для проверки наличия модифицированных оснований в ДНК цианофага LPP-S и циа-
нобиктерии P. boryanum использовали метод HPLC с помощью установки «Syslem
GOLD». Анализ профиля элюции гидролизатов позволил идентифицировать, кроме кано-
нических оснований присутствие в ДНК P. boryanum 5-метилцитозина в концентрации
1,2 % и N-6-метиладенина — 4 5 %. ДНК LPP-3 содержит GS0Io 5-метилцитозина и не
включает N-6-метиладенина. 5-Метіілцитозин удалось обнаружить только модифициро-
ванным методом гидролиза, ДНК фтористоводородной кислотой. Для выявления сайтспе-
цифического метилирования ДНК цианофага LPP-3 и ДНК P. boryanum подвергали
ферментативному гидролизу ρестриктазами-изошизомерами, по-разному реагирующими
на метилирование остатков цитозина и аденина в сайтах узнавания. Установлено ме-
тилирование по аденину в GАТС-последовательностях ДНК P. boryanum и по второму
иитозину CC(AIT )G G-последовательностей как в ДНК P- boryanum, так и в ДНК LPP-3.
Делается вывод о наличии у P. boryanum систем рестрикции — модификации dam- и
dcm !-подобного типа. Защита вирусного генома от систем рестрикции—модификации
хозяина осуществляется метилированием последовательности CmC(AIT)GG и контрсг-
лекцией по сайту BamHI. По данным рестрикционного анализа, контрселекции, оче-
видно, подвержена и последовательность GG(CIG)CC.
Введение. LPP-3 — цианофаг, инфицирующий нитчатую циаиобакте-
рию P. boryanum, является перспективным объектом для изучения про-
цессов регуляции вирусной инфекции у фототрофных прокариот.
Ранее нами показано, что Д Н К цианофага LPP-3 устойчива к дей-
ствию многих эндонуклеаз рестрикции с гексапалиндромными нуклео-
тидными сайтами узнавания . Кроме того, количество экспериментально
наблюдаемых сайтов рестрикции для некоторых пента- и тетраиалип-
дромных рестриктаз значительно отличается от теоретически ожидае-
мого для такого типа Д Н К [6]. Возможными причинами подобного яв-
ления могут быть метилирование генома цианофага LPP-3 либо элими-
нация потенциально «опасных» сайтов. Метилирование Д Н К — наибо-
лее распространенный способ защиты вирусного генома от систем рес-
трикции—-модификации прокариотических хозяев [18]. Ч а щ е всего ме-
тилированные основания присутствуют в Д Н К в виде 5-метилцитозина
и N-6-метиладенина и являются продуктами пострепликативпого мети-
лирования . П о м и м о этого, появляется все больше данных о другом спо-
собе защиты вирусной Д Н К — контрселекции сайтов узнавания рестрик-
таз и метилаз хозяина. Такой процесс проходит, вероятнее всего, за
счет трапсверсин либо транзиций оснований в «опасных» для вируса
© М. И. Менджул, С. А. Сырчин, А. А. Аверкиев, Б. А. Ребентиш, 1993
54 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. N° 5 54
последовательностях. В связи с этим интерес представляли исследова-
ния по выявлению метилированных оснований в Д Н К циапофага
LPP-3 и цианобактерии P. boryanum, а также специфичности их мети-
лирования для анализа систем рестрикции — модификации у P. borya-
num и способах защиты от них Д Н К циапофага LPP-3.
Материалы и методы. Объектами исследования служили цианофаг
LPP-3 [8, 9] и его хозяин — циаиобактерия P. boryanum Gom. GALUf
пггамм 465 (Ипдиан. ун-т, США).
Биомассу цианобактерии P. boryanum получали по методикам [7].
