Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогравітації

Проведено морфологічний та цитологічний аналіз проростків коренів Arabidopsis thaliana і досліджено процес індукції аутофагії в їх клітинах за умов мікрогравіатації. Встановлено істотне порушення розвитку коренів проростків і збільшення кількості аутофагосом в епідермальних клітинах перехідної зони...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2020
Hauptverfasser:	Шадріна, Р.Ю., Горюнова, І.І., Блюм, Я.Б., Ємець, А.І.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України 2020
Schriftenreihe:	Доповіді НАН України
Schlagworte:	Біологія
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/173192
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогравітації / Р.Ю. Шадріна, І.І. Горюнова, Я.Б. Блюм, А.І. Ємець // Доповіді Національної академії наук України. — 2020. — № 9. — С. 77-85. — Бібліогр.: 12 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-173192
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1731922020-11-26T01:26:38Z Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогравітації Шадріна, Р.Ю. Горюнова, І.І. Блюм, Я.Б. Ємець, А.І. Біологія Проведено морфологічний та цитологічний аналіз проростків коренів Arabidopsis thaliana і досліджено процес індукції аутофагії в їх клітинах за умов мікрогравіатації. Встановлено істотне порушення розвитку коренів проростків і збільшення кількості аутофагосом в епідермальних клітинах перехідної зони кореня на 6-ту добу вирощування за умов кліностатування, а також поступове зменшення їх кількості на 9-ту і 12-ту добу порівняно з контрольними рослинами, що може свідчити про адаптацію до умов зміненої гравітації. Результати транскрипційного аналізу активності генів родини atg8 (atg8a, atg8b, atg8c, atg8d, atg8e, atg8f, atg8g, atg8h та atg8i), залучених до реалізації початкових етапів аутофагії (6—12 діб кліностатування), свідчать про залежний від часу характер змін рівня експресії більшості цих генів. Зокрема, зареєстровано підвищення рівня експресії генів atg8a, atg8c, atg8d на 6-ту добу, поступове їх зниження на 9-ту добу і різке зниження після 12 діб кліностатування порівняно з контролем. Також встановлено значне (порівняно з контролем) підвищення рівня експресії генів atg8e, atg8f та atg8i на 6-, 9- та 12-ту добу. Отримані результати дають підставу стверджувати, що досліджувані гени atg8 є специфічними для реалізації початкових етапів аутофагії, індукованої мікрогравітацією. Morphological and cytological analyses of Arabidopsis thaliana seedlings roots growing under conditions mimicking a microgravity has been performed. Moreover, we assessed the process of autophagy induction in cells upon such conditions. Here, we report significant changes in the root development and the enhanced autophagosome formation in epidermal cells in the transitional zone on the 6th day of cultivation upon conditions on a rotating clinostat, as well as their gradual decrease on the 9th and 12th days, respectively, in comparison to control plants. These changes may suggest the induction of the adaptive process to the microgravity conditions. Family of atg8 genes (atg8a, atg8b, atg8c, atg8d, atg8e, atg8f, atg8g, atg8h, and atg8i) are involved in the implementation of initial stages of autophagy. Transcriptional analysis of atg8 isoforms indicates clear time-dependent expression changes (6-12 days of microgravity) in the majority of such genes. In particular, the increased expression levels (atg8a, atg8c, atg8d) on the 6th day, a gradual decrease on the 9th day, and a significant decrease after 12 days of growing on a clinostat have been observed in comparison to control. Our results de monstrate the significantly elevated expression of atg8e, atg8f, and atg8i genes on the 6th, 9th, and 2th days. The obtained data suggest that studied atg8 genes are specifically involved in autophagy induced by microgravity in Arabidopsis thaliana. 2020 Article Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогравітації / Р.Ю. Шадріна, І.І. Горюнова, Я.Б. Блюм, А.І. Ємець // Доповіді Національної академії наук України. — 2020. — № 9. — С. 77-85. — Бібліогр.: 12 назв. — укр. 1025-6415 DOI: doi.org/10.15407/dopovidi2020.09.077 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/173192 57.017.735+581.1 uk Доповіді НАН України Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Біологія Біологія
spellingShingle	Біологія Біологія Шадріна, Р.Ю. Горюнова, І.І. Блюм, Я.Б. Ємець, А.І. Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогравітації Доповіді НАН України
description	Проведено морфологічний та цитологічний аналіз проростків коренів Arabidopsis thaliana і досліджено процес індукції аутофагії в їх клітинах за умов мікрогравіатації. Встановлено істотне порушення розвитку коренів проростків і збільшення кількості аутофагосом в епідермальних клітинах перехідної зони кореня на 6-ту добу вирощування за умов кліностатування, а також поступове зменшення їх кількості на 9-ту і 12-ту добу порівняно з контрольними рослинами, що може свідчити про адаптацію до умов зміненої гравітації. Результати транскрипційного аналізу активності генів родини atg8 (atg8a, atg8b, atg8c, atg8d, atg8e, atg8f, atg8g, atg8h та atg8i), залучених до реалізації початкових етапів аутофагії (6—12 діб кліностатування), свідчать про залежний від часу характер змін рівня експресії більшості цих генів. Зокрема, зареєстровано підвищення рівня експресії генів atg8a, atg8c, atg8d на 6-ту добу, поступове їх зниження на 9-ту добу і різке зниження після 12 діб кліностатування порівняно з контролем. Також встановлено значне (порівняно з контролем) підвищення рівня експресії генів atg8e, atg8f та atg8i на 6-, 9- та 12-ту добу. Отримані результати дають підставу стверджувати, що досліджувані гени atg8 є специфічними для реалізації початкових етапів аутофагії, індукованої мікрогравітацією.
