Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин

Розроблено та впроваджено новий вид ДНК-маркерів, які ґрунтуються на аналізі поліморфізму І інтрону генів α-тубуліну. Здійснено біоінформаційний пошук генів α-тубуліну Arabidopsis thaliana, Linum usitatissimum, Oryza sativa, Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum. Показано, що більшість генів α-туб...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2018
Автори:	Пірко, Я.В., Постовойтова, А.С., Рабоконь, А.М., Калафат, Л.О., Приваліхін, С.М., Білоножко, Ю.О., Пірко, Н.М., Блюм, Я.Б.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України 2018
Назва видання:	Український ботанічний журнал
Теми:	Фізіологія, біохімія, клітинна та молекулярна біологія рослин
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/176738
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин / Я.В. Пірко, А.С. Постовойтова, А.М. Рабоконь, Л.О. Калафат, С.М. Приваліхін, Ю.О. Білоножко, Н.М. Пірко, Я.Б. Блюм // Український ботанічний журнал. — 2018. — Т. 75, № 6. — С. 576-584. — Бібліогр.: 23 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-176738
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1767382021-02-08T01:27:31Z Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин Пірко, Я.В. Постовойтова, А.С. Рабоконь, А.М. Калафат, Л.О. Приваліхін, С.М. Білоножко, Ю.О. Пірко, Н.М. Блюм, Я.Б. Фізіологія, біохімія, клітинна та молекулярна біологія рослин Розроблено та впроваджено новий вид ДНК-маркерів, які ґрунтуються на аналізі поліморфізму І інтрону генів α-тубуліну. Здійснено біоінформаційний пошук генів α-тубуліну Arabidopsis thaliana, Linum usitatissimum, Oryza sativa, Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum. Показано, що більшість генів α-тубуліну містили по 4–5 екзонів та 3–4 інтрони. Виявлено декілька винятків, зокрема ген α-тубуліну A. thaliana TUBA6 містить лише 2 екзони та 1 інтрон, а ген TUBA4 – 3 екзони та 2 інтрони. Встановлено, що довжини інтронів значною мірою відрізняються, навіть у межах одного виду. Також виявлено певну системність у кількості пар нуклеотидів екзонів. На основі даних аналізу екзон-інтронної структури генів α-тубуліну розроблено пару універсальних вироджених праймерів та проведено оцінку поліморфізму довжини І інтрону генів α-тубуліну в Arabidopsis thaliana та різних сортів L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum та S. lycopersicum. Показано утворення видоспецифічних ДНК-профілів, які містили різну кількість ампліконів І інтрону генів α-тубуліну. Діапазон варіювання розмірів ампліконів фрагментів інтронів, наприклад у S. tuberoum, становив 150–2 000 п. н. Природа появи великих фрагментів ДНК (понад 1 500 п. н.) у електрофоретичних спектрах проаналізованих видів потребує додаткових досліджень, оскільки такі фрагменти в цілому не передбачені результатами біоінформаційного аналізу. Виявлено поліморфізм довжини окремих фрагментів інтронів α-тубуліну серед сортів L. usitatissimum, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum, що дозволило диференціювати їх між собою. Отримані результати підтверджують доцільність подальшого використання поліморфізму довжин І інтрону генів α-тубуліну для генотипування та оцінки генетичної різноманітності різних видів та сортів вищих рослин. Розроблена ДНК-маркерна система є універсальною й поєднує в собі надійність, швидкість отримання вихідних даних і простоту їхнього аналізу. Разработан и внедрен новый вид ДНК-маркеров, которые оценивают полиморфизм I интрона генов α-тубулина. Выполнен биоинформационный поиск генов α-тубулина у Arabidopsis thaliana, Linum usitatissimum, Oryza sativa, Solanum tuberosum и Solanum lycopersicum. Показано, что большинство генов α-тубулина содержат по 4–5 экзонов и 3–4 интрона. Было выявлено несколько исключений. Например, ген α-тубулина A. thaliana TUBA6 содержит только 2 экзона и 1 интрон, а ген TUBA4 – 3 экзона и 2 интрона. Установлено, что длина интронов значительно варьирует даже внутри одного вида. Учитывая данные анализа экзон-интронной структуры генов α-тубулина, была разработана пара универсальных вырожденных праймеров и проведена оценка полиморфизма длины I интрона генов α-тубулина у A. thaliana и различных сортов L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum, S. lycopersicum. Показано наличие видоспецифических ДНК-профилей, содержащих разное количество ампликонов I интрона генов α-тубулина. Диапазон варьирования размеров ампликонов фрагментов интронов например, S. tuberosum, составлял 150–2 000 п. н. Причина появления больших фрагментов ДНК (свыше 1 500 п. н.) в електрофоретических спектрах проанализированных видов требует дополнительных исследований, поскольку такие фрагменты в целом не предусмотрены результатами биоинформационного анализа. Выявлен полиморфизм длин отдельных фрагментов интронов генов α-тубулина, что позволило дифференцировать различные сорта L. usitatissimum, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum между собой. Полученные результаты подтверждают целесообразность дальнейшего использования оценки полиморфизма длин I интрона генов α-тубулина в качестве универсальной ДНК-маркерной системы для проведения генотипирования и оценки генетического разнообразия различных видов (сортов) высших растений. A new type of DNA markers based on the analysis of the α-tubulin 1st intron polymorphism has been developed and implemented. The bioinformatics search for α-tubulin genes of Arabidopsis thaliana, Linum usitatissimum, Oryza sativa, Solanum tuberosum, and S. lycopersicum has been carried out. It has been shown that most genes of α-tubulin contained 4-5 exons and 3 to 4 introns. Several exceptions have been identified, including the A. thaliana α-tubulin gene TUBA6 that contained only 2 exons and 1 intron, and the TUBA4 gene that consisted of 3 exons and 2 introns. It have been established that the lengths of the introns varies considerably, even within the same species. A certain systemicity was found in the number of nucleotide pairs of exons. Based on data on the analysis of the α-tubulin gene exon-intron structure, the pair of universal degenerate primers have been created and the evaluation of the 1st intron length polymorphism of α-tubulin genes in Arabidopsis