Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза и хранении при температуре жидкого азота

Обнаружено явление критической опалесценции в цитоплазме зародышевой ткани чеснока — меристеме при охлаждении в парах жидкого азота, что указывает на наличие в системе фазового перехода жидкость–жидкость. Установлен факт выживания клеток ткани меристемы в цикле охлаждение–отогрев. Высказано предпо...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2017
Hauptverfasser:	Ходько, А.Т., Лысак, Ю.С.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України 2017
Schriftenreihe:	Физика низких температур
Schlagworte:	Низкоразмерные и неупорядоченные системы
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/175218
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза и хранении при температуре жидкого азота / А.Т. Ходько, Ю.С. Лысак // Физика низких температур. — 2017. — Т. 43, № 10. — С. 1500-1507. — Бібліогр.: 40 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-175218
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1752182021-02-01T01:28:26Z Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза и хранении при температуре жидкого азота Ходько, А.Т. Лысак, Ю.С. Низкоразмерные и неупорядоченные системы Обнаружено явление критической опалесценции в цитоплазме зародышевой ткани чеснока — меристеме при охлаждении в парах жидкого азота, что указывает на наличие в системе фазового перехода жидкость–жидкость. Установлен факт выживания клеток ткани меристемы в цикле охлаждение–отогрев. Высказано предположение, что главной причиной перехода меристемы в состояние анабиоза является резкое замедление диффузии в цитоплазме, обусловленное прохождением раствора через критическую точку, с последующим формированием в результате фазового перехода типа жидкость–жидкость дисперсной системы — высококонцентрированной эмульсии. Такое макрофазное разделение характерно для систем полимер–растворитель. Определен режим охлаждения в цикле криоконсервирования изучаемого биообъекта до температуры жидкого азота и его последующего отогрева, обеспечивающий сохранение жизнеспособности ткани. Виявлено явище критичної опалесценції в цитоплазмі зародкової тканини часнику — меристемі при охолодженні в парах рідкого азоту, що вказує на наявність в системі фазового переходу типу рідина– рідина. Встановлено факт збереження життєздатності клітин тканини меристеми в циклі охолодження– нагрівання. Висловлено припущення, що головною причиною переходу в стан анабіозу є різке уповільнення дифузії в цитоплазмі, яке обумовлене переходом розчину через критичну точку, з наступним формуванням, як результат фазового переходу типу рідина–рідина дисперсної системи — висококонцентрованої емульсії. Такий тип макрофазного розділення є типовим для систем полімер–розчинник. Визначено режим охолодження в циклі кріоконсервування біологічного об’єкту, що вивчається, до температури рідкого азоту та його наступного нагрівання, що забезпечує життєздатність тканини. Critical opalescence phenomenon was observed in the cytoplasm of garlic embryonic tissue—meristem—upon cooling in liquid nitrogen vapor, indicating liquid-liquid phase transition in the system. It was established that cells of the meristem tissue survive the cooling-thawing cycle. We suggest that the transition of meristem tissue to the state of anabiosis is mainly due to a drastic slowing of the diffusion in the cytoplasm caused by the passage of the solution through the critical point, followed by the formation of a dispersed system—a highly concentrated emulsion—as a result of a liquid-liquid phase transition. This macrophase separation is characteristic of polymer-solvent systems. We established the regime of cooling down to liquid nitrogen temperature and subsequent thawing in the cryopreservation cycle for the biological object under study, which ensures the preservation of tissue viability. 2017 Article Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза и хранении при температуре жидкого азота / А.Т. Ходько, Ю.С. Лысак // Физика низких температур. — 2017. — Т. 43, № 10. — С. 1500-1507. — Бібліогр.: 40 назв. — рос. 0132-6414 PACS: 64.70.P–, 64.70.Ja, 64.70.pj http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/175218 ru Физика низких температур Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Низкоразмерные и неупорядоченные системы Низкоразмерные и неупорядоченные системы
spellingShingle	Низкоразмерные и неупорядоченные системы Низкоразмерные и неупорядоченные системы Ходько, А.Т. Лысак, Ю.С. Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза и хранении при температуре жидкого азота Физика низких температур
description	Обнаружено явление критической опалесценции в цитоплазме зародышевой ткани чеснока — меристеме при охлаждении в парах жидкого азота, что указывает на наличие в системе фазового перехода жидкость–жидкость. Установлен факт выживания клеток ткани меристемы в цикле охлаждение–отогрев. Высказано предположение, что главной причиной перехода меристемы в состояние анабиоза является резкое замедление диффузии в цитоплазме, обусловленное прохождением раствора через критическую точку, с последующим формированием в результате фазового перехода типа жидкость–жидкость дисперсной системы — высококонцентрированной эмульсии. Такое макрофазное разделение характерно для систем полимер–растворитель. Определен режим охлаждения в цикле криоконсервирования изучаемого биообъекта до температуры жидкого азота и его последующего отогрева, обеспечивающий сохранение жизнеспособности ткани.
format	Article
author	Ходько, А.Т. Лысак, Ю.С.
author_facet	Ходько, А.Т. Лысак, Ю.С.
author_sort	Ходько, А.Т.