Д Н К цианобактерии P. boryanum выделяли по методу \[10] с некото-
рыми модификациями. Клетки собирали на фильтрах с диаметром пор
0,45 мкм, литическая смесь содержала 5—8 мг лизоцима («Serva», Гер-
мания) на 1 мл культуры с концентрацией 5-Ю 8 клеток в 1 мл. В каче-
стве детергента использовали N-лаурилсаркозин («Serva») в конечной
концентрации 2 %. Образование сферопластов контролировали под све-
товым микроскопом. Д Н К экстрагировали дважды фенолом с после-
дующей очисткой водной фазы эфиром. Затем ее осаждали двумя
объемами абсолютного этанола при —20'°С, после чего дважды промы-
вали 7С %-м этиловым спиртом и растворяли в ТЕ-буфере.
Вирусный лизат циапофага LPP-3 получали по ранее описанным
методикам [5]; Д Н К цианофага LPP-3—фенольно-детергентным ме-
тодом [4].
Химический гидролиз Д Н К НСЮ4 осуществляли по методу [1].
Д л я гидролиза Д Н К фтористоводородной кислотой использовали
модифицированный метод [13] (33 %-я HF, 80 °С в течение 2 ч).
ВЭЖХ гидролизатов проводили по модифицированному методу
[22] ; разделение продуктов химического гидролиза исследуемых Д Н К
и стандартных оснований — па хроматографической системе H P L C
«System GOLD» фирмы « В е с к т а п » (США), применяя колонку С-18
RPC с мобильной фазой 25 мМ KH 2PO 4 — изоиропаиол. В качестве
стандардоз применяли синтезированные основания HPLC-чистоты.
Идентификацию пиков и расчеты концентраций осуществляли с
помощью компьютерной программы, входящей в «System GOLD»
[25, 26].
Д л я ферментативного гидролиза Д Н К использовали эндопуклеазы
рестрикции Н П О «БИОТЕХ» (Россия), фирм «Pharmac ia» (Швеция)
и «Sigma» (США). Д Н К гидролизовали в буферных смесях, рекомен-
дованных фирмой-изготовителем.
Электрофорез продуктов ферментативного гидролиза проводили в
1 %-й агарозе, а также в 5 %-м и 8 %-м ПААГ по [4].
Бесклеточпые экстракты получали ранее описанным методом ульт-
развуковой дезинтеграции [3] с последующим ультрацентрифугирова-
нием при 108 000' g в течение 2 ч.
Метилазпую активность частично очищенных экстрактов P. borya-
num определяли по методу [15], используя в качестве донора металь-
ных групп 5-аденозил- і - (метил- 3 Н)метионин «Amersham» (Англия)
(555 ГБк/'ммоль). Кислотосодержащий буфер с S-аденозилметиопииом
нейтрализовали добавлением равного объема 200 мМ трис- НСІ-буфе-
ра, рН 8,7. Реакционная смесь содержала 185 кБк 5-аденозилметиопи-
па па 20 мкг Д Н К . Время инкубации составляло 3 ч при 37 °С. Актив-
ность проб измеряли па сциптилляциопном счетчике « В е с к т а п » LS
7800 (фильтры GF/C, «Whatman») .
Результаты и обсуждение. Ранее разработанные методы выявления
модифицированных оснований Д Н К с помощью тонкослойной хромато-
графии хорошо зарекомендовали себя для объектов с относительно вы-
соким их содержанием [2, 12]. Поэтому мы использовали наиболее
чувствительный метод обнаружения и идентификации модифицирован-
ных основании в Д Н К — В Э Ж Х продуктов химического гидролиза.
