Влияние различных концентраций глицерина на выход и растворимость рекомбинантной метионинаминопептидазы Escherichia coli

Изучали влияние глицерина на выход и растворимость рекомбинантного белка в модельной системе суперсинтеза метионинаминопептидазы (MAP) Е. coli с использованием РНК-полимеразы фага Т7. Обнаружено, что глицерин в составе богатой питательной среды может угнетать рост штамма-продуцента, способствовать н...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2003
Hauptverfasser:	Славченко, И.Ю., Борейко, Е.В., Воробей, Н.В.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2003
Schriftenreihe:	Біополімери і клітина
Schlagworte:	Молекулярна та клітинна біотехнології
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156688
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Влияние различных концентраций глицерина на выход и растворимость рекомбинантной метионинаминопептидазы Escherichia coli / И.Ю. Славченко, Е.В. Борейко, Н.В. Воробей // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 6. — С. 530-535. — Бібліогр.: 29 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-156688
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1566882019-06-19T01:29:58Z Влияние различных концентраций глицерина на выход и растворимость рекомбинантной метионинаминопептидазы Escherichia coli Славченко, И.Ю. Борейко, Е.В. Воробей, Н.В. Молекулярна та клітинна біотехнології Изучали влияние глицерина на выход и растворимость рекомбинантного белка в модельной системе суперсинтеза метионинаминопептидазы (MAP) Е. coli с использованием РНК-полимеразы фага Т7. Обнаружено, что глицерин в составе богатой питательной среды может угнетать рост штамма-продуцента, способствовать накоплению целевого продукта в растворимой форме и влиять на его выход. Показано, что манипулирование такими параметрами, как концентрация глицерина и оптическая плотность культуры, при которой его вносят в питательную среду, позволяет целенаправленно увеличивать выход МАР в растворимой форме. Разработанные подходы могут быть использованы для получения других рекомбинантных белков в клетках Е. coli. Вивчали вплив гліцерину на вихід і розчинність рекомбінантного білка в модельній системі суперсинтезу метіонін амінопептидази (МАР) Е. coli з використанням РНК-полімерази фага Т7. Виявлено, що гліцерин у складі багатого поживного середовища може пригнічувати ріст штаму-продуцента, сприяти накопиченню цільового продукту в розчинній формі і впливати на його вихід. Показано, що маніпулювання такими параметрами, як концентрація гліцерину і оптична густина культури, при якій його вносять у середовище, дозволяє цілеспрямовано підвищувати вихід МАР у розчинній формі. Розроблені в даному дослідженні підходи можна використовувати для одержання інших рекомбінантніх білків у клітинах Е. coli. The influence of glycerol on the yield and solubility of a recombinant protein in a model system of E. coli methionine aminopeptidase (MAP) overproduction using the bacteriophage 77 RNA polymerase has been investigated. We have found, that glycerol added in a rich medium may inhibit the producer growth, promote the MAP accumulation in a soluble form and influence the target product yield. It has been shown, that manipulation of such parameters as glycerol concentration and culture optical density, when glycerol is added to the medium, allows purposely to increase the MAP yield in a soluble form. The approaches developed may be applicable for the production of other recombinant proteins in E. coli cells. 2003 Article Влияние различных концентраций глицерина на выход и растворимость рекомбинантной метионинаминопептидазы Escherichia coli / И.Ю. Славченко, Е.В. Борейко, Н.В. Воробей // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 6. — С. 530-535. — Бібліогр.: 29 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.00067F http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156688 579.258 + 577.124 ru Біополімери і клітина Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Молекулярна та клітинна біотехнології Молекулярна та клітинна біотехнології
spellingShingle	Молекулярна та клітинна біотехнології Молекулярна та клітинна біотехнології Славченко, И.Ю. Борейко, Е.В. Воробей, Н.В. Влияние различных концентраций глицерина на выход и растворимость рекомбинантной метионинаминопептидазы Escherichia coli Біополімери і клітина
description	Изучали влияние глицерина на выход и растворимость рекомбинантного белка в модельной системе суперсинтеза метионинаминопептидазы (MAP) Е. coli с использованием РНК-полимеразы фага Т7. Обнаружено, что глицерин в составе богатой питательной среды может угнетать рост штамма-продуцента, способствовать накоплению целевого продукта в растворимой форме и влиять на его выход. Показано, что манипулирование такими параметрами, как концентрация глицерина и оптическая плотность культуры, при которой его вносят в питательную среду, позволяет целенаправленно увеличивать выход МАР в растворимой форме. Разработанные подходы могут быть использованы для получения других рекомбинантных белков в клетках Е. coli.
