Плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців

Плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців

Сконструйовано еукаріотний вектор експресії гена препроінсуліну людини для подальшої доставки у неендокринні клітини ссавців in vitro та in vivo з метою розробки експериментальної генної терапії діабету 1-го типу. Векторна конструкція складається з двох незалежних модулів: послідовності бактеріально...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Date:2007
Main Authors: Топорова, О.К., Кириленко, С.Д., Іродов, Д.М., Кордюм, В.А.
Format: Article
Language:Ukrainian
Published: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2007
Series:Біополімери і клітина
Subjects:
Молекулярна та клітинна біотехнології
Online Access:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156982
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:Плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців / О.К. Топорова, С.Д. Кириленко, Д.М. Іродов, В.А. Кордюм // Біополімери і клітина. — 2007. — Т. 23, № 2. — С. 100-107. — Бібліогр.: 21 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-156982
record_format dspace
spelling irk-123456789-1569822019-06-20T01:25:42Z Плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців Топорова, О.К. Кириленко, С.Д. Іродов, Д.М. Кордюм, В.А. Молекулярна та клітинна біотехнології Сконструйовано еукаріотний вектор експресії гена препроінсуліну людини для подальшої доставки у неендокринні клітини ссавців in vitro та in vivo з метою розробки експериментальної генної терапії діабету 1-го типу. Векторна конструкція складається з двох незалежних модулів: послідовності бактеріальної плазміди, шр дозволяє їй реплікуватися у клітинах Escherihia coli, і експресійної касети з цільовим та маркерним генами, фланкованої інвертованими термінальними повторами аденоасоційованого вирусу людини. Для забезпечення конститутивної експресії гена препроінсуліну використано промотор ранніх генів цитомегаловірусу людини. Для посилення експресії цільового трансгена у вектор субклонували енхансер 1 вірусу гепатиту В. Після перенесення in vitro векторної конструкції у клітини ссавців різного походження одержано стабільні трансформанти і ПЛР-аналізом підтверджено наявність цільового трансгена пре­проінсуліну людини у трансформованих клітинах. Eukaryotic expression vector for human preproinsuiin gene has been constructed for further delivery into non-endocrine mammalian cells in vitro and in vivo for the development of experimental gene therapy for type I diabetes. Vector construction consists of two independent modules, namely, bacterial plasmid sequence that allows its replication in Escherichia coli cells, and expression cassette for the target and marker genes which is flanked by inverted terminal repeats of human adeno-associated virus. The human cytomegalovirus immediate-early promoter has been used to ensure the constitutive expression of human preproinsuiin gene. The hepatitis B viral enhancer 1 was subcloned into cassette to increase the target transgene expression. After vector construction in vitro transfer into mammalian cells of different origin, the stable transformants were obtained and the availability of target human preproinsuiin transgene in the transformed cells has been confirmed by PCR analysis. Сконструирован эукариотный вектор экспрессии гена препро­инсулина человека для последующей доставки в неэндокринные клетки млекопитающих in vitro и in vivo с целью разработки экспериментальной генной терапии диабета 1-го типа. Векторная конструкция состоит из двух независимых модулей: последовательности бактериальной плазмиды, которая позво­ляет ей реплицироваться в клетках Escherihia coli, и экспрессионной кассеты с целевым и маркерным генами, фланкиро­ванной инвертированными терминальными повторами адено-ассоциированного вируса человека. Для обеспечения конститу­тивной экспрессии гена препроинсулина использовали промо­тор ранних генов цитомегаловируса человека. Для усиления экспрессии целевого трансгена в вектор субклонировали энхансер 1 вируса гепатита В. После переноса in vitro векторной конструкции в клетки млекопитающих разного происхожде­ния получены стабильные трансформанты и ПЦР-анализом подтверджена наличие целевого трансгена препроинсулина че­ловека в трансформированных клетках. 2007 Article Плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців / О.К. Топорова, С.Д. Кириленко, Д.М. Іродов, В.А. Кордюм // Біополімери і клітина. — 2007. — Т. 23, № 2. — С. 100-107. — Бібліогр.: 21 назв. — укр. 0233-7657 http://dx.doi.org/10.7124/bc.00075B http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156982 577.21 uk Біополімери і клітина Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Ukrainian
topic Молекулярна та клітинна біотехнології
Молекулярна та клітинна біотехнології
spellingShingle Молекулярна та клітинна біотехнології
Молекулярна та клітинна біотехнології
Топорова, О.К.
Кириленко, С.Д.
Іродов, Д.М.
Кордюм, В.А.
Плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців
Біополімери і клітина
description Сконструйовано еукаріотний вектор експресії гена препроінсуліну людини для подальшої доставки у неендокринні клітини ссавців in vitro та in vivo з метою розробки експериментальної генної терапії діабету 1-го типу. Векторна конструкція складається з двох незалежних модулів: послідовності бактеріальної плазміди, шр дозволяє їй реплікуватися у клітинах Escherihia coli, і експресійної касети з цільовим та маркерним генами, фланкованої інвертованими термінальними повторами аденоасоційованого вирусу людини. Для забезпечення конститутивної експресії гена препроінсуліну використано промотор ранніх генів цитомегаловірусу людини. Для посилення експресії цільового трансгена у вектор субклонували енхансер 1 вірусу гепатиту В. Після перенесення in vitro векторної конструкції у клітини ссавців різного походження одержано стабільні трансформанти і ПЛР-аналізом підтверджено наявність цільового трансгена пре­проінсуліну людини у трансформованих клітинах.
format Article
author Топорова, О.К.
Кириленко, С.Д.
Іродов, Д.М.
Кордюм, В.А.
author_facet Топорова, О.К.
Кириленко, С.Д.
Іродов, Д.М.
Кордюм, В.А.
author_sort Топорова, О.К.
title Плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців
title_short Плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців
title_full Плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців
title_fullStr Плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців
title_full_unstemmed Плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців
title_sort плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate 2007
topic_facet Молекулярна та клітинна біотехнології
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156982
citation_txt Плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців / О.К. Топорова, С.Д. Кириленко, Д.М. Іродов, В.А. Кордюм // Біополімери і клітина. — 2007. — Т. 23, № 2. — С. 100-107. — Бібліогр.: 21 назв. — укр.
series Біополімери і клітина
work_keys_str_mv AT toporovaok plazmídnijvektordlâdostavkigenapreproínsulínulûdinivklítinissavcív
AT kirilenkosd plazmídnijvektordlâdostavkigenapreproínsulínulûdinivklítinissavcív
AT írodovdm plazmídnijvektordlâdostavkigenapreproínsulínulûdinivklítinissavcív
AT kordûmva plazmídnijvektordlâdostavkigenapreproínsulínulûdinivklítinissavcív
first_indexed 2025-07-14T09:20:17Z
last_indexed 2025-07-14T09:20:17Z
_version_ 1837613520142729216
fulltext ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2007. Т. 23. № 2 Плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців О. К. Топорова, С. Д. Кириленко, Д. М. Іродов, В. А. Кордюм Інститут молекулярної біології і генетики HAH України Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, 03143, Україна toporova@imbg.org.ua Сконструйовано еукаріотний вектор експресії гена препроінсуліну людини для подальшої доставки у неендокринні клітини ссавців in vitro та in vivo з метою розробки експериментальної генної терапії діабету 1-го типу. Векторна конструкція складається з двох незалежних модулів: послідовності бактеріальної плазміди, шр дозволяє їй реплікуватися у клітинах Escherihia coli, і експресійної касети з цільовим та маркерним генами, фланкованої інвертованими термінальними повторами аденоасоційованого вирусу людини. Для забезпечення конститутивної експресії гена препроінсуліну використано промотор ранніх генів цитомегаловірусу людини. Для посилення експресії цільового трансгена у вектор субклонували енхансер 1 вірусу гепатиту В. Після перенесення in vitro векторної конструкції у клітини ссавців різного походження одержано стабільні трансформанти і ПЛР-аналізом підтверджено наявність цільового трансгена пре­ проінсуліну людини у трансформованих клітинах. Ключові слова: ген препроінсуліну людини, вектор експресії, стабільні трансформанти. Вступ. Ключовою проблемою генної терапії є сис­ тема введення в клітини людини заданого генетич­ ного матеріалу. Ця проблема складається з конк­ ретних завдань, а саме — отримання цільового ге­ на, створення експресійної генетичної конструкції, у якій ген є з'єднаним з відповідними регуляторни­ ми елементами, розобка засобів ефективної достав­ ку гена в клітини-мішені [1]. Методи доставки генетичного матеріалу за типом векторної системи можна класифікувати як вірусні та невірусні [2]. Використання