format	Article
author	Шадріна, Р.Ю. Горюнова, І.І. Блюм, Я.Б. Ємець, А.І.
author_facet	Шадріна, Р.Ю. Горюнова, І.І. Блюм, Я.Б. Ємець, А.І.
author_sort	Шадріна, Р.Ю.
title	Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогравітації
title_short	Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогравітації
title_full	Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогравітації
title_fullStr	Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогравітації
title_full_unstemmed	Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогравітації
title_sort	формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогравітації
publisher	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
publishDate	2020
topic_facet	Біологія
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/173192
citation_txt	Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогравітації / Р.Ю. Шадріна, І.І. Горюнова, Я.Б. Блюм, А.І. Ємець // Доповіді Національної академії наук України. — 2020. — № 9. — С. 77-85. — Бібліогр.: 12 назв. — укр.
series	Доповіді НАН України
work_keys_str_mv	AT šadrínarû formuvannâautofagosomtatranskripcíjnaaktivnístʹgenívatg8uklítinahkorenâarabídopsisuprirozvitkuautofagíízaumovmíkrogravítacíí AT gorûnovaíí formuvannâautofagosomtatranskripcíjnaaktivnístʹgenívatg8uklítinahkorenâarabídopsisuprirozvitkuautofagíízaumovmíkrogravítacíí AT blûmâb formuvannâautofagosomtatranskripcíjnaaktivnístʹgenívatg8uklítinahkorenâarabídopsisuprirozvitkuautofagíízaumovmíkrogravítacíí AT êmecʹaí formuvannâautofagosomtatranskripcíjnaaktivnístʹgenívatg8uklítinahkorenâarabídopsisuprirozvitkuautofagíízaumovmíkrogravítacíí
first_indexed	2025-07-15T09:43:31Z
last_indexed	2025-07-15T09:43:31Z
_version_	1837705578987651072
fulltext	77 ОПОВІДІ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ Ц и т у в а н н я: Шадріна Р.Ю., Горюнова І.І., Блюм Я.Б., Ємець А.І. Формування аутофагосом та транс- крипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогра- вітації. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2020. № 9. С. 77—85. https://doi.org/10.15407/dopovidi2020.09.077 Аутофагія є еволюційно консервативним клітинно-біологічним механізмом деградації та рециркуляції нутрієнтів і макромолекул, що забезпечує виживання клітин за несприят- ливих умов. Саме тому процеси аутофагії задіяні в підтримці гомеостазу клітин, форму- ванні зародка, проростанні насіння, утворенні провідних тканин ксилеми, старінні листків і захисті від патогенів [1]. Деградація пошкоджених органел та білкових агрегатів відбува- ється завдяки функціонуванню літичних структур клітини. Для цього реалізація механіз- мів аутофагії передбачає формування двомембранних молекул — аутофагосом, які достав- БІОЛОГІЯ ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2020. № 9: 77—85 https://doi.org/10.15407/dopovidi2020.09.077 УДК 57.017.735+581.1 Р.Ю. Шадріна, І.І. Горюнова, Я.Б. Блюм, А.І. Ємець Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України, Київ E-mail: yemets.alla@nas.gov.ua Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогравітації Представлено членом-кореспондентом НАН України А.І. Ємець Проведено морфологічний та цитологічний аналіз проростків коренів Arabidopsis thaliana і досліджено процес індукції аутофагії в їх клітинах за умов мікрогравіатації. Встановлено істотне порушення розвит- ку коренів проростків і збільшення кількості аутофагосом в епідермальних клітинах перехідної зони кореня на 6-ту добу вирощування за умов кліностатування, а також поступове зменшення їх кількості на 9-ту і 12-ту добу порівняно з контрольними рослинами, що може свідчити про адаптацію до умов зміненої граві- тації. Результати транскрипційного аналізу активності генів родини atg8 (atg8a, atg8b, atg8c, atg8d, atg8e, atg8f, atg8g, atg8h та atg8i), залучених до реалізації