Разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in vivo

В работе разработана новая улучшенная технология создания микроэлектродов на основе углеродных волокон. Произведенные по такой технологии датчики имеют длительное время жизни, устойчивы к электрохимической и химической предобработкам, а при электрохимической активации демонстрируют высокую чувствите...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2002
Автори:	Щувайло, О.Н., Данилейко, Л.В., Архипова, В.Н., Дзядевич, С.В., Ельская, А.В., Сеспуглио, Р., Солдаткин, А.П.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2002
Назва видання:	Біополімери і клітина
Теми:	Структура та функції біополімерів
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156307
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in vivo / О.Н. Щувайло, Л.В. Данилейко, В.Н. Архипова, С.В. Дзядзевич, А.В. Ельская, Р. Сеспуглио, А.П. Солдаткин // Вiopolymers and Cell. — 2002. — Т. 18, № 6. — С. 489-495. — Бібліогр.: 15 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-156307
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1563072019-06-19T01:27:26Z Разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in vivo Щувайло, О.Н. Данилейко, Л.В. Архипова, В.Н. Дзядевич, С.В. Ельская, А.В. Сеспуглио, Р. Солдаткин, А.П. Структура та функції біополімерів В работе разработана новая улучшенная технология создания микроэлектродов на основе углеродных волокон. Произведенные по такой технологии датчики имеют длительное время жизни, устойчивы к электрохимической и химической предобработкам, а при электрохимической активации демонстрируют высокую чувствительность к Н₂О₂. Минимально определяемая с помощью микроэлектродов концентрация перекиси водорода составляла 0,5 мкМ. Разработанные на основе указанных микроэлектродов биосенсоры для определения глюкозы, ацетилхолина и холина показывают высокую чувствительность при работе в модельных растворах. Минимально определяемые с помощью разработанных биосенсоров концентрации субстратов составляют для глюкозы 60 мкМ, для ацетилхолина и холина – 1 мкМ. Такая чувствительность микробиосенсоров позволяет использовать их in vivo для анализа указанных веществ в мозге млекопитающих. Розроблено нову покращену технологію створення мікроелектродів на основі вуглецевих волокон. Виготовлені за такою технологією датчики мають довгий час життя, стійкі до електрохімічної та хімічної передобробок, а при електрохімічній активації демонструють високу чутливість до Н₂О₂. Мінімальна концентрація перекису водню, шр визначається, складає 0,5 мкМ. Створені на основі цих мікроелектродів біосенсори для визначення глюкози, ацетилхоліну та холіну також є високочутливими при роботі в модельних розчинах. Мінімальні концентрації субстратів, які можна визначити за допомогою розроблених біосенсорів, складають для глюкози – 60 мкМ, для ацетилхоліну і холіну – 1 мкМ. Така чутливість мікробіосенсорів дозволяє використовувати їх in vivo для аналізу згаданих речовин у мозку ссавців. A new improved technology for manufacturing microelectrodes based on carbon fibres has been developed. The microelectrodes produced are long living, stable to electrochemical and chemical treatment. The electrochemically activated microelectrodes demonstrated high sensitivity to Н₂О₂ with the detection limit for hydrogen peroxide of 0.5 μM. The microbiosensors based on carbon fibre microelectrodes have been developed for the determination of glucose, acetylcholine and choline concentration. They demonstrate high sensitivity in model solutions. The detection limits for glucose, acetylcholine and choline are of 60 uM, 1 uM u 1 uM respectively, that permits these microbiosensors to be applied for in vivo analysis of these substrates in mammalian brain. 2002 Article Разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in vivo / О.Н. Щувайло, Л.В. Данилейко, В.Н. Архипова, С.В. Дзядзевич, А.В. Ельская, Р. Сеспуглио, А.П. Солдаткин // Вiopolymers and Cell. — 2002. — Т. 18, № 6. — С. 489-495. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.00062C http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156307 577.15;573.6 ru Біополімери і клітина Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура та функції біополімерів Структура та функції біополімерів
spellingShingle	Структура та функції біополімерів Структура та функції біополімерів Щувайло, О.Н. Данилейко, Л.В. Архипова, В.Н. Дзядевич, С.В. Ельская, А.В. Сеспуглио, Р. Солдаткин, А.П. Разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in vivo Біополімери і клітина
description	В работе разработана новая улучшенная технология создания микроэлектродов на основе углеродных волокон. Произведенные по такой технологии датчики имеют длительное время жизни, устойчивы к электрохимической и химической предобработкам, а при электрохимической активации демонстрируют высокую чувствительность к Н₂О₂. Минимально определяемая с помощью микроэлектродов концентрация перекиси водорода составляла 0,5 мкМ. Разработанные на основе указанных микроэлектродов биосенсоры для определения глюкозы, ацетилхолина и холина показывают высокую чувствительность при работе в модельных растворах. Минимально определяемые с помощью разработанных биосенсоров концентрации субстратов составляют для глюкозы 60 мкМ, для ацетилхолина и холина – 1 мкМ. Такая чувствительность микробиосенсоров позволяет использовать их in vivo для анализа указанных веществ в мозге млекопитающих.
