Редукция белоксинтезирующего аппарата пластид – причина стабильной хлорофиллдефектности, индуцируемой у растений антибиотиками

Редукция белоксинтезирующего аппарата пластид – причина стабильной хлорофиллдефектности, индуцируемой у растений антибиотиками

Изучена молекулярная основа стабильной хлорофиллдефектности, с высокой частотой индуциру­емой антибиотиками спектиномицином и стрептомицином у крестоцветных растений. Показа­но, что наиболее вероятной причиной хлорофиллдефектности является прекращение биосинтеза пчастидных белков, обусловленное реду...

Повний опис

Збережено в:
Бібліографічні деталі
Дата:1999
Автор: Зубко, М.К.
Формат: Стаття
Мова:Russian
Опубліковано: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1999
Назва видання:Биополимеры и клетка
Теми:
Клеточная биология
Онлайн доступ:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156810
Теги: Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:Редукция белоксинтезирующего аппарата пластид – причина стабильной хлорофиллдефектности, индуцируемой у растений антибиотиками / М.К. Зубко // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 6. — С. 496-500. — Бібліогр.: 14 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-156810
record_format dspace
spelling irk-123456789-1568102019-06-21T01:25:01Z Редукция белоксинтезирующего аппарата пластид – причина стабильной хлорофиллдефектности, индуцируемой у растений антибиотиками Зубко, М.К. Клеточная биология Изучена молекулярная основа стабильной хлорофиллдефектности, с высокой частотой индуциру­емой антибиотиками спектиномицином и стрептомицином у крестоцветных растений. Показа­но, что наиболее вероятной причиной хлорофиллдефектности является прекращение биосинтеза пчастидных белков, обусловленное редукцией белоксинтезирующего аппарата пластид, в частно­сти, важнейшего его компонента – рибосомной РНК. Предлагается использовать данное явление как модель для изучения биосинтетических функций пластид. Вивчено молекулярну основу стабільної хлорофілдефектності, що з високою частотою індукується антибіотиками спектиноміцином та стрептоміцином у хрестоцвітих рослин. Пока­зано, що найвірогіднішою причиною хлорофілдефектності є припинення біосинтезу пластидних білків, обумовлене редук­цією білоксинтезуючого апарату пластид, зокрема, одного з найважливіших його компонентів – рибосомної РНК. Пропо­нується використовувати це явище як модель для вивчення біосинтетичних функцій пластид. A molecular base for the stable chlorophyll deficiency induced with high frequency by antibiotics spectinomycin and streptomycin in cruciferous plants has been studied. It has been shown that the most probable cause of chlorophyll deficiency is knockouting plastid protein biosynthesis due to the reduction of plastid protein synthesis apparatus, in particular, ribosomal RNA as the most important component. This phenomenon is proposed as a model for studying biosynthetic functions of plastids. 1999 Article Редукция белоксинтезирующего аппарата пластид – причина стабильной хлорофиллдефектности, индуцируемой у растений антибиотиками / М.К. Зубко // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 6. — С. 496-500. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000545 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156810 575.224 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
topic Клеточная биология
Клеточная биология
spellingShingle Клеточная биология
Клеточная биология
Зубко, М.К.
Редукция белоксинтезирующего аппарата пластид – причина стабильной хлорофиллдефектности, индуцируемой у растений антибиотиками
Биополимеры и клетка
description Изучена молекулярная основа стабильной хлорофиллдефектности, с высокой частотой индуциру­емой антибиотиками спектиномицином и стрептомицином у крестоцветных растений. Показа­но, что наиболее вероятной причиной хлорофиллдефектности является прекращение биосинтеза пчастидных белков, обусловленное редукцией белоксинтезирующего аппарата пластид, в частно­сти, важнейшего его компонента – рибосомной РНК. Предлагается использовать данное явление как модель для изучения биосинтетических функций пластид.
format Article
author Зубко, М.К.
author_facet Зубко, М.К.
author_sort Зубко, М.К.
