Изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2b интерферона человека в системе экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Escherichia coli

Изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2b интерферона человека в системе экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Escherichia coli

Биосинтез альфа-2b интерферона человека (ИФН) в іслетках Е. coli BL21 (DE3), несущих плазмиду рЕТ-аИФН, индуцировали различными (от 0,01 до 10 мМ) концентрациями изопропил-β-D-тиогалактозида (ИПТГ). Плазмида рЕТ-аИФН содержит искусственный ген ИФН под контролем промотора гена 10 фага Т7. Ген РНК-пол...

Повний опис

Збережено в:
Бібліографічні деталі
Дата:2003
Автори: Славченко, И.Ю., Борейко, Е.В., Воробей, Н.В.
Формат: Стаття
Мова:Russian
Опубліковано: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2003
Назва видання:Біополімери і клітина
Теми:
Молекулярна та клітинна біотехнології
Онлайн доступ:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156621
Теги: Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:Изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2b интерферона человека в системе экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Escherichia coli / И.Ю. Славченко, Е.В. Борейко, Н.В. Воробей // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 5. — С. 457-462. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-156621
record_format dspace
spelling irk-123456789-1566212019-06-19T01:26:54Z Изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2b интерферона человека в системе экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Escherichia coli Славченко, И.Ю. Борейко, Е.В. Воробей, Н.В. Молекулярна та клітинна біотехнології Биосинтез альфа-2b интерферона человека (ИФН) в іслетках Е. coli BL21 (DE3), несущих плазмиду рЕТ-аИФН, индуцировали различными (от 0,01 до 10 мМ) концентрациями изопропил-β-D-тиогалактозида (ИПТГ). Плазмида рЕТ-аИФН содержит искусственный ген ИФН под контролем промотора гена 10 фага Т7. Ген РНК-полимеразы фага Т7 находится в хромосоме клеток Е. coli BL21 (DE3) под контролем lac-UV5 промотора Е. coli. Обнаружено, что значение минимальной концентрации ИПТГ, обеспечивающей эффективную экспрессию целевого белка, возрастает с понижением температуры культивирования продуцента после индукции. Так, при 37 °С полная индукция достигается внесением в среду ИПТГ в конечной концентрации 0,06 мМ, а при 21 °С –0,1 мМ. Показано, что снижение концентрации индуктора до 0,01 мМ не способствует накоплению ИФН в растворимой форме при культивировании продуцента при температуре 37 °С. Также установлено, что ИПТГ в конечной концентрации до 2 мМ не оказывает негативного влияния на литическое развитие бактериофага лямбда и инфицированные им плазмидосодержащие клетки лизируются, в результате чего рекомбинантный белок в растворимой форме накапливается непосредственно в культуральной среде. Минимальная концен­трация ИПТГ, обеспечивающая максимальный выход ИФН при данном способе его получения, составляет 0,2 мМ. Біосинтез альфа-2b інтерферону людини (ІФН) у клітинах Е. coli BL21 (DE3), які несуть плазміду рЕТ-αІФН, індукували різними (від 0,01 до 10 мМ) концентраціями ізопропіл-β-D-тіогалактозиду (ІПТГ). Плазміда рЕТ-αІФН містить штуч­ний ген ІФН під контролем промотора гена 10 фага Т7. Ген РНК-полімерази фага Т7 знаходиться в хромосомі клітин Е. coli BL21 (DE3) під контролем lac-UV5 промотора Е. coli Виявлено, що значення мінімальної концентрації ІПТГ, яка забезпечує ефективну експресію цільового білка, зростають із зниженням температури культивування продуцента після індукції. Так, при 37 °С повна індукція досягається внесенням до середовища ІПТГ у кінцевій концентрації 0,06 мМ, а при 21 °С–0,1 мМ. Показано, що зниження концентрації індуктора до 0,01 мМ не сприяє накопиченню ІФН у розчинній формі при культивуванні продуцента при температурі 37 °С. Також визначено, що ІПТГ у кінцевій концентрації до 2 мМ не чинить негативного впливу на літичний розвиток бактеріо­фага лямбда і інфіковані їм клітини, що містять плазміду, лізуються, в результаті чого рекомбінантний білок у роз­чинній формі накопичується безпосередньо в культуральному середовищі. Мінімальна концентрація ІПТГ, яка забезпечує максимальний вихід ІФН при цьому способі його отримання, складає 0,2 мМ. Various concentrations (from 0.01 up to JO MM) of isopropyl-fi-D-thiogalactoside (IPTG) were used to induce the human atpha~2b interferon (IFN) biosynthesis by recombinant E. coli BL21 (DE3) cells, harboring plasmid pET-alFN. The plasmid pET-alFN carries an artificial gene for IFN, which is under the control of the gene 10 phage T7 promoter. The gene for phage T7 RNA polymerasc is situated in the chromosome of E. coli BL2I (DE3) cells under the control of the lac-UV5 E. coli promoter. We have found, that a minimum concentration of IPTG, ensuring effective expression of the target protein, increases with the lowering of the producer cultivation temperature after induction. Thus, the full induction is achieved by adding IPTG to the medium in final concentration 0.06 mM at 37 °C, and 0,1 mM at 21 °C. It was shown, that the decrease of inductor concentration up to 0.01 mM did not promote accumulation of IFN in a soluble form when producer was cultivated at the temperature of 37 °C. It was also determined that IPTG in final concentration up to 2 mM did not have negative effect on the lytic development of bacteriophage lambda. As a result of the lysis of E. coli BL (pET-alFN) cells, infected by phage, the recombinant protein in a soluble form accumulates immediately in a growth medium. The minimum concentration of IPTG, ensuring the maximum yield of IFN obtained by this method is 0.2 mM. 2003 Article Изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2b интерферона человека в системе экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Escherichia coli / И.Ю. Славченко, Е.В. Борейко, Н.В. Воробей // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 5. — С. 457-462. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000675 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156621 579.258 + 577.124 ru Біополімери і клітина Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
topic Молекулярна та клітинна біотехнології
Молекулярна та клітинна біотехнології
spellingShingle Молекулярна та клітинна біотехнології
Молекулярна та клітинна біотехнології
Славченко, И.Ю.