title	Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза и хранении при температуре жидкого азота
title_short	Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза и хранении при температуре жидкого азота
title_full	Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза и хранении при температуре жидкого азота
title_fullStr	Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза и хранении при температуре жидкого азота
title_full_unstemmed	Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза и хранении при температуре жидкого азота
title_sort	физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза и хранении при температуре жидкого азота
publisher	Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України
publishDate	2017
topic_facet	Низкоразмерные и неупорядоченные системы
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/175218
citation_txt	Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза и хранении при температуре жидкого азота / А.Т. Ходько, Ю.С. Лысак // Физика низких температур. — 2017. — Т. 43, № 10. — С. 1500-1507. — Бібліогр.: 40 назв. — рос.
series	Физика низких температур
work_keys_str_mv	AT hodʹkoat fizikohimičeskieprocessyvzarodyševojrastitelʹnojtkanipriperehodevsostoânieholodovogoanabiozaihraneniipritemperaturežidkogoazota AT lysakûs fizikohimičeskieprocessyvzarodyševojrastitelʹnojtkanipriperehodevsostoânieholodovogoanabiozaihraneniipritemperaturežidkogoazota
first_indexed	2025-07-15T12:28:38Z
last_indexed	2025-07-15T12:28:38Z
_version_	1837715967401000960
fulltext	Low Temperature Physics/Физика низких температур, 2017, т. 43, № 10, c. 1500–1507 Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза и хранении при температуре жидкого азота А.Т. Ходько, Ю.С. Лысак Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков, Украина E-mail: a.khodko4@mail.ru Статья поступила в редакцию 5декабря 2016 г., после переработки 15 февраля 2017 г. опубликована онлайн 27 августа 2017 г. Обнаружено явление критической опалесценции в цитоплазме зародышевой ткани чеснока — мери- стеме при охлаждении в парах жидкого азота, что указывает на наличие в системе фазового перехода жидкость–жидкость. Установлен факт выживания клеток ткани меристемы в цикле охлаждение–отогрев. Высказано предположение, что главной причиной перехода меристемы в состояние анабиоза является резкое замедление диффузии в цитоплазме, обусловленное прохождением раствора через критическую точку, с последующим формированием в результате фазового перехода типа жидкость–жидкость дис- персной системы — высококонцентрированной эмульсии. Такое макрофазное разделение характерно для систем полимер–растворитель. Определен режим охлаждения в цикле криоконсервирования изучаемого биообъекта до температуры жидкого азота и его последующего отогрева, обеспечивающий сохранение жизнеспособности ткани. Виявлено явище критичної опалесценції в цитоплазмі зародкової тканини часнику — меристемі при охолодженні в парах рідкого азоту, що вказує на наявність в системі фазового переходу типу рідина– рідина. Встановлено факт збереження життєздатності клітин тканини меристеми в циклі охолодження– нагрівання. Висловлено припущення, що головною причиною переходу в стан анабіозу є різке уповіль- нення дифузії в цитоплазмі, яке обумовлене переходом розчину через критичну точку, з наступним фор- муванням, як результат фазового переходу типу рідина–рідина дисперсної системи — висококонцентро- ваної емульсії. Такий тип макрофазного розділення є типовим для систем полімер–розчинник. Визначено режим охолодження в циклі кріоконсервування біологічного об’єкту, що вивчається, до температури рід- кого азоту та його наступного нагрівання, що забезпечує життєздатність тканини. PACS: 64.70.P– Переходы в стеклообразное состояние в специфических системах; 64.70.Ja Переходы жидкость–жидкость; 64.70.pj Полимеры. Ключевые слова: анабиоз, криоконсервирование, критическая опалесценция , фазовые переходы (пре- вращения) жидкость–жидкость, жидкостное фазовое разделение, стеклование. Введение Явление обратимой остановки жизни — анабиоз было открыто в 1701 г. Антоном ван Левенгуком при наблю- дении за тихоходками и коловратками в циклических процессах их высушивания и последующего увлажнения. Это состояние организмов часто встречается в природе. По мнению Голдовского, анабиоз является всеобщим, первичным, но не всегда реализуемым свойством живой материи [1]. Широкое внедрение этого явления в практику свя- зано с развитием физики низких температур и повтор- ным открытием в 1949 г. Полджем криопротекторных свойств глицерина [2]. В 1912 г. русский ученый Мак- симов описал [3] феномен повышения холодоустойчи- вости растений после предварительного выдерживания их в водных растворах различных веществ, в том числе и глицерина, однако впоследствии эти исследования были забыты. На этой базе сформировался один из © А.Т. Ходько, Ю.