title Редукция белоксинтезирующего аппарата пластид – причина стабильной хлорофиллдефектности, индуцируемой у растений антибиотиками
title_short Редукция белоксинтезирующего аппарата пластид – причина стабильной хлорофиллдефектности, индуцируемой у растений антибиотиками
title_full Редукция белоксинтезирующего аппарата пластид – причина стабильной хлорофиллдефектности, индуцируемой у растений антибиотиками
title_fullStr Редукция белоксинтезирующего аппарата пластид – причина стабильной хлорофиллдефектности, индуцируемой у растений антибиотиками
title_full_unstemmed Редукция белоксинтезирующего аппарата пластид – причина стабильной хлорофиллдефектности, индуцируемой у растений антибиотиками
title_sort редукция белоксинтезирующего аппарата пластид – причина стабильной хлорофиллдефектности, индуцируемой у растений антибиотиками
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate 1999
topic_facet Клеточная биология
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156810
citation_txt Редукция белоксинтезирующего аппарата пластид – причина стабильной хлорофиллдефектности, индуцируемой у растений антибиотиками / М.К. Зубко // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 6. — С. 496-500. — Бібліогр.: 14 назв. — рос.
series Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv AT zubkomk redukciâbeloksinteziruûŝegoapparataplastidpričinastabilʹnojhlorofilldefektnostiinduciruemojurastenijantibiotikami
first_indexed 2025-07-14T09:08:29Z
last_indexed 2025-07-14T09:08:29Z
_version_ 1837612778645356544
fulltext ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1999. Т. 15. № 6 Редукция белоксинтезирующего аппарата пластид — причина стабильной хлорофиллдефектности, индуцируемой у растений антибиотиками М. К. Зубко Институт клеточной биологии и генетической инженерии Национальной Академии Украины Ул. Академика Заболотного, 148, Киев, 03143 , Украина Изучена молекулярная основа стабильной хлорофиллдефектности, с высокой частотой индуциру­ емой антибиотиками спектиномицином и стрептомицином у крестоцветных растений. Показа­ но, что наиболее вероятной причиной хлорофиллдефектности является прекращение биосинтеза пчастидных белков, обусловленное редукцией белоксинтезирующего аппарата пластид, в частно­ сти, важнейшего его компонента — рибосомной РНК. Предлагается использовать данное явление как модель для изучения биосинтетических функций пластид. Введение. Пластиды — важнейшие органеллы рас­ тительной клетки, выполняющие основные функ­ ции фотосинтеза. Они имеют собственный геном, называемый пластомом, и свой белоксинтезирую- щий аппарат, которые функционируют координи­ рование с генетической системой ядра, однако об­ ладают относительной автономией [1 ]. В последнее десятилетие молекулярная биология пластид разви­ вается достаточно бурно, что связано с общим подъемом в развитии биологии растений. Особенно плодотворной оказалась стратегия, основанная на подавлении основных функций хлоропластов, в частности, биосинтеза белка. В настоящее время для этого наиболее широко используются три под­ хода: 1) применение антибиотиков, блокирующих работу пластидных 70S рибосом [2] ; 2) использова­ ние мутантов, у которых стабильно нарушены раз­ личные звенья формирования или функционирова­ ния пластидных рибосом [3] ; 3) ингибирование биосинтеза белка на пластидных рибосомах повы­ шенными температурами [4 ]. Наряду с преимуще­ ствами каждый подход имеет определенные ограни­ чения. Так , ингибирование с помощью антибиоти­ ков и температуры часто оказывает действие на ряд других, непластидных функций, существенно © М. К. З У Б К О , влияет на рост и носит временный характер. Му­ танты с нарушенными функциями пластидного биосинтеза в подавляющем большинстве неиденти- фицированы с точки зрения генетических локусов и молекулярных механизмов. Недавно было обнаружено, что метаболическое блокирование биосинтеза белка на пластидных ри­ босомах с помощью антибиотиков спектиномицина и стрептомицина является необратимым для ряда крестоцветных растений. Это приводит к конверсии зеленых тканей в хлорофиллдефектные. Размноже­ ние таких тканей in vitro обеспечивает продукцию стабильных