Борейко, Е.В.
Воробей, Н.В.
Изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2b интерферона человека в системе экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Escherichia coli
Біополімери і клітина
description Биосинтез альфа-2b интерферона человека (ИФН) в іслетках Е. coli BL21 (DE3), несущих плазмиду рЕТ-аИФН, индуцировали различными (от 0,01 до 10 мМ) концентрациями изопропил-β-D-тиогалактозида (ИПТГ). Плазмида рЕТ-аИФН содержит искусственный ген ИФН под контролем промотора гена 10 фага Т7. Ген РНК-полимеразы фага Т7 находится в хромосоме клеток Е. coli BL21 (DE3) под контролем lac-UV5 промотора Е. coli. Обнаружено, что значение минимальной концентрации ИПТГ, обеспечивающей эффективную экспрессию целевого белка, возрастает с понижением температуры культивирования продуцента после индукции. Так, при 37 °С полная индукция достигается внесением в среду ИПТГ в конечной концентрации 0,06 мМ, а при 21 °С –0,1 мМ. Показано, что снижение концентрации индуктора до 0,01 мМ не способствует накоплению ИФН в растворимой форме при культивировании продуцента при температуре 37 °С. Также установлено, что ИПТГ в конечной концентрации до 2 мМ не оказывает негативного влияния на литическое развитие бактериофага лямбда и инфицированные им плазмидосодержащие клетки лизируются, в результате чего рекомбинантный белок в растворимой форме накапливается непосредственно в культуральной среде. Минимальная концен­трация ИПТГ, обеспечивающая максимальный выход ИФН при данном способе его получения, составляет 0,2 мМ.
format Article
author Славченко, И.Ю.
Борейко, Е.В.
Воробей, Н.В.
author_facet Славченко, И.Ю.
Борейко, Е.В.
Воробей, Н.В.
author_sort Славченко, И.Ю.
title Изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2b интерферона человека в системе экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Escherichia coli
title_short Изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2b интерферона человека в системе экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Escherichia coli
title_full Изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2b интерферона человека в системе экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Escherichia coli
title_fullStr Изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2b интерферона человека в системе экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Escherichia coli
title_full_unstemmed Изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2b интерферона человека в системе экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Escherichia coli
title_sort изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2b интерферона человека в системе экспрессии на основе рнк-полимеразы фага т7 в клетках escherichia coli
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate 2003
topic_facet Молекулярна та клітинна біотехнології
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156621
citation_txt Изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2b интерферона человека в системе экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Escherichia coli / И.Ю. Славченко, Е.В. Борейко, Н.В. Воробей // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 5. — С. 457-462. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.