format	Article
author	Щувайло, О.Н. Данилейко, Л.В. Архипова, В.Н. Дзядевич, С.В. Ельская, А.В. Сеспуглио, Р. Солдаткин, А.П.
author_facet	Щувайло, О.Н. Данилейко, Л.В. Архипова, В.Н. Дзядевич, С.В. Ельская, А.В. Сеспуглио, Р. Солдаткин, А.П.
author_sort	Щувайло, О.Н.
title	Разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in vivo
title_short	Разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in vivo
title_full	Разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in vivo
title_fullStr	Разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in vivo
title_full_unstemmed	Разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in vivo
title_sort	разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in vivo
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2002
topic_facet	Структура та функції біополімерів
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156307
citation_txt	Разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in vivo / О.Н. Щувайло, Л.В. Данилейко, В.Н. Архипова, С.В. Дзядзевич, А.В. Ельская, Р. Сеспуглио, А.П. Солдаткин // Вiopolymers and Cell. — 2002. — Т. 18, № 6. — С. 489-495. — Бібліогр.: 15 назв. — рос.
series	Біополімери і клітина
work_keys_str_mv	AT ŝuvajloon razrabotkamikrobiosensorovnaosnoveuglerodnyhvolokondlâopredeleniâglûkozyacetilholinaiholinainvivo AT danilejkolv razrabotkamikrobiosensorovnaosnoveuglerodnyhvolokondlâopredeleniâglûkozyacetilholinaiholinainvivo AT arhipovavn razrabotkamikrobiosensorovnaosnoveuglerodnyhvolokondlâopredeleniâglûkozyacetilholinaiholinainvivo AT dzâdevičsv razrabotkamikrobiosensorovnaosnoveuglerodnyhvolokondlâopredeleniâglûkozyacetilholinaiholinainvivo AT elʹskaâav razrabotkamikrobiosensorovnaosnoveuglerodnyhvolokondlâopredeleniâglûkozyacetilholinaiholinainvivo AT sespuglior razrabotkamikrobiosensorovnaosnoveuglerodnyhvolokondlâopredeleniâglûkozyacetilholinaiholinainvivo AT soldatkinap razrabotkamikrobiosensorovnaosnoveuglerodnyhvolokondlâopredeleniâglûkozyacetilholinaiholinainvivo
first_indexed	2025-07-14T08:44:56Z
last_indexed	2025-07-14T08:44:56Z
_version_	1837611296482131968
fulltext	ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2002. Т. 18. № 6 Разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in vivo О. Н. Щувайло, Л. В. Данилейко, В. Н. Архипова, С. В. Дзядевич, А. В- Ельская, Р. Сеспуглио1, А. П. Солдаткин Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143, Украина Е. mail: а soldatkin@vahoo.com * Отдел экспериментальной медицины, INSERM U480, Университет Клода Бернара Ул. Рокфеллера, 8, 69373, Лион Седекс, Франция Б. mail: cespugli@univ-lyonl.fr В работе разработана новая улучшенная технология создания микроэлектродов на основе углеродных волокон. Произведенные по такой технологии датчики имеют длительное время жизни, устойчивы к электрохимической и химической предобработкам, а при электрохимической активации демонстрируют высокую чувствительность к Н2О2. Минимально определяемая с помощью микроэлектродов концентрация перекиси водорода составляла 0,5 мкМ. Разработанные на основе указанных микроэлектродов биосенсоры для определения глюкозы, ацетилхолина и холина показывают высокую чувствительность при работе в модельных растворах. Минимально определяемые с помощью разработанных биосенсоров концентрации субстратов составляют для глюкозы 60 мкМ, для ацетилхолина и холина —- J мкМ. Такая чувствительность микробиосенсо ров позволяет использовать их in vivo для анализа указанных веществ в мозге млекопитающих. Введение. Для живых организмов глюкоза являет ся очень важным компонентом энергетического метаболизма. В тканях (мозг, сердце) и биологиче ских жидкостях (кровь, цереброспинальная жид кость) уровень глюкозы определяется гомеостати- ческим балансом, регулирующим его уровень в определенных, строго детерминированных преде лах. Изменение уровня глюкозы в организме мо жет иметь место, например, при таких патологиях, как диабет [1 ]. В случае церебрального метаболизма все ас