thaliana and various varieties of L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum, S. lycopersicum have been studied. It was shown the formation of species-specific DNA profiles that contained a different number of first intron amplicons of the α-tubulin genes. The range of the size variation of the amplicons of intron fragments, for example in S. tuberosum, was within 150 bp–2000 bp. The nature of the appearance of large DNA fragments (more than 1500 bp) in the electrophoretic spectra of the analyzed species requires additional research, since such fragments are not generally envisaged by the results of the bioinformatics analysis. The polymorphism of the length of individual fragments of α-tubulin introns among L. usitatissimum, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum varieties has been determined, which allowed to differentiate them among themselves. In general, data was obtained confirming the feasibility of further using the polymorphism of the lengths of the 1st intron of α-tubulin genes to genotyping and assessing the genetic diversity of different species (varieties) of higher plants. The developed DNA marker system is versatile and combines the reliability, speed of obtaining raw data and the simplicity of their analysis. 2018 Article Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин / Я.В. Пірко, А.С. Постовойтова, А.М. Рабоконь, Л.О. Калафат, С.М. Приваліхін, Ю.О. Білоножко, Н.М. Пірко, Я.Б. Блюм // Український ботанічний журнал. — 2018. — Т. 75, № 6. — С. 576-584. — Бібліогр.: 23 назв. — укр. 0372-4123 DOI: https://doi.org/10.15407/ukrbotj75.06.576 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/176738 uk Український ботанічний журнал Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Фізіологія, біохімія, клітинна та молекулярна біологія рослин Фізіологія, біохімія, клітинна та молекулярна біологія рослин
spellingShingle	Фізіологія, біохімія, клітинна та молекулярна біологія рослин Фізіологія, біохімія, клітинна та молекулярна біологія рослин Пірко, Я.В. Постовойтова, А.С. Рабоконь, А.М. Калафат, Л.О. Приваліхін, С.М. Білоножко, Ю.О. Пірко, Н.М. Блюм, Я.Б. Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин Український ботанічний журнал
description	Розроблено та впроваджено новий вид ДНК-маркерів, які ґрунтуються на аналізі поліморфізму І інтрону генів α-тубуліну. Здійснено біоінформаційний пошук генів α-тубуліну Arabidopsis thaliana, Linum usitatissimum, Oryza sativa, Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum. Показано, що більшість генів α-тубуліну містили по 4–5 екзонів та 3–4 інтрони. Виявлено декілька винятків, зокрема ген α-тубуліну A. thaliana TUBA6 містить лише 2 екзони та 1 інтрон, а ген TUBA4 – 3 екзони та 2 інтрони. Встановлено, що довжини інтронів значною мірою відрізняються, навіть у межах одного виду. Також виявлено певну системність у кількості пар нуклеотидів екзонів. На основі даних аналізу екзон-інтронної структури генів α-тубуліну розроблено пару універсальних вироджених праймерів та проведено оцінку поліморфізму довжини І інтрону генів α-тубуліну в Arabidopsis thaliana та різних сортів L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum та S. lycopersicum. Показано утворення видоспецифічних ДНК-профілів, які містили різну кількість ампліконів І інтрону генів α-тубуліну. Діапазон варіювання розмірів ампліконів фрагментів інтронів, наприклад у S. tuberoum, становив 150–2 000 п. н. Природа появи великих фрагментів ДНК (понад 1 500 п. н.) у електрофоретичних спектрах проаналізованих видів потребує додаткових досліджень, оскільки такі фрагменти в цілому не передбачені результатами біоінформаційного аналізу. Виявлено поліморфізм довжини окремих фрагментів інтронів α-тубуліну серед сортів L. usitatissimum, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum, що дозволило диференціювати їх між собою. Отримані результати підтверджують доцільність подальшого використання поліморфізму довжин І інтрону генів α-тубуліну для генотипування та оцінки генетичної різноманітності різних видів та сортів вищих рослин. Розроблена ДНК-маркерна система є універсальною й поєднує в собі надійність, швидкість отримання вихідних даних і простоту їхнього аналізу.
format	Article
author	Пірко, Я.В. Постовойтова, А.С. Рабоконь, А.М. Калафат, Л.О. Приваліхін, С.М. Білоножко, Ю.О. Пірко, Н.М. Блюм, Я.Б.
author_facet	Пірко, Я.В. Постовойтова, А.С. Рабоконь, А.М. Калафат, Л.О. Приваліхін, С.М. Білоножко, Ю.О. Пірко, Н.М. Блюм, Я.Б.
author_sort	Пірко, Я.В.
title	Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин
title_short	Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин
title_full	Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин
title_fullStr	Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин
title_full_unstemmed	Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин
title_sort	вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин
publisher	Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України
publishDate	2018
topic_facet	Фізіологія, біохімія, клітинна та молекулярна біологія рослин
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/176738
citation_txt	Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин / Я.В. Пірко, А.С. Постовойтова, А.М. Рабоконь, Л.О. Калафат, С.М. Приваліхін, Ю.О. Білоножко, Н.М. Пірко, Я.Б. Блюм // Український ботанічний журнал. — 2018. — Т. 75, № 6. — С. 576-584. — Бібліогр.: 23 назв. — укр.
series	Український ботанічний журнал
work_keys_str_mv	AT pírkoâv vivčennâpolímorfízmudovžiniíntronívgenívatubulínuâkmetodanalízugenetičnoídiferencíacííroslin AT postovojtovaas vivčennâpolímorfízmudovžiniíntronívgenívatubulínuâkmetodanalízugenetičnoídiferencíacííroslin AT rabokonʹam vivčennâpolímorfízmudovžiniíntronívgenívatubulínuâkmetodanalízugenetičnoídiferencíacííroslin AT kalafatlo vivčennâpolímorfízmudovžiniíntronívgenívatubulínuâkmetodanalízugenetičnoídiferencíacííroslin AT privalíhínsm vivčennâpolímorfízmudovžiniíntronívgenívatubulínuâkmetodanalízugenetičnoídiferencíacííroslin AT bílonožkoûo vivčennâpolímorfízmudovžiniíntronívgenívatubulínuâkmetodanalízugenetičnoídiferencíacííroslin AT pírkonm vivčennâpolímorfízmudovžiniíntronívgenívatubulínuâkmetodanalízugenetičnoídiferencíacííroslin AT blûmâb vivčennâpolímorfízmudovžiniíntronívgenívatubulínuâkmetodanalízugenetičnoídiferencíacííroslin