series Біополімери і клітина
work_keys_str_mv AT slavčenkoiû izučenievliâniârazličnyhkoncentracijinduktoranavyhodalʹfa2binterferonačelovekavsistemeékspressiinaosnovernkpolimerazyfagat7vkletkahescherichiacoli
AT borejkoev izučenievliâniârazličnyhkoncentracijinduktoranavyhodalʹfa2binterferonačelovekavsistemeékspressiinaosnovernkpolimerazyfagat7vkletkahescherichiacoli
AT vorobejnv izučenievliâniârazličnyhkoncentracijinduktoranavyhodalʹfa2binterferonačelovekavsistemeékspressiinaosnovernkpolimerazyfagat7vkletkahescherichiacoli
first_indexed 2025-07-14T09:00:42Z
last_indexed 2025-07-14T09:00:42Z
_version_ 1837612288241041408
fulltext ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2003. Т. 19. № 5 МОЛЕКУЛЯРНА І КЛІТИННА БІОТЕХНОЛОГІЇ Изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2Ь интерферона человека в системе экспрессии на основе РНК- полимеразы фага Т7 в клетках Escherichia coli И. Ю. Славченко 1 , 2 , Е. В. Борейко 1 , Н. В. Воробей 1 і ПНИК «Биотехнолог» Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143, Украина Е. mail: biotech@naverex.kiev.ua 2 Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143, Украина Биосинтез алъфа-2Ь интерферона человека (ИФН) в іслетках Е. coli BL21 (DE3), несущих плазмиду рЕТ-аИФН, индуцировали различными (от 0,01 до 10 мМ) концентрациями изопропил- p-D-тиогалактозида (ИПТГ). Плазмида рЕТ-аИФН содержит искусственный ген ИФН под контролем промотора гена 10 фага Т7. Ген РНК-полимеразы фага Т7 находится в хромосоме клеток Е. coli BL21 (DE3) под контролем lac-UV5 промотора Е. coli. Обнаружено, что значение минимальной концентрации ИПТГ, обеспечивающей эффективную экспрессию целевого белка, возрастает с понижением температуры культивирования продуцента после индукции. Так, при 37 °С полная индукция достигается внесением в среду ИПТГ в конечной концентрации 0,06 мМ, а при 21 °С —0,1 мМ. Показано, что снижение концентрации индуктора до 0,01 мМ не способствует накоплению ИФН в растворимой форме при культивировании продуцента при температуре 37 °С. Также установлено, что ИПТГ в конечной концентрации до 2 мМ не оказывает негативного влияния на литическое развитие бактериофага лямбда и инфицированные им плазмидосодержащие клетки лизируются, в результате чего рекомбинантный белок в растворимой форме накапливается непосредственно в культуральной среде. Минимальная концен­ трация ИПТГ, обеспечивающая максимальный выход ИФН при данном способе его получения, составляет 0,2 мМ. Введение. Использование регулируемых промото­ ров для транскрипции клонируемых генов позволя­ ет получать в значительных количествах рекомби- нантные белки, оказывающие токсическое воздей­ ствие на клетку, в частности, полипептиды гетеро- логичного происхождения в клетках Е. coli. Это достигается разобщением во времени процессов наращивания биомассы продуцента и синтеза целе­ вого продукта. Так, на первом этапе биотехнологического процесса клетки штамма-продуцента культивиру­ ют в условиях, оптимальных для их роста. И только после достижения бактериальной культурой заданной плотности индуцируют транскрипцию с © И. Ю СЛАВЧЕНКО, Е. В. Б О Р Е Й К О , Н. В. В О Р О Б Е Й , 2 0 0 3 промотора, под контролем которого находится це­ левой ген, и лишь на втором этапе создают опти­ мальные условия для эффективного синтеза целе­ вого белка. Для регулируемой экспрессии клонируемых ге­ нов широко используют /ас-промотор Е. coli и его мутанты, а также различные гибридные и синтети­ ческие промоторы, созданные на его основе, напри­ мер, tac, Ipp-lac, P2-lac, trc, Psyn, mac, гас и другие (см. обзоры [1, 2 ] ) . Индукторами этих промоторов являются лактоза и ее синтетический аналог изо- пропил-/?-0-тиогалактозид (ИПТГ). ИПТГ в отли­ чие от лактозы не метаболизируется бактериальной клеткой и чаще применяется для индукции транс­ крипции целевого гена, контролируемой /ас-промо­ тором или его производными. 457 mailto:biotech@naverex.kiev.ua СЛАВЧЕНКО И. Ю., Б О Р В Й К О Е. В., В О Р О Б Е Й Н. В. Для эффективного синтеза рекомбинантных белков разработаны и более сложные системы био­ синтеза, в которых /#с-промотор используют для транскрипции не целевого гена, а гена вспомога­ тельного продукта, необходимого для эффективной экспрессии целевого белка. Примером такого кас­ кадного процесса является система экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7, разработанная Стадиером [3] . В такой системе ген РНК-полиме­ разы фага Т7 под контролем lacUV5 промотора Е. coli локализован в хромосоме бактериальной клет­ ки, содержащей плазмиду с целевым геном под контролем промотора, узнаваемого РНК-полимера- зой фага Т7. При добавлении в среду индуктора лактозного оперона (лактозы или ИПТГ) синтези­ руется фаговый фермент, который