Стандартный метод гидролиза клеточной и вирионной Д Н К , проведен-
ного с помощью хлорной кислоты, не позволил нам идентифицировать
в пей 5-метилцитозии. Последнее может быть связано с процессами де-
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. N° 5 55
заминирования, что заставляет исследователей искать другие способы
гидролиза Д Н К . Среди них можно назвать ферментативный гидролиз
Д Н К [17] и химический гидролиз с помощью фтористоводородной
кислоты [13]. Нами был выбран метод химического гидролиза
Д Н К HF. г п п о
Хроматография продуктов гидролиза Д Н К P- boryanum и LPP-3
представлена на рис. 1. Анализ профиля элюции гидролизатов позво-
лил идентифицировать, кроме канонических оснований, присутствие
Рис. 1. Хроматография смеси стан-
дартных оснований (а)у а также про-
дуктов химического гидролиза HF
Д Н К LPP-3 (б) и Д Н К P. boryanum
(в)
в Д Н К P- boryanum 5-метилцитозина в концентрации 1,2 % и N-6-ме-
тиладенина — 4 , 5 % . Д Н К LPP-3 содержит 0 , 8 % 5-метилцитозина и
не включает N-6-метиладенина.
Д л я обнаружения сайтспецифического метилирования Д Н К циано-
фага LPP-3 и Д Н К P- boryanum подвергали ферментативному гидро-
лизу рестриктазами-изошизомерами, узнающими одинаковые палиндром-
ные последовательности, но по-разному реагирующими на метилирова-
ние остатков цитозина и аденина в этих последовательностях. Разли-
чия, наблюдаемые в электрофоретических профилях продуктов гидро-
л и з а Д Н К такими рестриктазами, являются тестом на наличие мети-
лированных оснований. Эндонуклеазы рестрикции MspI и HpaII исполь-
зуются для выявления метилированного цитозина в сайте- CCGG. HpaII
не гидролизует ни mCCGG-, ни CmCGG-последовательностей, в то вре-
мя как MspI чувствительна только к метилированию 5'-концевого ци-
тозина и расщепляет CmCGG, но не mCCGG. Характер электрофорети-
ческого распределения продуктов ферментативного гидролиза рестрик-
тазами MspI и HpaII свидетельствуют об отсутствии метилирования
Д Н К циапофага LPP-3 и цианобактерии P. boryanum по внутреннему
цитозину в сайте CCGG.
П а р а рестриктаз MvaI и ApyI узнает на Д Н К один и тот ж е с а ! т
CC (А/Т)GG. Рестриктаза MvaI гидролизует Д Н К по этому сайту неза-
висимо от наличия в нем 5-метилцитозина, а рестриктаза ApyI — толь-
ко в случае метилирования цитозина во втором положении и отсутствия
метилирования в первом. Как видно из рис. 2, распределение продуктов
гидролиза Д Н К цианофага LPP-3, полученных под действием этих нук-
леаз , практически идентично. То ж е самое отмечается и в случае про-
дуктов рестрикции Д Н К P. boryanum. Эти данные свидетельствуют
о том, что практически во всех CC(A/T)GG-caf tTax Д Н К циано-
фага LPP-3 и Д Н К P. boryanum цитозин во втором положении ме-
тилирован.
56 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. N° 5 56
Д л я определения метилированного аденина использовали нуклеа-
зы Sau3A, MboI и DpnI1 узнающие последовательность GATC. Sau3A
расщепляет Д Н К в этой последовательности вне зависимости от нали-
чия в ней метилированного аденина, но не гидролизует сайт, содержа-
щий метилированный цитозин, а рестриктаза MboI — только неметили-
рованные по остаткам аденина GATC-сайты независимо от присутствия
в них метилированного цитозина. Рестриктаза DpnI разрезает Д Н К
исключительно в GmATC-
последовательности.
Из рис. 3 видно, что
Д Н К P. boryanum в оди-
наковой степени гидроли-
зуется рестриктазами
Sau3A и DpnIy но не под-
вержена рестрикции
MboI. Эти данные под-
тверждаются тем, что
практически все GATC-
сайты, содержащиеся в
Д Н К P- boryanum, мети-
лированы по аденину.
Иную картину рестрик-
ции можно наблюдать
для Д Н К цианофагов
LPP-3. Так, эндонуклеа-
зы Sau3A и MboI образо-
вывали совершенно иден-
тичные рестрикты, в то
Рис. 2. Исследование сайтспе
цифического метилирования ци-
тозина Д Н К LPP-3 и P. borya-
num: 1 — маркер pBR322 /
BstNI; 2 — Д Н К P. boryanum,
3—5 — Д Н К P. boryanum, гид-
ролизованная ApyI (5), MvaI
(4), BclI (5); 6 — Д Н К LPP-3;
7~9 — Д Н К LPP-3, гидролиза-
ванная ApyI (7), MvaI (8).
