Выделение и свойства протеиназы пчелиного яда

В яде пчел (Apis mellifera) содержится протеиназа в количестве 0,8–1,5 % от белково-пептидной фракции. Хроматографией на бензамидин-сефарозе и обратнофазной хроматографией фермент очищен до гомогенного состояния с удельной активностью 110 ед/мг. Протеиназа обладает высокой гидрофобностью, имеет моле...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1999
Hauptverfasser:	Протас, А.Ф., Бондарева, О.С., Мулявко, Н.А.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1999
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Schlagworte:	Структура и функции биополимеров
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156536
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Выделение и свойства протеиназы пчелиного яда / А.Ф. Протас, О.С. Бондарева, Н.А. Мулявко // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 4. — С. 292-296. — Бібліогр.: 6 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-156536
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1565362019-06-19T01:29:07Z Выделение и свойства протеиназы пчелиного яда Протас, А.Ф. Бондарева, О.С. Мулявко, Н.А. Структура и функции биополимеров В яде пчел (Apis mellifera) содержится протеиназа в количестве 0,8–1,5 % от белково-пептидной фракции. Хроматографией на бензамидин-сефарозе и обратнофазной хроматографией фермент очищен до гомогенного состояния с удельной активностью 110 ед/мг. Протеиназа обладает высокой гидрофобностью, имеет молекулярную массу 20 к Да (гель-фильтрация), рН-оптимум действия 4,5, проявляет высокую специфичность по отношению к белкам в составе мембран (теней эритроцитов). Протеиназа кооперативно связывается с наружной клеточной мембраной (эритроцитов), максимальное соотношение связывания (в расчете на белок мембраны) – 1:1,2. Делается вывод о роли протеиназы как одного из токсических компонентов яда, способного существенно влиять на качественный и количественный состав яда при его сертификации. Встановлено, що в отруті бджіл (Apis mellifera) міститься протеїнова в кількості 0,8–1,5 % від білково-пептидної фракции Хроматографією на бензамідин-сефарозі та зворотнофазною хроматографією фермент очищено до гомогенного стану з питомою активністю ПО од/мг. Протеїназа має молекулярну масу 20 кДа, рН-оптимум дії 4,5, їй притаманна висока гідрофобність та специфічність по відношенню до білків у складі мембран (тіней еритроцитів). Протеїназа кооперативно зв'язується з клітинною мембраною (еритроцитів), при цьому вона практично повністю зв'язується з мембраною, максимальне співвідношенняе зв'язування (в розрахунку на білок мембрани) – 1:1,2. Робиться висновок стосовно функції протеїнази як одного з токсичних компонентів отрути. See venom contains specific protease. It consists about 0.8–15 % of total proteine-peptide fraction. The enzyme was purified with the help of benzamedine-sepharose and reverse-fase chromatography to the activity 110 U/mg. The protein is hydrophobic, its Mr is equal to 20 kDa (by gel-filtration), pHopt 4.5. Protease specifically binds to cell membrane in cooperative manner; the maximal binding ratio is 1.2. Enzyme has high substrate specifity for membrane proteins. It is concluded that protease is a specific toxic component of bee venom. 1999 Article Выделение и свойства протеиназы пчелиного яда / А.Ф. Протас, О.С. Бондарева, Н.А. Мулявко // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 4. — С. 292-296. — Бібліогр.: 6 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000528 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156536 638.178.8 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Протас, А.Ф. Бондарева, О.С. Мулявко, Н.А. Выделение и свойства протеиназы пчелиного яда Биополимеры и клетка
description	В яде пчел (Apis mellifera) содержится протеиназа в количестве 0,8–1,5 % от белково-пептидной фракции. Хроматографией на бензамидин-сефарозе и обратнофазной хроматографией фермент очищен до гомогенного состояния с удельной активностью 110 ед/мг. Протеиназа обладает высокой гидрофобностью, имеет молекулярную массу 20 к Да (гель-фильтрация), рН-оптимум действия 4,5, проявляет высокую специфичность по отношению к белкам в составе мембран (теней эритроцитов). Протеиназа кооперативно связывается с наружной клеточной мембраной (эритроцитов), максимальное соотношение связывания (в расчете на белок мембраны) – 1:1,2. Делается вывод о роли протеиназы как одного из токсических компонентов яда, способного существенно влиять на качественный и количественный состав яда при его сертификации.
