Регуляция биосинтеза фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта тканях хлопчатника
Исследовано влияние предпосевной обработки семян хлопчатника красным светом и электромагнитным полем низкой частоты на содержание фунгитоксичных веществ фенольной природы — фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта проростках хлопчатника....
Збережено в:
| Дата: | 2014 |
|---|---|
| Автор: | |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України
2014
|
| Назва видання: | Физиология растений и генетика |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/159468 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Регуляция биосинтеза фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта тканях хлопчатника / И.Г. Ахмеджанов // Физиология растений и генетика. — 2014. — Т. 46, № 6. — С. 535-540. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-159468 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1594682019-10-05T01:25:29Z Регуляция биосинтеза фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта тканях хлопчатника Ахмеджанов, И.Г. Исследовано влияние предпосевной обработки семян хлопчатника красным светом и электромагнитным полем низкой частоты на содержание фунгитоксичных веществ фенольной природы — фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта проростках хлопчатника. Досліджено вплив передпосівної обробки насіння бавовнику червоним світлом та електромагнітним полем низької частоти на вміст фунгітоксичних речовин фенольної природи — фітоалексинів в інфікованих збудником вертицильозного вілту проростках бавовнику. Influence of presowing treatment of seeds by red light and low-frequency electromagnetic field on maintenances of fungi toxic substances of the phenolic nature — phytoalexines in infected by Verticillium wilt pathogen cotton sprouts is investigated. 2014 Article Регуляция биосинтеза фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта тканях хлопчатника / И.Г. Ахмеджанов // Физиология растений и генетика. — 2014. — Т. 46, № 6. — С. 535-540. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. 2308-7099 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/159468 533.37:581.14:577.34 ru Физиология растений и генетика Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| description |
Исследовано влияние предпосевной обработки семян хлопчатника красным светом и электромагнитным полем низкой частоты на содержание фунгитоксичных веществ фенольной природы — фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта проростках хлопчатника. |
| format |
Article |
| author |
Ахмеджанов, И.Г. |
| spellingShingle |
Ахмеджанов, И.Г. Регуляция биосинтеза фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта тканях хлопчатника Физиология растений и генетика |
| author_facet |
Ахмеджанов, И.Г. |
| author_sort |
Ахмеджанов, И.Г. |
| title |
Регуляция биосинтеза фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта тканях хлопчатника |
| title_short |
Регуляция биосинтеза фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта тканях хлопчатника |
| title_full |
Регуляция биосинтеза фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта тканях хлопчатника |
| title_fullStr |
Регуляция биосинтеза фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта тканях хлопчатника |
| title_full_unstemmed |
Регуляция биосинтеза фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта тканях хлопчатника |
| title_sort |
регуляция биосинтеза фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта тканях хлопчатника |
| publisher |
Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України |
| publishDate |
2014 |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/159468 |
| citation_txt |
Регуляция биосинтеза фитоалексинов в инфицированных возбудителем вертициллезного вилта тканях хлопчатника / И.Г. Ахмеджанов // Физиология растений и генетика. — 2014. — Т. 46, № 6. — С. 535-540. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
| series |
Физиология растений и генетика |
| work_keys_str_mv |
AT ahmedžanovig regulâciâbiosintezafitoaleksinovvinficirovannyhvozbuditelemverticilleznogoviltatkanâhhlopčatnika |
| first_indexed |
2025-07-14T12:01:36Z |
| last_indexed |
2025-07-14T12:01:36Z |
| _version_ |
1837623669108506624 |
| fulltext |
УДК 533.37:581.14:577.34
РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА ФИТОАЛЕКСИНОВ В
ИНФИЦИРОВАННЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕМ ВЕРТИЦИЛЛЕЗНОГО
ВИЛТА ТКАНЯХ ХЛОПЧАТНИКА
И.Г. АХМЕДЖАНОВ
Институт биоорганической химии Академии наук Республики Узбекистан
100125 Ташкент, ул. М. Улугбека, 83
e-mail: iskakhm@mail.ru
Исследовано влияние предпосевной обработки семян хлопчатника красным све-
том и электромагнитным полем низкой частоты на содержание фунгитоксичных
веществ фенольной природы — фитоалексинов в инфицированных возбудителем
вертициллезного вилта проростках хлопчатника. Установлено, что фотостимуля-
ция семян красным светом индуцирует фитоалексинообразование в инфициро-
ванных патогеном тканях хлопчатника в 1,5—2 раза эффективнее по сравнению
с индуктором электромагнитной природы. Выявлена обратная зависимость меж-
ду содержанием фитоалексинов в тканях проростков, полученных из обработан-
ных и необработанных индукторами семян, и количеством растений с признака-
ми поражения вилтом, что указывает на возможность использования красного
света и слабых низкочастотных электромагнитных полей в качестве факторов,
способствующих интенсификации процесса фитоалексинообразования в ответ
на заражение хлопчатника вертициллезным вилтом.