вірусних векторів, а саме — ретро- вірусів, аденовірусів, герпесвірусів та ін., має низ­ ку переваг, до яких можно віднести їхню здатність ефективно трансфікувати велику кількість клітин (а в деяких випадках тривало експресувати чу­ жорідні гени), тропізм і стійкість до деградації лізосомами [3—6]. За минуле 10-ліття затвердже­ но біля 1290 протоколів клінічних випробувань з генної терапії, більше 870 з них передбачають © О. К, ТОПОРОВА, С. Д. КИРИЛЕНКО, Д. М. ІРОДОВ, В. А. КОРДЮМ, 2007 100 вірусну трансфекцію, приблизно 70 % вірусних систем перенесення засновані на використанні аде- но- та ретровірусних векторів (таблиця). Однак використання вірусних векторів поста­ вило питання, пов'язані з безпекою таких систем для людини. У першу чергу це стосується по­ тенційної туморогенності ретровірусів, а також мо­ жливої активації ними онкогенів або інактивації генів — супресорів злоякісної трансформації у клі- тинах-мішенях через здатність ретровірусих век­ торів неспецифічно інтегрувати у геном реципієнт- них клітин [7]. При застосуванні найвживаніших рекомбінантних аденовірусних векторів спостері­ гається швидке зниження експресії цільового гена внаслідок високої імуногенності самих векторів (імунна відповідь розвивається після 2—3 ін'єкцій) [8—10]. Введення аденовірусних векторів пацієн­ там зазвичай супроводжується симптомами, що є характерними для гострих респіраторних вірусних інфекцій, внаслідок чого утруднюється проведення повторних курсів генної терапії [11]. Останніми mailto:toporova@imbg.org.ua ПЛАЗМЩНИЙ ВЕКТОР ДЛЯ ДОСТАВКИ ГЕНА ПРЕПРОІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ Кількісний розподіл затверджених протоколів клінічних випробувань з генної терапії за типом використаних векторних систем ( www. wiley. со. uk/genmed/ clinical) Векторні системи Клінічні протоколи % Кількість Аденовіруси Ретровіруси «Naked» плазмідна ДНК Ліпофекція Віруси вакцинії Поксвіруси Аденоасоційовані віруси Герпесвіруси РНК-доставка Інші 26 23 18 7,9 7 6,8 3,7 3,4 1,3 2,4 322 293 230 99 88 85 46 43 16 31 роками одержано повідомлення про декілька ле­ тальних випадків під час клінічних випробувань різних генотерапевтичних протоколів, у яких вико­ ристовували вірусні вектори [12]. Це призвело до обмеження їхнього застосування і пошуку альтер­ нативних невірусних систем для доставки генів Нашу роботу спрямовано на розробку саме невірусних засобів перенесення генів, що мають бути впроваджені в експериментальній генній те­ рапії тяжкої патології мультифакторної природи — діабету 1-го типу. Конструювання вектора експресії гена інсуліну людини та його випробування у трансфекційних експериментах in vitro є першим етапом цієї роботи. Враховуючи вищезазначені не­ доліки вірусних векторних систем, ми мали за мету створити невірусні експресійні вектори для перено­ су цільових генів у клітини ссавців [13, 14]. Дана стаття представляє результати конструювання плазмідного вектора експресії повнорозмірного гена препроінсуліну людини для подальшої доставки у неендокринні клітини ссавців in vitro та in vivo. Матеріали і методи. Реактиви. В роботі вико­ ристано реактиви фірм «Sigma» (США), «Aldrich» (США), «Amersham-Pharmacia Biotech» (Швеція) і вітчизняного виробництва кваліфікації о. с. ч. і х. ч.; ферменти для генно-інженерних робіт вироб­ ництва фірми «МВІ Fermentas» (Литва). Дизайн сконструйованих рекомбінантних мо­ лекул та стратегію етапів молекулярного субклону- вання розробляли з використанням комплексу про­ грам Vector NT1 та баз даних серверу «National Center for Biotechnology Informational». Плазміди і штами Escherichia coli. Реком- бінантну плазміду рНВ320 (плазміда pBR322, яка містить повну послідовність вірусу гепатиту В) люб'язно надано у попередні роки Е. Я. Греном (Інститут органічного синтезу АН Латвії). Плаз­ міду pTR-UF одержано від С. Зол оту хіна (Gene Therapy Center Vector Core Lab, USA), плазміду pBlueScriptSK+ — від фірми «Stratagene» (США). Всі плазміди, що містять інвертовані термінальні повтори аденоасоційованого вірусу, підтримувалися в клітинах Е. coli штаму Sure2 (e!4~ (МсгА~) A(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endAl supE44 thi-1 gyrA96 relAl lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kan) uvrC [F' proAB lacPZAMJ5 TnlO (Tef) Amy Cam) («Stratagene»). Проміжні плазмідні конструкції під­ тримувалися у клітинах штаму