початкових етапів аутофагії (6—12 діб кліностату- вання), свідчать про залежний від часу характер змін рівня експресії більшості цих генів. Зокрема, зареє- стровано підвищення рівня експресії генів atg8a, atg8c, atg8d на 6-ту добу, поступове їх зниження на 9-ту добу і різке зниження після 12 діб кліностатування порівняно з контролем. Також встановлено значне (по- рівняно з контролем) підвищення рівня експресії генів atg8e, atg8f та atg8i на 6-, 9- та 12-ту добу. Отрима- ні результати дають підставу стверджувати, що досліджувані гени atg8 є специфічними для реалізації по- чаткових етапів аутофагії, індукованої мікрогравітацією. Ключові слова: аутофагія, аутофагосоми, кліностатування, гени atg8, Arabidopsis thaliana, мікрогравітація. 78 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2020. № 9 Р.Ю. Шадріна, І.І. Горюнова, Я.Б. Блюм, А.І. Ємець ляють компоненти, що потребують деградації, до літичних вакуолей для їх подальшої ре- циркуляції [2]. Формування аутофагосом є високодинамічним процесом, до якого залуче но велику кількість білків, зокрема ATG (autophagy related proteins). Більшість ATG- білків є консервативними у рослин оскільки їх участь у формуванні аутофагосом є кри- тично важливою [3]. Раніше було встановлено, що УФ-опромінювання, голодування, ос- мотичний та сольовий стреси характерним чином впливають на профілі експресії генів atg8 у Arabidopsis thaliana [4, 5]. Оскільки мікрогравітація також є стресовим фактором, що зумовлює істотні клітин но- фізіологічні зміни у рослин, нами було проведено попереднє дослідження [6] щодо впливу кліностатування на можливий розвиток аутофагії в коренях A. thaliana. Отримані резуль- тати свідчать про наявність морфологічних ознак індукції цього процесу в період від 6-ї до 12-ї доби з початку кліностатування. Це і стало поштовхом для початку досліджень впливу мікрогравітації на особливості експресії генів білків, залучених до реалізації аутофагії, оскільки це допоможе зрозуміти, як адаптувати та краще вирощувати рослини в умовах кос- мічного польоту в майбутньому. Саме тому метою даного дослідження було з’ясування початкових етапів розвитку ауто- фагії, пов’язаних з формуванням аутофагосом, і аналіз транскрипційних профілів генів atg8 в A. thaliana в умовах змодельованої мікрогравітації. Матеріали та методи. Як об’єкт дослідження використовували проростки A. thaliana екотипу Columbia Col-0. Насіння A. thaliana стерилізували в 10 %-му розчині гіпохлори- ту натрію (NaOCl), що містив 0,5 % Tween-20, протягом 15 хв і відмивали п’ять разів сте- рильною дистильованою водою. Після цього насіння висаджували на живильне середови- ще Мурасіге—Скуга (МС), що містило 4,4 г/л макро- та мікросолей середовища, набір ві- тамінів (M0222, Duchefa, Нідерланди), 10 % сахарози, 8,6 г агару, рН 5,6—5,7. Насіння стратифікували за температури 4 °C протягом доби, після чого чашки Петрі розміщували в кліностаті з режимом обертання 2 об/хв для подальшого пророщування насіння та росту проростків впродовж 12 діб при 22 °C і тривалості світлового періоду 14 год на добу. Тотальну РНК з рослинного матеріалу (6- , 9- та 12-добові проростки A. thaliana) ізо- лювали за допомогою innuSOLV RNA Reagent (Analytik Jena AG, Німеччина) згідно з ре- комендаціями виробника. Якість та цілісність виділеної РНК перевіряли електрофоре- тично в 1 %-му агарозному гелі з формамідом. Концентрацію РНК у зразках визначали за допомогою спектрофотометра при довжині хвилі 260 нм. Далі концентрацію ізольованої РНК нормалізовували до 100 нг/мкл. кДНК синтезували за допомогою зво ротної тран- скриптази (Revertasa Máxima, Thermo Fisher Scientific, США), 5х суміш для ПЛР, що місти- ла 5 мМ дНТФ, 2,5 мМ MgCl2 (Укргентех, Україна), 1 мкл олігонуклеотидів (OligodT (18) Thermo Fisher Scientific, США), 500 нг тотальної РНК як матриці, згідно