с высокой эф­ фективностью и специфичностью осуществляет процесс транскрипции целевого гена, находящегося в составе плазмидного вектора под контролем про­ мотора фага Т7. Анализ литературных данных показал, что на­ иболее часто для индукции применяют ИПТГ в конечной концентрации 1 мМ. Однако в отдельных работах эффективный синтез целевых продуктов достигнут при использовании ИПТГ в концентра­ ции 0,1 мМ и меньше для индукции транскрипции целевого гена, контролируемой tac-промотором [4—7 ], /ас-промотором [8 ], а также в описанной выше системе экспрессии на основе РНК-полиме­ разы фага Т7 [9, 10] . Показано, что высокие концентрации ИПТГ могут стимулировать образо­ вание целевого продукта в нерастворимой форме [4, 6, 7, 9 ] , влиять на его локализацию (в цитоп­ лазме и/или периплазме), а также угнетать рост рекомбинантных бактерий [5] . Оптимальная концентрация индуктора для разных систем биосинтеза может колебаться в ши­ роких пределах и зависеть от множества факторов, таких как сила используемого промотора, нуклео- тидная последовательность клонируемого гена, ток­ сичность целевого продукта, состав питательной среды, физиологическое состояние клеток в момент индукции, использование того или иного штамма- продуцента и др. Поэтому поиск оптимальной кон­ центрации индуктора, обеспечивающей продуктив­ ный синтез целевого белка, является актуальной задачей при оптимизации технологий получения рекомбинантных полипептидов с использованием регулируемых промоторов. Цель настоящей работы заключалась в изуче­ нии влияния различных концентраций ИПТГ на выход рекомбинантного альфа-2Ь интерферона че­ ловека (ИФН) в системах экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Е. colt Материалы и методы. В работе использован ранее полученный [11] штамм Е. coli BL21 (рЕТ- аИФН) (F, ompT, hsdSfi (rB~ m~ gal dcm) (DE3), несущий плазмиду с искусственным геном, кодиру­ ющим альфа-2Ь интерферон человека, транскрип­ ция которого контролируется промотором гена 10 фага Т7. Плазмида сконструирована на основе вектора рЕТ-24а{+) (KanR) («Novagen», США) и трансформирована в штамм Е. coli BL21 (DE3). Для инфицирования продуцента использовали фаг AcI857Q~R~ (cI857Qaml 17Ram54), источником которого служил лизогенный штамм Е. coli К802 (hsdR\ hsdM", gar, met', SupE) (AcI857Q~R"~). В качестве индикаторной культуры при титровании фага использовали штамм Е. coli RLM1 {thi, leu", lac , tonA, SupE). Как правило, получали (1,5— 3,0) 10 1 0 БОЕ/мл лизата. Среды. Бактериальные культуры выращивали в жидкой питательной среде Porcine («Difco», США), приготовленной согласно рекомендации производителя. На основе разработанной нами сре­ ды ПВ10 (вода — 1 л, пептон (Винницкий мясо­ комбинат) — 10 г, NaCl — 10 г, дрожжевой экс­ тракт (USB) — 5 г) готовили 1,5 и 0,5 %-е агари- зованные среды. При выращивании плазмидосодержащих кле­ ток BL21 (рЕТ-аИФН) в среду добавляли канами- цин до конечной концентрации 50 мкг/мл. Для индукции синтеза целевого продукта в клетках BL21 (рЕТ-аИФН) в среду вносили раствор ИПТГ («Іпаїсо», США) до заданной конечной концентра­ ции. При использовании в биотехнологическом процессе бактериофага лямбда в жидкую среду добавляли 1 М раствор MgS0 4 из расчета 1 мл на 1 л среды, а также глицерин до конечной концен­ трации 2 %. Культивирование продуцента. Питательную среду засевали инокулятом Е. coli BL21 (рЕТ- аИФН), предварительно выращенным в термостате при температуре 37 °С в течение ночи. Соотноше­ ние объема инокулята к объему среды и объема среды к объему колбы составляло 1:10. Культуру выращивали на качалке в условиях интенсивной (160 об/мин) аэрации при температуре 37 °С до оптической плотности (ОП) 3,0. Затем по 25 мл культуральной среды переносили в колбы объемом 0,25 л и в каждую из них для индукции синтеза целевого продукта добавляли определенное количе­ ство раствора ИПТГ. В контрольный вариант ИПТГ не вносили. После этого продолжали куль­ тивирование продуцента при температуре 37 или 21 °С в течение ~ 18 ч. При получении рекомбинантного белка с ис­ пользованием фага перед индукцией культуру ин­ фицировали фагом AcI857Q~R~, добавляя заранее полученный фаголизат в количестве 1/5 объема культуральной среды, и продолжали культивирова­ ние в течение 18 ч при температуре 21 °С. 458 В Л И Я Н И Е К О Н Ц Е Н Т Р А Ц И И И Н Д У К Т О Р А НА В Ы Х О Д А Л Ь Ф А - 2 Ь И Ф Н Получение фаголизата AcI857Q~R~, эл ектрофо- ретический анализ растворимой и нерастворимой фракций клеточных белков, суммарных белков плазмидосодержащих клеток и их фаголизатов осу­ ществляли, как описано ранее [12] . Для электрофоретического анализа белков на полиакриламидный гель наносили образцы в коли­ честве, эквивалентном 10 мкл клеточной суспензии или