format	Article
author	Славченко, И.Ю. Борейко, Е.В. Воробей, Н.В.
author_facet	Славченко, И.Ю. Борейко, Е.В. Воробей, Н.В.
author_sort	Славченко, И.Ю.
title	Влияние различных концентраций глицерина на выход и растворимость рекомбинантной метионинаминопептидазы Escherichia coli
title_short	Влияние различных концентраций глицерина на выход и растворимость рекомбинантной метионинаминопептидазы Escherichia coli
title_full	Влияние различных концентраций глицерина на выход и растворимость рекомбинантной метионинаминопептидазы Escherichia coli
title_fullStr	Влияние различных концентраций глицерина на выход и растворимость рекомбинантной метионинаминопептидазы Escherichia coli
title_full_unstemmed	Влияние различных концентраций глицерина на выход и растворимость рекомбинантной метионинаминопептидазы Escherichia coli
title_sort	влияние различных концентраций глицерина на выход и растворимость рекомбинантной метионинаминопептидазы escherichia coli
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2003
topic_facet	Молекулярна та клітинна біотехнології
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156688
citation_txt	Влияние различных концентраций глицерина на выход и растворимость рекомбинантной метионинаминопептидазы Escherichia coli / И.Ю. Славченко, Е.В. Борейко, Н.В. Воробей // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 6. — С. 530-535. — Бібліогр.: 29 назв. — рос.
series	Біополімери і клітина
work_keys_str_mv	AT slavčenkoiû vliânierazličnyhkoncentracijglicerinanavyhodirastvorimostʹrekombinantnojmetioninaminopeptidazyescherichiacoli AT borejkoev vliânierazličnyhkoncentracijglicerinanavyhodirastvorimostʹrekombinantnojmetioninaminopeptidazyescherichiacoli AT vorobejnv vliânierazličnyhkoncentracijglicerinanavyhodirastvorimostʹrekombinantnojmetioninaminopeptidazyescherichiacoli
first_indexed	2025-07-14T09:03:25Z
last_indexed	2025-07-14T09:03:25Z
_version_	1837612459652808704
fulltext	ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина* 2003. Т. 19. № 6 Влияние различных концентраций глицерина на выход и растворимость рекомбинантной метионинаминопептидазы Escherichia coli И. Ю- Славченко1' 2 , Е. В. Борейко1, Н. В. Воробей1 і ПНИК «Биотехнолог» Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143, Украина 2 Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143 , Украина Е. mail: biotech@naverex.kiev.ua Изучали влияние глицерина на выход и растворимость рекомбинантного белка в модельной системе суперсинтеза метионинаминопептидазы (MAP) Е. coli с использованием РНК-полимера- зы фага Т7. Обнаружено, что глицерин в составе богатой питательной среды может угнетать рост штамма-продуцента, способствовать накоплению целевого продукта в растворимой форме и влиять на его выход. Показано, что манипулирование такими параметрами, как концентрация глицерина и оптическая плотность культуры, при которой его вносят в питательную среду, позволяет целенаправленно увеличивать выход МАР в растворимой форме. Разработанные подходы могут быть использованы для получения других рекомбинантных белков в клетках Е. coli. Введение. При высоком уровне экспрессии клони руемых генов в бактериальных культурах, в част ности, в Е. coli рекомбинантные белки как гетеро-, так и гомологичного происхождения очень часто накапливаются в клетках штамма-продуцента в виде нерастворимых агрегатов, получивших назва ние «тельца включений» (inclusion bodies). В таких тельцах включений (IBs) рекомбинантный белок находится в неактивном, часто денатурированном и связанном с рибосомами, нуклеиновыми кислотами и цитоплазматическими белками состоянии. Это значительно усложняет процесс получения целево го белка в биологически активной форме, при котором необходимо применять методы, связанные с