BciI (9)
время как рестриктаза DpnI не гидролизовала вирусную Д Н К , что
свидетельствует об отсутствии метилирования аденина в GATC-сайтах.
Из сравнения количества метилированных CmC (А/Т) GG-сайтов
рестриктазы ApyI и общего количества 5- метилцитозина в исследован-
ных Д Н К следует, что почти весь метилированный цитозин сосредото-
чен в этих сайтах. Это предположение подтверждает близкое к теоре-
тически ожидаемому количество сайтов рестрикции у Д Н К LPP-3 и
P. boryanum для эндонуклеаз, чувствительных к метилированию цито-
зина в сайтах узнавания,— AluI, BbvIf Sau3A и HpaIL Особо следует
отметить сильное отклонение количества сайтов рестрикции для эндо-
нуклеаз HaeIIIf Cfrl31 и Avail от их теоретически ожидаемого числа.
Так, при 53 %-м содержании GC-nap в Д Н К LPP-3 вероятность встре-
чаемости GGCC-сайта равна примерно 200, то же количество можно
было бы ожидать и для GGNCC. Однако реально мы наблюдаем 1 и
7 сайтов соответственно. Если бы ингибирование рестрикции было свя-
зано с метилированием сайтов узнавания для этих рестриктаз, то коли-
чество 5-метилцитозина в этом случае должно было бы быть в 3—
5 раз выше экспериментально обнаруженного.
Идентичность рестриктов, полученных после гидролиза Д Н К
LPP-3 нуклеазами CfrI31 и AvaIIf свидетельствует, согласно общепри-
нятым методам определения специфичности рестриктаз, о том, что
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. N° 5 5 7
CfrlSl гидролизует Д Н К LPP-3 по сайтам Avail. Следовательно, сай-
ты GG(C/ 'G)CC должны быть либо метилированы по последнему цито-
зину, либо подвергнуты контрселекции. В случае метилирования
GG (C/G) СС-сайт должен существовать в виде GG (C/G) Cm (СА/Т) GG,
т. е. перекрываться ApyI-сайтом. Однако данная последовательность
содержит GGCC-сайт HaeIIIy который не ингибируется метилирова-
нием. К тому же методом двойных переваров нам удалось установить,
что уникальный сайт HaeIII является частью последовательности
Рис. 3. И с с л е д о в а н и е сайтспецифического м е т и л и р о в а н и я аденина и
Д Н К LPP-3 и P. boryanum: 1 — м а р к е р pBR322IHaeIII; 2, 3 — Д Н К
LPP-3, г и д р о л и з о в а н н а я Sau3A и DpnI соответственно; 4, 5 — Д Н К
Р. Ьощапит, г и д р о л и з о в а н н а я Sau3A и DpnI соответственно; 6 — М а р -
кер pBR322/BsiNI; 7 — Д Н К LPP-3; Я — Д Н К P. boryanum; 9 — Д Н К
LPP-3 MboI; 10>— Д Н К P. boryanum/MboI
Есо1471 (AGGCCT). Таким образом, мы вправе предположить отсут-
ствие в Д Н К LPP-3 последовательностей G G ( C / G ) C C . Причиной это-
го явления может быть защита от вирусспецифических нуклеаз, обра-
зующихся на ранних этапах инфекции [7].
В результате измерения метилтрансферазной активности частично
очищенных бесклеточных экстрактов P. boryanum были получены сле-
дующие данные: при использовании в качестве субстрата реакции Д Н К
фага лямбда из clam+- и с!.ст+-содержащего хозяина активность проб
составляла 3820=h800l имп/мин, пеметилированной Д Н К из эритроци-
тов цыплят — 29950+2050' имп/мин. Эти сведения подтверждают при-
сутствие сайтспецифических метил аз у P. boryanum.