супернатанта фаголизата. Выход биомассы определяли по оптической плотности на фотоколориметре КФК-3 (РФ) при А= = 540 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Выход целевого продукта устанавливали по процентному содержанию ИФН в образцах денси- тометрированием соответствующих дорожек геля с помощью прибора Image Master («Pharmacia Bio- tech», Швеция). Результаты и обсуждение. Влияние различных концентраций ИПТГ на выход рекомбинантного альфа-2Ь интерферона человека исследовали в двух ранее [11] разработанных нами биотехноло­ гических системах получения данного белка с ис­ пользованием РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Е. coli. Первая система базируется на стандартном способе получения рекомбинантных белков путем культивирования клеток, несущих плазмиду с це­ левым геном, в данном случае BL21 (рЕТ-аИФН). После внесения ИПТГ в культуральную среду индуцируется синтез целевого продукта, который накапливается внутри бактериальной клетки. Для извлечения рекомбинантного белка клетки необхо­ димо разрушить, что в условиях промышленного производства не только требует использования до­ рогостоящего оборудования, но и приводит к зна­ чительным потерям целевого продукта. Вторая система основана на разработанных нами ранее способах получения рекомбинантных белков с использованием бактериофага Я и преду­ сматривает инфицирование фагом на определенном этапе технологического процесса клеток штамма- продуцента, несущих плазмиду с целевым геном. В результате фаговой инфекции бактериальные клет­ ки лизируются и целевой белок высвобождается в культуральную среду. Использование бактериофага лямбда в биотехнологическом процессе обеспечива­ ет накопление рекомбинантного белка непосредст­ венно в культуральной среде и, как показано нами в работе [13] , может способствовать накоплению целевого продукта в растворимой форме. На первом этапе работы исследовали влияние различных концентраций ИПТГ на выход ИФН, культивируя клетки Е. coli BL21 (рЕТ-аИФН) при температуре 37 ° С Ранее нами установлено [11] , что если после индукции ИПТГ (1 мМ) процесс биосинтеза ИФН осуществляется при данной тем­ пературе, то выход целевого белка более высокий, чем при 21 ° С Однако рекомбинантный полипеп­ тид при 37 °С накапливается в клетках в нераство­ римом виде. В первой серии экспериментов для индукции синтеза целевого продукта использовали ИПТГ с конечной концентрацией в интервале от 0,1 до 10 мМ, а именно: 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 2; 4; 6; 8; 10 мМ. В контрольный вариант ИПТГ не вносили. Культивирование продуцента осуществля­ ли, как описано в разделе «Материалы и методы». Образцы отбирали через 4 ч после индукции и по окончании процесса, измеряли их ОП, проводили электрофоретический анализ суммарных белков клетки, а также фракций растворимых и нераство­ римых белков. В результате проведенных исследований уста­ новлено следующее. Согласно данным, полученным при электрофоретическом анализе лизатов клеток штамма-продуцента, выход ИФН при индукции его синтеза ИПТГ с конечной концентрацией в интер­ вале от 0,1 до 10 мМ находится примерно на одном уровне как через 4 ч после индукции, так и через 18 ч (данные не представлены) и колеблется в пределах 15—20 % от суммарных белков клетки. В контрольном образце, в котором синтез ИФН не индуцировали, целевой белок электрофоретически не определяется. Анализ значений ОП в образцах через 4 ч после индукции показал, что выход биомассы при концентрации индуктора 0,1 мМ на 4±1 % ниже, чем в контроле. При более высоких концентрациях ИПТГ выход биомассы еще ниже. Однако статистически достоверной зависимости уг­ нетения роста от концентрации индуктора в преде­ лах 0,2—10 мМ не установлено, и уменьшение выхода биомассы при таких концентрациях индук­ тора в среднем ниже по сравнению с контролем на 24 ,9±4 %. Минимальная концентрация ИПТГ, обеспечи­ вающая эффективный синтез ИФН в первой серии экспериментов, не была установлена, поскольку она не находится в пределах 0,1—10 мМ. В связи с этим исследовали влияние на выход ИФН более низких концентраций индуктора — от 0,01 до 0,1 мМ: в культуральную среду добавляли ИПТГ до конечной концентрации 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 и 0,1 мМ. Электрофореграмма образцов, получен­ ных в одном из таких экспериментов, представлена на рис. 1. В результате проведенных исследований уста­ новлено, что при использовании индуктора в мини­ мальной концентрации (0,01 мМ) выход ИФН составляет около 5 % (дорожка 2) и постепенно увеличивается до 16 % при повышении концентра­ ции ИПТГ до 0,06 мМ (дорожки J—5). При кон­ центрации 0,06; 0,08 и 0,1 мМ выход целевого белка находится на одном уровне (дорожки 5—7). Анализ значений ОП в