денатурацией полипептидов и последующей рена- турацией уже очищенных препаратов (см. обзоры [1—3]). При этом выход активного белка из IBs, как правило, не превышает 10—20 %. Однако проблемы, связанные с накоплением рекомбинантных белков в нерастворимом виде, не ограничиваются усложнением технологического © И. Ю. С Л А В Ч Е Н К О , Е. В. Б О Р Е Й К О , Н. В. В О Р О Б Е Й , 2 0 0 3 процесса и большими потерями целевого продукта. Полученные препараты могут содержать молекулы с измененными свойствами, поскольку рекомби нантный белок приходится солюбилизировать в жестких условиях с использованием мощных дена турирующих агентов, таких как гуанидинхлорид, мочевина и детергенты. Такие манипуляции могут неблагоприятно сказываться на структурно-функ циональных и антигенных свойствах генно-инже нерного продукта, что нежелательно при дальней шем использовании его как для изучения физико- химических и биологических свойств, так и получения препаратов для медицинских целей. По этому для решения проблем, связанных с синтезом рекомбинантных белков в нерастворимом виде, ис следователи наряду с оптимизацией методов выде ления активного белка из IBs разрабатывают стра тегии, обеспечивающие накопление целевого про дукта в бактериальной клетке в растворимом виде. Одним из подходов, способствующих накопле нию рекомбинантных белков в растворимой форме, является увеличение в бактериальной клетке кон центрации молекулярных шаперонов, участвую- 530 mailto:biotech@naverex.kiev.ua В Л И Я Н И Е Г Л И Ц Е Р И Н А НА В Ы Х О Д М Е Т И О Н И Н А М И Н О П Е П Т И Д А З Ы Е. COLI щих в фолдинге белка, например, GroEL/GroES, DnaJ/DnaK [4—6], что достигается их коэкспрес- сией с целевым продуктом. Показано, что такие параметры, как специфи ческая скорость роста и эффективность синтеза рекомбинантного продукта могут влиять на его растворимость [7 ]. Эти и другие показатели во многом зависят от условий культивирования про дуцента, в частности, состава питательной среды, температурного режима культивирования проду цента, уровня аэрации и т. д. Так, добавление в питательную среду этанола [8, 9], а также немета- болизируемых Сахаров, например сахарозы [10— 12], в некоторых случаях позволило добиться ожи даемого результата. Внесение в питательную среду в условиях осмотического шока таких химических шаперонов, как глицинбетаин, сорбит и др., также может способствовать получению рекомбинантного белка в растворимом виде [13, 14]. В работе [15] авторами продемонстрировано, что при культиви ровании продуцента в бедной среде целевой белок образовывался в виде IBs, в то время как в богатой среде — в растворимом виде. Использование неко торых технологических приемов, в частности, сни жение температуры культивирования клеток штам ма-продуцента [5, 16—19], рН среды [20] и кон центрации индуктора [10, 12, 21] также может способствовать накоплению рекомбинантного белка в растворимой форме. Несмотря на большой интерес к решению про блемы биосинтеза рекомбинантных белков в нера створимом виде, процесс образования IBs еще мало изучен. Поэтому поиск факторов, влияющих на получение рекомбинантных белков в растворимом виде, помогает приблизиться к пониманию данного процесса и создавать технологии, позволяющие получать рекомбинантные белки в активной рас творимой форме, что является актуальной задачей при выполнении работ как фундаментального, так и прикладного характера. Целью данной работы явилось изучение влия ния различных концентраций глицерина в составе богатой питательной среды на уровень синтеза и растворимость рекомбинантного белка в модельной системе биосинтеза метионинаминопептидазы (MAP) Е. coli. Материалы и методы. В качестве продуцента в работе использовали полученный ранее штамм Е. coli BL21 (рЕТ-МАР) [18], несущий плазмиду рЕТ-МАР с геном map под контролем промотора гена 10 фага Т7. Плазмида сконструирована на основе вектора рЕТ-24а(+) (KanR) («Novagen», США) и трансформирована в штамм Е. coli BL21 (DE3) ОТ, ompT, hsdSB (r~ mB gal dcm) (DE3). Среды. Бактериальную культуру выращивали в разработанной нами ранее питательной среде ПВ40 [18] с добавлением канамицина до конечной концентрации 50 мкг/мл. Для индукции синтеза целевого продукта в среду вносили раствор изопро- пил-^-Э-тиогалактозида (ИПТГ) до конечной кон центрации 1 мМ, а также глицерин — до заданной концентрации. Культивирование продуцента. Питательную среду засевали инокулятом Е. coli BL21 (рЕТ- МАР), предварительно выращенным в термостате при температуре 37 °С в течение ночи. Соотноше ние объема инокулята к объему среды составляло 1:10. Культуру выращивали на качалке в условиях интенсивной (160 об/мин) аэрации при температу ре 37 °С до заданной оптической плотности (ОП) и индуцировали синтез рекомбинантного белка до бавлением раствора ИПТГ. Затем продолжали культивирование продуцента в этих же условиях в течение —18 ч. Глицерин в зависимости от условий эксперимента добавляли в среду перед инокуля цией, при достижении культурой ОП 0,5, 1,0, а также одновременно с индуктором. Электрофорэтический анализ растворимой и нерастворимой фракций клеточных белков, сум марных белков плазмидосодержащих клеток осу ществляли, как описано ранее [17]. На полиакрил- амидный гель (ПААГ) наносили образцы в количе стве, эквивалентном 5 мкл клеточной суспензии. Оптическую плотность культуры определяли на фотоколориметре КФК-3 (Российская Федера ция) при X = 540 нм с длиной оптического пути 1 см. Результаты и обсуждение. В качестве объекта для изучения влияния различных концентраций глицерина в составе богатой питательной среды на выход и растворимость рекомбинантного белка в клетках Е. coli выбрана ранее разработанная нами система экспрессии MAP Е. coli на основе РНК- полимеразы фага Т7 [18]. MAP (ЕС 3.4.11.18) кодируется геном тар и содержит 264 аминокис лотных остатка. Она удаляет N-концевой метионин у большинства растущих полипептидов на ранних стадиях белкового синтеза в клетках Е. coli. При разработке технологии получения рекомбинантной МАР нами установлено, что в процессе биосинтеза она накапливается в бактериальных клетках пре имущественно в нерастворимом виде. Выбор глицерина в качестве фактора, способ ного положительно влиять на выход и раствори мость рекомбинантного продукта, сделан на следу ющих основаниях. Известны случаи, когда его добавление в питательную среду обеспечивало бо лее эффективный синтез целевого белка [22—25]. 531 СЛАВЧЕНКО И. Ю . , Б О Р Е Й К О Е. В . , В О Р О Б Е Й Н. В. Так, внесение глицерина в богатую питательную среду до конечной концентрации 0,5 % позволило нам на 30 % увеличить выход рекомбинантного альфа-2Ь интерферона человека [25]. Глицерин является бедным источником углерода, поэтому маловероятно, что наблюдаемое увеличение выхода целевого продукта связано с повышением энергети ческой и питательной ценности среды. Недавно показано [23], что углеводы могут усиливать экс прессию чужеродных генов, индуцируя осмотиче ские стрессовые ответы в клетках Е. colu Известно, что в результате осмотического стресса повышается уровень фактора as — сигма-субьединицы РНК- полимеразы, контролирующего экспрессию более 50 генов, вовлеченных в клеточный ответ на стресс (см. обзор [26]). В их числе могут быть гены, кодирующие факторы, которые тем или иным спо собом положительно влияют на экспрессию целево го продукта. Кроме того, глицерин, являясь хими ческим шапероном, как известно, стабилизирует белки in vitro и in vivo, а также влияет на процесс сборки белка, регулируя фолдинговую активность