з рекомендація- ми виробника, та води, вільної від РНКаз. ПЛР проводили за допомогою ампліфікатора Biorad CFX96 (США). Реакційна суміш для проведення ПЛР у реальному часі містила: 0,25 мкл ДНК-по лі- мерази (Thermo Fisher Scientific, США), 50 нг матриці кДНК і 10 мкл барвника SYBR Green (Sigma-Aldrich, Німечинна) у 10х буфері. Умови проведення реакції: початкова де нату- рація — 94 °C протягом 12 хв; 44 цикли ампліфікації (денатурація — 94 °C, 15 с; зв’язування праймера з матрицею — 10 с; синтез — 72 °C, 40 с) та фінальна елонгація — при 72 °C про- 79ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2020. № 9 Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису... тягом 10 хв. Температура зв’язування праймера з матрицею: для atg8a, atg8b — 57 °C; для atg8c, atg8d, atg8e, atg8f, atg8g, atg8h — 58 °C; для atg8i — 59 °C. Використані в дослідженні пари праймерів наведені в таблиці. Як контроль для ПЛР оцінювали рівень експресії фактору елонгації α (AtEFα). Про- дукти ПЛР аналізували за методом ΔΔ СТ [7]. Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою програми Microsoft Excel 2019. Для кожного досліджуваного по- казника було визначено його середнє значення та стандартне відхилення від середнього значення в межах однієї вибірки. Для дослідження особливостей прижиттєвої локалізації аутофагосом у клітинах про- ростки A. thaliana обробляли барвником LysoTracker™ Red DND-99 (Thermo Fisher Scien- ti fic, США) у концентрації 1 мМ з подальшим 3-кратним відмиванням проростків у нат- рієво-фосфатному буфері (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,76 мМ KH2PO4, pH 7,4) [8]. Зображення отримували за умов такої конфігурації режиму сканування: канал TRIC, збудження аргоновим лазером з довжиною хвилі 647 нм, об’єктив Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC лазерного сканувального конфокального мікроскопа LSM 510 META (Carl Zeiss, Німеччина). Особливості локалізації аутофагосом за нормальних умов і кліностатування досліджу- вали в епідермальних клітинах кореневого апекса, клітинах апікальної меристеми, епідер- мальних клітинах кори перехідної зони та зони розтягу, у трихобластах, атрихобластах і кореневих волосках зони диференціації. Кожен дослід проводили не менше, ніж у трьох повторах, під час кожного з експериментів аналізували не менше як 100 коренів. Результати та обговорення. Раніше нами вже було охарактеризовано зміни в морфо ло- гії та рості коренів проростків A. thaliana, індуковані кліностатуванням [6]. Зокрема, за цих умов спостерігається вкорочення довжини коренів експериментальних рослин та їх закру- чування через відсутність постійної сили тяжіння (рис. 1). За умов зміненої гра вітації ви- явлено істотні відмінності у диференціації клітин, швидкості росту коренів і проростків. Враховуючи характер цих змін протягом певного періоду вирощування, було ви рішено про- аналізувати ключові параметри розвитку аутофагії, починаючи з 6-ї доби експерименту. Оскільки мікрогравітація є стресовим чинником, що призводить до морфологічних і ростових порушень проростків, і, відповідно, за цих умов починається розвиток аутофагії Послідовності праймерів до генів atg8 Ген Прямий праймер Зворотний праймер atg8a GGGTTTGTTTCTCCCCCGAT AGCAGTTGGAGGCAATGTGT atg8b ACCCTAAATCCATCCTCTCTGTT TGGCTTTTTCAGCTCCAAGC atg8c ACAGGACAAATGGCAACAAAGG GCACAAAAGCATTGGAAGGCA atg8d TCTTGTGTTCCGTGGTCGAG ACACCATGAACGGAAGACCT atg8e CAGAGTTTTATCCTTATCCGTTCCA AGCATTAAAACGTGGCGGAT atg8f GTAGTCTACAGGCGTGGAAGG AGGTGGCTTGCTTGCTTAGTA atg8g GTCAGCTTCAGGCAGGATCA ACCGATTGGTTGTGCCTACAT atg8h TGCCAGACATGGAGAAGAACA CGTGTGAATCATCATCACTTGGT atg8i CCTTTTGACTTCGCCGCTTG ATCAACCAAAGGTTTTCTCACTGC 80 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2020. № 9 Р.Ю. Шадріна, І.І. Горюнова, Я.Б. Блюм, А.