образцах через 4 ч после индукции показал, что незначительное снижение 459 СЛАВЧЕНКО И. Ю. , Б О Р Е Й К О Е. В. , В О Р О Б Е Й Н. В. М 1 2 3 4 5 6 7 Рис. 1. Электрофореграмма суммарных белков клеток Е. coli BL (рЕТ-аИФН), культивированных при температуре 37 °С в течение 4 ч после индукции различными конечными концент­ рациями изопропил-^-Б-тиогалактозида: 1 — 0 (контроль); 2 — 0,01; 3 — 0,02; 4 — 0,04; 5 — 0,06; 6 — 0,08; 7 — 0,1 мМ; м — маркер интерферона выхода биомассы наблюдается при концентрации ИПТГ 0,1 мМ, а при концентрациях от 0,01 до 0,08 ОП образцов такая же, как в контроле. Из данных, полученных в первой и второй серии экспериментов, следует, что выход целевого белка при концентрациях ИПТГ от 0,06 до 10 мМ имеет близкие значения. Поэтому наблюдающееся умень­ шение выхода биомассы при 0,1 мМ на 4 ± 1 %, а при концентрации ИПТГ от 0,2 до 10 мМ — на 24 ,9±4 %, вероятнее всего, в конкретных условиях данного эксперимента имеет место не за счет токсического действия рекомбинантного белка, а обусловлено присутствием ИПТГ в культуральной среде. Однако для подтверждения этого предполо­ жения необходимо провести специальные исследо­ вания, которые не были выполнены, поскольку не являлись задачей данной работы. Электрофоретический анализ растворимой и нерастворимой фракций белков показал, что сни­ жение концентрации индуктора не способствовало накоплению ИФН в растворимой форме (данные не представлены). В настоящее время снижение кон­ центрации индуктора рассматривается как один из подходов, предотвращающих образование рекомби­ нантного белка в неактивной нерастворимой фор­ ме, о чем свидетельствуют успехи, достигнутые в некоторых работах [4, 6, 7, 9 ] . Но не всегда данный прием, как и в представленной работе, приводит к желаемому результату. Хотя в данной системе биосинтеза уменьшение концентрации индуктора не способствовало нако­ плению ИФН в растворимой форме, однако другой подход, применение которого способствует повыше­ нию растворимости рекомбинантных белков, а именно — снижение температуры культивирования продуцента, как показано нами ранее [11 ], обеспе­ чивает накопление в клетках ИФН преимущест­ венно в растворимом виде. Считается, что как в случае уменьшения концентрации индуктора, так и температуры культивирования продуцента после индукции снижается скорость синтеза целевого белка и это способствует правильной сборке реком­ бинантного полипептида. На следующем этапе работы исследовали вли­ яние различных концентраций ИПТГ (от 0,01 до 10 мМ) на выход интерферона при культивирова­ нии клеток Е. coli BL21 ірЕТ-аИФН) после индук­ ции при температуре 21 ° С Ранее нами установлено [11] , что скорость накопления целевого белка при 21 °С значительно ниже, чем при 37 °С. Поэтому для достижения максимального выхода ИФН клетки после индук­ ции необходимо культивировать при 21 °С более продолжительное время, чем при 37 °С. Однако при пониженной температуре даже в случае увели­ чения времени культивирования продуцента на­ блюдается более низкий выход ИФН (10—11 % от суммарных белков клетки), чем при 37 °С, однако он накапливается в клетках преимущественно в растворимой форме. Поэтому в данной серии экс­ периментов образцы отбирали по окончании био­ технологического процесса (через 18 ч после ин­ дукции), измеряли их ОП и проводили электрофо­ ретический анализ только суммарных белков клетки. В результате обнаружено, что ИФН в конт­ рольном варианте (без добавления ИПТГ) (рис. 2, дорожка 7) и в вариантах, в которых для индукции синтеза интерферона использовали ИПТГ в кон­ центрации 0,01 (дорожка 2) и 0,02 мМ, (дорожка 3) электрофоретически не выявляется. При конеч­ ной концентрации ИПТГ в культуральной среде 0,04 мМ целевой белок составляет около 7 % от суммарных белков клетки (дорожка 4) и его выход повышается с увеличением концентрации ИПТГ до 0,1 мМ (дорожки 5—7). Дальнейшее повышение концентрации индуктора не привело к статистиче­ ски достоверному увеличению выхода целевого белка (данные не представлены). Полученные ре­ зультаты свидетельствуют о том, что температура культивирования продуцента может влиять на зна­ чение минимальной концентрации индуктора, обеспечивающей эффективную экспрессию целево­ го продукта. В этом случае при снижении темпера­ туры культивирования продуцента требуются более высокие концентрации ИПТГ. 460 В Л И Я Н И Е К О Н Ц Е Н Т Р А Ц И И И Н Д У К Т О Р А НА В Ы Х О Д АЛЬФА-2Ь И Ф Н 1 2 3 4 5 6 7 М Рис. 2. Электрофореграмма суммарных белков клеток Е. coli BL (рЕТ-аИФН), культивированных при температуре 21 °С в течение 18 ч после индукции различными конечными концент­ рациями изопропил-^-Б-тиогалактозида: / — 0 (контроль); 2 — 0,01; 3 — 0,02; 4 — 0,04; J — 0,06; 6 — 0,08; 7 — 0,1 мМ; м — маркер интерферона Так, при культивировании продуцента после индукции при температуре 37 °С целевой белок электрофоретически определяется при конечной концентрации ИПТГ 0,01 мМ, а при температуре 21 °С — только при концентрации ИПТГ в 4 раза выше (0,04 мМ). Полную индукцию при 37 °С обеспечивает ИПТГ в конечной концентрации 0,06 мМ, а при 21 °С — 0,1 мМ. На следующем этапе работы изучали влияние конечной концентрации индуктора от 0,01 до 2 мМ на выход ИФН в системе его биосинтеза с исполь­ зованием бактериофага лямбда. Процесс биосинте­ за осуществляли, как описано в разделе «Материа­ лы и методы». Образцы для анализа отбирали по окончании биотехнологического процесса, измеря­ ли их ОП и проводили электрофоретический ана­ лиз супернатантов. В ходе исследований установлено, что ИПТГ в конечной концентрации от 0,01 до 2 мМ не оказы­ вает негативного влияния на литическое развитие бактериофага и ОП образцов, инфицированных фагом AcI857Q~R~, независимо от концентрации индуктора колебалась в пределах 1,7—2,0. При этом ОП контрольного образца, в который не вносили ИПТГ, составляла также около 2,0, а в контроле с добавлением 1 мМ ИПТГ, но не инфи­ цированном фагом, — 8,5. Электрофоретический анализ супернатантов фаголизатов показал, что в данной системе биосин­ теза ИФН требуется несколько большая концент­ рация индуктора, чем в системе без использования бактериофага лямбда. На рис 3 представлена элек­ трофореграмма образцов, полученных в одном из таких экспериментов. Так, согласно данным элект- рофоретического анализа, ИФН визуально регист­ рируется в образце, в котором для индукции син­ теза ИФН использовали ИПТГ в концентрации 0,08 мМ (дорожка J) и его выход составляет около 6 % от растворимых белков клетки. С увеличением концентрации ИПТГ до 0,2 мМ (дорожка 7) выход ИФН повышается с 6 до 10 % и колеблется в пределах 10—11 % при концентрации ИПТГ 0,4; 0,6; 0,8 и 1 мМ (дорожки 8—77). Таким образом, в результате проведенных ис­ следований установлено, что минимальная концен­ трация индуктора, обеспечивающая эффективный синтез рекомбинантного альфа-2Ь интерферона че­ ловека, различна для анализируемых в данной работе систем экспрессии на основе РНК-полиме- разы, фага Т7 и может зависеть от температурного режима культивирования клеток штамма-проду­ цента Е. coli BL21 (рЕТ-аИФН). Показано, что при температуре 37 °С полная индукция достигается при конечной концентрации ИПТГ 0,06 мМ, при 21 °С — 0,1 мМ, а в системе с использованием бактериофага лямбда — 0,2 мМ. Это значительно меньше рекомендуемой концент­ рации 1 мМ. Поэтому поиск оптимальной концен­ трации индуктора может рассматриваться как один из этапов оптимизации технологии получения ре­ комбинантных полипептидов с использованием ре­ гулируемых промоторов. М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И Рис. 3. Электрофореграмма супернатантов фаголизатов клеток Е. coli BL (рЕТ-аИФН), культивированных при температуре 21 °С в течение 18 ч после индукции различными конечными концентрациями изопропил-уЗ-Б-тиогалактозида: / — 0 (конт­ роль); 2 — 0,02; 3 — 0,04; 4 — 0,06; 5 — 0,08; 6 — 0,1; 7 — 0,2; $ — 0,4; 9 — 0,6; / 0 — 0,8; / / — 1 , 0 мМ; м — маркер интерферона 461 СЛАВЧЕНКО И. Ю . , Б О Р Е Й К О Е В., В О Р О Б Е Й Н. В. Кроме того, при крупномасштабном производ­ стве рекомбинантного интерферона, учитывая до­ статочно высокую стоимость ИПТГ, использование е ю минимальной концентрации для индукции мо­ жет привести к значительному экономическому эффекту и к снижению себестоимости конечного продукта. /. Yu. Slavchenko, Е. V. Вогеуко, N. V. Vorobey Influence of various inductor concentrations on the human alpha-2b interferon production in the bacteriophage T7 RNA polymerase-base expression system in Escherichia coli cells Summary Various concentrations (from 0.01 up to JO мМ) of isopropyl-fi-D- thiogalactoside (IPTG) were used to induce the human alpha-2b interferon (JFN) biosynthesis by recombinant E. coli BL21 (DE3) cells, liarboring plasmid рЕТ-aIFN. The plasmid рЕТ-aIFN carries an artificial gene for I FN, which is under the control of the gene JO phage T7 promoter. The gene for phage T7 RNA polymerase is situated in the chromosome of E. coli BL2J (DE3) cells under the control of the lac-UV5 E. coli promoter. We have found, that a minimum concentration of IPTG, ensuring effective expression of the target protein, increases with the lowering of the producer cultivation temperature after induction. Thus, the full induction is achieved by adding JPTG to the medium in final concentration 0.06 mM at 37 °С, and 0,J mM at 21 °С. It was shown, that the decrease of inductor concentration up to 0.01 mM did not promote accumulation of I FN in a soluble form when producer