таких молекулярных шаперонов, как GroEL, DnaK и ClpB [27]. В данной работе изучали влияние глицерина на скорость роста культуры, выход и растворимость MAP. Глицерин вносили в питательную среду до конечной концентрации 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 10; 12; 1 4 ; 1 6 ; 1 8 и 2 0 % . В контрольный вариант глице рин не добавляли. Поскольку ранее нами установ лено, что снижение температуры культивирования продуцента MAP BL21 (рЕТ-МАР) после индукции синтеза целевого белка до 21 °С способствует накоплению МАР в растворимой форме [18], про дуцент культивировали при 37 °С. В первой серии экспериментов клетки культи вировали в присутствии глицерина с момента ино куляции. Культуру выращивали до ОП 2,0 и учи тывали время, за которое она выросла на среде с разными концентрациями глицерина до данной величины оптической плотности. Анализ получен ных результатов показал, что наличие в питатель ной среде глицерина в концентрации до 2 % не влияет на скорость роста культуры BL21 (рЕТ- МАР) (рис 1, кривая / ) . Глицерин в конечной концентрации выше 4 % существенно угнетал рост штамма-продуцента, причем это имело четкую концентрационную зависимость. В вариатах с со держанием глицерина 18 и 20 % культура Е. coli BL21 (рЕТ-МАР) выросла только до ОП -0 ,6 , поэтому на диаграмме (рис. 1, кривая 1) значение времени, за которое она достигли ОП 2,0 не указано. Для индукции синтеза рекомбинантного белка при достижении клетками ОП 2,0 в среду добавля ли раствор ИПТГ и продолжали культивировать штамм-продуцент при температуре 37 °С в течение 18 ч. Выход MAP определяли электрофоретическим анализом, в результате которого показано, что внесение глицерина в среду при инокуляции в концентрации 0,5 % не приводит к снижению выхода целевого белка по сравнению с контролем (без добавления глицерина). При концентрации же глицерина от 1 до 8 % количество синтезированной МАР в образцах приблизительно одинаковое и несколько ниже, чем в контроле. Близкий между собой, но еще более низкий выход MAP наблюда ется при концентрации глицерина от 10 до 16 % (рис. 2). Таким образом, нами установлено, что в условиях данного эксперимента глицерин в конеч ной концентрации 4 % и выше угнетает рост штамма-продуцуента Е. coli BL21 (рЕТ-МАР). При этом степень негативного воздействия глицерина на ростовые свойства культуры возрастает с повы шением концентрации глицерина в среде. При добавлении глицерина в концентрации выше 1 % снижается и выход рекомбинантного белка. Приме ры отрицательного влияния глицерина на выход 532 ВЛИЯНИЕ Г Л И Ц Е Р И Н А НА В Ы Х О Д М Е Т И О Н И Н А М И Н О П Е П Т И Д А З Ы Е. СОІЛ Рис. 2. Электрофореграмма образцов клеток Е. coli BL21 (рЕТ- МАР), культивированных в присутствии различных концентра ций глицерина: / — 0; 2 — 0,5; 3—1; 4 — 2; 5 — 4; б — 6; 7 — 8; 8 — 10; 9 — 12; 10 — 14 и 11 — 16 %; ж — маркер MAP целевых продуктов описаны и в работах [28, 29]. 8 результате исследований нами также установле но, что глицерин способствует накоплению целево го белка в растворимой форме при концентрации выше 6 %. Однако положительное воздействие на раство римость рекомбинантного белка глицерин оказывал в концентрациях, угнетающих как рост бактери альных клеток, так и синтез целевого белка. А это существенно сказывалось на его конечном выходе. В данных экспериментах штамм-продуцент Е. coli BL21 {рЕТ-МАР) выращивали в присутствии гли церина с момента инокуляции, однако не было известно, влияет ли время внесения глицерина в питательную среду на исследуемые параметры. По этому мы исследовали влияние на скорость роста культуры, выход и растворимость МАР не только различных концентраций глицерина, но и оптиче ской плотности культуры, при которой он добавля ется в среду. Для этого