пекты, связанные с потреблением и производством энергии, имеют как чисто научный, так и приклад ной медицинский интерес. Механизмы, регулирую щие эти процессы, до сих пор до конца не изучены, поскольку исследования в основном проведены в post-mortem период [1, 2] , а полученные таким © О. Н. Щ У В А Й Л О , Л. В. Д А Н И Л Е Й К О . В. Н. А Р Х И П О В А , С. В. Д З Я Д Е В И Ч , А. В. ЕЛЬСКАЯ, Р. С Е С П У Г Л И О , образом данные далеки от таковых, полученных в физиологических условиях in vivo. Прогресс же в этой области может быть достигнут только при прямых исследованиях глюкозы in vivo. Поэтому в последнее время значительные усилия исследовате лей направлены на разработку биосенсоров для определения глюкозы in vivo [3, 4 ], но, к сожале нию, рабочие характеристики таких биосенсоров не всегда удовлетворяют практическим требованиям и нуждаются в улучшении. Нейромедиаторы играют очень важную роль в функционировании организма, так как они явля ются ключевыми молекулами, обеспечивающими связь между нейронами. Непрерывное исследова ние уровня нейромедиаторов очень важно для изу чения физиологии нервных клеток и детального понимания их функции. Ацетилхолин — один из наиболее важных нейромедиаторов, ответственых за передачу сигналов в нейронах головного и спин ного мозга, где он локализован диффузно. Деталь- 489 mailto:soldatkin@vahoo.com mailto:cespugli@univ-lyonl.fr Щ У В А Я Л О О. Н. И Д Р . ная информация о концентрации ацетилхолина и холина (предшественника ацетилхолина) в разных отделах мозга может быть важна для понимания их влияния на память, сон, бодрствование, а также их роли в таких заболеваниях, как эпилепсия, болез ни Альцгеймера, Паркинсона и др. [5 ]. Для анализа ацетилхолина и холина в биоло гических жидкостях разработано и применено не сколько методов, в частности, биохимический ана лиз с использованием радиоактивных меток [6, 7 ], вывокоэффективную жидкостную хроматографию с электрохимической детекцией [8 ], а также микро диализную технику с биосенсорной детекцией [9 ]. Основными недостатками перечисленных методов являются длительное время анализа и необходи мость использования дорогого и сложного оборудо вания. Кроме того, они не могут быть использова ны для исследований in vivo. Простейший путь для устранения этих недостатков — применение имп лантируемых микробиосенсоров для прямого изме рения ацетилхолина in vivo. Перспективным преоб разователем в этом случае является электрод на основе углеродного волокона [3, 10, 11]. Целью данного исследования была разработка технологии получения микроэлектродов на основе углеродного волокна и микробиосенсоров для опре деления глюкозы, холина и ацетилхолина in vivo. Материалы и методы. В работе использовали: ферменты глюкозооксидазу (ГОД) из Aspergillus niger с активностью 181,6 ед. акт/мг; ацетилхо- линэстеразу (АХЭ) из электрического угря с актив ностью 301 ед. акт/мг; холиноксидазу (ХО) из Alcaligenes species с активностью 12 ед. акт/мг производства фирмы «Sigma—Aldrich Chimie S.a.r.l.» (Франция). Субстратами служили глюкоза, а также хлори ды ацетилхолина и холина фирмы «Sigma—Aldrich Chimie S.a.r.k. Бычий сывороточный альбумин (БСА) и 50 %- й водный раствор глутарового альдегида (ГА) так же получены от фирмы «Sigma—-Aldrich Chimie S.a.r.b. Как рабочий использовали 10 мМ калий-фос фатный буфер (KH 2 P0 4 -NaOH), рН 7,4, отечест венного производства квалификации «ос. ч.». Все другие реактивы были отечественного и импортно го производства квалификации «ос. ч.» и «х. ч.» В работе применяли микроэлектроды собствен ного производства на основе углеродных моноволо кон с диаметром 30 мкм и длиной рабочей части 500 мкм (AVCO тип, Lowel, MA). Перед работой микроэлектроды предобрабатывали электрохимиче ски [3 ]. В случае повторного использования микро электродов старые ферментные мембраны удаляли с помощью хромовой смеси, отмывали большими объемами рабочего буфера и снова обрабатывали электрохимически [3]. В случае глюкозного и