растений-альбиносов с очень высокой частотой [5] . В настоящей работе показано, что у таких хлорофиллдефектных растений полностью подавлен пластидный биосинтез белка и редуциро­ вано количество 708-рибосомной РНК. Это откры­ вает некоторые альтернативные возможности для изучения биосинтеза в пластидах и ядерно-цито- плазматических взаимодействий. Материалы и методы. Растительный мате­ риал. Хлорофиллдефектные линии (растения Bras- sica napus и каллусы Arabidopsis thaliana) были получены в результате инкубирования семян и проростков со спектиномицином и дальнейшего культивирования без антибиотика [5] . Растения и 496 каллусы поддерживали на среде Мурасиге и Скуга 16]. Суммарные белки и Вестерн-блот-анализ. Экстракты суммарных белков были приготовлены в пробирках эппендорф из 300 мг замороженных тканей (зеленых и хлорофиллдефектных) , гомоге­ низированных с помощью стеклянной палочки в 600 мкл буфера, содержащего 80 мМ трис-HCl (рН 7,5), 10 %-й глицерин, 10 % - й Д С Н , 0,5 % - й меркаптоэтанол. Соотношение между навеской ткани и объемом буфера составляло 1:2. Экстракты, прокипяченные в течение 3 мин, центрифугировали (5 мин) при максимальной скорости настольной центрифуги, и супернатант использовали для фракционирования в 10 % - й ДСН-ПААГ геле. Для визуализации белков гели окрашивали раствором кумасси. Для имму- ноблот-анализа белки с неокрашенных гелей пере­ носили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond- ECL («Amersham», Англия) и инкубировали с ан­ тителами к белкам D 1 , 33 кДа (фотосистема II) и светособирающего комплекса II. Связанные антите­ ла детектировали люминесцентным методом по инструкции, производителя (Amersham ECL Wes­ tern blotting detection Kit). Антитела были любезно предоставлены профессором Р. Херрманном, д-ра­ ми Р.-Б. Клосгеном и И. Адамской (Мюнхен). Хлорофиллдефектный пластомный мутант A. thali- апа 180а индуцирован с помощью нитрозоэтилмо- чевины (неопубликованные данные) . РНК и Нозерн-блот-анализ. Суммарная РНК была выделена из асептических хлорофиллдефект­ ных и зеленых тканей В. пар us по общепринятой методике [7J. По 3 мкг Р Н К , фракционированных в 2 %-м агарозном геле (1*ТВЕ), визуализирован­ ных окрашиванием с помощью бромистого этидия и перенесенных на мембрану, гибридизовали про­ бой pHvcP8, содержащей хлоропластные гены ри- босомной РНК [8 ]. В альтернативном варианте по 10 мкг Р Н К из нескольких зеленых, белых и желтых линий независимого происхождения фрак­ ционировали в денатурирующем 1 % - м геле с формальдегидом (6 % ) , переносили на мембрану Gene Screen и гибридизовали с пробами pHvcPS и pBG35, как и в предыдущем эксперименте. Плаз - мида pBG35 содержит клонированный повтор ядер­ ной рДНК льна размером 7 тыс. п. н. Саузерн-блот-гибридизация. Суммарные Д Н К , выделенные из зеленых и белых тканей, после переваривания рестриктазами EcoRl и ВатНІ пе­ реносили на мембрану Gene Screen и гибридизова­ ли с фрагментами плазмид рТВ27 [9 ] и pBG35 (10), содержащих соответственно последовательно­ сти хлоропластного генома и повтор ядерной Р В Д У К Ц И Я Н Е Л О К . - С И Н Т Е З И Р У Ю Ш Е Г О А П П А Р А Т А П Л А С Т И Д рДНК. Блоты отмывали в 0,1 х SSC—0,1 %-й ДСН при температуре 50 ° С Результаты и обсуждение . После обработки растений спектиномицином были индуцированы хлорофиллдефектные линии (каллусы A thaliana и растения В. napus). Кроме полностью белых (бес- хлорофильных) растений, у В. napus получены также желтые растения, у которых количество хлорофилла было снижено в 10—13 раз по сравне­ нию с контрольными зелеными растениями [5 ]. Индукция стабильной хлорофиллдефектности с по­ мощью антибиотиков (спектиномицина и стрепто­ мицина) обсуждалась в связи с предполагаемым механизмом полного выключения биосинтеза белка на пластидных рибосомах, что обеспечивает репро­ дукцию безрибосомных пластид и соответственно хлорофиллдефектность без мутирования хлоропла­ стного или ядерного генома. Целью данной работы была проверка некоторых аспектов этого предполо­ жения. Отправная логика экспериментов состояла в следующем. Если механизм генерации хлорофилл­ дефектности антибиотиками действительно основан на необратимой потере