format	Article
author	Протас, А.Ф. Бондарева, О.С. Мулявко, Н.А.
author_facet	Протас, А.Ф. Бондарева, О.С. Мулявко, Н.А.
author_sort	Протас, А.Ф.
title	Выделение и свойства протеиназы пчелиного яда
title_short	Выделение и свойства протеиназы пчелиного яда
title_full	Выделение и свойства протеиназы пчелиного яда
title_fullStr	Выделение и свойства протеиназы пчелиного яда
title_full_unstemmed	Выделение и свойства протеиназы пчелиного яда
title_sort	выделение и свойства протеиназы пчелиного яда
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1999
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156536
citation_txt	Выделение и свойства протеиназы пчелиного яда / А.Ф. Протас, О.С. Бондарева, Н.А. Мулявко // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 4. — С. 292-296. — Бібліогр.: 6 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT protasaf vydelenieisvojstvaproteinazypčelinogoâda AT bondarevaos vydelenieisvojstvaproteinazypčelinogoâda AT mulâvkona vydelenieisvojstvaproteinazypčelinogoâda
first_indexed	2025-07-14T08:52:30Z
last_indexed	2025-07-14T08:52:30Z
_version_	1837611772387786752
fulltext	ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1999. Т. 15. № 4 Выделение и свойства протеиназы пчелиного яда А. Ф. Протас1, О. С. Бондарева, Н. А- Мулявко і Межотраслевая фирма «Берег» Ул. Карантинная, 14, Одесса, 270014 , Украина Институт пчеловодства им. П. И. Прокоповича УААН Ул. Академика Заболотного, 19, Киев, 03022 , Украина В яде пчел (Apis mellifera) содержится протеиназа в количестве 0,8—1,5 % от белково-пептидной фракции. Хроматографией на бензамидин-сефарозе и обратнофазной хроматографией фермент очищен до гомогенного состояния с удельной активностью 110 ед/мг. Протеиназа обладает высокой гидрофобностью, имеет молекулярную массу 20 к Да (гель-фильтрация), рН-оптимум действия 4,5, проявляет высокую специфичность по отношению к белкам в составе мембран (теней эритроцитов). Протеиназа кооперативно связывается с наружной клеточной мембраной (эритроцитов), максимальное соотношение связывания (в расчете на белок мембраны) — 1:1,2. Делается вывод о роли протеиназы как одного из токсических компонентов яда, способного существенно влиять на качественный и количественный состав яда при его сертификации. Введение. Протеиназы достаточно часто встреча ются как один из токсических компонентов яда насекомых и позвоночных [1—3] . Их присутствие наряду с другими составляющими обеспечивает деградацию всех классов биохимических компонен тов клетки. Сведения о наличии протеиназ в яде пчел несколько противоречивы. Согласно данным одних авторов, протеиназная активность в пчели ном яде не выявлена или присутствуют ее следы и, напротив, хорошо известно присутствие ингибитора протеаз [3, 4 ]. С другой стороны, реальный опыт проведения сертификации пчелиного яда свиде тельствует о присутствии некоторого фактора, оче видно, протеиназы, обусловливающего некоторое видоизменение профиля элюции яда при хроматог- рафическом анализе в том случае, если яд некото рое время (до 1 ч) находится в растворе при слабокислых рН (об этом детальнее в разделе «Результаты и обсуждение»). Помимо этого, неко торые сертификаты, выполненные, в частности, в Грузии в перечне компонентов яда содержат пункт «Протеиназа», указанное содержание которой со ставляет около 1 % . В связи с этим целью данной работы было решить вопрос о присутствии протеи назы в составе яда пчел. © А. Ф . П Р О Т А С , О. С. Б О Н Д А Р Е В А , Н. А. М У Л Я В К О , 1999 Материалы и методы. Работы выполняли на высушенном яде-сырце пчел (Apis mellifera), со бранном методом электростимуляции в различных регионах Украины. Проанализированы 100 образ цов яда. Протеиназную активность измеряли ана логично описанному