was cultivated at the temperature of 37 °С. It was also determined that IPTG in final concentration up to 2 mM did not have negative effect on the lytic development of bacteriophage lambda. As a result of the lysis of E. coli BL (рЕТ-aIFN) cells, infected by phage, the recombinant protein in a soluble form accumulates immediately in a growth medium. The minimum concentration of IPTG, ensuring the maximum yield of I FN obtained by this method is 0.2 mM. I. Ю. Славченко, О. В. Борейко, Н. В. Воробей Вивчення впливу різних концентрацій індуктора на вихід альфа- 2Ь інтерферону людини в системі експресії на основі РНК- полімерази фага Т7 у клітинах Escherichia coli Резюме Біосинтез альфа-2Ь інтерферону людини (ІФН) у клітинах Е. coli BL21 (DE3), які несуть плазміду рЕТ-аіФН, індукували різними (від 0,01 до 10 мМ) концентраціями ізопропіл-p-D- тіогалактозиду (ІПТГ). Плазміда рЕТ-аІФН містить штуч­ ний ген ІФН під контролем промотора гена 10 фага Т7. Ген РНК-полімерази фага Т7 знаходиться в хромосомі клітин Е. coli BL21 (DE3) під контролем lac-UV5 промотора Е. coli Виявлено, що значення мінімальної концентрації ІПТГ, яка забезпечує ефективну експресію цільового білка, зростають із зниженням температури культивування продуцента після індукції. Так, при 37 °С повна індукція досягається внесенням до середовища ІПТГ у кінцевій концентрації 0,06 мМ, а при 21 °С—0,1 мМ. Показано, що зниження концентрації індуктора до 0,01 мМ не сприяє накопиченню ІФН у розчинній формі при культивуванні продуцента при температурі 37 °С. Також визначено, що ІПТГ у кінцевій концентрації до 2 мМ не чинить негативного впливу на літичний розвиток бактеріо­ фага лямбда і інфіковані їм клітини, що містять плазміду, лізуються, в результаті чого рекомбінантний білок у роз­ чинній формі накопичується безпосередньо в культуральному середовищі. Мінімальна концентрація ІПТГ, яка забезпечує максимальний вихід ІФН при цьому способі його отримання, складає 0,2 мМ. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Balbas P. Understanding the art of producing protein and nonprotein molecules in Escherichia coli II Мої. Biotechnol.— 2001.—19, N 3 .—P. 251—267. 2. Friehs K, Reardon K. F. Parameters influencing the produc­ tivity of recombinant E. coli cultivations / / Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.—1993.—48.—P. 53—77. 3. Studier F. W., Moffatt B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes / / J. Мої. Biol .—1986.—189, N 1.—P. 113—130. 4. Sawyer J. R., Schlom J., Kashmiri S. V. The effects of induction conditions on production of a soluble anti-tumor sFv in Escherichia coli II Protein Eng.—1994.—7, N 11.— P. 1401 — 1406. 5. Sriubolmas N., Panbangred W., Sriurairatana S., Meevoo- tisom V. Localization and characterization of inclusion bodies in recombinant Escherichia coli cells overproducing penicillin G acylase / / Appl. Microbiol. Biotechnol.—1997.—47, N 4.— P. 373—378. 6. Waters S., Neujahr H. Y. A fermentor culture for production of recombinant phenol hydroxylase / / Protein Exp. Purif.— 1994.—5, N 6.—P. 534—540. 7. Bowden G. A., Georgiou G. Folding and aggregation of beta-lactamase in the periplasmic space of Escherichia coli II J. Biol. Chem.—1990.—265, N 28.—P. 16760—16766. 8. Donovan R. S., Robinson C. W., Glick B. R. Optimizing the expression of a monoclonal antibody fragment under the transcriptional control of the Escherichia coli lac promoter / / Can. J. Microbiol.—2000.—46, N 6.—P. 532—541. 9. Yang Q. H., Wu C. L., Lin K, Li L. Low concentration of inducer favors production of active form of 6-phosphofructo-2- kinase/fructose-2,6-bisphosphatase in Escherichia coli II Pro­ tein Exp. Purif .—1997.—10, N 3 .—P. 320—324. 10. Galloway C. A., Sowden M. P., Smith H. C. Increasing the yield of soluble recombinant protein expressed in E. coli by induction during late log phase / / Biotechniques.—2003.—34, N 3.—P. 524—530. 11. Славченко И. Ю., Борейко Е. В., Воробей Н. В., Черных С. И., Кордюм В. А. Суперсинтез альфа-2Ь интерферона человека в клетках Escherichia coli в растворимой форме с использованием системы экспрессии на основе РНК-поли­ меразы фага Т7 / / Біополімери і клітина.—2003.—19, № 4.—С. 367-373. 12. Славченко И. Ю., Борейко Е. В., Гаврииі Т. Г., Костю- ченко И. П., Кордюм В. А. Биосинтез основного фактора роста фибробластов человека в клетках Escherichia coli и его очистка / / Біополімери і клітина.—2003.—19, № 2.— С. 179—184. 13. Славченко И. Ю., Борейко Е. В., Воробей Н. В., Гаврииі Т. Г., Пехота Е. H.f Кордюм В. А. Суперсинтез и очистка метионинаминопептидазы Escherichia coli II Біополімери і клітина.—2003.—19, № 3 . — С — 2 7 4 — 2 8 0 . УДК 579.258 + 577.124 Надійшла до редакції 30.05.03 462

Схожі ресурси