холинового биосенсоров для образования биоселективных мембран готовили смесь фермента и БСА в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,4, с конечной концентрацией 150 мг/мл каждого. В случае ацетилхолинового биосенсора смесь для приготовления биоселектив ных мембран содержала БСА и ферменты АХЭ, ХО в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,4, с конечной концентрацией 120, 20 и 80 мг/мл соот ветственно. Во все смеси добавляли глицерин до конечной концентрации 10 % для стабилизации ферментов при иммобилизации, а также для пре дотвращения преждевременного высыхания раство ров и улучшения адгезии мембран к поверхности преобразователя. Смесь фермент (ы)—БСА наноси ли на рабочую поверхность электрода методом погружения. Для полимеризации мембран датчики помещали в атмосферу насыщенных паров ГА на 6 мин (17 °С), а потом подсушивали на воздухе в течение 10 мин. Перед измерениями биосенсоры вымачивали некоторое время в 10 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,4) до получения стабильного базового сигна ла. Измерения проводили с использованием мо дельных растворов субстратов в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,4, при температуре 36 °С Необходи мую концентрацию субстратов задавали введением определенных аликвот их концентрированных рас творов. Амперометрические измерения проводили в проточно-инжекционной системе (рис 1) с по мощью потенциостата. Измерения осуществляли по трехэлектродной схеме: рабочий электрод на осно ве углеродного моноволокна, хлорсеребряный элек трод сравнения и вспомогательный платиновый электрод. Использовали циклическую треугольную развертку потенциала от 850 до 1100 мВ. Результаты и обсуждение. В последнее время для определения концентраций различных веществ in vivo очень часто разрабатываются биосенсоры на основе углеродных волокон. Наиболее распростра ненная технология изготовления микроэлектродов на основе углеродных волокон описана в работах [3, 10, 11]. Она состоит в следующем: кусочек углеродного волокна приклеивается к серебряной или посеребренной проволоке с помощью серебря ного токопроводящего клея, затем помещается в стеклянный капилляр с таким образом оттянутым концом, чтобы наружная часть углеродного волок на, выполняющая функцию рабочей поверхности электрода, и конец проволоки, который использу- 490 Р А З Р А Б О Т К А М И К Р О Б И О С Е Н С О Р О В НА О С Н О В Е К А Р Б О Н О В Ы Х В О Л О К О Н Рис. 1. Схематическое представление экспериментальной уста новки ется для контакта с электродом, находились снару жи. Далее оба конца стеклянного капилляра зали ваются эпоксидной смолой для герметизации элек трода. При таком методе производства электродов затрачивается много ручной работы и технология трудно поддается адаптации к массовому производ ству. Кроме того, полученные подобным образом электроды плохо воспроизводимы, неустойчивы в агрессивных водных средах и нестабильны при длительном использовании (эпоксидная смола на бухает и разрушается, нарушая герметичность). Поэтому свои исследования мы начали с усовер шенствования технологии производства электродов на основе углеродных волокон, заключающегося в том, что использовался прижимной контакт между углеродным волокном и посеребренной медной про волокой, а герметичность между волокном и стек лянным капилляром достигалась сплавлением стек ла и волокна (рис 2). К другому концу проволоки припаивали стандартный разъем, а капилляр со стороны контакта заливали эпоксидной смолой. На стеклянный капилляр сверху дополнительно над евали полимерную пленку. Таким образом, дости гали следующих преимуществ: прямое сплавление углеродного волокна со стеклом увеличивало срок службы электрода, дава ло возможность применения сильных химических и электрохимических предобработок для увеличения его чувствительности, а также позволяло много кратно использовать электроды; прямой электрический контакт между углерод ным волокном и посеребренной медной проволокой обеспечивал