глицерин до разных конечных кон центраций вносили в среду при достижении куль турой Е. coli BL21 (рЕТ-МАР) ОП 0,5 с последую щей индукцией синтеза MAP при ОП 2,0. Полу ченные данные показали (рис 1, кривая 2), что в таких условиях эксперимента угнетение роста кле ток носит менее выраженный характер. Даже в вариантах с содержанием глицерина 18 и 20 % культура выросла до ОП 2,0, в то время как при выращивании продуцента в присутствии таких же концентраций глицерина, но внесенного в среду не при достижений ОП культурой 0,5, а перед иноку ляцией, продуцент вырос только до ОП -0,6 . Близкие результаты получены при добавлении гли- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 в Р и с 3. Электрофореграмма образцов белковых фракций клеток Е. coli BL21 (рЕТ-МАР), культивированных после индукции в присутствии различных концентраций глицерина: 1 — 0; 2 — 0,5; 3 — 1; 4 — 2; 5 — 4; 6 — 6; 7 — 8 ; 8 — 10; 9 — 1 2 ; 10 — 14; 11 — 16; 12—18 и / 5 — 20 %; а — суммарные белки клетки; б — фракция нерастворимых белков; в — фракция раек творимых белков; м — маркер MAP церина при ОП 1,0. И хотя нам удалось добиться снижения угнетения роста клеток штамма-проду цента и добавление глицерина способствовало на коплению рекомбинантного белка в растворимом 533 СЛАВЧЕНКО И. Ю . , Б О Р Е Й К О Е. В . , В О Р О Б Е Й Н. В. виде (рис. 3, я, б), увеличения выхода MAP с единицы объема по сравнению с контролем мы не наблюдали. В результате дальнейших исследований уста новлено, что наиболее благоприятным моментом внесения глицерина является добавление его одно временно с индуктором. На рис. 3 представлены электрофореграммы образцов, полученных в одном из таких экспериментов. Эти данные свидетельст вуют о том, что добавление глицерина в момент индукции положительно влияет на выход белка во всем диапазоне используемых концентраций гли церина (рис. 3, а). Нами установлено, что культи вирование клеток в его присутствии способствует накоплению рекомбинантного белка в растворимом виде. Показано, что обнаруженный эффект имеет концентрационную зависимость. Так, на электро- фореграммах (рис. 3, а, б) продемонстрировано, что при увеличении концентрации глицерина в составе культуральной среды количество MAP уменьшается во фракции нерастворимых и увели чивается во фракции растворимых белков. Конеч ный выход растворимого белка зависит от того, при какой ОП культуры добавляли глицерин в культу- ральную среду. Однако этот параметр влияет не на проявление эффекта глицерина, а на общий выход рекомбинантного белка, в том числе растворимого. Таким образом, в представленном исследова нии показано, что культивирование продуцента в присутствии глицерина может существенно увели чивать выход рекомбинантного белка в раствори мой форме. Установлено, что на эффективность этого процесса влияют такие параметры, как кон центрация глицерина и время его внесения в пита тельную среду. Разработанные в данной работе технологические подходы могут быть использованы для получения других рекомбинантных белков в растворимой форме в клетках Е. colL I. Yu. Slavchenko, Е. V. Boreyko, N. V. Vorobey Influence of various glycerol concentrations on the yield and s o l u b i l i t y of the Escherichia coli recombinant methionine aminopeptidase Summary The influence of glycerol on the yield and solubility of a recombinant protein in a model system of E. coli methionine aminopeptidase (MAP) overproduction using the bacteriophage T7 RNA polymerase has been investigated. We have found, that glycerol added in a rich medium may inhibit the producer growth, promote the MAP accumulation in a soluble form and influence the target product yield. It has been shown, that manipulation of such parameters as glycerol concentration and culture optical