first_indexed	2025-07-15T14:33:25Z
last_indexed	2025-07-15T14:33:25Z
_version_	1837723817872457728
fulltext	576 Ukr. Bot. J., 2018, 75(6) Вступ ДНК-маркери широко застосовуються для вирішення багатьох проблем сучасної генетики, геноміки, філогенетики, збереження біорізноманіття, а також для молекулярної селекції, насінництва тощо (Gupta et al., 2003; Andersen et al., 2003). Зважаючи на всебічне використання різноманітних ДНК-маркерних систем у молекулярно-генетичних дослідженнях, надзвичайно актуальними залишаються питання пошуку та впровадження нових, ефективних та більш чутливих маркерів. На сьогодні більшість ДНК-маркерів базуються на оцінці поліморфізму анонімних послідовностей геному. До таких маркерних систем належать RAPD (random amplified polymorphic DNA) (Fu, 2006), AFLP (amplified fragment length polymorphism) (Everaert et al., 2001), ISSR (inter simple sequence repeats) (Pali et al., 2015), SSR (simple sequence repeats) (Singh et al., 2015) тощо. Такі ДНК-маркери розроблені для багатьох видів рослин і є достатньо інформативними, однак вони мають певні недоліки, що обмежує сферу їхнього застосування. Саме тому спостерігається перехід від анонімних ДНК-маркерів до ген-специфічних (gene-targeted markers (GTMs)), що ґрунтуються на оцінці поліморфізму конкретних генних послідовностей (Gupta et al., 2003). https://doi.org/10.15407/ukrbotj75.06.576 Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин Ярослав В. ПІРКО, Анастасія С. ПОСТОВОЙТОВА, Анастасія М. РАБОКОНЬ, Любов О. КАЛАФАТ, Сергій М. ПРИВАЛІХІН, Юлія О. БІЛОНОЖКО, Надія М. ПІРКО, Ярослав Б. БЛЮМ ДУ "Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України" вул. Осиповського, 2а, Київ 04123, Україна yarvp1@gmail.com nastya.postovoytova@gmail.com Pirko Ya.V., Postovoitova A.S., Rabokon A.M., Kalafat L.O., Privаlikhin S.M., Bilonozhko Yu.O., Pirko N.M., Blume Ya.B. Study of intron length polymorphism of the α-tubulin genes as a method of analysis of the genetic differentiation in plants. Ukr. Bot. J., 2018, 75(6): 576–584. Institute of Food Biotechnology and Genomics, National Academy of Sciences of Ukraine 2a Osypovskoho Str., Kyiv 04123, Ukraine Abstract. A new type of DNA markers based on the analysis of the α-tubulin 1st intron polymorphism has been developed and implemented. The bioinformatics search for α-tubulin genes of Arabidopsis thaliana, Linum usitatissimum, Oryza sativa, Solanum tuberosum, and S. lycopersicum has been carried out. It has been shown that most genes of α-tubulin contained 4-5 exons and 3 to 4 introns. Several exceptions have been identified, including the A. thaliana α-tubulin gene TUBA6 that contained only 2 exons and 1 intron, and the TUBA4 gene that consisted of 3 exons and 2 introns. It have been established that the lengths of the introns varies considerably, even within the same species. A certain systemicity was found in the number of nucleotide pairs of exons. Based on data on the analysis of the α-tubulin gene exon-intron structure, the pair of universal degenerate primers have been created and the evaluation of the 1st intron length polymorphism of α-tubulin genes in Arabidopsis thaliana and various varieties of L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum, S. lycopersicum have been studied. It was shown the formation of species-specific DNA profiles that contained a different number of first intron amplicons of the α-tubulin genes. The range of the size variation of the amplicons of intron fragments, for example in S. tuberosum, was within 150 bp–2000 bp. The nature of the appearance of large DNA fragments (more than 1500 bp) in the electrophoretic spectra of the analyzed species requires additional research, since such fragments are not generally envisaged by the results of the bioinformatics analysis. The polymorphism of the length of individual fragments of α-tubulin introns among L. usitatissimum, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum varieties has been determined, which allowed to differentiate them among themselves. In general, data was obtained confirming the feasibility of further using the polymorphism of the lengths of the 1st intron of α-tubulin genes to genotyping and assessing the genetic diversity of different species (varieties) of higher plants. The developed DNA marker system is versatile and combines the reliability, speed of obtaining raw data and the simplicity of their analysis. Keywords: DNA-marker, genotyping, polymerase chain reaction, Arabidopsis thaliana, Linum usitatissimum, Oryza sativa, Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum © Я.В. ПІРКО, А.С. ПОСТОВОЙТОВА, А.М. РАБОКОНЬ, Л.О. КАЛАФАТ, С.М. ПРИВАЛІХІН, Ю.О. БІЛОНОЖКО, Н.М. ПІРКО, Я.Б. БЛЮМ, 2018 577Укр. бот. журн., 2018, 75(6) генетичних відмінностей рослин на внутрішньо- та міжвидовому рівнях. Матеріали та методи Матеріалом для дослідження обрано різні види та сорти рослин, які представляють практичний інтерес для генетичних та селекційних досліджень, а також являються широко розповсюдженими господарсько цінними культурами. Зважаючи на це, проаналізовано дикий тип Arabidopsis thaliana (10 рослин), 5 сортів Linum usitatissimum L. ('Чарівний', 'Сіверський', 'Каменяр', 'Журавка', 'Іванівський'), 5 сортів Oryza sativa L. ('Преміум', 'Консул', 'Віконт', 'YIP-4970', 'YIP-4558'), 5 сортів Solanum lycopersicum L. ('Money Maker', 'Перлина', 'Волгоградський', 'Балконне чудо золоте', 'Американський синій') та 4 сорти Solanum tuberosum L. ('Зарево', 'Левада', 'Світанок', 'Вернісаж'). Кожного сорту аналізували не менше 5 рослин. Анотовані послідовності генів α-тубуліну A. thaliana були взяті з бази даних GenBank (NCBI). Пошук генів, що кодують α-тубулін у геномах L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum та S. lycopersicum, здійснювали за допомогою інструменту BLASTN версії 2.2.26+ у базі даних Phytozome v11 (www.phytozome.net). Множинне вирівнювання знайдених послідовностей виконували за допомогою програми Clustal Х (Larkin et al., 2007). Праймери підбирали до консервативних ділянок І та ІІ екзонів генів α-тубуліну, отриманих під час множинного вирівнювання, та