Наличие сайтспецифического метилирования в Д Н К LPP-3 и
P. boryanum, а также проявляемая этой цианобактерией метилтранс-
феразная активность свидетельствуют о существовании у нее систем ре-
стрикции—модификации двух типов — dam- и dcml-подобной систем.
Защита вирусного генома от dcml-подобной системы хозяина осуще-
58 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. N° 5 58
стьляетс.я за счет метилирования CmC (А/Т)GG-последователыюсти.
Длч GmATC-caiiTa следует отметить, что, поскольку Д Н К циапофага
LPP-S рестрицируется эндонуклеазой MboIy то контрселекции д о л ж н а
подверг аться расширенная последовательность, включающая GATC.
Мы провели рестрикцию Д Н К вируса и хозяина всеми известными эн-
допуклеазами с расширением GATC: BclI (TGATCC, BglII (AGATCT),
Pviil (CGATCG), BamtII (GGATCC) , XtiolI ( P u G A T C P y ) . Все рестрик-
тазы, кроме BamHly гидролизовали как Д Н К LPP-3y так и Д Н К P. bo-
ryanum. Рестриктаза PvuI имела только один сайт на Д Н К LPP-3. Ис-
ходя из полученных данных можно предположить наличие у P. borya-
num эпдоиуклеазы рестрикции с сайтом узнавания, подобным BamtII.
Использованный подход позволяет, па наш взгляд, с большей точ-
н о с т ь ю говорить о специфичности систем рестрикции — модификации
P. boryanum.
Нужно подчеркнуть, что, хотя для Anabat?na variabilis было т а к ж е
показано наличие dam- и dcm-подобпых систем, LPP-3 в целом отлича-
ется от цпанофагов А и ЛЛ'-серии. Так, у циапофага A-4L полностью
отсутствуют последовательности, которые могут быть метилированы хо-
зяином, а вирусы A-IL и AN-IO метилированы по GATC-последователь-
пости и отличаются по GGCC: у A-4L эта последовательность метили-
рована, а у AN-IO подвержена контрселекции [19].
Таким образом, в результате проведенных экспериментов было ус-
тановлено: Д Н К цианобактерии P. boryanum содержит 1,2 % 5-метил-
цптозппа и 4 , 5 % N-6-метиладенина; Д Н К циапофага LPP-3 — 0 , 8 %
5-метилцитозина и не включает N-6-метиладенина. P. boryanum обла-
дает системами рестрикции — модификации dam- и dcmi-подобііого ти-
па. Защита вирусного генома от систем рестрикции — модификации хо-
зяина осуществляется за счет метилирования последовательности
CinC (А /Т) GG π контрселекции гю сайту BamtlL Контрселекции, оче-
видно, подвержена и последовательность G G ( C / G ) C C .
P е ю м е. Д л я перевірки наявност і модифікованих основ у Д Н К ц і а н о ф а г а
LPP-3 і ц іанобактер і ї P. boryanum використано метод H P L C за д о п о м о г о ю установки
<Sys tem GOLD». Аналіз профілю елюці ї г ідролізат ів д о з в о л и в ідентифікувати , окрім
канонічних основ, присутність у Д Н К P- boryanum 5 -мєтилцитозипу в концентрац і ї
1 , 2 % та N-6-метиладеніну — 4,5 %. Д Н К LPP-3 містить 0 , 8 % 5 -метилцитозину і не
в к л ю ч а є N-6-метиладеніну . 5 -Метилцитозии в д а л о с я виявити лише м о д и ф і к о в а н и м
методом г ідролізу Д Н К ф т о р и с т о в о д н е в о ю кислотою. Д л я виявлення сайтспсцифічпого
м е т и л ю в а н н я Д Н К ц іанофага LPP-3 і Д Н К P- boryanum п і д д а в а л и ф е р м е н т а т и в н о м у
г ідролізу рестриктазами- і зошизомерами , по-р ізному реагуючими на м е т и л ю в а н н я за-
лишків цитозину і аденіну в сайтах п і знавання . Встановленно м е т и л ю в а н н я по аденіну
в GATC-посл ідовностях Д Н К P- boryanum та по д р у г о м у цитозину GC (А/Т) GG-no -
слідовностей як у Д Н К P- boryanum, т ак і в Д Н К LPP-3. З р о б л е н о висновок про
наявність у P. boryanum систем рестрикці ї — модифікац і ї d a m - і d c m l - п о д і б н о г о типу.