DH5a (f80dlacZAM15, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdR17 (гКГ тК+), supE44, relAl, deoR, MlacZYA- argF)U196) («Life Technologies», Велика Британія). Компетентні клітини Е. coli одержували і трансформували згідно з [15]. Плазмідну ДНК виділяли методом лужного лізису з депротеїніза- цією фенолом і хлороформом відповідно до методів, описаних Маніатісом та ін. [15]. Електрофоретич­ ний аналіз та елюцію фрагментів ДНК з гелю проводили згідно з [15]. Для експериментів in vitro використано клі­ тинні лінії миші (BALB/3T3 сіоп АЗІ — клітини ембріонального походження, L-M-TK", APRT" — фібробластоподібні клітини), свині (SPEV — кліти­ ни нирки ембріона), хом'яка (СНО-К1 — епітеліо- подібні клітини яєчника) та клітинні лінії людини (HeLa — карцинома шийки матки, Нер-2 — епі- дермоїдна карцинома гортані). Клітини отримано з російської колекції клітинних культур (Санкт-Пе­ тербург). Клітини культивували при температурі 37 °С в атмосфері, що містила 5 % С02, на поживних середовищах F10 («Sigma») або DMEM («Sigma»), до складу яких входило 10 % емб­ ріональної телячої сироватки («Геном», Україна). У середовище додавали 100 ОД/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину (Київмедпрепарат, Ук­ раїна) . Токсичність трансфекційних препаратів ДНК визначали за допомогою тест-набору CellTiter 96R («Promega», США). Одержання стабільних трансформантів. Трансфекцію проводили, як описано в [13, 14]. Час контакту клітин з трансформуючою сумішшю складав 1 год ЗО хв при температурі 37 °С, після 101 ТОПОРОВА О. К. ТА IH. чого зазначену суміш замінювали на ростове сере­ довище. Надалі клітини культивували протягом 72 год і переводили у селективні умови. Селективне середовище містило 20 % ембріональної телячої сироватки та 1000 мкг/мл генетицину (антибіотик G-418, «MP Biomedicals»). Сумарну ДНК з клітин стабільних трансфор- мантів виділяли, використовуючи Genomic DNA purification Kit («Fermentas», Литва), згідно з реко­ мендаціями виробника. Концентрацію ДНК визна­ чали флуорометрично за допомогою Hoefer Dy- NA Quant™ 200 Fluorometer («Amersham Bioscien- ces», США). Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) прово­ дили у класичному варіанті. Реакційна суміш (25 мкл) містила: 2,5 мкл 10-кратного буфера для Taq-полімерази, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP («МВІ Fermentas»), 1,0 од. Taq-полімерази («МВІ Fermentas»), по 15 пмоль відповідних праймерів, 2 мкл (100 нг) водного розчину сумарної ДНК, воду до кінцевого об'єму. Ампліфікацію фрагмента гена препроінсуліну людини здійснювали на ДНК- ампліфікаторі Biometra Personal Cycler (Швеція). Після завершення ПЛР продукти ампліфікації виз­ начали методом електрофорезу в 1 %-му агарозно- му гелі. В позитивних пробах на гелі виявлялася специфічна смуга, що відповіала ампліфікованому фрагменту ДНК розміром 461 п. н. У негативних пробах такої смуги не виявлено. Випадків появи специфічних смуг у негативних контролях і їхньої відсутності у позитивних контролях не було. Результати і обговорення. Як відомо, діабет 1-го типу є аутоімунним захворюванням із прогре­ суючою деструкцією /2-клітин підшлункової залози та розвитком абсолютної інсулінової недостатності [16]. Радикальне лікування можна здійснити тіль­ ки за допомогою сучасних технологій генної (або генно-клітинної) терапії. Стратегія нашої розробки замісної генної терапії ІЗЦД базується на створенні безпечної невірусної векторної системи, яка забез­ печуватиме ектопічну конститутивну експресію по- внорозмірного гена препроінсуліну людини в неен- докринних клітинах. Використання плазмідних ДНК як експресую- чих векторів дозволяє переносити повнорозмірні функціональні гени у клітини-мішені [17], але не забезпечує довготривалого функціонування цільо­ вого трансгена. Ми розробили інтегративну конст­ рукцію для переносу гена препроінсуліну людини в клітини широкого кола хазяїв, у якій використано Рис. 1. Карта-схема плазміди pBR322ins інвертовані термінальні повтори аденоасоційова- ного вірусу (ААВ, субтип 2), що є ключовими елементами для інтеграції ААВ у геном хазяїна. Показано, що ці паліндромні послідовності є міні­ мальними цис-діючимп елементами, суттєво не­ обхідними для вбудовування ДНК вірусу у геном хазяїна [18, 19]. Дизайн векторної молекули пере­ дбачає наявність двох незалежних модулів у єдиній конструкції: послідовності