Ключевые слова: Gossypium hirsutum L., хлопчатник, вилт, фитоалексины, красный
свет, фитохром, электромагнитные поля низкой частоты.
Как известно, повышение устойчивости хлопчатника к поражению воз-
будителем вертициллезного вилта во многих случаях заключается в ин-
дуцировании биосинтеза в тканях растений фитоалексинов (ФА), таких
как изогемигоссипол (ИГГ) и госсипол-эквивалент (ГЭ), токсичных для
возбудителя [1].
Для интенсификации иммунных реакций хлопчатника с целью по-
вышения вилтоустойчивости применяется стимулирование фитоалекси-
нообразования в тканях растения с помощью различных химических ве-
ществ биогенной и абиогенной природы путем замачивания семян,
опрыскивания растений в различные фазы развития и т.п. [5, 14]. Одна-
ко широкое применение химических средств защиты растений сопро-
вождается рядом отрицательных последствий: загрязнение окружающей
среды, возможная адаптация гриба-возбудителя вертициллезного вилта,
появление новых вирулентных рас патогена, токсическое влияние на по-
лезную микрофлору.
На фитоалексинообразующую способность растений в ответ на за-
ражение патогенами существенное влияние оказывают факторы окружа-
ющей среды и физиологическое состояние самого растительного орга-
низма. Свет также является индуктором фитоалексинообразования в
растительной ткани. Так, ультрафиолетовое облучение (УФ-облучение)
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ И ГЕНЕТИКА. 2014. Т. 46. № 6
535
© И.Г. АХМЕДЖАНОВ, 2014
семян и растений возбуждает защитные реакции растений [13]. В то же
время создание стресса с помощью УФ-облучения (длина волн <0,4
мкм) имеет ряд недостатков, связанных с возможностью его деструктив-
ного действия не только на патоген, но и на растение-хозяина, а также
с тем, что процесс УФ-облучения трудоемок и небезвреден для организ-
ма человека.
Альтернативой УФ-облучения является красный свет (КС), кото-
рый, индуцируя реакцию цис-транс-изомеризации хромофора фитохро-
ма — билитриен-разомкнутого тетрапирольного цикла — активирует
фитохромную систему растений и тем самым регулирует многие метабо-
лические процессы клетки [4], в том числе и фитоалексинообразование
[9]. Кроме того, показана возможность повышения устойчивости расте-
ний к различным вредным факторам, включая возбудителей болезней,
с помощью кратковременного стрессирующего воздействия индуктора-
ми различной природы, т.е. закалки растений [8]. Исследования ряда ав-
торов [2, 11, 12] показали, что к таким индукторам можно отнести и
электромагнитные поля низкой частоты (ЭМП НЧ).
Учитывая эффективность и простоту использования слабых низко-
частотных электромагнитных полей для обработки растений, а также их
нейтральность в смысле экологического влияния, мы сравнили действие
КС и ЭМП НЧ в качестве индукторов фитоалексинообразования в тка-
нях хлопчатника, инфицированных возбудителем вертициллезного вилта.
Методика
В экспериментах использовали семена восприимчивого к вилту хлоп-
чатника сорта С-4727 (G. hirsutum L.). Семена перед проращиванием в
темноте для получения этиолированных проростков и перед посевом в
лизиметры обрабатывали электромагнитным полем генератора электро-
магнитных импульсов с частотой 4 Гц и магнитной индукцией 200—
500 нТл в течение 30 мин [7] или красным светом люминесцентных
ламп, излучающих в области 590—660 нм, в течение 5 мин [3]. Для ин-
фицирования растений 18—20-суточные этиолированные проростки ук-
ладывали в ванночки и путем опрыскивания обрабатывали индуктором
вилтового поражения из расчета 0,05 мг/100 мл воды. Искусственное за-
ражение растений дозированным инокулюмом расы-2 гриба Verticillium
dahliae Kleb (2,5 млн спор/мл) проводили в фазу 5—6 настоящих листь-
ев путем введения в зону корневой шейки с помощью стерильного ка-
пилляра. Контролем служили растения, в стебли которых с помощью ка-
пилляра вводили воду [1].