методу [5 ] , инкубационная смесь содержала 75 м к г / м л яда и 5 м г / м л субстра та (белка), пробу инкубировали при температуре 37 °С, буфер содержал 0,15 М NaCl . В качестве субстрата использовали сывороточный альбумин человека. За единицу активности принимали коли чество фермента, переводящее в кислотораствори- мое состояние 1 мг белка за 1 ч в приведенных выше условиях. Измерения проводили на спектро фотометре DU-65 («Весктап», С Ш А ) . Тени эритроцитов человека выделяли центри фугированием из гемолизата очищенных эритроци тов в 1 мМ трис-HCl, рН 7,4. Хроматографию на бензамидин-сефарозе осу ществляли аналогично описанному ранее методу [5] с учетом известных рекомендаций [6] . Обрат- нофазную хроматографию проводили на колонке PepRPC 5 / 5 HR («Pharmacia», Швеция) в линей ном градиенте концентрации ацетонитрила 0— 100 % за 20 мин в присутствии 0,05 % Н 3 Р 0 4 или трифторуксусной кислоты, скорость э л ю ц и и — 1 м л / м и н . Гель-фильтрацию осуществляли на ко лонке К 9 / 6 0 с сефакрилом S200 HR («Phar- 292 т а с і а » ) , объем нанесения — 0,5 мл , буфер — 0,15 М NaCl, 10 мМ Na-фосфат , рН 4 ,5 , скорость элюции 1 м л / м и н . Для определения молекулярной массы использовали коэффициент распределения Kav и соответствующий график фирмы — изготови теля геля. Хроматографию проводили в HPLC-сис- теме фирмы «ISCO» (США). Для исследования взаимодействия протеиназы с мембраной к теням эритроцитов в концентрации 100 м к г / м л (по белку) добавляли равный объем раствора очищенной протеиназы, инкубировали в течение 30 с и пропускали через фильтр с диамет ром пор 0,45 мкм («МШіроге», С Ш А ) , определяли концентрацию несвязавшегося белка по Лоури. Ма тематический расчет кривой связывания выполня ли с помощью компьютерной программы Enzfitter («Elsevier-Biosoft», Англия) . Результаты и обсуждение. Опыт проведения хроматографического контроля качества яда пока зывает, что даже сравнительно непродолжительное выдерживание яда в растворе перед разделением при комнатной температуре приводит к некоторому искажению профиля элюции (рис. 1). Уже через 1 ч наблюдается искажение пиков, а через 3 ч яд формально не соответствуют стандарту. Такой ре зультат не зависел от образца яда, что предполага ет наличие протеиназы, а не является случайным загрязнением. Следует отметить, что аналогичные изменения, хотя и менее выраженные, наблюдают ся в некоторых образцах яда через 10 и более месяцев его хранения. Эти обстоятельства и послу жили основанием для проведения уже целенаправ ленных исследований. При проведении реакции для выявления проте- иназной активности в обычных условиях наблюда ется линейная зависимость повышения содержания в инкубационной среде кислоторастворимых Лоу- ри-положительных продуктов. Выбор рН был обу словлен тем, что в среднем водный раствор яда в концентрации 1 м г / м л имеет рН 4,3—4,7, а анализ специфической (гемолитической) активности пче линого яда проводят при рН 4,5. В связи с получен ным результатом дальнейшие исследования прово дили, инкубируя пробы на протяжении 3 ч. Корректный анализ любого фермента возмо жен только с учетом оптимальных условий его действия, в частности рН. Зависимость активности протеиназы от величины рН имеет довольно слож ный характер (рис. 2) . Максимальная активность наблюдается при рН 4,5 , а после практически полного ее падения при рН около 7 выявляется второй пик активности, хотя и значительно мень ший, чем в кислом диапазоне. Протеиназа была идентифицирована обратно- В Ы Д Е Л Е Н И Е И С В О Й С Т В А П Р О Т Е И Н А З Ы П Ч Е Л И Н О Г О ЯДА 1 і • і і і і 0 10 20 мин Рис. 1. Профили элюции яда на колонке PepRPC: а — исход ный (выделенный пик содержит протеиназную активность); б — через 3 ч после растворения; в — препарат очищенной протеи назы фазной хроматографией. Анализ всего профиля элюции протеиназной активности в приведенных выше условиях выявил ее только в одном пике (выделенный пик на рис. 1, а ) . Обращает на себя внимание очень высокий уровень гидрофобности фермента —элюция с колонки происходит при концентрации ацетонитрила около 80 % , то есть при концентрации, обычно используемой уже для 293 П Р О Т А С А. Ф . . Б О Н Д А Р Е В А О. С, М У Л Я В К О Н. А. промывки колонки. Содержание протеиназы в яде колебалось от 0,6 до 1,4 %. Анализ достаточно большого числа образцов показал, что частотное распределение содержания протеиназы в яде имеет определенную закономерность (рис 3, а ) . Пред ставляло интерес сопоставить эти данные с содер жанием протеиназы в единицах активности на единицу массы яда. Оказалось, что подобное, хотя и несколько менее выраженное распределение, на блюдается и при ферментативном анализе (рис. 3 , б). Наиболее вероятно, что больший разброс по сравнению с хроматографическими данными обус ловлен инактивацией протеиназы при сборе и хра нении яда. Таким образом, можно выделить два популяционных типа ядов — с относительно низ- Е, оти. еб. 1,0- 0,6- 0.2- Рис. 2. Зависимость активности протеиназы (Е) от рН. Бу фер — 10 мМ N a H 2 P 0 4 - u H T p a T ким и высоким содержанием протеиназы. Харак терно, что яд с промежуточным содержанием про теиназы встречается крайне редко. Надо полагать, что относительный уровень ее содержания детер минирован генетически. При гель-фильтрации яда на колонке с сефак- рилом S200 пик протеиназной активности симмет ричен и соответствует молекулярной массе 20 кДа (рис. 4 ) . Д л я построения калибровочного графика помимо данных фирмы — изготовителя геля (см. «Материалы и методы») использовали голубой де- кстран (V 0 ) , сывороточный альбумин человека (67 к Д а ) , овальбумин (45 кДа) и Р Н К а з у А (13,7 кДа) Аффинной хроматографией на бензамидин-се- фарозе (рис. 5) с последующей доочисткой обрат- нофазной хроматографией протеиназа может быть выделена в чистом виде (рис. 1, в) с удельной активностью около 110 ед /мг . Протеиназа обладает высокой субстратной спе цифичностью, что следует из приведенных ниже данных: Субстрат Активность, % Тени эритроцитов 100 САЧ 27 Гемоглобин 38 Д Н К а з а I 39 Миоглобин 3 Лизоцим 0 Гистоны 5 Протамин 5 Рис. 3. Частотное распределение содержания протеиназы в образцах яда на основе: а — относительного содержания при хроматографическом разделении (%); б— протеолитической активности. Ось ординат — частота встречаемости (%) 294 В Ы Д Е Л Е Н И Е И С В О Й С Т В А П Р О Т Е И Н А З Ы П Ч Е Л И Н О Г О ЯДА Рис. 5. Очистка протеиназы на бензамидин-сефарозе Некоторые белки она вообще не гидролизует. В то же время активность по отношению к белкам в составе клеточной мембраны (теней эритроцитов) не менее чем в два раза выше любого другого субстрата. С учетом высокой гидрофобности проте иназы можно предположить, что такая специфич ность обусловлена предварительной своеобразной иммобилизацией фермента на липидах или гидро фобных участках белков мембраны, что способст вует созданию благоприятных условий для прояв ления ферментативной активности. Не исключено также , что фермент в принципе гидролизует пре имущественно высокогидрофобные участки белков. В какой-то мере этот вопрос может быть решен при наличии количественной оценки взаимодействия протеиназы с клеточной мембраной. Оказалось, что протеиназа способна специфически связываться с тенями эритроцитов. При этом наблюдается типич ная 5-образная кривая связывания (рис. 6 ) , а график Хилла был линейным. При этом коэффици ент Хилла равен 5,8, равновесная константа ассо ц и а ц и и — 42 м к г / м л , а максимальный уровень связывания — 1,2 мг