бактеріальної плазміди, що дозволяє їй реплікуватися у клітинах Е. соїі, та послідовності експресійної касети з цільовим та маркерним генами, фланкованої інвертованими термінальними повторами аденоасоційованого віру­ су людини. Джерелом гена препроінсуліну людини (ins) для його подальшого субклонування є рекомбінан- тна плазміда pBR322ins, схематичне зображення якої наведене на рис. 1. Повнорозмірний ген ін­ суліну людини клоновано в ВатНІ сайт плазміди pBR322 у складі фрагмента геному довжиною 2870 п. н. в оточенні фланкуючих послідовностей, з 5'-кінця якого знаходиться частина власної регуля­ торної області гена, що складає 72 п. н. [20, 21]. Дизайн заданого вектора передбачає одержання конструкції для конститутивного синтезу цільового трансгена. Для цього необхідно максимально вида­ лити фланкуючі ділянки геному людини з клонова- ного фрагмента. Ген препроінсуліну людини з мі­ німальними 5'- та З'-оточуючими ділянками суб- клонували в два етапи. На першому — з плазміди pBRins (рис. 1) вилучили HincII-EcoRI фрагмент довжиною 3064 п. н. і по сайтах Smal-EcoRI вбудували в плазміду pBlueScriptSK+, на друго- 102 ПЛАЗМІДКИЙ ВЕКТОР ДЛЯ ДОСТАВКИ ГЕНА ПРЕПРОІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ му — позбавлялися Sphl-EcoRI ділянки розміром 1444 п. н. і кінці вектора після затуплення Т4 ДНК-полімеразою (сайт EcoRI був добудований, а SphI — відщеплений) лігували. Така проміжна конструкція pSK91, яка містить у своєму полі- лінкері фрагмент геномної ДНК людини довжиною 1615 п. н. з геном препроінсуліну, виявилася дуже зручною для подальших маніпуляцій (рис. 2). Маючи на увазі подальшу доставку векторних молекул у клітини печінки in situ, при конструю­ ванні цільової плазміди ми використали енхансер- ну послідовність геному гепатотропного вірусу ге­ патиту В (субтип ayw) для посилення експресії гена препроінсуліну. Енхансер 1 (enh 1), лока­ лізований між відкритою рамкою зчитування по­ верхневого антигену всередині Р-області, почи­ нається перед Х-областю і частково з нею перекри­ вається. Фрагмент enh 1 (437 п. н.) вилучали з плазміди рНВ320 (рис. 3) за ВатНІ-НраІ сайтами рестрикції. Його кінці добудовували фрагментом Кльонова ДНК-полімерази І Е. соїі. Векторну ДНК pSK91 гідролізу вали рестриктазою Sail і після обробки фрагментом Кльонова та дефосфорилюван- ня субклонували enh 1 (рис. 4). Аналіз одержаних клонів виявив наявність рекомбінантних плазмід- них ДНК з одиничною послідовністю enh 1. За результатами рестрикційного аналізу рекомбінан- тної молекули та сиквенування клонованого фраг­ мента показано, що плазміда pSK91 містить одну копію послідовності енхансера 1, ВатНІ сайт якого знаходиться з З'-кінця полілінкера (даних не наве­ дено). Для забезпечення можливості тестування вве­ деного у клітини трансгена за допомогою ПЛР у 103 ТОПОРОВА О. К. ТА IH. Рис. 6. Карта-схема плазміди pTR-UF. ITR — інвертований кінцевий повтор AAV; Pcmv — промотор/енхансер ранніх генів цитомегаловірусу людини; SD/SA — донор/акцептор сплайсин­ гу; gfp JO — ген зеленого флуоресцентного білка; рАІ, рА2 — сигнали поліаденілювання; пео — ген неоміцинфосфотрансфе- рази Рис. 7. Карта-схема плазміди pTRhinse-neo проміжну плазміду pSK91e вбудували синтезовану послідовність (Рг23), що не має гомології з послі­ довністю геномів ссавців, клітини яких передбаче­ но використати в експериментах in vitro, ex vivo та in situ. Синтезований фрагмент 5-AGCTGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3' 3 -CTGCAACATTTTGCTGCCGGTCATA-5' вбудували в полілінкер плазміди pSK9Je, не пору­ шуючи цілісності гена препроінсуліну (рис. 5). 104 Проміжні плазміди використано для подальшо­ го конструювання рекомбінантного вектора з геном препроінсуліну людини pTRhins-neo та вектора, що містить послідовність ins/enh 1 — pTRhinse-neo. Векторну основу цільової конструкції складала плазміда pTR-UF (рис. 6), створена на базі геному аденоасоційованого вірусу, з якого було вилучено структурні гени та на їхнє місце вбудовано ген резистентності до антибіотика G-418 та ген зелено­ го флуоресцентного білка. Цільові вектори для гена препроінсуліну люди­ ни конструювали з використанням двох проміжних рекомбінантних плазмід pSK91 та pSK9Je23. Із складу базової плазміди pTR-UF вилучали перший репортерний ген gfp неповним гідролізом рестрик- тазами NotI і Sail, а замість цього фрагмента вбудували послідовність