С. Лысак, 2017 Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза разделов физико-химической биологии — криобиоло- гия. Появились технологии криоконсервирования и сублимационной сушки, сочетающие охлаждение и вы- сушивание в вакууме, позволяющие искусственно пере- водить биосистемы в состояние анабиоза. Надо заме- тить, что это явление необходимо учитывать и при проведении других процессов, например при стерилиза- ции, при перелетах межпланетных аппаратов с целью исключения заноса земных форм жизни и др. Изучение и решение проблем анабиоза важно для практических целей, а также имеет общебиологическое значение. К сожалению, интенсивных исследований в этом направ- лении не ведется. По мнению Ушатинской, анабиоз относится к «заброшенным проблемам» [4]. Несмотря на длительную историю вопроса, в пони- мании физико-химических процессов при переходе живых систем в это состояние до сих пор имеется мно- го неясного и спорного. Однако очевиден тот факт, что определяющими факторами в реализации механизмов анабиоза являются физические параметры внешней среды и вызываемые ими изменения структуры и свойств цитоплазмы и клеточных органелл. Большин- ство исследователей переход биосистемы в состояние холодового анабиоза связывают с замедлением биохи- мических реакций, а также с процессами кристаллиза- ции льда и стеклования в цитоплазме и окружающем клетки растворе [5–8] при понижении температуры. Известно, что цитоплазма представляет собой мно- гокомпонентный водный раствор с большим содержа- ние полимеров, и при понижении температуры в ней возможны как фазовые переходы жидкость–кристалл, так и критические фазовые переходы жидкость–жид- кость (ФПЖ–Ж). При ФПЖ–Ж первично однородная (матричная) жидкая фаза распадается на две или боль- шее количество фаз, отличающихся по концентрации компонентов между собой и от исходной фазы. Отме- тим, что в таких системах первым актом фазовых пре- вращений наиболее вероятным будет ФПЖ–Ж, так как для образования зародыша новой аморфной фазы тре- буется только соответствующая флуктуация по кон- центрации, без трехмерной упорядоченности, необхо- димой для появления зародыша критического размера кристаллической фазы. При спинодальном механизме фазового превращения достаточными оказываются очень малые флуктуации по составу. Они имеют тен- денцию резко увеличиваться за счет возрастания разли- чия в составе соседних элементов объема. В результате оказывается, что, в отличие от механизма зародышеоб- разования, распад по спинодальному механизму проте- кает чрезвычайно быстро. Только после этого, причем не всегда в конечные сроки экспериментального наблю- дения (большие времена установления равновесия — индукционный период), становится возможной кри- сталлизация [9]. По представлениям Френкеля и Карги- на, кристаллизация является вторичным процессом [10]. Такой двухступенчатый механизм кристаллизации Vekilov называет «неклассической» нуклеацией [11]. В области биотехнологии растений используются методы вегетативного размножения с помощью экс- плантов, т.е. частей растения, содержащих тотипатент- ную зародышевую ткань — меристему, имеющую спо- собность дифференцироваться во все типы клеток и из которых можно вырастить целый новый организм. В качестве эксплантов могут выступать черенки, почки и др. Также из них выделяют практически индивидуаль- ную недифференцированную зародышевую ткань, что используется, например, для получения безвирусного материала. Создание запасов таких генетических ре- сурсов, в том числе и в состоянии анабиоза, в целях сохранения биоразнообразия и селекции, является ак- туальной научной проблемой. В работе [12] было показано, что при относительно медленном охлаждении зародышевой растительной ткани (корневой меристемы чеснока (Allium sativum L.) наблюдалась близкая к 100% ее сохранность. Особый интерес представляет тот факт, что наряду с тканью, криоконсервированной под защитой криопротекторов, выживала и нативная ткань, т.е. криоконсервированная без предварительной обработки криозащитными рас- творами. Повышенный интерес к сохранению этого объекта связан с тем, что в ходе биологической эволюции это растение утратило способность производить семена. Для создания запасов генетических ресурсов чеснока необходимо криоконсервировать вегетативную ткань. Отметим, что семена растений находятся в состоя- нии покоя естественным образом. Имеются сообщения о выживании при охлаждении до температуры жидкого азота нативных меристем кар- тофеля [13], пазушных почек ивы и шелковицы [14], апексов земляники садовой [15]. Все описанные здесь наблюдения согласуются с гипотезой А.М. Голдовского. С целью выяснения природы фазовых переходов в цитоплазме при криоконсервировании нами было предварительно проведено изучение фазового поведе- ния клеточного сока, полученного из всего комплекса тканей зубка чеснока, представляющего собой видоиз- мененную почку. Такая модель максимально близка по составу к цитоплазме клеток меристемы, но обладает объемом, позволяющим провести более детальное изу- чение происходящих в ней фазовых превращений. Ре- гистрируя критические явления оптическим методом и оценивая консистенцию образовавшегося продукта, в работе [16] было установлено, что при охлаждении– отогреве в клеточном соке реализовывался ФПЖ–Ж, в результате которого образовывалась грубодисперс- ная система — высококонцентрированная эмульсия (псевдогель) типа «вода в масле». Известно (см. на- пример, [17]), что именно макрофазное жидкостное фазовое разделение характерно для растворов полиме- Low Temperature Physics/Физика низких температур, 2017, т. 43, № 10 1501 А.