І. Ємець Рис. 1. Загальний вигляд проростків A. thaliana, вирощених за контрольних умов та за умов кліностату- вання. Масштабна лінійка — 0,5 см Рис. 2. Розподіл аутофагосом (вказані стрілками) в епідермальних клітинах перехідної зони коренів A. thaliana після 6, 9, 12 діб вирощування в контрольних умовах та за умов кліностатування. Масштаб на лінійка — 20 мкм 81ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2020. № 9 Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису... [6], нами було проаналізовано появу аутофагосом у клітинах досліджуваних рослин. Для виявлення аутофагосом у клітинах коренів A. thaliana використовували флуоресцентний барвник LysoTracker Red, оскільки він специфічно зв’язується з аутофагосомами і допо- магає ідентифікувати ці внутрішньоклітинні структури в живих клітинах. Дослідження проводили на 6- , 9- та 12-ту добу росту проростків A. thaliana за умов кліностатування. Починаючи з 6-ї доби культивування (рис. 2) спостерігали появу забарвлених червоних структур розміром від 1 мкм, що відповідають аутофагосомам. Слід зазначити, що для епідермальних клітин перехідної зони кількість аутофагосом на 6-ту добу зростала порів- ня но з контролем. На 9-ту добу культивування (див. рис. 2) кількість аутофагосом змен- шувалася порівняно з відповідним показником на 6-ту добу, але вона була більшою, ніж у контролі. На 12-ту добу (див. рис. 2) кліностатування кількість аутофагосом знижувала- ся порівняно з 9-ю добою, що може свідчити про адаптацію клітин коренів проростків до умов зміненої гравітації. Важливо зазначити, що розміри епідермальних клітин коренів експериментальних рослин були меншими порівняно з контрольними. Найімовірніше, це пов’язано зі стресовим навантаженням, що зазнають клітини внаслідок вирощування рос- лин в умовах кліностатування. Також було проаналізовано розвиток аутофагії в клітинах кореневого чохлика A. tha- liana, який є зоною кореня, що складається з клітин, які під час росту кореня зазнають най- Рис. 3. Розподіл аутофагосом у клітинах кореневого чохлика коренів A. thaliana після 6, 9, 12 діб ви ро- щування в контрольних умовах та за умов кліностатування. Масштабна лінійка — 20 мкм 82 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2020. № 9 Р.Ю. Шадріна, І.І. Горюнова, Я.Б. Блюм, А.І. Ємець більше механічного стресу. Нами було встановлено, що в клітинах ко ре невого чохлика як контрольних, так і рослин, які вирощували в умовах кліностатування, високий рівень роз- витку аутофагії відзначається на 9-ту добу (рис. 3). Проте істотної різ ниці між рівнем роз- витку аутофагії в клітинах контрольних та експериментальних рослин на 6-ту та 12-ту добу не спостерігали. Відомо, що білок ATG8 відіграє важливу роль у процесах реалізації аутофагії. Локалі- зуючись як із зовнішньої, так і внутрішньої мембрани аутофагосоми, він відповідає за від’єднання та експансію преаутофагосомної структури [9]. У A. thaliana родина генів atg8 представлена дев’ятьма генами, які віднесені до трьох субродин. Наявність багатьох генів atg8 свідчить про те, що їх білкові продукти можуть бути задіяні на різних етапах фор- му вання аутофагосом [10]. У результаті молекулярно-генетичного аналізу профілів екс- пре сії усіх дев’яти генів atg8 було виявлено, що рівень їх експресії залежить від тривалості кліностатування (рис. 4). Зокрема, рівень експресії генів atg8e, atg8f та atg8i підвищувався на 6- , 9- і 12-ту добу кліностатування. Однак зміни рівня експресії гена atg8i в умовах кліностатування були Рис. 4. Рівень експресії різних генів atg8 у рослин A. thaliana через 6, 9, 12 діб вирощування за контроль- них умов та за умов кліностатування 83ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2020. № 9 Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису... найбільш вираженими (у 1,5—1,8 раза вище, ніж у контролі) порівняно зі змінами цього