гена препроінсуліну, вирі­ зану за відповідними сайтами Notl-Sall із плазміди pSK91. Таким чином, перша цільова векторна плазміда pTRhins-neo містить повнорозмірний ген препроінсуліну людини під регуляцією промотору ранніх генів цитомегаловірусу та репортерний ген неоміцинфосфотрансферази (стійкість до антибіо­ тика G-418). Другу векторну конструкцію одержа­ но переклонуванням Xbal-Xhol фрагмента pSK- 91е23, що містить ген препроінсуліну та енхансер 1 вірусу гепатиту В, у векторну ДНК pTR-UF, з якої вилучено ген gfp за умов повного гідролізу рестриктазою ХЬаІ та неповного гідролізу Xhol (рис. 7). Склад експресійної касети плазміди pTRhinse-neo відрізняється від pTRhins-neo наяв­ ністю енхансера 1 вірусу гепатиту В, що, як ми передбачаємо, може відігравати ключову роль при використанні клітин печінки як органа-мішені для ектопічної експресії цільового трансгена. Одержані цільові конструкції містять інвер­ товані термінальні повтори аденоасоційованого ві­ русу — паліндромні послідовності довжиною 145 п. н. Плазміди з такими елементами є дуже не­ стабільними і не можуть підтримуватися в клітинах більшості штамів Е. colt Ми підтримували їх у клітинах штаму Sure2 E. соїі, створеного фірмою «Stratagene» для конструкцій, що містять палін­ дромні елементи. Використання інших штамів для трансформації нашими векторними плазмідами спричинювало вищеплення різної довжини фраг­ ментів переважно правого інвертованого повтору (даних не наведено). Трансфекція культивованих клітин ссавців комплексами ДНК—поліетиленімін (ПЕІ). Опти- ПЛАЗМЩНИЙ ВЕКТОР ДЛЯ ДОСТАВКИ ГЕНА ПРЕПРОІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ проліферацію клітин CellTiter 96, який широко використовують у клітинній біології для вивчення цитотоксичних агентів (рис. 8, 9). Ми трансфікували in vitro ДНК pTRhinse-neo у клітини ссавців різного видового походження: ми­ ші, свині, хом'яка та клітинні лінії людини HeLa (карцинома шийки матки), Нер-2 (епідермоїдна карцинома гортані). Селекцією на антибіотику G- 418 одержано стабільні трансформанти всіх вище­ зазначених ліній. На рис. 10 представлено резуль­ тати відбору стабільних трансформантів L-M-TK після трансфекції pTRhinse-neo. Ефективність трансформації при переносі плазмідної ДНК у ком- Рис. 9. Фотографії клітин лінії L-M-TK" під час тесту на проліферацію через 24 год після трансфекції (15000 клітин на лунку): / 10 мкг ДНК; 2 — 5 мкг ДНК; 3 — 2,5 мкг ДНК; 4 — 1 мкг ДНК; 5 — 0,5 мкг ДНК мальним засобом переносу генів виявилося викори­ стання розгалуженого ПЕІ з молекулярною масою 25 кДа як трансфекційного реагенту [14]. Препа­ рат ДНК/ПЕІ готували у масовому еквіваленті 1:2. Утворення комплексів ДНК з ПЕІ виявляли за затримкою міграції ДНК в 1 %-му агарозному гелі при електрофорезі (методом гель-ретардації). Вста­ новлено оптимальні дози векторної ДНК, яку вво­ дили у комплексі з ПЕІ: 10 мкг ДНК на 500000 клітин при переносі in vitro. Оскільки ефективність переносу залежить від ступеня токсичності транс­ фекційного матеріалу, ми перевіряли цитотоксич- ність препаратів ДНК за допомогою тесту на плексі з ПЕІ досягала 30 % (клітини пухлинних ліній людини трансформувалися з більшою ефек­ тивністю, ніж інші). Ці дані свідчать про мож­ ливість використання даного вектора для переносу цільових генів у широке коло реципієнтних клітин ссавців різного походження. Передбачаючи подальше випробування створе­ ного вектора в експериментах на тваринах з мо­ дельним діабетом, ми вважали за необхідне визна­ чити методом ПЛР, чи зберігається цільовий ген у трансформованих клітинах. Послідовність гена пре- проінсуліну людини високогомологічна послідов­ ності гена препроінсуліну дослідних тварин, а та- 105 ТОПОРОВА О. К. ТА Ш. Рис. 10. Відбір стабільних трансформантів на селективному середовищі та виявлення наявності трансгена препроінсуліну людини в трансформованих клітинах: а — контрольні нетранс- формовані клітини L-M-TK"; б — клітини L-M-TK", трансфор­ мовані ДНК pTRhinse-neo\ в — схема розташування праймерів на гені препроінсуліну людини відносно його структурної карти у складі плазміди pTRhinse-neo\ г — электрофореграма про­ дуктів ампліфікації фрагмента гена препроінсуліну людини піс­ ля ПЛР сумарної ДНК стабільних трансформантів клітинних ліній різного видового походження (І •— негативний контроль; 2 — нетрансформовані клітини; 3 — SPEV; 4 — L-M-TK"; 5 — СНО-К1; 6 — Нер-2; 7 — BALB/3T3; 8 — позитивний плаз- мідний контроль) кож має високу внутрішню гомологію через при­ сутність множинних коротких повторів. Наявність у векторі синтезованої послідовності дала змогу розрахувати пару праймерів INS3EX/INS-23 для тестування гена препроінсуліну людини за присут­ ності генів препроінсуліну тварин різного видового походження. Структуру синтезованих олігонуклео- тидних праймерів для проведення ПЛР наведено на рис. 10, в: місце відпалу праймера INS3EX розта­ шоване на З'-кінці екзона гена препроінсуліну, праймер INS-23 є гомологічним послідовності Рг23, яку було синтезовано та вбудовано у касету. До­ вжина очікуваного ПЛР-фрагмента складає 461 п. н. ПЛР-аналіз сумарної ДНК стабільних трансфор­ мантів виявив наявність трансгену препроінсуліну 106 в клітинах усіх досліджуваних ліній, про що свід­ чить очікувана смуга на електрофореграмі про­ дуктів ПЛР-аналізу (рис. 11, в). Висновки. Створено нову рекомбінантну плаз- міду, яка містить повнорозмірний ген препроінсу­ ліну людини в експресійній касеті, фланкованій інвертованими термінальними повторами аденоасо- ційованого вірусу. Для посилення експресії цільового гена, який перебуває під регуляцією конститутивного ткани- нонеспецифічного промотору, в конструкцію кло- новано енхансер 1 вірусу гепатиту В. Експериментально доведено, що нова плазміда є вектором, який ефективно трансформує in vitro клітини ссавців різних видів і різного тканинного походження. Розроблено праймери, які надійно визначають наявність трансгена препроінсуліну в клітинах усіх досліджуваних ліній. Отримано стабільні лінії клітин ссавців різного видового походження, які містять у своєму геномі ген препроінсуліну людини. О. К Toporova, S. D. Kyrylenko, D. М. Irodov, V. A. Kordium Plasmid vector for the human preproinsuiin gene delivery into mammalian cells Summary Eukaryotic expression vector for human preproinsuiin gene has been constructed for further delivery into non-endocrine mammalian cells in vitro and in vivo for the development of experimental gene therapy for type J diabetes. Vector construction consists of two independent modules, namely, bacterial plasmid sequence that allows its replication in Escherichia coli cells, and expression cassette for the target and marker genes which is flanked by inverted terminal repeats of human adeno-associated virus. The human cytomegalovirus immediate-early promoter has been used to ensure the constitutive expression of human preproinsuiin gene. The hepatitis В viral enhancer 1 was subcloned into cassette to increase the target transgene expression. After vector construction in vitro transfer into mammalian cells of different origin, the stable trans- formants were obtained and the availability of target human preproinsuiin transgene in the transformed cells has been confirmed by PCR analysis. Keywords: human preproinsuiin gene, expression vector, stable transformants. E. К Топорова, С. Д Кириленко, Д. М. Иродов, В. А. Кордюм Плазмидный вектор для доставки гена препроинсулина человека в клетки млекопитающих Резюме Сконструирован эукариотный вектор экспрессии гена препро­ инсулина человека для последующей доставки в неэндокринные клетки млекопитающих in vitro и in vivo с целью разработки экспериментальной генной терапии диабета 1-го типа. Век- ПЛАЗМЩНИЙ ВЕКТОР ДЛЯ ДОСТАВКИ ГЕНА ПРЕПРОІНС.ТЛШУ ЛЮДИНИ торная конструкция состоит из двух независимых модулей: последовательности бактериальной плазмиды, которая позво­ ляет ей реплицироваться в клетках Escherihia coli, и экспрес- сионной кассеты с целевым и маркерным генами, фланкиро­ ванной инвертированными терминальными повторами адено- ассоциированного вируса человека. Для обеспечения конститу­ тивной экспрессии гена препроинсулина использовали промо­ тор ранних генов цитомегаловируса человека. Для усиления экспрессии целевого трансгена в вектор субклонировали энхан- сер 1 вируса гепатита В. После переноса in vitro векторной конструкции в клетки млекопитающих разного происхожде­ ния получены стабильные трансформанты и ПЦР-анализом подтверджена наличие целевого трансгена препроинсулина че­ ловека в трансформированных клетках. Ключевые слова: ген препроинсулина человека, вектор экс­ прессии, стабильные трансформанты ПЕРЕЛІК ЛІТЕРАТУРИ 1. Strauss M., Barranger J. A. Concepts in gene therapy.—Ber­ lin: DeGruyter, 1997.