Т. Ходько, Ю.С. Лысак ров, обладающих пониженной, по сравнению с раство- рами низкомолекулярных веществ, суммарной энтро- пией и, как правило, не способных к образованию ми- целл. Признаков образования льда в биологической жидкости в работе [16] выявлено не было. Рожков [18] наблюдал критические явления и ФПЖ–Ж в водно-солевых растворах альбумина, как модели цитоплазмы, при изменении концентрации соли. В экспериментах Hirsh, Bent и Erbi [19] исследова- лись почки и черенки тополя (Populus balsamifera L.), которые в состоянии зимнего покоя были помещены в жидкий азот. Сочетая методы дифференциального термического анализа, динамического механического анализа и электронной микроскопии, авторы [19] пришли к выводу, что в цитоплазме этих объектов имел место ФПЖ–Ж. Таким образом, анализ результатов работ [13–19] позволяет сформулировать представление, что ФПЖ–Ж является главной причиной перехода зародышевых растительных тканей из жизнедействующего состоя- ния в анабиоз (см. также [20]). Данное представление [20] основывалось на допу- щении, что фазовые превращения в ткани меристемы, малый объем которой затрудняет детальное изучение свойств выделяемой из нее жидкости, и в клеточном соке, полученном из целого зубка чеснока, идентичны по своей природе. Целью данной работы является определение приро- ды фазового перехода непосредственно в живой ткани меристемы и обоснование режимов ее охлаждения до температуры жидкого азота, при которой происходит хранение биоматериала. Материалы и методы Корневую меристему чеснока сорта «Мерефянский белый» выделяли в условиях стерильного ламинарного бокса из основания побега, находящегося в зубке. Средняя масса одной меристемы, определенная по ре- зультатам взвешивания 6 экземпляров, составила 0,5 мг. Для криоконсервирования образцы ткани помеща- лись в стерильные контейнеры на основе полиимидно- фторопластовой пленки ПМФ-351 (ТУ-6-19-226-89), которые герметизировались путем термической сварки. Для оптического наблюдения процессов при охлажде- нии, исследуемую ткань помещали на поверхность чашки Петри из силикатного стекла и накрывали предметным стеклом (имитация контейнера), чтобы уменьшить ско- рость охлаждения и испарения воды от непосредственно- го контакта со струей паров азота. В данном исследова- нии выделение растительного биологического материала производилось без соблюдения правил асептики. Микроскопию в проходящем свете лампы накали- вания с увеличением ×80 проводили на микроскопе PZO Warshawa (Польша). Результаты фиксировали в видео режиме цифровой микроскопической камерой «LEVENHUK C 130» (Китай) с частотой 30 кадров в секунду. Охлаждение исследуемых биообъектов проводи- лось способами, приведенными в табл. 1. Таблица 1. Используемые режимы охлаждения Номер режима Описание режима охлаждения Режим №1 Прямое погружение с покачиванием кон- тейнеров с биообъектами в жидкий азот. Режим №2 Помещение контейнеров с биообъектами в пары жидкого азота на высоте 35–50 мм от зеркала на 30 мин с последующим по- гружением в жидкий азот. Режим №3 Обдув с расстояния 40–50 мм парами жидкого азота биообъекта, находящегося на столике микроскопа между предмет- ным стеклом и чашкой Петри. Срок хранения образцов в жидком азоте составлял трое суток. Отогрев контейнеров осуществляли на воз- духе при комнатной температуре до исчезновения инея на поверхности контейнера, что занимало 2–3 мин. Вскрытие контейнера производилось с соблюдением правил асептики и антисептики. Жизнеспособность меристем оценивалась методом культивирования их после деконсервации на среде Mu- rashige и Skoog [21] в фитотроне в режиме шестнадца- тичасового светового дня при температурах 15–17 °С. Эксперименты проводились в конце января – начале февраля. Количество параллельных опытов при куль- тивировании криоконсервированного материала рав- нялось 6, при оптическом наблюдении — 5. Результаты и обсуждение В образцах, криоконсервированных по режиму №1, выживших экземпляров обнаружено не было. Результаты культивирования контрольных образцов и охлаждавшихся по режиму №2 на 30-е сутки экспе- римента представлены на рис. 1(а), (б). Данное наблю- дение однозначно свидетельствует о наличии состоя- ния анабиоза в процессе низкотемпературного хранения. Отметим, что рост и развитие растений из экспериментальных образцов меристемы (рис. 1(б)) отстает от контрольных (рис. 1(a)), не подвергавшихся охлаждению. Это достоверно указывает на наличие нелетальных повреждений, имевших место в процессе криоконсервирования. Морфологическая картина препарата меристемы чеснока представлена на рис. 2. В верхней и левой части препарата видна жидкость, вытекшая из ткани. По химическому составу она близ- ка к цитоплазме. Некоторые различия могут быть свя- заны с процессом смешения цитоплазмы с межклеточ- 1502 Low Temperature Physics/Физика низких температур, 2017, т. 43, № 10 Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза ной жидкостью, но в зародышевой ткани клетки плот- но прилегают друг к другу, и