воспроизводимое внутреннее сопро тивление электродов и упрощал процедуру их про изводства; полимерное покрытие стеклянного капилляра увеличивало устойчивость электрода к физическим повреждениям при работе, а также позволяло ис пользовать различные поддерживающие устройства (например, направляющие для электрода при по гружении в проточную систему), что позволило уменьшить процент повреждений электрода при работе. Приготовленные таким образом электроды проверяли на чувствительность к перекиси водоро да. На рис 3 представлено типичное изменение вольт-амперной характеристики микроэлектрода при внесении Н 2 0 2 в ячейку. Проверка чувстви тельности показала (рис 4), что электроды без предварительной обработки характеризуются го раздо более низкой чувствительностью к Н 2 0 2 (ми нимально определяемая концентрация составляла около 50 мкМ), чем электрохимически предобрабо- танные электроды. Последние демонстрировали минимально определяемую концентрацию переки си водорода, равную 0,5 мкМ, но и эта величина ограничивалась в основном техническими характе ристиками потенциостата и несовершенством сис темы измерения. Дальнейшее усовершенствование измеритель ной схемы (применение полного экранирования измерительного блока, дополнительная стабилиза ция питания прибора), а также применение совре менных импульсных амперометрических методов измерений позволит увеличить чувствительность электродов к перекиси водорода и соответственно улучшить характеристики разрабатываемых био сенсоров. Высокая чувствительность электродов к малым концентрациям перекиси водорода абсолют но необходима при создании биосенсоров для опре деления холина и ацетилхолина, поскольку кон центрация этих веществ в мозге составляет величи ны порядка десятка микромолей на килограмм массы мозга [12]. Предварительно обработанные электрохимически электроды и были использованы в дальнейшем как преобразователи для создания микробиосенсоров, специфичных к глюкозе, холи- ну и ацетилхолину. В основе работы амперометрических фермент ных биосенсоров для определения глюкозы и холи на лежат следующие реакции: ГОД Глюкоза + 0 2 Глюконолактон + Н 2 0 2 ; (1) 491 Ш У В А Й Л О О. Н. И Д Р . Рис. 3. Типичная вольт-амперная характеристика ультрамикро- электрода на основе углеродного волокна в отсутствие (У) и присутствии (2) 0,25 мМ Н 2 0 2 в растворе Рис. 4. Калибровочные кривые для определения перекиси водо рода до (/) и после (2) электрохимической активации ультра- микроэлектрода хо Холин + 0 2 -* Бетаин+ Н 2 0 2 . (2) Превращение глюкозы и холина (реакции 1 и 2) сопровождается накоплением перекиси водорода, электрохимически активного вещества, что позво ляет определять эти вещества амперометрическими биосенсорами на основе глюкозооксидазы и холи- ноксидазы. На рис. 5 приведены типичные отклики глюкозного биосенсора на различные концентрации глюкозы в проточной системе. Из этого рисунка хорошо видно, что при увеличении концентрации глюкозы величины откликов пропорционально воз растают. Полученная на основании таких результатов калибровочная кривая для определения концентра- 492 Р А З Р А Б О Т К А М И К Р О Б И О С Е Н С О Р О В НА О С Н О В Е К А Р Б О Н О В Ы Х В О Л О К О Н ций глюкозы с помощью глюкозного микробиосен сора представлена на рис 6. Глюкозный микробио- сенсор характеризовался линейной зависимостью величины отклика биосенсора от концентрации глюкозы в диапазоне 0—4 мМ и минимально опре деляемой концентрацией 0,06 мМ, что соответству ет концентрациям глюкозы в мозге [3 ]. Микробиосенсор на основе холиноксидазы был более чувствительным к малым концентрациям холина в проточной ячейке. Калибровочная кривая для определения холина, полученная аналогично глюкозному биосенсору, представлена на рис. 7. Холиновый микробиосенсор характеризовался ли нейной зависимостью величины отклика биосенсо ра от концентрации холина в диапазоне 0— 300 мкМ и минимально определяемой концентра цией 1 мкМ, что превышает диапазон изменения концентрации