аналізували за допомогою онлайн-інструменту OligoAnalyzer 3.1 (https:// eu.idtdna.com/calc/analyzer). Оцінення поліморфізму довжини І інтрону генів α-тубуліну проводили з використанням власноруч розроблених універсальних вироджених ПЛР- праймерів: TUA_1in_F: 5’ – TGG GAR CTN TAY TGY CTY GA – 3’; TUA_1in_R: 5’ – TCR CTR AAR AAN GTR TTR AAN GMA TC – 3’. Тотальну геномну ДНК з проростків дослід- жуваних видів рослин виділяли за допомогою ЦТАБ-методу (Sambrook et al., 2001). Концентрацію та чистоту отриманої ДНК визначали за допомогою спектрофотометра ("Eppendorf", США). Зразки зберігали при температурі мінус 20 °С. Одним з багатообіцяючих напрямів у розробці генспецифічних ДНК-маркерів є підхід, заснова- ний на оцінці поліморфізму довжини інтронів генів або ILP (intron length polymorphism) (Wang et al., 2005). Генам, об'єднаним у родини генів, що кодують різні ізотипи одного і того самого білка, притаманна певна консервативність екзонних ділянок та гіперваріабельність інтронів. Правильно підібрані ILP-праймери для проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) дозволяють аналізувати поліморфізм довжини інтронних ділянок генів між сусідніми екзонами. Знання екзон-інтронної структури та нуклеотидної послідовності цільових генів є необхідним для розробки ефективних ILP- маркерів. Такі маркери мають значні переваги, зокрема: кодомінантність, універсальність, високу відтворюваність результатів, простоту аналізу та інтерпретацію результатів, відносно низьку собівартість аналізу тощо (Bardini et al., 2004). На сьогодні вже розроблені та впроваджені ILP-маркерні системи, які базуються на оцінці поліморфізму довжин інтронів генів (Thomas et al., 2007; Li et al., 2009), зокрема генів, що кодують ферменти електронно-транспортного ланцюга (Ferreira et al., 2009), а також ключових генів білків цитоскелету клітини – актину (Postovoitova et al., 2017; Postovoitova et al., 2018) та β-тубуліну (TBP, Tubulin-based polymorphism) (Bardini et al., 2004; Rabokon et al., 2018). Гени α-тубуліну належать до мультигенної родини генів тубулінів. Найбільш дослідженими є 6 генів α-тубуліну Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, які кодують 4 ізотипи білку (Kopczak et al., 1992; Favery et al., 2001). α-Тубулін разом із β-тубуліном виконує важливі функції в еукаріотичній клітині, зокрема входить до складу мікротрубочок – основної складової цитоскелету (Findeisen et al., 2014) – та є дуже консервативним білком. Така консервативність амінокислотної послідовності α-тубуліну відповідно відображена і в послідовностях кодуючих ділянок генів (екзонах). Цей факт дозволяє припустити, що гени α-тубуліну можуть бути використані для створення універсальної ILP- маркерної системи, придатної для проведення молекулярно-генетичного аналізу різних генотипів вищих рослин. Тому метою дослідження було розроблення ДНК-маркерної системи, яка ґрунтується на оцінці поліморфізму довжин інтронів генів α-тубуліну, для встановлення можливості її застосування в аналізі 578 Ukr. Bot. J., 2018, 75(6) є 6 анотованих послідовностей α-тубуліну, закодованих у геномі A. thaliana, а саме: P11139_ TUBA1, B9DG7_TUBA2, Q56WH1_TUBA3, Q0WV25_TUBA4, B9DHQ0_TUBA5, P29511_ TUBA6, які були в подальшому використані в дослідженні. На сьогодні достовірні дані щодо генів α-тубуліну закодованих в геномах L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum та S. lycopersicum, на жаль, є неповними. Тому як матрицю для пошуку генів α-тубуліну в геномах цих видів рослин використали нуклеотидну послідовність гена α-тубуліну TUBA1 A. thaliana. За результатами пошуку в базі даних Phytozome v 11 у геномі O. sativa виявлено 4 послідовності, які ймовірно кодують α-тубулін: LOC_Os07g0574800 та LOC_Os07g0574800, визначені як гени TUBA1 та TUBA2 відповідно, а також послідовності Os03g11970 та Os03g51600. В геномі L. usitatissimum знайдено 6 нуклеотидних послідовностей генів α-тубуліну: Lus10005705, Lus10020281, Lus10013765, Lus10035422, Lus10031032, Lus10039169. Також знайдено 4 нуклеотидні послідовності генів α-тубу- ліну у S. tuberosum: PGSC0003DMG400011537, PGSC0003 DMG400030627, PGSC0003 DMG4- 000 01320, PGSC0003 DMG400008752. У геномі S. lycopersicum виявлено 4 послідовності генів α-тубуліну: Solyc08g006890, Solyc04g77020, Solyc02g87880, Solyc02g91870. Проведений аналіз екзон-інтронної структури генів TUBA1 та TUBA5 у A. thaliana свідчить про те, що вони містять в своєму складі по п'ять екзонів та чотири інтрони, гени TUBA2 та TUBA3 – по чотири екзони та три інтрони. Однак найбільше відрізняються від інших гени α-тубуліну TUBA4 та TUBA6, оскільки вони мають в своєму складі лише три екзони та два інтрони, й два екзони та один інтрон відповідно. Довжини екзонів коливаються в межах 93–1259 п. н., а інтронів — 77–512 п. н. Результати аналізу екзон-інтронної структури генів α-тубуліну O. sativa показали, що гени Os07g38730 та Os03g11970 містять по п'ять екзонів і чотири інтрони, а Os11g14220 та Os03g51600 мають чотири екзони та три інтрони. Довжини екзонів становлять 93–657 п. н., а інтронів – 81–1081 п. н. Гени α-тубуліну, закодовані в геномі L. usitatissimum, містили переважно п'ять екзонів та чотири інтрони. Виключенням є лише ген α-тубуліну Lus10035422, що має в своєму складі чотири екзони та три інтрони. Довжини екзонів ПЛР-аналіз поліморфізму І інтрону генів α-тубуліна здійснювали за допомогою амплі- фікатора Thermal Cycler 2720 ("Applied Biosystems", США). Кожна реакційна суміш об'ємом 10 мкл містила п'ятикратний ПЛР-буфер із сульфатом амонію, 2,5 ммоль MgCl 2 , 50 нг рослинної ДНК, 1 мкМ кожного з праймерів, 0,2 мМ кожного дНТФ, 0,5 од. Taq полімерази ("Fermentas", Литва). Протокол ампліфікації був наступний: початкова денатурація (95 °С) – 3 хв, 38 циклів ампліфікації (денатурація 95 °С – 45 с, відпал праймерів 57 °С – 45 с, подовження 72 °С – 1 хв), кінцеве подовження 72 °С – 7 хв, 4 °С – утримання. Подальше розділення ПЛР-продуктів викону- вали за допомогою електрофорезу в 6%-ому не- денатуруючому поліакриламідному гелі в 1х ТВЕ-буфері протягом 2,5 год за напруги 390 В (Sambrook et al., 2001). Як ДНК-маркер для визначення довжини фрагментів використовували O'GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use ("Fermentas", Литва) з