—553 p. 2. Hodgson С P. The vector void in gene therapy / / Bio- Technology.—1995.—13.—P. 222—225. 3. Relph K, Harrington K, Pandha H. Clinical review. Recent developments and current status of gene therapy using viral vectors in the United Kingdom / / BMJ.—2004.—329.— P. 839—842. 4. Hurskainen H., Tyynela K, Turunen M., Vanninen R.. Lehtolainen P., Paljarvi L., Sandmair A. M., Loimas S., Puranen P., Immonen A., Kossila M., Puranen M., Johansson R., Vapalahti M., Yla-Herttuala S. Thymidine kinase gene therapy for human malignant glioma, using replication-deficient retroviruses or adenoviruses / / Hum. Gene Ther.—2000.— 1 1 — P. 2197—2205. 5. St George J. A. Gene therapy progress and prospects: ade­ noviral vectors / / Gene Ther.—2003.—10.—-P. 1135—1141. 6. Hitt M. M., Graham F. L. Adenovirus vectors for human gene therapy / / Adv. Virus Res,—2000.—55.—P. 479—505. 7. Schroder A. R., Shinn P., Chen H., Berry C , Ecker J. R., Bushman F. D. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots / / Cell.—2002,—110.— P. 521—529. 8. Schagen F. H., Ossevoort M.t Toes R. E., Hoeben Re. Immune responses against adenoviral vectors and their transgene pro­ ducts: a review of strategies for evasion / / Crit. Rev. Oncol. Hematol.—2004.—50.—P. 51—70. 9. Muruve D. A. The innate immune response to adenovirus vectors / / Hum. Gene Ther.—2004.—15.—P. 1157—1166. 10. Smith T. A., Idamakanti N., Rollence M. L., Marshall-Neff J., Kim J., Mulgrew K, Nemerow G. R., Kaleko M., Steven­ son S. С Adenovirus serotype 5 fiber shaft influences in vivo gene transfer in mice / / Hum. Gene Ther.—2003.—14.— P. 777—787. 11. Smith J. S., Tian J., Lozier J. N.. Byrnes A. P. Severe pulmonary pathology after intravenous administration of vectors in cirrhotic rats / / Мої. Ther.—2004.—9.—P. 932—941. 12. Hacein-Bey-Abina S., Von Kalle C, Schmidt M., McCormack M. P., Wulffraat N., Leboulch P., Lim A., Osborne С S.t Pawliuk R., Morillon E., Sorensen R., Forster A., Eraser P., Cohen J. J., de Saint B. G., Alexander I., Wintergerst U., Frebourg Т., Aurias A., Stoppa-Lyonnet D.y Romana S., Radford-Weiss L, Gross F., Valensi F., Delabesse E.f Macin- tyre E., Sigaux F., Soulier J., Leiva L. E., Wissler M., Prim C, Rabbitts T. H., Le Deist F., Fischer A., Cavazzana-Calvo M. LM02-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1 / / Science.—2003.—302.— P. 415—419. 13. Кордюм В. А., Топорова О. К., Новікова С. М., Ліхачева Л. I., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Козел Ю. О., Потапенко Р. І., І родов Д. М. Розробка підходів до генної терапії атеросклерозу / / Журн. АМН України.—2004.—10, № 2.—С. 288—300. 14. Топорова Е. К.,Новикова С. Н., Лихачева Л. И., Сухорада Е. М., Рубан Т. А., Козел Ю. М., Иродов Д М., Кордюм В. А. Невирусная доставка гена apoAl человека в клетки млекопитающих in vitro и in vivo II Біополімери і клі­ тина.—2004.—20, № 1—2.—С 25—32. 15. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual.—New York: Cold Spring Harbor Lab. press, 1989. 16. Stoll S. M., Calos M. P. Extrachromosomal plasmid vectors for gene therapy / / Curr. Opin. Мої. Ther.—2002.—4.— P. 299—305. 17'. Громнацкий Я. И. Диабетология.—М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002.—254 с. 18. Yang С. С, Xiao X., Zhu X., Ansardi D. С, Epstein N. D., Frey M. R., Matera A. G., Samulski R. J. Cellular recombina­ tion pathways and viral terminal repeat hairpin structures are sufficient for adeno-associated virus integration in vivo and in vitro II J. Virol.—1997.—71.—P. 9231—9247. 19. Hui ser D., Heilbronn R. Adeno-associated virus integrates site-specifically into human chromosome 19 in either orienta­ tion and with equal kinetics and frequency / / J. Gen. Virol.—2003.—84.—P. 133—137. 20. Незнанов Н. С, Трояновский Б. М., Гартель А. Л., Макарова И. В., Бендукидзе К. А, Газарян К. Г. Моле­ кулярное клонирование гена инсулина человека / / Моле- куляр. генетика, микробиология и вирусология.—1987.— № 7.—С. 14—15. 21. Lukash L L, Podolskaya S. V., Neborachko L. N., Sukhorada H. M., Varzanova I. S., Kordyum V. A. Expression of insulin gene introduced into embryonic human cells / / Advances in gene technology: Molecular biology of human genetic disease: Proc. Miami Bio/Technol. Eur. Symp. (Short Reports.) — Monaco, 1994.—Vol. 5.—P. 62. УДК 577.21 Надійшла до редакції 25.12.06 107

Similar Items