фермента на 1 мг белка эрит- роцитарной мембраны. Т а к и м образом, связывание каждой молекулы фермента облегчает связывание следующей. Надо полагать, что именно эти процес сы и обусловливают высокую активность и специ фичность протеиназы. Связывание протеиназы с клеточной мембраной имеет еще один аспект, ка сающийся субстратной специфичности протеиназы. Из полученных по максимальному уровню связы вания данных следует, что при достаточной кон центрации фермента клеточная мембрана оказыва ется полностью покрыта протеиназой. В такой си т у а ц и и э ф ф е к т и в н о с т ь г и д р о л и з а б у д е т чрезвычайно высокой, то есть субстратная специ фичность может быть обусловлена и таким спосо бом. 295 П Р О Т А С А. Ф . , Б О Н Д А Р Е В А О. С , М У Л Я В К О Н. А. Таким образом, в пчелином аде содержится высокогидрофобная протеиназа, действие которой специфически направлено на гидролиз белков, ас социированных с клеточной мембраной. Возможно, что у нее могут быть и другие функции, однако полученные результаты позволяют рассматривать ее как один из токсических факторов яда. Наличие протеиназы, несомненно, должно учитываться при контроле качества яда. Очевидно, что в тех случа ях, когда влажность яда достаточно высока, созда ются условия для эндогенной деградации компо нентов яда. Это ж е обстоятельство, видимо, накла д ы в а е т о п р е д е л е н н ы е о г р а н и ч е н и я на срок хранения яда. О. Ф. Протас, О. С. Бондарева, Н. О. Мулявко Виділення та властивості протеїнази бджолиної отрути Резюме Встановлено, що в отруті бджіл (Apis mellifera) міститься протеїнова в кількості 0,8—1,5 % від білково-пептидної фрак ции Хроматографією на бензамідин-сефарозі та зворотнофаз- ною хроматографією фермент очищено до гомогенного стану з питомою активністю ПО оді мг. Протеїназа має молеку лярну масу 20 кДа, рН-оптимум дії 4,5, їй притаманна висока гідрофобність та специфічність по відношенню до білків у складі мембран (тіней еритроцитів). Протеїназа кооператив но зв'язується з клітинною мембраною (еритроцитів), при цьому вона практично повністю зв'язується з мембраною, максимальне співвідношенняе зв'язування (в розрахунку на білок мембрани) — 1:1,2. Робиться висновок стосовно функції протеїнази як одного з токсичних компонентів отрути. A. F. Protas, О. S. Bondareva, N. О. Muliavko Purification and properties of bee venom protease Summary Bee venom contains specific protease. It consists about 0.8—1.5 % of total proteine-peptide fraction. The enzyme was purified with the help of benzamedine-sepharose and reverse-fase chromatography to the activity 110 U/mg. The protein is hydrophobic, its Mr is equal to 20 kDa (by gel-filtration), pHopt 4.5. Protease specifically binds to cell membrane in cooperative manner; the maximal binding ratio is 1.2. Enzyme has high substrate specifity for membrane proteins. It is concluded that protease is a specific toxic component of bee venom. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Ахунов А. Протеолитические ферменты ядов среднеазиат ских змей / / Вопр. герпентологии.—Л.: Наука, 1973.— С. 34—36. 2. Покровский А. А. Ферментный механизм некоторых ин токсикаций (попытка ферментной классификации ядов) / / Успехи, биол. х и м и и . — 1 9 6 2 . — № 4 .—С. 61—80. 3. Орлов Б. Н. Зоотоксинология.—M.: Высш. шк., 1985.— 228 с. 4. Иванов Ц., Шкендеров С. Пчелиные продукты.—София: Земиздат, 1985.—226 с. 5. Протас А. Ф., Чаяло П. П. Выделение гистон-специ- фической протеиназы из ядер клеток мозга крыс / / Укр. биохим. ж у р н . — 1 9 9 1 . — 6 3 , № 6 .—С. 99—102 . 6. Benzamidine Sefarose 6B. Pharmacia. Data Sheet. УДК 638.178.8 Поступила в редакцию 28.05.98 296

Выделение и свойства протеиназы пчелиного яда

Institution

Ähnliche Einträge