кроком 100 пар нуклеотидів. Подальшу візуалізацію фрагментів проводили за допомогою забарвлення нітратом срібла (Rahman et al., 2000). Отримані цифрові зображення аналізували в програмі GelAnalyzer (http://www. gelanalyzer.com/). Результати та обговорення Відомо, що використання ILP-маркерів потребує наявності попередньої інформації про нуклеотидні послідовності, що кодують цільові гени. Як джерело поліморфізму в даному дослідженні були обрані інтрони генів α-тубуліну вищих рослин. Зважаючи на те, що α-тубуліни є консервативними білками, можна передбачити певну консервативність їх кодуючих ділянок (екзонів). Гени α-тубулінів також входять до складу великої мультигенної родини генів тубулінів, і в геномах рослин, як правило, закодовано декілька їхніх ізотипів одночасно (Findeisen et al., 2014). З метою розроблення ДНК-маркерів, що ґрунтуються на оцінці поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну, було здійснено аналіз екзон-інтронної структури генів α-тубуліну в геномах видів вищих рослин. Для цього використовували 5 видів рослин, а саме: A. thaliana, L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum та S. lycopersicum, геноми яких повністю сиквеновані. Гени α-тубуліну A. thaliana є найбільш широко дослідженими серед вищих рослин (Kopczak et al., 1992). На сьогодні в базі даних Gene Bank http://www.gelanalyzer.com/ http://www.gelanalyzer.com/ 579Укр. бот. журн., 2018, 75(6) Детальні дані щодо екзон-інтронного аналізу всіх генів α-тубуліну, закодованих у геномах A. thaliana, L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum та S. lycopersicum, наведені в таблиці. Загалом, представлені результати аналізу екзон-інтронної структури генів α-тубуліну, закодованих в геномах A. thaliana, L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum та S. lycopersicum, показали, що більшість генів мають у своєму складі по 4–5 екзонів та 3–4 інтрони. Однак є декілька винятків, зокрема ген α-тубуліну A. thaliana TUBA6 містить лише 2 екзони та 1 інтрон, а ген TUBA4 – 3 екзони та 2 інтрони. Найімовірніше, така відмінність у структурі даних генів пов'язана із екзогенізацією інтроних ділянок, унаслідок чого змінюється зчитування гену та інтрон, разом із поряд розташованими екзонами, розпізнається як одна коливаються в межах від 93 до 654 п. н., інтронів – від 77 до 456 п. н. Варто зазначити, що дані щодо пошуку та аналізу генів α-тубуліну L. usitatissimum були нещодавно опубліковані (Pydiura et al., 2018). Отримані нами результати з ними повністю узгоджуються. Результати аналізу екзон-інтронної структури генів α-тубуліну S. tuberosum засвідчують, що всі гени цього білка містять по чотири екзони та три інтрони. Кількість пар нуклеотидів (п. н.) екзонних ділянок генів α-тубуліну S. tuberosum складає 93–657 п. н., довжини інтронів – 77–4459 п. н. У геномі S. lycopersicum всі гени α-тубуліну мають по чотири екзони та три інтрони. Довжини екзонів генів α-тубуліну складають 93–657 п. н., довжини інтронів – 77–1136 п. н. Таблиця. Аналіз екзон-інтронної структури генів α-тубуліну Table. Exon-intron structure analysis of α-tubulin genes Ген І екзон, п. н. І інтрон, п. н. ІІ екзон, п. н. ІІ інтрон, п. н. ІІІ екзон, п. н. ІІІ інтрон, п. н. ІV екзон, п. н. IV інтрон, п. н. V екзон, п. н. Arabidopsis thaliana TUBA1 113 160 215 512 200 72 509 86 316 TUBA2 93 462 235 93 371 85 654 - - TUBA3 212 82 215 77 200 111 497 - - TUBA4 93 409 606 83 654 - - - - TUBA5 113 83 215 77 200 111 509 91 316 TUBA6 93 198 1259 - - - - - - Oryza sativa Os07g38730 113 910 215 81 200 557 509 119 316 Os11g14220 93 892 235 86 371 112 657 - - Os03g11970 113 436 215 443 200 1081 509 92 313 Os03g51600 93 946 235 86 371 108 657 - - Linum иsitatissimum Lus10005705 114 452 215 77 200 82 509 109 319 Lus10020281 113 401 215 81 200 82 509 107 319 Lus10013765 113 335 215 86 200 204 509 129 316 Lus10035422 93 456 235 82 371 104 654 - - Lus10031032 93 458 235 93 371 106 654 - - Lus10039169 113 300 228 86 200 207 509 164 316 Solanum tuberosum PGSC0003DMG400011537 93 4459 235 77 371 89 657 - - PGSC0003DMG400030627 93 151 235 91 371 160 657 - - PGSC0003DMG400001320 93 87 235 96 371 89 654 - - PGSC0003DMG400008752 93 1266 235 79 371 78 654 - - Solanum lycopersicum Solyc08g006890 93 1136 235 79 371 77 657 - - Solyc04g77020 93 950 235 88 371 90 655 - - Solyc02g87880 93 102 235 91 371 94 654 - - Solyc02g91870 94 279 235 95 371 157 657 - - 580 Ukr. Bot. J., 2018, 75(6) чітких фрагментів у діапазоні 500–600 п. н. і двох ампліконів розмірами близько 1371 та 1666 п. н. Природа появи останніх двох великих фрагментів у ДНК-профілі A. thaliana потребує додаткового дослідження, оскільки такі амплікони інтронів не були передбачені попереднім біоінформаційним аналізом. Результати аналізу поліморфізму довжин інтронів генів α-тубуліну в сортів L. usitatissimum представлено на рис. 2 (зразки 2–6). Утворені фрагменти інтронів розподіляються в діапазоні 400–2000 п. н. Для всіх проаналізованих сортів L. usitatissimum показана поява спільних ам- пліконів інтронів α-тубуліну, що свідчить про утворення видоспецифічних ДНК-профілів. Більшість фрагментів інтронів L. usitatissimum є мономорфними, однак сорт 'Чарівний' (рис. 2, зразок 2) містить амплікони розміром 754 та 1764 п. н., що відрізняє ДНК-профіль цього сорту від інших. Також сорт 'Сіверський' (рис. 2, зразок 3) містить унікальний амплікон довжиною близько 336 п. н. Найімовірніше, якщо розширити вибірку сортів L. usitatissimum, можна виявити більшу кількість поліморфних фрагментів інтронів генів α-тубуліну. Результати аналізу поліморфізму довжини І інтрону генів α-тубуліну в різних сортів O. sativa показані на рис. 2, зразки 7–11. У результаті проведення ПЛР-аналізу амплікони інтронів генів α-тубуліну O. sativa розподілились у широкому діапазоні від 300 до 2000 п. н. Характерним для проаналізованих зразків O. sativa є те, що всі утворені ДНК-профілі є унікальними за рахунок розподілу та кількості візуалізованих фрагментів інтронів. Мономорфними є лише фрагменти з довжинами близько 590, 1177, 1539 та 1704 п. н. Більшість утворених фрагментів інтронів виявилися поліморфними. Зокрема, у сорту 'Преміум' (рис. 2, зразок 7) наявні поліморфні амплікони інтронів розмірами близько 423, 425, суцільна екзонна ділянка. Явище