хлоропластного биосинтеза белка, а не на мутагенном действии антибиотиков, как предполагалось в более ранних исследованиях [ И , 12] , это можно легко зарегистрировать, анали­ зируя синтез белков, кодируемых хлоропластным геномом, и наличие рибосомных Р Н К в пластидах. Большая субъединица (БС) рибулозо-бисфос- фат-карбоксилазы и оксигеназы (Рубиско) — бе­ лок, синтезируемый на пластидных рибосомах в очень больших количествах [1 , 2 ] . Как видно из р и с 1, полоса БС Рубиско очень хорошо детекти­ руется при окрашивании суммарных белков из зеленых растений, имея несколько различную электрофоретическую подвижность у В. napus и А. thaliana. БС совсем не обнаруживается в экстрак­ тах из белых каллусов A. thaliana и белых растений В. napus (рис. 1), а т а к ж е у желтых растений В. napus (данные не приведены). Большинство других белков, кодируемых преимущественно ядром, обна­ ружено в приблизительно одинаковых количествах у зеленых и белых линий растений, что свидетель­ ствует об адекватной загрузке белков при электро­ форезе. Другой белок, D1 фотосистемы II, кодиру­ емый пластидным геном psbA, был исследован с помощью Вестерн-блот-гибридизации (рис. 2) . Чет­ ко детектируемый у зеленых растений В. napus и A. thaliana, белок D1 совсем не обнаруживался в экстрактах белых линий. Таким образом, синтез двух белков, кодируемых хлоропластным геномом, полностью подавлен у хлорофиллдефектных линий. Экспрессия некоторых ядерных генов, кодиру­ ющих белки пластид, существенно подавлена у 497 3 V B K O VI К х 33 к Ли б 180а А15 ядерных мутантов ячменя albostrians, которые де­ фектны по рибосомам пластид [13] . К таким бел­ кам относится, в частности, хлорофиллсвязываю- щий белок LHCII (фотосистема 11). Вестерн-блот- а н а л из п о к а з а л , ч т о L H C I I в о в с е не обнаруживается у белых растений В . napus, но обнаруживается у желтых растений в количестве, в 25—30 раз меньшем, чем у зеленых растений (рис. 2). Аналогично, кодируемый ядром, но транспорти­ руемый в хлоропласты 33 кДа белок также не обнаружен у белых линий В . napus и A . t kalian а (рис. 2) . Подавление биосинтеза пластидных бел- шеи з 1/10 1/30 ж б Рис. 2. Анализ пластидных белков у зеленых и хлорофидлде- фектных линий с помощью иммуноблотинга: з, о, ж зеленые, белые и желтые линии соответственно;-В. п.— В. napus (1/10, J/30—разведение экстрактов) ; ,4. th. --A. t ha На па і 180а — пластомный белый мутант, индуцированный с помощью хими­ ческого мутагенеза) ; N. t.—N: tabacum (A15 — пластомный белый мутант) 498 Рис. 3. Анализ р и б о с о м і ю й РНК у хлорофиллдефектных линий />. napus: Л — суммарный препарат Р Н К зеленого и белого растений и . Г •-- се Нозерн-блої после гибридизации с пробой pJIvcPS, содержащей хлоропластные гены р Р Н К ; />— Нозерн-блот РНК из различных зеленых и хлорофиллдефектных линий независимого происхождения после гибридизации с пробой pHvcPS (показаны варианты с обработкой препаратов РНК Д П К а з о й и РНКазо і 'П : В— Нозерн-блот РНК из различных линий посте гибридизации с пробой рВОЗЗ (ядерный повтор р Д Н К ) ; Г—Саузсрн-блот суммарных препаратов Д Н К после переваривания EcoRl {J") и ВатШ и последующей і 'ибри и І . М І і щи с хлоропластной пробой р'ГВ27 (Г) и ядерной пробой рВСЗЗ (Г'). Ц и ф р ы показывают количество нанесенной Д Н К в мкк Остальные обозначения — тс же, что на рис. 1, 2 данного вывода полностью согласуется с данными опытов по обработке препаратов РНК. ДНКазой и Р Н К а з о й (р и с. 3, 1>). а т а к ж с к о н т р о л ь н о й гибри­ дизацией на общее количество РНК, перенесенной на фильтр (рис. 3, />>. Результаты опытов также не М О Г У Т быть объяснены вариациями в количестве матриц для транскрипции, поскольку количество хлоропластной и ядерной ДНК у зеленых и белых растений соизмеримо в пределах опытов, что под­ тверждено Саузерн-блот-гибридизацией с примене­ нием проб на пластидную и ядерную ДНК (рис. 3, Л . В целом приведенные здесь результаты свиде­ тельствуют о том, что стабильная хлорофиллде- фектность, индуцированная у крестоцветных рас­ тений с помощью антибиотиков, во всех исследо­ ванных случаях связана с редукцией количества пл аспидной рРНК и продуктов