Эффективность защитных реакций хлопчатника определяли по со-
держанию в тканях этиолированных проростков фунгитоксичных ве-
ществ фенольной природы — фитоалексинов ИГГ и ГЭ, а также по сте-
пени поражения вегетирующих растений вилтом [1].
Стебли проростков очищали от коры, измельчали и фиксировали
жидким азотом. Затем взвешивали навески по 4 г, заливали их 30 мл
хлороформа и ставили в темное место на 1 сут. Затем полученный хло-
роформный экстракт, содержащий фитоалексины, отфильтровывали от
твердых остатков, хлороформ выпаривали под вакуумом при низкой
температуре (–50 °С) до сухого состояния.
Остаток растворяли в 1 мл хлороформа и наносили на пластинки
Силуфола UV-254 фирмы Kavalier (Чехия). Пластинки помещали в хро-
536
И.Г. АХМЕДЖАНОВ
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
матографические камеры и проводили однократное разделение в систе-
ме растворителей бензол—метанол (9 : 1). Бензол и метанол должны
быть безводными. С примесью воды система получается мутной и не-
пригодной для анализов. Высушенные с помощью фена хроматограммы
просматривали в УФ-свете и проявляли флюороглюцином (2 % в 96 %-м
этаноле).
Количественное определение фитоалексинов проводили элюирова-
нием пятен с хроматограмм смесью бензол—метанол (9 : 1) и измерени-
ем интенсивности окраски на фотоэлектроколориметре при синем све-
тофильтре.
Вегетационные опыты проводили в 5 повторностях по 50 растений
в каждой, содержание фитоалексинов определяли в 6-кратной повтор-
ности.
Результаты и обсуждение
Физиолого-биохимическое изучение различных аспектов жизнедеятель-
ности растений дает возможность использовать иммунные свойства са-
мого организма, с помощью которых он защищается от нападения пато-
генов в природе. Результаты исследований показали, что КС и ЭМП НЧ
действуют на проростки хлопчатника аналогично физиологически
активным препаратам (индукторам), которые активируют иммунные
свойства растений, проявляющиеся в продуцировании фитоалексинопо-
добных веществ при контакте с патогеном. Анализом хроматограмм вы-
явлено, что обработка семян КС и ЭМП НЧ индуцирует реакцию сверх-
чувствительности в инфицированных патогеном тканях гипокотилей
этиолированных проростков хлопчатника (рисунок). Зоны хромато-
грамм, в которых определяются фитоалексины ИГГ и ГЭ, окрашивают-
ся флюороглюцином значительно ин-
тенсивнее в вариантах с проростками,
выращенными из облученных индук-
торами семян, по сравнению с проро-
стками из необлученных семян.
Таким образом, хроматографиче-
ская характерика хлороформных экс-
трактов опытных и контрольных про-
ростков хлопчатника качественно
указывает на ФА-индуцирующую ак-
тивность КС и ЭМП НЧ.
Данные, представленные в табли-
це, отражают влияние обработки се-
537
РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА ФИТОАЛЕКСИНОВ
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
Хроматограммы количественного содержания
изогемигоссипола и госсипол-эквивалента в
гипокотилях этиолированных проростков
хлопчатника сорта С-4727 через 48 ч после ин-
фицирования грибом V. dahliae (инфекционная
нагрузка 2,5 млн спор/мл):
К — контроль (семена перед посевом не обрабатыва-
ли, проростки не инфицировали); V.d. — семена пе-
ред посевом не обрабатывали, проростки инфициро-
вали индуктором вилтового поражения; ЭМ + V.d. —
семена перед посевом обрабатывали электромагнит-
ным полем, проростки инфицировали; КС + V.d. —
семена перед посевом обрабатывали красным светом,
проростки инфицировали К V.d. ЭМ+V.d. КС+V.d.
мян хлопчатника КС и ЭМП НЧ на количественное содержание ФА, об-
разующихся в тканях проростков через 48 ч после инфицирования воз-
будителем вертициллезного вилта. Опрыскивание этиолированных про-
ростков препаратом гриба вызывало индукцию ФА-образования, при
этом как фотостимуляция, так и стрессирование семян воздействием
ЭМП НЧ приводили к заметному усилению ФА-индуцирующей способ-
ности инфицированных тканей этиолированных проростков. В то же
время следует отметить, что после обработки семян КС содержание ИГГ
повышалось в 1,5—2 раза сильнее, чем после обработки ЭМП НЧ. От-
мечена также небольшая разница в содержании ГЭ в вариантах с пред-
обработкой семян КС и ЭМП НЧ. Выявленные различия эффективнос-
ти регуляторного влияния использованных в экспериментах индукторов
физической природы на интенсивность защитных реакций против воз-
будителя вертициллезного вилта хлопчатника связаны, по-видимому, со
специфичностью действия КС на этот процесс.