density, when glycerol is added to the medium, allows purposely to increase the MAP yield in a soluble form The approaches developed may be applicable for the production of other recombinant proteins in E. coli cells. I. Ю. Славченко, О. В. Борейко, Н. В. Воробей Вплив різних концентрацій гліцерину на вихід і розчинність рекомбінантної метіонінамінопептидази Escherichia coli Резюме Вивчали вплив гліцерину на вихід і розчинність рекомбінан- тного білка в модельній системі суперсинтезу метіонін амінопептидази (МАР) Е. coli з використанням РНК-полі- мерази фага Т7. Виявлено, що гліцерин у складі багатого поживного середовища може пригнічувати ріст штаму-проду- цента, сприяти накопиченню цільового продукту в розчинній формі і впливати на його вихід. Показано, що маніпулювання такими параметрами, як концентрація гліцерину і оптична густина культури, при якій його вносять у середовище, дозво ляє цілеспрямовано підвищувати вихід МАР у розчинній фор мі. Розроблені в даному дослідженні підходи можна використо вувати для одержання інших рекомбінантніх білків у клітинах Е. coli. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Middelberg A. P. Preparative protein refolding / / Trends Biotechnol.—2002.—20, N 10.—P. 437—443. 2. Misawa S., Kumagai I. Refolding of therapeutic proteins produced in Escherichia coli as inclusion bodies / / Biopo- lymers.—1999.—51, N 4.—P. 297—307. 3. Mukhopadhyay A. Inclusion bodies and purification of proteins in biologically active forms / / Adv. Biochem. Eng. and Biotechnol.—1997.—56.—P. 61 — 109. 4. Schlieker C, Bukau В., Mogk A. Prevention and reversion of protein aggregation by molecular chaperones in the E. coli cytosol: implications for their applicability in biotechnology / / J. Biotechnol.—2002.—96, N 1.—P. 13—21. 5. Chao Y. P., Chiang C. J., Lo Т. E., Fu H. Overproduction of D-hydantoinase and carbamoylase in a soluble form in Es cherichia coli II Appl. Microbiol. Biotechnol.—2000.—54, N 3 .—P. 348—353. 6. Amrein К, E., Takacs В., Stieger M., Molnos J., Flint N. A., Burn P. Purification and characterization of recombinant human p50csk protein-tyrosine kinase from an Escherichia coli expression system overproducing the bacterial chaperones GroES and GroEL / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1995.—92, N 4.—P. 1048—1052. 7. Shin C. S., Hong M. S., Kim D. Y., Shin H. C , Lee J. Growth-associated synthesis of recombinant human glucagon and human growth hormone in high-cell-density cultures of Escherichia coli 11 Appl. Microbiol, and Biotechnol.—1998.— 49, N 4.—P. 364—370. 8. Thomas J. G., Baneyx F. Divergent effects of chaperone overexpression and ethanol supplementation on inclusion body formation in recombinant Escherichia coli II Protein Exp. Purif .—1997.—11, N 3 .—P. 289—296. 9. Nygaard F. В., Harlow К W. Heterologous expression of soluble, active proteins in Escherichia coli: the human estrogen receptor hormone-binding domain as paradigm / / Protein Exp. Purif .—2001.—21, N 3 .—P. 500—509 . 10. Sawyer J. R., Schlom J., Kashmiri S. V. The effects of induction conditions on production of a soluble anti-tumor sFv in Escherichia coli II Protein. Eng.—1994.—7, N 11 .— P. 1401—1406. 11. Georgiou G., Valax P., Ostermeier M., Horowitz P. M. Folding and aggregation of ТЕМ beta-lactamase: analogies with the formation of inclusion bodies in Escherichia coli II Protein Sc i .—1994.—3, N 11.—P. 1953—1960. 12. Bowden G. A., Georgiou G. Folding and aggregation of 534 В Л И Я Н И Е Г Л И Ц Е Р И Н А НА В Ы Х О Д М Е Т И О Н И Н А М И Н О П Е П Т И Д А З Ы Е. COLI beta-lactamase in the periplasmic space of Escherichia coli II J. Biol. Chem.—1990.—265, N 28 .—P. 16760—16766. 