показника для інших генів atg8. Порівнюючи отримані дані з результатами дослідження змі ни рівня експресії різних генів atg8 в умовах голодування, сольового та осмотичного стре сів [11], ми також встановили підвищення рівня експресії (у 1,5—2 рази) генів atg8e, atg8f за умов впливу всіх досліджуваних стресових чинників (голодування, сольовий та осмо тич ний стрес) порівняно із контролем. При цьому для гена atg8i вищий рівень екс- пресії порівняно з контролем відмічено тільки за умов голодування. Раніше було показано, що мутантні лінії A. thaliana з гіперекспресію генів atg8e, atg8f (35S-ATG8e, Actin-ATG8f) характе ри зуються посиленим розвитком аутофагії, що супроводжується зростанням кіль- кості аутофагосом [12]. Для гена atg8g на жодному з часових проміжків не виявлено істотного підвищення рівня експресії порівняно з контролем, оскільки отримані показники були нижчими за контрольні: на 6-ту добу —1,0, на 9-ту добу — 0,15, на 12-ту добу —0,44. Це може свідчити про те, що, можливо, ген atg8g не залучений напряму до реалізації аутофагії, яка розвива- ється саме за умов мікрогравітації. Раніше нами також було вста новлено, що рівень експре- сії гена atg8g в умовах осмотичного стресу був нижчим від конт рольних значень. У випадку генів atg8a, atg8c, atg8d спостерігали інші закономірності у змінах рівня їх експресії. На 6-ту добу кліностатування рівень експресії цих генів зростав і становив 0,72 для гена atg8a, 1,1 для гена atg8c, 1,55 для гена atg8d. У подальшому їх рівень експре- сії знижувався. На 9-ту добу експерименту значення рівня експресії становили 0,24 для гена atg8a, —0,15 для гена atg8c, 0,18 для гена atg8d. Ще нижчим рівень експресії цих генів був після 12 діб вирощування за умов кліностатування: —1,0 для гена atg8a, —2,0 для гена atg8c і —2,18 для гена atg8d. Таким чином, нами вперше на транскрипційному рівні отримано результати, які під- тверджують розвиток аутофагії, індукованої кліностатуванням у A. thaliana. Враховуючи ту обставину, що білок ATG8 є структурною одиницею аутофагосом і безпосередньо бере участь у розвитку стресоіндукованої аутофагії в клітині, результати проведеного нами транскриптомного аналізу різних генів цього білка свідчать як про розвиток аутофагії під впливом мікрогравітації, так і про те, що частина вищезазначених генів atg8 може бути виокремлена як більш специфічна для повноцінної реалізації аутофагії за цих умов. Зок- рема, встановлено підвищення рівня експресії генів atg8e, atg8f та atg8i на 6- , 9- і 12-ту до бу вирощування рослин в умовах мікрогравітації. Отримані дані дають фундамент для подальшого вивчення клітинних механізмів залучення різних ізотипів білка ATG8 та їх взаємодії з іншими молекулярними компонентами, задіяними у розвитку аутофагії в умо- вах мікрогравітації. Дослідження виконано за фінансової підтримки проєкту “Розробка концепції регуля- ції розвитку та стресостійкості рослин для їх адаптації до умов космічних польотів шляхом залучення клітинно-біологічних ресурсів” цільової комплексної програми НАН України з нау- кових космічних досліджень на 2018—2022 рр. (номер державної реєстрації 01118U003742). 84 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2020. № 9 Р.Ю. Шадріна, І.І. Горюнова, Я.Б. Блюм, А.І. Ємець ЦИТОВАНА ЛІТЕРАТУРА 1. Chen Q., Shinozaki D., Luo J., Pottier M., Havé M., Marmagne A., Reisdorf-Cren M., Chardon F., Tho mine S., Yoshimoto K., Masclaux-Daubresse C. Autophagy and nutrients management in plants. Cells. 2019. 8, № 11. 1426. https://doi.org/10.3390/cells8111426 2. Masclaux-Daubresse C., Chen Q., Havé M. Regulation of nutrient recycling via autophagy. Curr. Opin. Plant Biol. 2017. 39. Р. 8—17. https://doi.org/10.1016/j.pbi.2017.05.001 3. Tang J., Bassham D.C. Autophagy in crop plants: What’s new beyond Arabidopsis? Open Biology. 2018. 8, № 12. 