трансляции в пла- 499 З У Б К О М. К стидах. Это позволяет рассматривать данную систе­ му в качестве эффективной модели для изучения различных сторон биосинтеза белка в пластидах и роль этого процесса в экспрессии целого ряда ядерных генов, вовлеченных в ядерно-цитоплазма- тические взаимодействия. Данная работа выполнена на базе Биологиче­ ской Школы Манчестерского Университета. Автор глубоко признателен д-ру А. Дэю за помощь в выполнении работы и участие в обсуждении ре­ зультатов. м. к. Зубко Редукція білоксинтезуючого апарату пластид — причина стабільної хлорофілдефектності, індукованої у рослин антибіотиками Резюме Вивчено молекулярну основу стабільної хлорофілдефектності, що з високою частотою індукується антибіотиками спекти- номіцином та стрептоміцином у хрестоцвітих рослин. Пока­ зано, що найвірогіднішою причиною хлорофілдефектності є припинення біосинтезу пластидних білків, обумовлене редук­ цією білоксинтезуючого апарату пластид, зокрема, одного з найважливіших його компонентів—рибосомної РИК. Пропо­ нується використовувати це явище як модель для вивчення біосинтетичних функцій пластид. М. К. Zubko Reduction of piastid protein synthesis apparatus is a base of stable chlorophyll deficiency induced by antibiotics in plants Summary A molecular base for the stable chlorophyll deficiency induced with high frequency by antibiotics spectinomycin and streptomycin in cruciferous plants has been studied. It has been shown that the most probable cause of chlorophyll deficiency is knockouting piastid protein biosynthesis due to the reduction of piastid protein synthesis apparatus, in particular, hbosomal RNA as the most important component. This phenomenon is proposed as a model for studying biosynthetic functions of p last ids. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Kirk J. Т. O., Tilney-Bassett R. A. E. The Plastids.—Amster­ dam: Elsevier, 1978. 2. Ellis R. J. Inhibitors for studying chloroplast transcription and translation in vivo II Methods in Chloroplast Molecular Biology / Eds Edelman et al.— Amsterdam: Elsevier, 1982.— P. 559—564 . 3. Bonier Т., Sears В. B. Plastome mutants / / Plant Мої. Biol. Rep .—1986 .—4.—P. 69—92. 4. Feierabend J., Berberich T. Heat-induced ribosome-deficiency of plastids — mechanisms and applications / / The Translation- al Apparatus of Photosynthetic Organelles / Eds R. Mache.— Berlin, Heidelberg: Springer, 1991.—P. 215—227. 5. Зубко M. К. Стабильная хлорофиллдефектность, инду­ цированная у крестоцветных растений с помощью анти­ биотиков / / Физиология и биохимия культури, расте­ ний.—1999 .—№ 6.—С. 467—477. 6. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / / Physiol. Plant.— 1962. — 1 5 . — P . 473—497. 7. Poulson R. Isolation, purification and fractionation of RNA / / The Ribonucleic Acids / Eds Stewart P. , Letham D.—Berlin: Springer, 1973.—P. 243—261 . 8. Day A., Ellis Т. H. N. Deleted forms of piastid DNA in albino plants from cereal another culture / / Curr. Genet .—1985.— 9.—P. 671—678. 9. Sugiura M., Shinozaki K., Zaita N., Kusuda A/., Kumano M. Clone bank of the tobacco {Nicotiana tabacum) chloroplast genome as a set of overlapping restriction endonuclease frag­ ments — mapping of 11 ribosomal protein genes / / Plant Sci. —1986 .—44 .—P. 211—217. 10. Goldsbrough P. В., Cullis C. A. Characterization of the genes for ribosomal RNA in flax / / Nucl. Acids Res.—1981 .—9.—P. 1301 — 1309. 11. Sager R. Streptomycin as a mutagen for nonchromosomal genes / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1962 .—48 .—P. 2018—2026. 12. Sarma N. P., Patnaik A. Streptomycin induced nuclear- cytoplasmic mutations in rice / / Ind. J. Exp. Biol. —1982 .—20 , N 2 .—P. 177—178. 13. Hess W. R., Muller A., Nagy F., Burner T. Ribosome-deficient plastids affect transcription of light-induced nuclear genes: genetic evidence for a plastid-derived signal / / Мої. and Gen. Genet .—242.—P. 305—312 . 14. Svab Z., Maliga P. Nicotiana tabacum mutants with chloroplast encoded streptomycin resistance and pigment deficiency / / Theor. and Appl. Genet .—1986 .—72.—P. 637—643 . УДК 575.224 Поступила в редакцию 20.07.98 500

Схожі ресурси