холина в мозге [12, 13]. В случае же ацетилхолинового сенсора ситуа ция сложнее, при его создании используется двух- ферментная мембрана с каскадом реакций: Ацетилхолин Холин + СН 3СООН; Холин + 0 2 -* Бетаин + Н 2 0 2 . (3) Фермент ацетилхолинэстераза расщепляет суб страт до холина и ацетата, электрохимически не активных веществ. Поэтому нужно было комбини ровать две реакции, т. е. при разработке ацетилхо линового биосенсора биоселективную мембрану конструировали таким образом, что она содержала два фермента — АХЭ и ХО [14, 15], что предпола гало чувствительность такого сенсора к двум суб- 493 Ш У В А Й Л О О. Н. И Д Р . О 200 400 600 800 1000 Ацетилхолин, мкМ Рис. 8. Калибровочная кривая ацетилхолинового микробиосен- сора стратам, ацетилхолину и холину. Поэтому для определения концентраций ацетилхолина необхо димо использовать два микробиосенсора: один — на основе двух ферментов (АХЭ и ХО) и другой — на основе ХО. Разница в силе сигналов этих двух сенсоров будет пропорциональна величине концен трации ацетилхолина. Кроме вспомогательной ро ли, холиновый сенсор имеет и самостоятельную ценность, так как с его помощью можно следить за концентрацией холина. Ацетилхолиновый микробиосенсор, созданный на основе углеродного волокна и коиммобилизован- ных ферментов АХЭ и ХО, также демонстрировал высокую чувствительность к малым концентраци ям ацетилхололина. Калибровочная кривая для определения ацетилхолина (рис. 8) показывает, что сенсор имеет линейную зависимость величины отклика от концентрации субстрата в диапазоне О—300 мкМ, а минимально определяемая концент рация ацетилхолина составляет 1 мкМ, что также покрывает диапазон изменения его концентраций в мозге [12, 13]. Таким образом, разработанные на основе угле родных волокон микробиосенсоры проверены в мо дельных условиях роботы при определении глюко зы, ацетилхолина и холина. Они показали высокую чувствительность к соответствующим субстратам и могут быть использованы для работы in vivo в мозге крыс, что и планируется на ближайшее будущее. Но, кроме этого, хорошо известно, что в мозге животных могут находиться в значительных кон центрациях различные электрохимически актив ные вещества, такие как аскорбиновая и мочевая кислоты, допамин, серотонин и др. Именно поэто му до начала экспериментов in vivo необходимо изучить специфичность и селективность разрабо танных микробиосенсоров, на что и будут направ лены дальнейшие исследования. Часть данной работы выполнена в рамках грантов NATO (LST.CLG.977826), INTAS (N 00- 0751), а также совместной украинско-французской программы «Дніпро» и авторы благодарят NATO, INTAS и Министерство образования и науки Укра ины за финансовую помощь. О. М. Schuvailo, L. V. Danyleyko, V. М. Arkhypova, S. V. Dzyadevych, A. V. Etskaya, R. Cespuglio, A. P. Soldatkin Development of microbiosensors based on carbon fibres for in vivo determination of glucose, acetylcholine and choline Summary A new improved technology for manufacturing microelectrodes based on carbon fibres has been developed. The microelectrodes produced are long living, stable to electrochemical and chemical treatment. The electrochemically activated microelectrodes demonstrated high sensitivity to H202 with the detection limit for hydrogen peroxide of 0.5 pM. The microbiosensors based on carbon fibre microelectrodes have been developed for the determination of glucose, acetylcholine and choline concentration. They demonstrate high sensitivity in model solutions. The detection limits for glucose, acetylcholine and choline are of 60 pM, 1 цМ и 1 цМ respectively, that permits these microbiosensors to be applied for in vivo analysis of these substrates in mammalian brain. О. M. Щувайло, Л. В. Данілейко, В. М. Архипова, С. В. Дзядевич, Г. В. Єльська, Р. Сеспугліо, О. П. Солдаткін Розробка мікробіосенсорів на основі вуглецевих волокон для визначення глюкози, ацетилхоліну та холіну in vivo Резюме Розроблено нову покращену технологію створення