Доказательством специфичности эффектов КС является разнона-
правленность действия КС и дальнего красного света (ДКС) на синтез
ФА: в отличие от предобработки семян КС, активирующей фитохром-
ную систему и тем самым стимулирующей ФА-образование, обработка
семян ДКС, приводящая к обратной фотоконверсии фитохрома из ак-
тивной Рдк- в неактивную Рк-форму, не влияла на эффективность за-
щитных реакций инфицированных растений хлопчатника по сравнению
с контролем [3]. Этот факт может свидетельствовать о том, что облуче-
ние семян КС через каскад фитохромзависимых реакций способствует
снятию механизма супрессии генов, ответственных за реакцию сверхчув-
ствительности при заражении растений возбудителем вертициллезного
вилта. Некоторые ученые считают [10], что механизм супрессии эффек-
тивнее функционирует в восприимчивых к вилту генотипах хлопчатни-
ка, поэтому в обычных условиях они характеризуются невысоким содер-
жанием в тканях ФА, а после снятия этого механизма под действием
активной формы фитохрома приобретают способность к существенному
повышению уровня ФА-образования, как это отмечено для исследован-
ного в наших экспериментах сорта С-4727.
Под действием неспецифических стрессирующих факторов, к кото-
рым относится и электромагнитное стрессирование, механизм образова-
ния ФА другой. В ответ на неспецифический стрессор развивается длин-
ная и сложная цепь неспецифических ответов растения, включающая
экспрессию защитных генов с последующим синтезом защитных фер-
ментов, и т.д. [6]. Вполне вероятно, что различия в механизмах влияния
КС и ЭМП НЧ на систему защитных реакций против вилтового пора-
538
И.Г. АХМЕДЖАНОВ
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
Влияние обработки семян электромагнитным полем низкой частоты или красным светом на
содержание фитоалексинов в этиолированных проростках хлопчатника сорта С-4727 через
48 ч после инфицирования грибом V. dahliae (инфекционная нагрузка 2,5 млн спор/мл) и
количество растений (% общего числа) с признаками вертициллезного увядания
ИГГ ГЭ
Вариант
мкг/г сырой ткани
Пораженные растения, %
Контроль — — —
V.d. 19,2±2,3 25,0±2,7 28,4
ЭМ + V.d. 24,7±3,1 29,0±2,5 10,6
КC + V.d. 28,1±3,2 31,3±4,1 6,3
жения хлопчатника обусловливают в конечном итоге разницу в эффектив-
ности ФА-индуцирующей способности инфицированных тканей пророст-
ков, выращенных из фотостимулированных и стрессированных электро-
магнитным полем семян. Различия в содержании ФА, особенно ИГГ, в
опытных и контрольных вариантах хорошо коррелируют с количеством
растений с признаками вилтового поражения, что является еще одним ве-
сомым доказательством эффективности применения КС и ЭМП НЧ в ка-
честве индукторов повышения эффективности механизма ФА-образова-
ния в ответ на заражение хлопчатника вертициллезным вилтом.
1. Авазходжаев М.Х., Зельцер С.Ш. Физиологические факторы вилтоустойчивости хлоп-
чатника. — Ташкент: ФАН, 1980. — 122 с.
2. Аксенов С.И., Грунина Т.Ю., Горячев С.Н. О механизмах стимуляции и торможения при
прорастании семян пшеницы в электромагнитном поле сверхнизкой частоты // Био-
физика. — 2007. — 52, № 2. — С. 332—338.
3. Ахмеджанов И.Г., Гуссаковский Е.Е., Авазходжаев М.Х., Зельцер С.Ш. Регуляция фито-
алексинообразования в тканях хлопчатника при облучении семян красным светом //
Узбек. биол. журн. — 1993. — № 1. — С. 3—5.
4. Волотовский И.Д. Фитохром — регуляторный фоторецептор растений. — М.: Наука,
1992. — 168 с.
5. Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая и молекулярная
фитопатология. — М.: Об-во фитопатологов, 2001. — 302 с.
6. Малиновский В.И. Физиология растений: Учеб. пособие. — Владивосток: Изд-во Даль-
невосточн. гос. ун-та, 2004. — 94 с.
7. Тонких А.К. Механизмы действия слабых низкочастотных электромагнитных полей на
живые организмы // Узбек. биол. журн. — 2010. — Спецвыпуск. — С. 93—99.
8. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее
регуляция. — Уфа: Гилем, 2001. — 160 с.