З а х и с т в ірусного генома від систем рестрикці ї — модифікац і ї х а з я ї н а зд ійснюється
м е т и л ю в а н п я м послідовності C m C (А/Т) G G і контрселекцією за сайтом B a m I i I . Коптр-
селекці ї , скоріш за все, п іддається і послідовність G G ( C / ' G ) C C , щ о п і д т в е р д ж у є т ь с я
д а н и м и рестрикційного аналізу .
S u m m а г у . H P L C m e t h o d w a s used to s t u d y s o m e pecu l ia r i t i e s of c y a n o b a c t e r i u m
Plecionema boryanum and c y a n o p h a g e LPP-3 D N A compos i t i on . The e lu t ion p rof i l e a n a -
lys is of the p r o d u c t s of D N A acid h y d r o l y s i s e n a b l e to i d e n t i f y in D N A P. boryanum
apa r t of canon ica l b a s e s the p resence of 4.5 % N - 6 - m e t h y l a d e n i n e and 1.2 % 5 -me thy l -
cy tos inc , D X A LPP-3 h a v e 0,8 % 5 - m e t h y l c y t o s i n e and no N - 6 - m e t h y l a d e n i n e . The pre-
sence of 5 - m e t h y l c y t o s i n e w a s detec ted on ly due to the app l i ca t i on of the mod i f i ed hyd-
ro lys i s me thod H F .
The res t r i c t ion e n d o n u c l e a s e s - i s o s h i s o m e r s , D N A h y d r o l y s i s of wh ich depend on pre-
sence of m e t h y l a t e d bases in the r ecogn i t i on si tes , we re used to detect s i te -speci f ic m e t h y -
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. N° 5 59
lation. The comparison of the products of the DNA LPP-3 and P. boryanum fermentati-
ve hydrolysis by MspI and HpaII; Sau3A, MboI and DpnI; ApyI and MvaI restrictases
enable to determined that DNA LPP-3 and P. boryanum has a high methylation degree
of the inner cytosine in the CC(A/T)GG site and P. boryanum on the adenine in the GATC
site; CCGG site wasn't methylated in both DNA.
Proceeding from the data obtained a conclusion can be drown on the presence of
dam- and dcml-like restriction — modification systems in P. boryanum. Defence of viral
DNA against host R-M systems occur by cytosine methylation in sequence CmC(A/T)GG
and counter-selection BamHI sites.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Александруїикина Η. И., Кирнос Μ. Д., Маградзе Η. Μ. и др. Об аналоге цитозина
в ДНК, бактериофага Shigella sonnei «УФА»/ /Биоорг . химия.— 1978.—4, № 9.—
С. 119ІІ—1196.
2. Кирнос М. Д.. Александр у иікина Н. И., Ванюшин Б. Ф. 5-метилцитозин в пиримиди-
новых последовательностях Д Н К растений и животных: специфичность метилирова-
ния // Биохимия.— 1981.—46, № 8.—С, 1458^-1474.
3. Лысенко Т. Г., Шайнская О. А., Геращенко И. В., Сырчин С. А. Сравнение двух ме-
тодов получения бесклеточных экстрактов цианобактерий для изучения активности
дегидрогеназ / / Микробиол. журн.— 1989.— 51, № 3.— С. 87—91.
4. Маниатис Т., Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекуляр-
ное клонирование.— М. : Мир, 1984.— 480 с.