180162. https://doi.org/10.1098/rsob.180162 4. Оленєва В.Д., Литвин Д.І., Ємець А.І., Блюм Я.Б. Вплив УФ-В на транскрипційні профілі генів осно- вних білків, залучених до розвитку аутофагії за участю мікротрубочок. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2018. № 1. С. 100—109. https://doi.org/10.15407/dopovidi2018.01.100 5. Olenieva V., Lytvyn D., Yemets A., Bergounioux C., Blume Y. Tubulin acetylation accompanies autophagy development induced by different abiotic stimuli in Arabidopsis thaliana. Cell Biol. Int. 2019. 43, № 9. Р. 1056—1064. https://doi.org/10.1002/cbin.10843 6. Шадріна Р.Ю., Ємець А.І., Блюм Я.Б. Розвиток аутофагії як адаптивної відповіді рослин Arabidopsis thaliana на умови мікрогравітації. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2019. 25. С. 327— 332. https://doi.org/10.7124/FEEO.v25.1186 7. Rao X., Huang X., Zhou Z., Lin X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta CT) method for quantitative real- time polymerase chain reaction data analysis. Biostat., Bioinforma. Biomath. 2013. 3, № 3. Р. 71—85. 8. Chazotte B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011. 2. pdb. prot5571. https://doi.org/10.1101/pdb.prot5571 9. Yang X., Bassham D.C. New insight into the mechanism and function of autophagy in plant cells. Int.l Rev. Cell Mol. Biol. 2015. 320. Р. 1—40. https://doi.org/10.1016/bs.ircmb.2015.07.005 10. Doelling J.H., Walker J.M., Friedman E.M., Thompson A.R., Vierstra R.D. The APG8/12-activating enzyme APG7 is required for proper nutrient recycling and senescence in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 2002. 277, № 36. Р. 33105—33114. https://doi.org/10.1074/jbc.M204630200 11. Оленєва В. Д., Литвин Д. І., Ємець А. І., Блюм Я. Б. Вплив голодування, осмотичного та сольового стресів на транскрипційні профілі генів основних білків, залучених до розвитку аутофагії за участю мікротрубочок. Вісн. Укр. т-ва генетиків і селекціонерів 2017. 15, № 2. С. 174—180. https://doi.org/ 10.7124/visnyk.utgis.15.2.876 12. Chen Q., Soulay, F., Saudemont, B., Elmayan, T., Marmagne, A., & Masclaux-Daubresse, C. L. Overexpression of ATG8 in Arabidopsis stimulates autophagic activity and increases nitrogen remobilization efficiency and grain filling. Plant Cell Physiol. 2019. 60, № 2. С. 343—352. https://doi.org/10.1093/pcp/pcy214 Надійшло до редакції 10.07.2020 REFERENCES 1. Chen, Q., Shinozaki, D., Luo, J., Pottier, M., Havé, M., Marmagne, A., Reisdorf-Cren, M., Chardon, F., Thomine, S., Yoshimoto, K. & Masclaux-Daubresse, C. (2019). Autophagy and nutrients management in plants. Cells, 8, No. 11. 1426. https://doi.org/10.3390/cells8111426 2. Masclaux-Daubresse, C., Chen, Q. & Havé, M. (2017). Regulation of nutrient recycling via autophagy Curr. Opin. Plant Biol., 39, рр. 8-17. https://doi.org/10.1016/j.pbi.2017.05.001 3. Tang, J. & Bassham, D. C. (2018). Autophagy in crop plants: What’s new beyond Arabidopsis? Open Biol., 8, No. 12. 180162. https://doi.org/10.1098/rsob.180162 4. Olenieva, V. D., Lytvyn, D. I., Yemets, A. I. & Blume, Ya. B. (2018). Influence of UV-B on expression pro- files of genes involved in the development of autophagy by means of microtubules. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr., No. 1, рр. 100-109. https://doi.org/10.15407/dopovidi2018.01.100 5. Olenieva, V., Lytvyn, D., Yemets, A., Bergounioux, C. & Blume, Y. (2019). Tubulin acetylation accompanies autophagy development induced by different abiotic stimuli in Arabidopsis thaliana. Cell Biol. Int., 43, No. 9, рр. 1056-1064. https://doi.org/10.1002/cbin.10843 6. Shadrina, R. Yu., Yemets, A. I. & Blume, Ya. B. (2019). Autophagy development as an adaptive response to microgravity conditions in Arabidopsis thaliana. Faktory eksperimental’noi evolucii organizmiv, 25, рр. 327-332. https://doi.org/10.7124/FEEO.v25.1186 85ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2020. № 9 Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису... 7. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z. & Lin, X. (2013). An improvement of the 2ˆ(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat. Bioinforma. Biomath., 3, No. 3, рр. 71-85. 8. Chazotte, B. (2011). Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols, 2, pdb.prot5571. https://doi.org/10.1101/pdb.prot5571 9. Yang, X. & Bassham, D. C. (2015). New insight into the mechanism and function of autophagy in plant cells. Int. Rev. Cell Mol. Biol., 320, рр. 1-40. https://doi.org/10.1016/bs.ircmb.2015.07.005 10. Doelling, J. H., Walker, J. M., Friedman, E. M., Thompson, A. R. & Vierstra, R. D. (2002). The APG8/12- activating enzyme APG7 is required for proper nutrient recycling and senescence in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem., 277, No. 36, рр. 33105-33114. https://doi.org/10.1074/jbc.M204630200 11. Olenieva, V. D., Lytvyn, D. I., Yemets, A. I. & Blume, Ya. B. (2017). Influence of sucrose starvation, osmotic and salt stresses on expression profiles of genes involved in the development of autophagy by means of microtubules. Visnik Ukrains’kogo tovaristva genetikiv i selekcioneriv, 15, No. 2, pp. 174-180. https://doi. org/10.7124/visnyk.utgis.15.2.876 12. Chen, Q., Soulay, F., Saudemont, B., Elmayan, T., Marmagne, A. & Masclaux-Daubresse, C.L. (2019). Ove- rexpression of ATG8 in Arabidopsis stimulates autophagic activity and increases nitrogen remobilization efficiency and grain filling. Plant Cell Physiol., 60, No. 2, рр. 343-352. https://doi.org/10.1093/pcp/pcy214 Received 10.07.2020 R.Yu. Shadrina, I.I. Horiunova, Ya.B. Blume, A.I. Yemets Institute of Food Biotechnology and Genomics of the NAS of Ukraine, Kyiv E-mail: yemets.alla@nas.gov.ua AUTOPHAGOSOME FORMATION AND TRANSCRIPTIONAL ACTIVITY OF ATG8 GENES IN ARABIDOPSIS ROOT CELLS DURING THE DEVELOPMENT OF AUTOPHAGY UNDER MICROGRAVITY CONDITIONS Morphological and cytological analyses of Arabidopsis thaliana seedlings roots growing under conditions mi- micking a microgravity has been performed. Moreover, we assessed the process of autophagy induction in cells upon such conditions. Here, we report significant changes in the root development and the enhanced autopha- gosome formation in epidermal cells in the transitional zone on the 6th day of cultivation upon conditions on a rotating clinostat, as well as their gradual decrease on the 9th and 12th days, respectively, in comparison to con- trol plants. These changes may suggest the induction of the adaptive process to the microgravity conditions. Family of atg8 genes (atg8a, atg8b, atg8c, atg8d, atg8e, atg8f, atg8g, atg8h, and atg8i) are involved in the imple- mentation of initial stages of autophagy. Transcriptional analysis of atg8 isoforms indicates clear time-depen- dent expression changes (6-12 days of microgravity) in the majority of such genes. In particular, the increased expression levels (atg8a, atg8c, atg8d) on the 6th day, a gradual decrease on the 9th day, and a significant dec- rease after 12 days of growing on a clinostat have been observed in comparison to control. Our results de mon- strate the significantly elevated expression of atg8e, atg8f, and atg8i genes on the 6th, 9th, and 2th days. The obtained data suggest that studied atg8 genes are specifically involved in autophagy induced by microgravity in Arabidopsis thaliana. Keywords: autophagy, autophagosome, clinostatting, atg8 genes, Arabidopsis thaliana, microgravity.

Формування аутофагосом та транскрипційна активність генів atg8 у клітинах кореня арабідопсису при розвитку аутофагії за умов мікрогравітації

Institution

Ähnliche Einträge