подавляющую часть объ- ема составляют именно они. Резко очерченная черная дуга — это край образовавшейся капли. Зернистая структура, занимающая основную площадь препара- та, — клеточная масса. Мелкие черные точки в ней — ядра клеток. Клеточная стенка в меристеме находится на начальном этапе своего формирования. По мере охлаждения по режиму №3 система дости- гает температуры фазового перехода, и препарат резко затемняется за время около 1 с в пределах поля зрения микроскопа. Начальный этап этого процесса представ- лен на рис. 3(а). Состояние системы через 1 с представ- лено на рис. 3(б). Потемнение происходит в клеточной массе и вытекшей из нее жидкости одновременно, что свидетельствует об идентичности их химического со- става и фазового поведения при охлаждении. За преде- лы ткани и вытекшей из нее жидкости, ограниченной дугообразной границей, процесс потемнения не рас- пространился. Во всех экспериментах были получены схожие результаты. Температурный диапазон фазового превращения непосредственно в изучаемом живом биообъекте тех- нически определить затруднительно из-за малых раз- меров и неравновесности системы, создающей значи- тельный градиент температур. В модельном объекте — клеточном соке чеснока — нами было установлено, что он находился в диапазоне (–2)–(–5) °С [16]. Высокая скорость фазового перехода говорит о его кооперативной природе, что характерно для вещества, находящегося в критическом состоянии [22]. В целях более детального изучения динамики про- цесса критической опалесценции нами было проведено наблюдение за этим явлением в листе высшего водно- го растения — элодеи (Elodea L.). Это растение обла- дает гораздо более крупными клетками, по сравнению с клетками меристемы чеснока, и является удобным модельным объектом. При охлаждении в условиях, аналогичных выше- описанным, наблюдалось потемнение клеток, распре- деление которых по листу было случайным. Фрагмент видеограммы этого процесса представлен на рис. 4. При покадровом просмотре не удалось зарегистриро- вать процесс развития потемнения в отдельной клетке, это указывает, что он занимает время менее 1/30 с. Данный результат подтверждает кооперативный ха- рактер критического состояния в клетках листа. Похожие наблюдения были описаны ранее. Так, высо- кую скорость процесса изменения внешнего вида клеток корней пшеницы при охлаждении в процессе изучения явления вымерзания растений отмечал Бугаевский еще в 1939 г. [23]. Усиление светорассеяния преимущественно в сто- рону возбуждающего света, носящее название крити- ческой опалесценции [24], обусловлено флуктуацией параметра порядка (концентрация для растворов) и появлением капиллярных волн на границе раздела фаз вследствие низких значений поверхностного натяжения в окрестности критического состояния [25]. Коэффици- ент поверхностного натяжения и интенсивность рассеян- ного света находятся в обратной зависимости. Разработка теории рассеяния света на молекулярных «шероховато- Рис. 1. (Онлайн в цвете) Культивирование контрольных об- разцов (a) и охлаждавшихся по режиму №2 (б) на 30-е сутки эксперимента. (а) (б) Рис. 2. Морфологическая картина препарата меристемы чес- нока. Увеличение ×80. Рис. 3. (Онлайн в цвете) (a) Начальный этап процесса крити- ческой опалесценции, (б) состояние через 1 с от состояния на рис. 3(а). Увеличение ×80. (а) (б) Рис. 4. (Онлайн в цвете) Критическая опалесценция в клетках листа элодеи при охлаждении. Увеличение ×80. Low Temperature Physics/Физика низких температур, 2017, т. 43, № 10 1503 А.Т. Ходько, Ю.С. Лысак стях» поверхности раздела фаз и первое эксперименталь- ное наблюдение этого явления принадлежит Мандель- штаму [24]. Теоретическое объяснение процесса опалес- ценции вблизи критической точки растворов, как следствие флуктуаций концентрации компонентов, было дано Эйнштейном в 1910 г. [26]. Если ФПЖ–Ж реализуется по механизму нуклеа- ции–роста зародышей, то это ведет к образованию на его начальных этапах низкоразмерных неупорядочен- ных структур, представляющих собой капли, отли- чающиеся по концентрации компонентов от матричной фазы. По мере их роста и реализации процессов коагу- ляции и коалесценции формируется грубодисперсная система — эмульсия. Критические явления могут быть только при фазо- вых переходах между изотропными фазами, например, жидкость–газ и жидкость–жидкость. В случае перехо- да жидкость–кристалл параметр порядка меняется скачком и сразу принимает конечное значение, что исключает возможность его флуктуаций [27]. В данной работе низкоразмерные неупорядоченные структуры являются не предметом, а инструментом исследования, позволяющим понять природу и механизм фазового перехода. Исследования методом светорассеяния пока- зали, что эффективные размеры микрокапелек в кри- тических эмульсиях составляют несколько десятков нанометров [28]. Частицы дисперсной фазы таких раз- меров способны к участию в броуновском движении [25]. Это повышает энтропию системы и, соответст- венно, понижает ее свободную энергию, что делает ультрамикрогетерогенные критические эмульсии, в отличие от прочих эмульсий, термодинамически ста- бильными системами. Полученные результаты позволяют заключить, что