9. А. с. Госкомизобрет. СССР № 1782387. / И.Г. Ахмеджанов, Е.Е. Гуссаковский, М.Х. Аваз-
ходжаев и др. Способ повышения устойчивости хлопчатника к поражению возбудите-
лем вертициллезного вилта. — М.: 1992.
10. Avazkhodjaev M.Kh., Zeltzer S.S., Nuritdinova H., Raviprakashi G.Dani. Phytoalexins as a fac-
tor in wilt resistance of cotton // Handbook of Phytoalexin Metabolism and Action. — New
York—Basel—Hong Kong: Marcel Dekker Inc., 1995. — P. 129—160.
11. Ben-Izhak M.E., Parola A.H., Kost D. Low-frequency electromagnetic fields induce a stress
effect upon higher plants, as evident by the universal stress signal, alanine // Biochem. Biophys
Res. Commun. — 2003. — 302, N 2. — P. 427—434.
12. Bilalis D.J., Katsenios N., Efthimiadou A. et al. Magnetic field pre-sowing treatment as an
organic friendly technique to promote plant growth and chemical elements accumulation in
early stages of cotton // Aust. J. Crop Sci. — 2013. — 7, N 1. — P. 46—50.
13. Haard N.F. Stress metabolites // Post. Harvest Physiol. and Crop Preserv. Proc. NATO Adv.
Study Inst. Sounion (28 Apr.—8 May 1981). — New-York—London, 1983. — P. 299—314.
14. Stossel P., Magnolato D. Phytoalexins in Phaseolus vulgaris and Glycine max induced by che-
mical treatment, microbial contamination and fungal infection // Experimentia. — 1983. —
39, N 2. — P. 153—154.
Получено 08.08.2014
РЕГУЛЮВАННЯ БIОСИНТЕЗУ ФIТОАЛЕКСИНIВ В IНФIКОВАНИХ ЗБУДНИКОМ
ВЕРТИЦИЛЬОЗНОГО ВIЛТУ ТКАНИНАХ БАВОВНИКУ
І.Г. Ахмеджанов
Iнститут біоорганічної хімії Академії наук Республіки Узбекистан, Ташкент
Досліджено вплив передпосівної обробки насіння бавовнику червоним світлом та електро-
магнітним полем низької частоти на вміст фунгітоксичних речовин фенольної природи —
фітоалексинів в інфікованих збудником вертицильозного вілту проростках бавовнику.
Встановлено, що фотостимуляція насіння червоним світлом індукує фітоалексиноутворен-
ня в інфікованих патогеном тканинах бавовнику в 1,5—2 рази ефективніше порівняно з
539
РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА ФИТОАЛЕКСИНОВ
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
індуктором електромагнітної природи. Виявлено обернену залежність між вмістом фіто-
алексинів у тканинах проростків, отриманих з обробленого й необробленого індукторами
насіння, та кількістю рослин з ознаками ураження вілтом, що вказує на можливість вико-
ристання червоного світла і слабких низькочастотних електромагнітних полів як чинників,
які сприяють інтенсифікації процесу фітоалексиноутворення у відповідь на зараження ба-
вовнику вертицильозним вілтом.
THE REGULATION OF PHYTOALEXINS BIOSYNTHESIS IN INFECTED BY
VERTICILLIUM WILT PATHOGEN COTTON TISSUES
I.G. Ahmedzhanov
Institute of Bioorganic Chemistry, Academy of Sciences of Republic of Uzbekistan
83 M. Ulugbek St., Tashkent, 100125, Uzbekistan
Influence of presowing treatment of seeds by red light and low-frequency electromagnetic field on
maintenances of fungi toxic substances of the phenolic nature — phytoalexines in infected by
Verticillium wilt pathogen cotton sprouts is investigated. It is established, that photostimulation of
seeds by red light induces the phytoalexines formation in infected with the pathogen cotton tis-
sues in 1,5—2 times more effectively in comparison with the inductor of electromagnetic nature.
It is revealed the negative correlation between the maintenance of phytoalexins in the sprouts tis-
sues received from treated and untreated by the inductors seeds and quantity of plants with signs
of the wilt disease that specifies the possibility of use of red light and weak low-frequency elec-
tromagnetic fields as the factors promoting an intensification of process of phytoalexines forma-
tion in reply to Verticillium wilt infection of cotton.
Key words: Gossypium hirsutum L., cotton, wilt, phytoalexines, red light, phytochrome, low-frequen-
cy electromagnetic fields.
540
И.Г. АХМЕДЖАНОВ
ISSN 2308-7099. Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46. № 6
|