екзогенізації описано і для інших генів білків цитоскелету рослин, зокрема для генів актину та ß-тубуліну (Kim et al., 2000; Pydiura et al., 2018). Окрім того, спостерігається певна системність у кількості пар нуклеотидів екзонів, а довжини інтронів у межах одного виду значно відрізняються. Це свідчить про певну консервативність кодуючих ділянок генів α-тубуліну та гіперваріабельність інтронних ділянок. Зважаючи на отримані дані щодо екзон- інтронної структури генів α-тубуліну у різних видів вищих рослин, можна сказати про перспективність використання інтронів цих генів для розроблення нової ILP-маркерної системи. З метою створення ДНК-маркерів, які б дозволили оцінити поліморфізм довжини інтронів генів α-тубуліну на підставі попередньо здійсненого вирівнювання, була розроблена пара вироджених праймерів для проведення ПЛР. Зважаючи на той факт, що ген TUBA6 A. thaliana містить лише І інтрон, вироджені праймери підібрані таким чином, щоб оцінити поліморфізм довжини І інтрону всіх генів α-тубуліну. Прямий та зворотний праймери (TUA_1in_F, TUA_1in_R) відпалюються на консервативних ділянках І та ІІ екзонів і дозволяють проводити ампліфікацію ділянки гена α-тубуліну, що розташована між праймерами та містить І інтрон (рис. 1). Зважаючи на гіперваріабільність інтронів генів α-тубуліну, можна передбачити поліморфізм утворюваних під час ПЛР фрагментів. На рис. 2 представлені результати аналізу A. thaliana, різних сортів L. usitatissimum та O. sativa з використанням розробленої ДНК-маркерної системи. На зразку 1 показано специфічний ДНК- профіль A. thaliana дикого типу, в якому фрагменти інтронів α-тубуліну розташовані в діапазоні довжин 300–2 000 п. н. Найбільш чіткі амплікони інтронів мають розміри близько 340 та 607 п. н. Також спостерігається утворення низки менш Рис. 1. Схема гена α-тубуліну (TUA_1in_F та TUA_1in_R – місця відпалу прямого та зворотнього праймерів) Fig. 1. Scheme of the α-tubulin gene (TUA_1in_F and TUA_1in_R designated annealing forward and reverse primers) 581Укр. бот. журн., 2018, 75(6) верхній частині електрофореграми від 1 000 до 2 000 п. н. Слід зазначити, що сорт 'Американський синій' (рис. 3, зразок 5) містить декілька унікальних ампліконів з довжинами близько 205, 268 та 396 п. н., що значно відрізняє цей сорт від інших. Загалом кожен з проаналізованих сортів, що має унікальний ДНК-профіль інтронів, відрізняється один від одного за рахунок кількості та розподілу ампліконів інтронів генів α-тубуліну. Також на рис. 3 продемонстровані ДНК- профілі інтронів 4 сортів (зразки 4–9) S. tuberosum, проаналізовані з використанням ДНК-маркерів, які виявляють поліморфізм довжини І інтрону генів α-тубуліну. Утворені амплікони інтронів візуалізувалися в діапазоні 150–2 000 п. н. Більшість фрагментів є мономорфними, хоча були присутні й поліморфні фрагменти. У зразка 9 сорту 'Вернісаж' 487 і 814 п. н., проте відсутній фрагмент 343 п. н. Такий ДНК-профіль інтронів у сорту 'Преміум' є унікальним та відрізняє його від інших зразків у вибірці. Загалом, ДНК-маркери, засновані на виявленні поліморфізму довжини І інтрону генів α-тубуліну, вдало генотипували сорти O. sativa та продемонстрували значну кількість поліморфних ампліконів інтронів. На рис. 3 представлені результати аналізу поліморфізму довжини І інтрону генів α-тубуліну в сортів S. lycopersicum та S. tuberosum. ДНК-профілі п'яти сортів S. lycopersicum представлені в зразках 1–5 (рис. 3). Утворені фрагменти інтронів генів α-тубуліну розподілилися в широкому діапазоні довжин, від 200 до 2000 п. н. Більшість ампліконів є мономорфними, однак спостерігається поява поліморфних фрагментів інтронів переважно у Рис. 2. Електрофореграма продуктів ПЛР ДНК рослин з праймерами до І інтрону генів α-тубуліну в Arabidopsis thaliana, Linum иsitatissimum та Oryza sativa: 1 – A. thaliana – дикий тип; 2–6 – сорти L. иsitatissimum (2 – 'Чарівний', 3 – 'Сіверський', 4 – 'Каменяр', 5 – 'Журавка', 6 – 'Іванівський'); 7–11 – сорти O. sativa (7 – 'Преміум', 8 – 'Консул', 9 – 'Віконт', 10 – 'YIP-4970', 11 – 'YIP-4558'). М – маркер молекулярної маси O'GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas) Fig. 2. The electrophoregram of PCR products of the plants DNA with primers to the 1st intron of α-tubulin genes in Arabidopsis thaliana, Linum иsitatissimum, and Oryza sativa. 1– A. thaliana wild type, 2–6 – L. isitatissimum varieties, 2 – 'Charivnyi', 3 – 'Severskyi', 4 – 'Kamenyar', 5 – 'Zhuravka', 6 – 'Ivanivskyi', 7-11 – O. sativa varieties, 7 – 'Premium', 8 – 'Consul', 9 – 'Vikont', 10 – 'YIP-4970', 11 – 'YIP-4558'. M – molecular weight marker O'GeneRuler ™ 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas) 582 Ukr. Bot. J., 2018, 75(6) Ferreira A.O., Cardoso H.G., Macedo E.S., Breviario D., Arnholdt-Schmitt B. Intron polymorphism pat- tern in AOX1b of wild St John's wort (Hipericum per- foratum) allows discrimination between individual plants. Physiol. Plant., 2009, 137: 520–531. https://doi. org/10.1111/j.1399-3054.2009.01291.x наявний фрагмент 410 п. н., що відрізняє ДНК- профіль цього сорту від інших. Характерною ознакою сорту 'Світанок' є відсутність декількох ампліконів у ДНК-профілі. Загалом, за допомогою ДНК-маркерів, що оцінюють поліморфізм довжин інтронів генів α-тубуліну, вдалося диференціювати генотипи різних сортів S. tuberosum. Отже, результати проведеного аналізу свідчать про те, що розроблений підхід дозволяє генотипувати різні рослини та ідентифікувати поліморфізм довжини інтронів генів α-тубуліну на міжсортовому та міжвидовому рівнях. Слід зазначити, що ряд утворених фрагментів ДНК з великою довжиною потребує додаткових досліджень, оскільки вони не були передбачені попереднім біоінформаційним аналізом і за своєю природою можуть бути гетеродимерами. Висновки Запропонована нова ILP-маркерна система, що дозволяє оцінити поліморфізм довжини І інтрону генів α-тубуліну у різних видів рослин. Розроблена ДНК-маркерна система є універсальною й дає можливість проводити генотипування та диференціацію різних видів (сортів) вищих рослин, поєднуючи в собі надійність, швидкість отримання вихідних даних і простоту їхнього аналізу. Вона може бути використана для молекулярно- генетичного аналізу вищих рослин і є простим, надійним інструментом