при охлаждении в цитоплазме клеток меристемы чес- нока имеет место переход через критическую точку раствора и последующий фазовый переход типа жид- кость–жидкость, протекающий по механизму нуклеа- ции–роста зародышей. Резкое замедление диффузии в окрестности критиче- ского состояния ведет к практической остановке бимоле- кулярных биохимических реакций [22]. После прохожде- ния критической точки раствора восходящая (против градиента концентрации — «эффект Горского») диффу- зия [29] формирует в цитоплазме связнодисперсную сис- тему — высококонцентрированную эмульсию, иначе называемую псевдогель. Она обладает так называемой «структурной вязкостью», которая значительно превы- шает исходную вязкость однофазного раствора. Сово- купность вышеперечисленных факторов делает жизне- действующее состояние невозможным. Возобновление жизнедеятельности системы после отогрева достоверно указывает на наличие в охлажден- ных образцах меристемы состояния холодового анабио- за. Для его реализации одним из условий является прак- тическое отсутствие диффузии в цитоплазме. В состоя- нии анабиоза она, главным образом, определяет ско- рость биохимических процессов жизнедеятельности. Наряду с этим изменяется состояние гидратных оболо- чек ионов и макромолекул, что потенциально также должно сказаться на жизнедеятельности. В системе полимер–растворитель ФПЖ–Ж может быть обусловлен как изменением температуры, так и концентрации компонентов раствора [9]. Анабиоз при высыхании — ангидробиоз, — впервые и был описан Левенгуком. Гелеподобная структура цитоплазмы мик- роорганизмов, высушенных путем сублимации и нахо- дящихся в этом состоянии, описана в работе [30]. Крат- кий литературный обзор по процессам, протекающим при переходе биологических объектов в ангидробиоз и реактивации после него, был осуществлен Харчук [31]. В качестве примера ФПЖ–Ж, реализуемых при из- менении различных термодинамических параметров, можно привести следующее наблюдение. На рис. 5(a) показана микроскопическая картина фазового распада среды культивирования, в которой находятся клетки семенников поросят, при охлаждении, а на рис. 5(б) — фазовый распад этой же капли при ее высыхании при комнатной температуре на столике микроскопа. Во втором случае фазовое превращение вызвано измене- нием содержания воды в растворе. Регулярная (модули- рованная) дендритная структура характерна для проме- жуточных стадий ФПЖ–Ж, который реализуется по спинодальному механизму. Модулированные структу- ры интерпретируются как системы упругих концен- трационных доменов, образование которых приводит к достижению абсолютного минимума суммы химиче- ской свободной энергии и энергии внутренних меха- нических напряжений в системе [32]. Вероятней всего, в основе обоих видов анабиоза ле- жит одно и то же явление — ФПЖ–Ж, но вызываемое изменением различных параметров состояния. По сути, явление анабиоза обусловлено свойствами растворов, частным случаем которых является цитоплазма, и не определяется специфическими свойствами биологиче- ского уровня организации материи. По нашему мнению, Рис. 5. (Онлайн в цвете) Фазовый распад среды культивирова- ния при охлаждении (a) и в этой же капле при высыхании (б). Увеличение ×80. (а) (б) 1504 Low Temperature Physics/Физика низких температур, 2017, т. 43, № 10 Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза такое представление о механизмах перехода биосистем в нежизнедействующее состояние подтверждает пра- вильность гипотезы, сформулированной Голдовским о первичности и всеобщности анабиоза [1]. Как видно из изложенного, в процессе фазового пере- хода в цитоплазме происходят значительные изменения, но возобновление после деконсервации процессов жиз- недеятельности достоверно свидетельствует о возможно- сти восстановления жизнеспособной структуры. Вероят- но, это явление частично обусловлено фундаментальным свойством полимеров — малой способностью к смеше- нию, определяемой низкой, по сравнению с эквивалент- ным числом независимых молекул, энтропией полимер- ных цепей [33]. Полимерные молекулы практически не изменяют своих индивидуальных свойств, концентриру- ясь в дисперсионной среде [34]. После смешения с водой из дисперсной фазы в случае охлаждения либо из окру- жающей среды в случае высушивания биологическая система, как показывает практика, в ряде случаев способ- на вернуться к жизнедеятельному состоянию. Смерть клеток могут вызывать причины, сопутст- вующие фазовому переходу, — повреждение мембран и клеточных органелл в результате увеличения объема при ФПЖ–Ж, изменение агрегатного состояния самих мем- бран, растрескивание в затвердевающей цитоплазме (в жизнедействующем состоянии представляющей собой многокомпонентный раствор), нарушение межклеточных контактов в многоклеточных структурах ткани в резуль- тате термоиндуцируемых деформаций при быстром ох- лаждении. Из биохимических факторов криоповрежде- ний следует учитывать явление, именуемое «температурный шок». Под этим понимается значитель- ное повышение процента погибших клеток при резком охлаждении клеточной суспензии в положительной об- ласти температурной шкалы Цельсия, которое отсутству- ет при относительно