мікроелек- тродів на основі вуглецевих волокон. Виготовлені за такою технологією датчики мають довгий час життя, стійкі до електрохімічної та хімічної передобробок, а при електрохі мічній активації демонструють високу чутливість до Н2Ог Мінімальна концентрація перекису водню, шр визначається, складає 0,5 мкМ. Створені на основі цих мікроелектродів біосенсори для визначення глюкози, ацетилхоліну та холіну також є високочутливими при роботі в модельних розчинах. Мінімальні концентрації субстратів, які можна визначити за допомогою розроблених біосенсорів, складають для глюкози — 60 мкМ, для ацетилхоліну і холіну — 1 мкМ. Така чутливість мікробіосенсорів дозволяє використовувати їх in vivo для аналізу згаданих речовин у мозку ссавців. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Norberg К. Changes in the cerebral metabolism induced by hyperventilation at different blood glucose levels / / J. Neuro- chem.—1976.—26.—P. 353—359. 2. Oldendorf W. #., Stoller В. E. Rat brain free glucose and lactate measurement by novel method using bisecting decapita tion-extrusion and enzyme denaturation at five seconds / / J. Neurochem.—1991.—56.—P. 611—614. 3. Netchiporouk L /., Shram N. F., Jaffrezic-Renault N., Marte let C, Cespuglio R. In vivo brain glucose measurements: 494 Р А З Р А Б О Т К А М И К Р О Б И О С Е Н С О Р О В НА О С Н О В Е К А Р Б О Н О В Ы Х В О Л О К О Н differential normal pulse voltammetry with enzyme-modified carbon fiber microelectrodes / / Anal. Chem.—1996.—68, N 24—P. 4358—4364. 4. Kenausis G.t Chen Q., Heller A. Electrochemical glucose and lactate sensors based on «wired» thermostable soybean pero xidase operating continuously and stably at 37 °С / / Anal. Chem.—1997.—69.—P. 1054—1060. 5. Fisher A., Hanin I., Lachman C. Alzheimer's and Parkinson's diseases: Strategies for research and development.—New York: Plenum press, 1986. 6. Guyenet P. G., Agid Y, Javoy F., BeaujouanJ. C , RossierJ., Glowinski J. Effect of dopaminergic receptor agonists and antagonists on the activity of the neo-striatal cholinergic system / / Brain Res.—1975.—84.—P. 227—244. 7. Haubrich D. R., Gerber N.t Pflueger А. В., Zweig M. Tissue choline studied using a simple chemical assay / / J. Neuro- chem.—1981.—36.—P. 1409—1417. 8. Roisin M. P., Brassart J. L.t Chorion G., Crepel K, Ben Ari Y. A new method for the measurement of endogenous transmit ter release in localized regions of hippocampal slices / / J. Neurosci. Meth.—1991.—37.—P. 183—189. 9. Kissinger P. T. Microdialysis in Neuroscience / Eds Т. E. Robinson, J. B. Justice.—Amsterdam: Elsevier, 1991.— P. 103—115. 10. TamiyaE., Sugiura Y., Navera E. N., Mizoshita S.t Nakajima K, Akiyama A , Karube I. Ultra micro acetylcholine sensor based on an enzyme-modified carbon-fiber electrode / / Anal, chim. acta.—1991.—251.—P. 129—134. 11. Shram N. F.t Netchiporouk L. /., Martelet C, Jaffrezic- Renault N., Bonnet C , Cespuglio R. In vivo voltammetric detection of rat brain lactate with carbon fibre microelectrodes coated with lactate oxidase / / Anal. Chem.—1998.—70.— P. 2618—2622. 12. Rogers K. J., Slater P. Brain acetylcholine and monoamines during experimental catatonia / / J. Pharm. Pharmacol.— 1970.—23D.—P. 135—137. 13. Tucek S. Problems in the organization and control of acetyl choline synthesis in brain neurons / / Progr. Biophys. and Мої. Biol.—1984.—44.—P. 1—44. 14. Larsson N., Ruzgas T.f Gorton L., Kokaia M.f Kissinger P., Csoregi E. Design and development of an amperometric biosensor for acetylcholine determination in brain microdia- lysates / / Electrochim. acta.—1998.—43.—P. 3541—3554. \5.Niwa 0., Horiuchi T.t Kurita R.t Torimitsu K. On-line electrochemical sensor for selective continuous measurement of acetylcholine in cultured brain tissue / / Anal. Chem.—1998.— 70.—P. 1126—1132. УДК 577.15; 573.6 Надійшла до редакції 27.09.01 495 file:///5.Niwa

Разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in vivo

Репозитарії

Схожі ресурси