молекулярно-генетичного аналізу, який можна використовувати як само- стійно, так і в поєднанні з іншими маркерними системами. СПИСОК ПОСИЛАНЬ Andersen J.R., Lübberstedt T. Functional markers in plants. Trends Plant Sci., 2003, 8(11): 554–560. https://doi. org/10.1007/s10142-004-0107-0 Bardini M., Lee D., Donini P., Mariani A., Giani S., Tos- chi M., Lowe C., Breviario D. Tubulin-based polymor- phism (TBP): a new tool, based on functionally relevant sequences, to assess genetic diversity in plant species. Genome, 2004, 47(2): 281–291. https://doi.org/10.1139/ g03-132 Everaert I., Riek J. D., Loose M. D., Waes J.V., Bocks- taele E.V. Most similar variety grouping for distinctness evaluation of flax and linseed (Linum usitatissimum L.) varieties by means of AFLP and morphological data. Plant Var Seeds, 2001, 14: 69–87. Favery B., Ryan E., Foreman J., Linstead P., Boudonck K., Steer M., Shaw P., Dolan L. KOJAK encodes a cellulose synthase-like protein required for root hair cell morphogenesis in Arabidopsis. Genes & Dev., 2001, 15: 79–89. https://doi.org/10.1101/gad.188801 Рис. 3. Електрофореграма продуктів ПЛР ДНК рослин з праймерами до І інтрону генів α-тубуліну у Solanum lycopersicum та Solanum tuberosum: 1–5 – сорти S. lycopersicum (1 – 'Money Maker', 2 – 'Перлина', 3 – 'Волгоградський', 4 – 'Балконне чудо золоте', 5 – 'Американський синій'); 6–9 – сорти S. tuberosum (6 – 'Зарево', 7 – 'Левада', 8 – 'Світанок', 9 – 'Вернісаж'). М – маркер молекулярної маси O'GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas) Fig. 3. The electrophoregram of PCR products of the plants DNA with primers to the 1st intron of α-tubulin genes in Solanum lycopersicum and Solanum tuberosum. 1–5 – S. lycopersicum varieties, 1 – 'Money Maker', 2 – 'Perlyna', 3 – 'Volgogradskyi', 4 – 'Balcone chydo zolote', 5 – 'Amerykanskyy syniy', 6–9 – S. tuberosum varieties, 6 – 'Zarevo', 7 – 'Levada', 8 – 'Svitanok', 9 – 'Vernisage'. M – molecular weight marker O'GeneRuler ™ 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas) 583Укр. бот. журн., 2018, 75(6) Postovoitova A.S., Yotka O.Yu., Pirko Ya.V., Blume Ya.B. Molecular genetic evaluation of Ukrainian flax cul- tivars homogeneity based on intron length polymor- phism of actin genes and microsatellite loci. Cytol. Genetics, 2018, 52(6): 448–460. https://doi.org/10.3103/ S0095452718060099 Pydiura N., Pirko Ya., Galinousky D., Postovoitova A., Yemets A., Kilchevsky A., Blume Ya. Genome-wide identification, phylogenetic classification, and exon- intron structure characterisation of the tubulin and actin genes in flax (Linum usitatissimum). Cell Biol. Intl., 2018. https://doi.org/ 10.1002/cbin.11001 Rabokon A.N., Pirko Ya.V., Demkovych A.Ye., Blume Ya.B. Comparative analysis of the efficiency of intron-length polymorphism of β-tubulin genes and microsatellite loci for flax varieties genotyping. Cytol. Genetics, 2018, 52(1): 3–15. https://doi.org/10.3103/s0095452718010115 Rahman M.H., Jaquish B., Khasa P.D. Optimization of PCR protocol in microsatellite analysis with silver and SYBR stains. Plant Mol. Biol. Rep., 2000, 18(4): 339–348. Sambrook J.F., David W.R. Molecular сloning: a labora- tory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, vol. 2, 763 pp. Sambrook J.F., Russell D.W. Molecular сloning: a labora- tory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, 2100 pp. Singh P., Mehta N., Sao A. Genetic purity assessment in linseed (Linum usitatissimum L.) varieties using microsat- ellite markers. Suppl. Genetics Plant Breed., 2015, 10(4): 2031–2036. Thomas B.C., Rapaka L., Lyons E., Pedersen B., Freel- ing M. Arabidopsis intragenomic conserved noncoding sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104: 3348– 3353. https://doi.org/10.1073/pnas.0611574104 Wang X., Zhao X., Zhu J., Wu W. Genome-wide investiga- tion of intron length polymorphisms and their potential as molecular markers in rice (Oryza sativa L.). DNA Res., 2005, 12: 417–427. https://doi.org/10.1093/dnares/ dsi019 Рекомендує до друку Надійшла 15.11.2018 О.К. Золотарьова Findeisen P., Mühlhausen S., Dempewolf S., Hertzog J., Zietlow A., Carlomagno T., Kollmar M. Six subgroups and extensive recent duplications characterize the evo- lution of the eukaryotic tubulin protein family. Genome Biol. Evol., 2014, 6: 2274–2288. https://doi.org/10.1093/ gbe/evu187 Fu Y.B. Redundancy and distinctiveness in flax germplasm as revealed by RAPD dissimilarity. Plant Genet. Resour., 2006, 4: 117–124. https://doi.org/10.1079/PGR2005106 Gupta P.K., Rustgi S. Molecular markers from the tran- scribed/expressed region of the genome in higher plants. Funct. Integr. Genomics, 2004, 4(3): 139–162. https://doi. org/10.1007/s10142-004-0107-0 Kim E., Wriggers W., Phillips M., Kokabi K., Rubenstein P.A., Reisler E. Cross-linking constraints on F-actin structure. J. Mol. Biol., 2000, 299: 421–429. https://doi. org/10.1006/jmbi.2000.3727 Kopczak S.D., Haas N.A., Hussey P.J., Silflow C.D., Snustad D.P. The small genome of Arabidopsis contains at least six expressed alpha-tubulin genes. Plant Cell, 1992, 4: 539–547. https://doi.org/ 10.1105/tpc.4.5.539 Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., Mc- Gettigan P.A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson T.J., Hig- gins D.G. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinfor- matics, 2007, 23: 2947–2948. https://doi.org/10.1093/ bioinformatics/btm404 Li X., Tan L., Wang L., Hu S., Sun C. Isolation and char- acterization of conserved non-coding sequences among rice (Oryza sativa L.) paralogous regions. Mol. Genet. Genomics, 2009, 281: 11–18. https://doi.org/10.1007/ s00438-008-0388-4 Pali V., Mehta N., Verulkar S.B., Xalxo M.S., Saxena R.R. Molecular diversity in flax (Linum usitatissimum L.) as re- vealed by DNA based markers. Vegetos, 2015, 28(1): 157– 165. https://doi.org/10.5958/2229-4473.2015.00022.1 Postovoitova A.S., Yotka O.Yu., Pirko Ya.V., Blume Ya.B. Factors in Exp. Evol. Organisms, 2017, 20: 99–103. [По- стовойтова А.С., Йотка О.Ю., Пірко Я.В., Блюм Я.Б. Поліморфізм довжин інтронів генів актину у різних сортів льону–довгунця української селекції. Фак- тори експериментальної еволюції організмів, 2017, 20: 99–103]. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi019 https://doi.org/10.1093/dnares/dsi019 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Larkin MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Blackshields G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Brown NP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chenna R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=McGettigan PA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=McGettigan PA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=McWilliam H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Valentin F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wallace IM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wilm A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lopez R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Thompson JD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gibson TJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Higgins DG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Higgins DG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17846036 https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btm404 https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btm404 584 Ukr. Bot. J., 2018, 75(6) Пирко Я.В., Постовойтова А.С., Рабоконь А.Н., Калафат Л.А., Привалихин С.Н., Белоножко Ю.А., Пирко Н.Н., Блюм Я.Б. Изучение полиморфизма длины интронов генов α-тубулина как метод анализа генетической дифференциации растений. Укр. бот. журн., 2018, 75(6): 576–584. ГУ "Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины" ул. Осиповского, 2а, Киев 04123, Украина Разработан и внедрен новый вид ДНК-маркеров, кото- рые оценивают полиморфизм I интрона генов α-тубули- на. Выполнен биоинформационный поиск генов α-ту- булина у Arabidopsis thaliana, Linum usitatissimum, Oryza sativa, Solanum tuberosum и Solanum lycopersicum. Показа- но, что большинство генов α-тубулина содержат по 4–5 экзонов и 3–4 интрона. Было выявлено несколько ис- ключений. Например, ген α-тубулина A. thaliana TUBA6 содержит только 2 экзона и 1 интрон, а ген TUBA4 – 3 экзона и 2 интрона. Установлено, что длина интро- нов значительно варьирует даже внутри одного вида. Учитывая данные анализа экзон-интронной структуры генов α-тубулина, была разработана пара универсальных вырожденных праймеров и проведена оценка полимор- физма длины I интрона генов α-тубулина у A. thaliana и различных сортов L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum, S. lycopersicum. Показано наличие видоспецифических ДНК-профилей, содержащих разное количество ампли- конов I интрона генов α-тубулина. Диапазон варьиро- вания размеров ампликонов фрагментов интронов на- пример, S. tuberosum, составлял 150–2 000 п. н. Причина появления больших фрагментов ДНК (свыше 1 500 п. н.) в електрофоретических спектрах проанализированных видов требует дополнительных исследований, поскольку такие фрагменты в целом не предусмотрены результата- ми биоинформационного анализа. Выявлен полимор- физм длин отдельных фрагментов интронов генов α-ту- булина, что позволило дифференцировать различные сорта L. usitatissimum, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum между собой. Полученные результаты подтверждают це- лесообразность дальнейшего использования оценки по- лиморфизма длин I интрона генов α-тубулина в качестве универсальной ДНК-маркерной системы для проведе- ния генотипирования и оценки генетического разноо- бразия различных видов (сортов) высших растений. Ключевые слова: ДНК-маркер, генотипирование, полимеразная цепная реакция, Arabidopsis thaliana, Linum usitatissimum, Oryza sativa, Solаnum tuberоsum, Solаnum lycopersicum Пірко Я.В., Постовойтова А.С., Рабоконь А.М., Калафат Л.О., Приваліхін С.М., Бiлоножко Ю.О., Пірко Н.М., Блюм Я.Б. Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин. Укр. бот. журн., 2018, 75(6): 576–584. ДУ "Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України" вул. Осиповського, 2а, Київ 04123, Україна Розроблено та впроваджено новий вид ДНК-маркерів, які ґрунтуються на аналізі поліморфізму І інтрону генів α-тубуліну. Здійснено біоінформаційний пошук генів α-тубуліну Arabidopsis thaliana, Linum usitatissimum, Oryza sativa, Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum. Показа- но, що більшість генів α-тубуліну містили по 4–5 екзо- нів та 3–4 інтрони. Виявлено декілька винятків, зокрема ген α-тубуліну A. thaliana TUBA6 містить лише 2 екзони та 1 інтрон, а ген TUBA4 – 3 екзони та 2 інтрони. Вста- новлено, що довжини інтронів значною мірою відріз- няються, навіть у межах одного виду. Також виявлено певну системність у кількості пар нуклеотидів екзонів. На основі даних аналізу екзон-інтронної структури ге- нів α-тубуліну розроблено пару універсальних виро- джених праймерів та проведено оцінку поліморфізму довжини І інтрону генів α-тубуліну в Arabidopsis thaliana та різних сортів L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum та S. lycopersicum. Показано утворення видоспецифіч- них ДНК-профілів, які містили різну кількість амплі- конів І інтрону генів α-тубуліну. Діапазон варіювання розмірів ампліконів фрагментів інтронів, наприклад у S. tuberoum, становив 150–2 000 п. н. Природа появи ве- ликих фрагментів ДНК (понад 1 500 п. н.) у електрофо- ретичних спектрах проаналізованих видів потребує до- даткових досліджень, оскільки такі фрагменти в цілому не передбачені результатами біоінформаційного аналізу. Виявлено поліморфізм довжини окремих фрагментів ін- тронів α-тубуліну серед сортів L. usitatissimum, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum, що дозволило диференцію- вати їх між собою. Отримані результати підтверджують доцільність подальшого використання поліморфізму довжин І інтрону генів α-тубуліну для генотипування та оцінки генетичної різноманітності різних видів та сор- тів вищих рослин. Розроблена ДНК-маркерна система є універсальною й поєднує в собі надійність, швидкість отримання вихідних даних і простоту їхнього аналізу. Ключові слова: ДНК-маркер, генотипування, полімеразна ланцюгова реакція, Arabidopsis thaliana, Linum usitatissimum, Oryza sativa, Solаnum tuberоsum, Solаnum lycopersicum

Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин

Репозитарії

Схожі ресурси