медленном охлаждении до этой же температуры. Это явление хорошо известно в области низкотемпературного консервирования генетических ресурсов сельскохозяйственных животных, и на практике оно было замечено при разбавлении спермы производи- телей холодными растворами [35]. Эксперименты пока- зали, что в клеточном соке чеснока быстрое охлаждение вызывало растрескивание образцов [16]. Возможно, эти- ми факторами в наших наблюдениях определяется факт выживания как нативной, так и обработанной растворами криопротекторов зародышевой ткани чеснока только при относительно медленном режиме охлаждения. Переход клетки в нежизнедействующее состояние происходит при прохождении цитоплазмы через кри- тическую точку и далее в температурную область ФПЖ–Ж (–2)–(–5) °С для клеточного сока чеснока). При дальнейшем охлаждении до температуры хране- ния биообъекта (–196 °С) такая система вследствие постепенного увеличения вязкости превратится в твер- дое аморфное тело — стекло. Как резкое охлаждение, так и быстрый отогрев цитоплазмы, может вызывать растрескивание, связанное с неодновременным сжати- ем при охлаждении и расширением при нагреве на- ружных и внутренних слоев образца [36]. Успешная реализация криоконсервирования натив- ной ткани меристемы чеснока только при относительно медленных режимах глубокого охлаждения находится в согласии с вышеизложенными представлениями о фазо- вых переходах и изменениях агрегатного (физического) состояния в криобиологических системах. Явление анабиоза при высыхании и охлаждении широко распространено в природе, но в естественных условиях на поверхности Земли достижение темпера- туры стеклования цитоплазмы маловероятно, однако при разработке технологии криоконсервирования этот фактор должен обязательно учитываться. Фазовое разделение в жидких растворах может происходить также и при добавлении небольших ко- личеств некоторых веществ, способных изменить кри- тическую температуру смешения [22]. Этим эффектом Габуда обосновывает гипотезу о механизме наркоза, который, вероятно, можно рассматривать как анабиоз части клеток в многоклеточном организме [37]. При переходе из анабиоза в жизнедействующее со- стояние биоза, очевидно, возобновляется близкое к ис- ходному, супрамолекулярное строение цитоплазмы [38] и гидратных оболочек ионов и макромолекул. В результате нежизнеспособная двух- или более фазная дисперсная структура цитоплазмы превращается в жизнеспособную и жизнедействующую структуру однофазного студня [34]. При этом нужно помнить, что связанная вода в гид- ратных оболочках не может рассматриваться как полно- ценная фаза, поскольку она не может быть механически отделена от ионов или макромолекул. Криоконсервирование без использования криопро- тективных веществ позволяет избегать их токсическо- го и дегитратирующего действия на биообъекты. Од- нако, как уже было отмечено, растения, выращиваемые из криоконсервированного материала, задерживаются в развитии по сравнению с контрольными, выращи- ваемыми из нативного. Это указывает на то, что помимо цитотоксичности имеются иные факторы криоповреждений, и вопрос целесообразности применения криопротекторов может являться предметом дальнейшего изучения. Затронутые в настоящей статье аспекты фазовых превращений в растительных тканях при охлаждении имеют отношение как к проблеме криоконсервирова- ния, так и к проблеме вымерзания растений. При крио- консервировании цитоплазма находится в стеклооб- разном состоянии, которое является термодинамически метастабильным, но кинетически устойчивым, что препятствует образованию льда по мере постепенного приближения системы к состоянию термодинамиче- ского равновесия с окружающей средой. Low Temperature Physics/Физика низких температур, 2017, т. 43, № 10 1505 А.Т. Ходько, Ю.С. Лысак На основе результатов, изложенных в данной рабо- те, разработаны технологии криоконсервирования, подтвержденные патентами Украины [39,40]. Заключение В жизнедействующем состоянии цитоплазма пред- ставляет собой однофазный полимерный студень, в кото- ром возможен обмен веществ путем пассивной диффузии и активного транспорта. При реализации в цитоплазме фазового перехода типа жидкость–жидкость путем ох- лаждения либо при изменении концентрации раствора путем дегидратации (испарением или осмотически) об- разуется многофазная грубодисперсная система — высо- коконцентрированная эмульсия типа «вода в масле». Резкое повышение вязкости цитоплазмы из-за фазо- вых превращений приводит к блокированию процессов внутриклеточного массообмена, в результате чего био- логическая система переходит в нежизнедействующее состояние — анабиоза или смерти, достоверно разли- чить которые можно, только вернув ее к параметрам состояния жизнедеятельности. Процесс стеклования стабилизирует сохранность биологического материала. Авторы выражают глубокую благодарность проф. А.И. Божкову, проф. С.М. Логвинкову, проф. Н.О. Мчед- лову-Петросяну, проф. А.Н. Рассохе, доц. И.И. Морозо- вой и к.б.н. К.Б. Миксону за консультативную помощь и поддержку. 1. А.М. Голдовский, Основы учения о состояниях организ- мов, Наука, Ленинград (1977). 2. О. Смит, Биологическое действие замораживания и пе- реохлаждения, Изд-во иностр. лит, Москва (1963). 