5. Менджул М. И.. Сырчин С. А., Аверкиев А. А., Бусахина И. В. Сравнение различных
методов выделения цианофага LPP-3 и его Д Н К // Микробиол. журн.— 1992.— 54,
No 2.— С. 70—74.
6. Менджул М. И. Сырчин С. А., Ребентиш Б. А. и др. Резистентность Д Н К цианофа-
га LPP-3 к действию различных эндонуклеаз рестрикции // Там же.— 1993.—55.
7. Нестерова Н. В. Калиниченко Т. С., Мельник А. И., Сырчин С. А. Деградация ге-
нома цианобактерий при репродукции цианофагов AS-IL, S-8K, LPP-3 и A-I / / Т а м
же.— 1991.—53, No 3.— С. 43—49·
8. Нестерова Н. В. Сагун Т. С., Пилипенко В. Г. Идентификация цианофага LPP-3 //
V съезд Укр. микробиол. о-ва: Тез. докл.— Киев : Наук, думка, 1974.— С. 163—165.
9. Нестерова Н. В., Сагун Т. С., Спивак Н. #.. Воцелко С. К. Характеристика генома
цианофага LPP-3A/ /Микробиол. ж у р н — 1982.—44, № 3 .—С. 34—38.
10. Adams D. G. Isolation and restriction analysis of DNA from heterocysts and vege-
tative cells of cyanobacteria / / J . Gen. Microbiol — 1988.—781, N 1 — P. 45—55.
11. Bancroft I., Smith R. J. Analysis of restriction endonuclease sites in cyanophages
infecting the heterocystous cyanobacteria Anabaena and Nostoc / / J . Gen. Virol.—
1988.—69, N 3 . — P . 739—743.
12. Brown P. T. H. DNA methylation in plants and t issue cu l ture / /Genome.— 1989.—
31, N 2 . — P . 717—729.
13. Catania I., Keenan B. C., Margison G. P., Fairweather D. S. Determination of 5-met-
hylcytosine by acid hydrolysis of DNA with hydrofluoric acid / / Anal. Biochem.—
1987.—167, N 2 . — P . 347—351.
14. Chirikjian J. G. Gene amplification and analysis. Restriction endonucleases and me-
thylases.— New York; Amsterdam; London : Elsevier, 1987.— Vol. 5.— 303 p.
15. Doolittle M. M., Sirotkin K. Bacteriophage T2 and T4, damh and Ecodam methyla-
tion: preference at different s i tes / / Biochim. (et biophys. acta.— 1988.— 949.—
P. 240—246.
16. Hahn D. R., McHenney Μ. A., Baltz R. Characterization of FP 22 a large streptomyce-
te bacteriophage with DNA insensitive to c leavage by many restriction enzymes / /
. J. Gen. Microbiol.— 1990.— 136, N 12.—P. 2395—<2404.
17. Kaneko T., Katoh K., Fujimoto M. et al. Determination of the nucleotide composition
of a deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography of its enzyma-
tic hydrolysate: a review. / / J. Microbiol. M e t h . - 1986.—N 4 . — P . 229—240.
18. Kruger D. H., Bickle T. A. Bacteriophage survival: multiple mechanisms for avowing
the DNA restriction systems of their hosts .// Microbiol. Rev.— 1983.— 47.— P. 345—
360.
19. Lambert G. R., Carr W. G. Resistance of DNA from fi lamentous and unicellular cya-
nobacteria to restriction endonuclease c leavage // Biochim. et biophys. acta.— 1984.—
781 .—P. 45—55.
20. McClelland M. Selection against dam methylation sites in the genomes of DNA ente-
robacteriophages // J. Мої. Evol.— 1985 .—21.—P. 317—322.
21. Padhy R. N., Hottat F. G., Coene M. M., Hoet P. P. Restriction analysis and quanti-
tative estimation of methylated bases of f i lamentous and unicellular cyanobacterial
D N A s / / J . Bacteriol.— 1988.— 170, N 4 . — P . 1934—1939.