13. Barth S., Huhn M., Matthey В., Klimka A , Galinski E. A., Engert A. Compatible-solute-supported periplasmic expression of functional recombinant proteins under stress conditions / / Appl. Environ, and Microbiol.—2000.—66, N 4.—P. 1572— 1579. 14. Blackwell J. R., Horgan R. A novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form / / FEBS Let t—1991 .—295, N 1—3.—P. 10—12. 15. Moore /. Т., Uppal A., Maley F., Maley G. F. Overcoming inclusion body formation in a high-level expression system / / Protein Exp. Purif .—1993.—4, N 2.—P. 160—163. 16. Schein C. #., Noteborn M. H. M. Formation of soluble recombinant proteins in Escherichia coli is favored by lover growth temperature / / B io techno logy .—1988 .—N 6.— P. 291—294. 17. Славченко И. Ю.} Борейко Е. В., Faepuui Т. Г., Костю- ченко И. П., Кордюм В. А. Биосинтез основного фактора роста фибробластов человека в клетках Escherichia coli и его очистка / / Біополімери и клітина.—2003.—19, № 2 .— С. 179—184. 18. Славченко И. Ю., Борейко Е. В., Воробей Я . В., Гаврши Т. Г., Пехота Е. Н., Кордюм В. А. Суперсинтез и очистка метионинаминопептидазы Escherichia coli 11 Біополімери и клітина.—2003.—19, № 3.—С. 274—280. 19. Славченко И. Ю., Борейко Е. В., Воробей И. В., Черных С. И. у Кордюм В. А. Суперсинтез растворимого альфа-2Ь интерферона человека в клетках Escherichia coli с исполь зованием системы экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 / / Біополімери и клітина.—2003.—19, № 4 .— С. 367—373. 20. Sugimoto S., Yokoo У., Hatakeyama N., Yotsuji A., Teshiba S., Hagino H. Higher culture pH is preferable for inclusion body formation of recombinant salmon growth hormone in Escherichia coli II Biotechnol. Lett .—1991.—13.—P. 385— 388. 21. Yang Q. H., Wu C. L, Lin K, Li L. Low concentration of inducer favors production of active form of 6-phosphofructo-2- kinase/fructose-2,6-bisphosphatase in Escherichia coli II Pro tein Exp. Purif .—1997.—10, N 3 .—P. 320—324 . 22. Park S. Gunsalus R. P. Oxygen, iron, carbon, and superoxide control of the fumarase fumA and fumC genes of Escherichia coli: role of the arcA, fnr, and soxR gene products / / J. Bacterid.—1995.—177, N 21 .—P. 6255—6262. 23. Kagawa N., Cao Q. Osmotic stress induced by carbohydrates enhances expression of foreign proteins in Escherichia coli II Arch. Biochem. and Biophys .—2001.—393, N 2 .—P. 290— 296. 24. Leandro P., Lechner M. C , Tavares de Almeida I., Konecki D. Glycerol increases the yield and activity of human phenyl alanine hydroxylase mutant enzymes produced in a prokaryotic expression system / / Мої. Genet. Metab.—2001.—73, N 2 .— P. 173—178. 25. Славченко И. Ю. Влияние органических источников угле рода на синтез рекомбинантного белка в клетках Es cherichia coli II Біополімери і клітина.—2002.—18, № 4 — С. 334—339. 26. Hengge-Aronis R. Back to log phase: & s as a global regulator in the osmotic control of gene expression in Escherichia coli II Мої. Microbiol.—1996.—21, N 5 .—P. 887—893 . 27. Diamant S., Eliahu N.t Rosenthal D., Goloubinoff P. Chemi cal chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses / / J. Biol. Chem.—2001.—276, N 43 .—P. 39586—39591 . 28. Eppler Т., Boos W. Glycerol-3-phosphate-mediated repression of malT in Escherichia coli does not require metabolism, depends on enzyme I I A G I c and is mediated by с AMP levels / / Мої. Microbiol.—1999.—33, N 6.—P. 1221—1231 . 29. Fang A., Demain A. L. Influence of aeration and carbon source on production of microcin B17 by Escherichia coli ZK650 / / Appl. Microbiol, and Biotechnol.—1997.—47, N 5 .—P. 547—553 . УДК 579.258 + 577.124 Надійшла до редакції 20.08.03 535

Влияние различных концентраций глицерина на выход и растворимость рекомбинантной метионинаминопептидазы Escherichia coli

Institution

Ähnliche Einträge