3. Н.А. Максимов, Известия С.-Петербургск. лесн. и-та 25, 1 (1913). 4. Р.С. Ушатинская, Скрытая жизнь и анабиоз, Наука, Москва (1990). 5. Л.К. Лозина-Лозинский, Очерки по криобиологии, Наука, Ленинград (1972). 6. П.Ю. Шмидт, Анабиоз, Изд-во АН СССР, Москва- Ленинград (1955). 7. А.И. Жмакин, УФН 3, 243 (2008). 8. Life in the frozen state, Barry J. Fuller, Nick Lane, and Erica E. Benson (eds.), Boca Raton, London–New York- Washington (2004). 9. С.П. Папков, Равновесие фаз в системе полимер–рас- творитель, Химия, Москва (1981). 10. Г.М. Бартенев, С.Я. Френкель, Физика полимеров, Хи- мия, Ленинград (1990). 11. P.G. Vekilov, Crist. Growth Des. 10, 5007 (2010). 12. Ю.С. Лысак, А.Т. Ходько, Т.Ф. Стрибуль, А.М. Компаниец, Пробл. криобиологии 3, 257 (2012). 13. Н.О. Шевченко, Автореф. дис. … канд. біол. наук.: ІПКіК НАН України, Харків (2006). 14. Tie-Gang Lu and Ling-Ceng Jiam, Cryopreservation of tro- pical plant germeplasm, (2000). 15. О.Н. Высоцкая, Т.В. Никишина, А.Ю. Балекин, Биофи- зика живой клетки 10, 63 (2014). 16. А.Т. Ходько, Ю.С. Лысак, Біофізич. Вісник 32(2), 48 (2014). 17. К. Холмберг, Б. Йенссон, Б. Кронберг, Б. Линдман, По- верхностно-активные вещества и полимеры в водных рас- творах, БИНОМ. Лаборатория знаний, Москва (2007). 18. С.П. Рожков, Журн. физ. химии 70, 1982 (1996). 19. A. Hirsh, T. Bent, and E. Erbe, Thermochimica Acta 155, 163 (1989). 20. А.Т. Ходько, Ю.С. Лысак, Биофизика живой клетки 10, 206 (2014). 21. М.К. Зубко, И.В. Кириченко, В.Б. Кускова, Методы культивирования растительных объектов in vitro, Пре- принт / АН УССР, Институт ботаники, Киев (1988). 22. М.А Анисимов, Критические явления в жидкостях и жидких кристаллах, Наука, Москва (1987). 23. М.Ф. Бугаевский, ДАН СССР, 22, 132 (1939). 24. И.Л. Фабелинский, Молекулярное рассеяние света, Нау- ка, Москва (1965). 25. М.И. Гельфман, О.В. Ковалевич, В.П. Юстратов, Колло- идная химия, Лань, СПб (2004). 26. А. Эйнштейн, Сборник научных трудов. Наука, Москва (1966) т. 3, с. 216. 27. А.З. Паташинский, В.П. Покровский, Флуктуационная теория фазовых переходов, Наука, Москва (1982). 28. Е.Д. Щукин, Коллоидная химия, Высш. школа, Москва (2004). 29. А. Вест, Химия твердого тела. Теория и приложения, ч. 2, Мир, Москва (1988). 30. М.Е. Беккер, Б.Э. Дамберг, А.И. Рапопорт, Анабиоз микро- организмов, Зинатне, Рига (1981). 31. И.А. Харчук, Экология моря 70, 62 (2005). 32. А.Г. Хачатурян, Теория фазовых превращений и струк- тура твердых растворов, Наука, Москва (1974). 33. А.Л. Волынский, Природа 3, 44 (2014). 34. С.П. Папков, Студнеобразное состояние полимеров, Хи- мия, Москва (1974). 35. Ф.И. Осташко, Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей, Урожай, Киев (1978). 36. Ю.А. Гулоян, Технология стеклотары и сортовой по- суды, Легбытпромиздат, Москва (1986). 37. С.П. Габуда, Связанная вода. Факты и гипотезы, Наука, Новосибирск (1982). 38. Ж.-М. Лен, Супрамолекулярная химия. Концепции и пер- спективы, Наука, Новосибирск (1998). 39. Ю.С. Лисак, О.Т. Ходько, Т.Ф. Стрибуль, Спосіб кріо- консервування меристем часнику, Пат. 79464 Україна МПК А01N1/02, № u201211630; заявл. 08.10.2012; опубл. 25.04.2013, Бюл. №8. 40. Ю.С. Лисак, О.Т. Ходько, Спосіб кріоконсервування меристем сільськогосподарських рослин, Пат. 100791 Україна МПК А01N3/00, А23B4/06, А23B7/055, № u201501645; заявл. 25.02.2015; опубл. 10.08.2015, Бюл. №15. 1506 Low Temperature Physics/Физика низких температур, 2017, т. 43, № 10 Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза Physico-chemical processes in embrionik plant tissue during transition to cool anabiosis state and storage at liquid nitrogen temperature A.T. Khodko and Yu.S. Lysak Critical opalescence phenomenon was discovered in the cytoplasm of meristem-embryonic tissue of gar- lic while cooling in the gas phase of liquid nitrogen. Liquid-liquid phase transition was proved to take place in the system. The fact of meristemic cells survival was fixed during cooling-warming. It is assumed that there is a dramatic slowdown of diffusion in the cyto- plasm. The latter is stipulated by the system’s transi- tion through the liquid-liquid critical point with subse- quent formation of a disperse system – a highly concentrated emulsion resulting from the multicompo- nent liquid solution conjugation. The macrophase sep- aration is typical for the polymer-solution system. The cooling regime to liquid nitrogen temperature and the following warming regime for the biological system under study were determined in order to ensure surviv- ing of the meristematic tissue. PACS: 64.70.P– Glass transitions of specific sys- tems; 64.70.Ja Liquid-liquid transitions; 64.70.pj Polymers. Keywords: anabiosis state, cryopreservation, phase transition (changes) liquid–liquid, liquid phase separa- tion, glass formation. Low Temperature Physics/Физика низких температур, 2017, т. 43, № 10 1507 Введение Материалы и методы Результаты и обсуждение Заключение

Физико-химические процессы в зародышевой растительной ткани при переходе в состояние холодового анабиоза и хранении при температуре жидкого азота

Institution

Ähnliche Einträge