22. Pogany G., Jeney A., Major J., Lapis K. Sugar-nucleotides in 5-hexyl-2-deoxyuridine-
treated lewis lung tumor cells by HPLC // Chromatogram.— 1989.— 10, N 3.—
P. 2—3.
23. Roberts J. R. Restriction enzymes and their i soshizorners / /Nucl . Acids Res—1988,—
16 .—P. 271—313.
60 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. N° 5 60
24. Schroeder C., Hurkseat H., Meisel A. et at. Unusual occurrence of EcoPl and EeoP 15
recognit ion sites and counterselect ion of type II rnethylation and restriction sequences
in bacteriophage T7 D N A / / G e n e — 1986 — 45, N 1 . — P . 77—86.
25. Sekulie S., Hacldad P. R. Effect of peak ta i l ing on computer optimizat ion procedu-
res for high-performance liquid chromatography / / J. Chromatogr .— 1988.— 459,
N 1 . — P . 65—77.
26. Sinhalg R. P., Landes J. P. High-performance liquid chromatographic ana lys i s of
D N A composit ion and D N A modif icat ion by chloroacetaldehyde / / Ibid.— 1988.—458.—
P. 117—128.
Ин-т микробиологии и вирусологии Получено 18.01.93
А Н Украины, Киев
ВНИИГенетика, Москва
УДК 577.112+371.24
А. В. Братусь, С. 3. Мальченко, Η. А. Чащин
ПРЕДСКАЗАНИЕ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ
МОДИФИЦИРОВАННЫМ GUHA- МЕТОДОМ *
В работе предложен новый метод предсказания вторичной структуры белка, основанный
на известном в области экспертных систем GUHA-методе. Облучение и предсказание
базируются на информации о вторичной структуре 108 белков (около 20 000 аминокис-
лотных остатков) с рентгеноструктурным разрешением менее 0,2 нм. Средняя точность
предсказания по использованному в работе банку данных составила для а-спирали —
74 %, ^-складки — 67 %, нерегулярной структуры — 71 % и общая — 68 %.
Введение. Известно, что предсказание вторичной структуры белка с
точностью 75—85 % позволяет составить общее представление о его
пространственной структуре, а увеличение точности—получить доволь-
но близкую к реальной пространственную модель белка [1].
Существующие в настоящее время методы не всегда позволяют до-
стичь необходимой точности, поэтому, несмотря на множество спосо-
бов предсказания вторичной структуры белка, поиск новых подходов в
этом направлении не прекращается.
В предлагаемой работе описывается известный в области эксперт-
ных систем GUHA-метод [2] и его приложение к предсказанию вторич-
ной структуры белков.
Материалы и методы. В работе использовали банк данных, содер-
жащий информацию о вторичной структуре 108 белков (20 000 амино-
кислотных остатков) с рентгеноструктурным разрешением менее 0,2 нм.
Эти данные были получены из Брухевенского банка данных простран-
ственных структур белков. Вторичная структура классифицирована по
трем конформациям: α-спираль (/ι), β-складка (е) и нерегулярная (с).
Таким образом, каждому аминокислотному остатку присваивается одно
из трех состояний вторичной структуры — /і, е или с.
Д л я прогнозирования вторичной структуры белка применен моди-
фицированный GUHA-метод. Суть его состоит в следующем.
Пусть исследуемая предметная область отражается эмпирически-
ми данными в виде таблицы. Формально таблица может быть представ-
лена в таком виде:
M=(Mod9 Λ, ...,/«>,
где Mod — множество объектов;
fi: Mod-^Vi — унарные отношения, определенные в данной пред-
метной области;
У / = { 1 , 2, ...,/Ci, Un)— множество значений отношения;
fi, Un есть символ неопределенной информации.
* Статья представлена членом редколлегии В. И. Даниловым.
© А. В. Братусь, С. 3. Мальченко, Н. А. Чащин, 1993
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. N° 5 61
|