Експресія химерних генів fbpb::gfp та fbpB(ΔTMD)::gfp в рослинах Nicotiana tabacum та Nicotiana benthamiana
Cтворено дві векторні конструкції для агробактеріальної трансформації рослин, які містять химерні послідовності генів fbpB та fbpB(ΔTMD) туберкульозної мікобактерії, поєднаних з маркерним геном gfp. Проведено генетичну трансформацію N.tabacum та N.benthamiana за допомогою агробактерії, в наслідок...
Gespeichert in:
| Datum: | 2010 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2010
|
| Schriftenreihe: | Фактори експериментальної еволюції організмів |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/177787 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Експресія химерних генів fbpb::gfp та fbpB(ΔTMD)::gfp в рослинах Nicotiana tabacum та Nicotiana benthamiana / М.Ю. Василенко, І.О. Нітовська, М.М. Кучук, М.В. Кучук // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2010. — Т. 9. — С. 229-233. — Бібліогр.: 11 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-177787 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1777872021-02-18T17:17:03Z Експресія химерних генів fbpb::gfp та fbpB(ΔTMD)::gfp в рослинах Nicotiana tabacum та Nicotiana benthamiana Василенко, М.Ю. Нітовська, І.О. Кучук, М.М. Кучук, М.В. Біотехнології у медицині та сільському господарстві Cтворено дві векторні конструкції для агробактеріальної трансформації рослин, які містять химерні послідовності генів fbpB та fbpB(ΔTMD) туберкульозної мікобактерії, поєднаних з маркерним геном gfp. Проведено генетичну трансформацію N.tabacum та N.benthamiana за допомогою агробактерії, в наслідок якої отримано ряд стабільних трансгенних ліній. Також детектовано транзієнтну експресію химерного білку Ag85B(ΔTMD)::GFP в інфільтрованих листах N.benthamiana, яку частково охарактеризовано за допомогою цитологічних та біохімічних методів. Создано две векторные конструкции для агробактериальной трансформации растений, которые содержат последовательности генов fbpB и fbpB(ΔTMD) туберкулезной микобактерии, соединенных с маркерным геном gfp. Проведена генетическая трансформация N.tabacum та N.benthamiana при помощи агробактерии, в результате которой получено ряд стабильных трансгенных линий. Также детектирована транзиентная экспрессия химерного белка Ag85B(ΔTMD)::GFP в инфильтрированных листьях N.benthamiana, которую частично охарактеризовали при помощи цитологических и биохимических методов. Two vector constructs have been created for agrobacterial transformation. Vectors are possessed chimerical sequences of fbpB and fbpB(ΔTMD) genes which fused with marker gfp gene. Genetic transformation of N.tabacum and N.benthamiana has been performed by agrobacterium-mediated method. Stable transgenic lines were selected and transient expression of chimerical Ag85B(ΔTMD)::GFP protein was observed and partially characterized by cytological and biochemical methods. 2010 Article Експресія химерних генів fbpb::gfp та fbpB(ΔTMD)::gfp в рослинах Nicotiana tabacum та Nicotiana benthamiana / М.Ю. Василенко, І.О. Нітовська, М.М. Кучук, М.В. Кучук // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2010. — Т. 9. — С. 229-233. — Бібліогр.: 11 назв. — укр. 2219-3782 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/177787 uk Фактори експериментальної еволюції організмів Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Біотехнології у медицині та сільському господарстві Біотехнології у медицині та сільському господарстві |
| spellingShingle |
Біотехнології у медицині та сільському господарстві Біотехнології у медицині та сільському господарстві Василенко, М.Ю. Нітовська, І.О. Кучук, М.М. Кучук, М.В. Експресія химерних генів fbpb::gfp та fbpB(ΔTMD)::gfp в рослинах Nicotiana tabacum та Nicotiana benthamiana Фактори експериментальної еволюції організмів |
| description |
Cтворено дві векторні конструкції для агробактеріальної трансформації рослин,
які містять химерні послідовності генів fbpB та fbpB(ΔTMD) туберкульозної
мікобактерії, поєднаних з маркерним геном gfp. Проведено генетичну трансформацію N.tabacum та N.benthamiana за допомогою агробактерії, в наслідок якої
отримано ряд стабільних трансгенних ліній. Також детектовано транзієнтну експресію химерного білку Ag85B(ΔTMD)::GFP в інфільтрованих листах N.benthamiana, яку частково охарактеризовано за допомогою цитологічних та біохімічних
методів. |
| format |
Article |
| author |
Василенко, М.Ю. Нітовська, І.О. Кучук, М.М. Кучук, М.В. |
| author_facet |
Василенко, М.Ю. Нітовська, І.О. Кучук, М.М. Кучук, М.В. |
| author_sort |
Василенко, М.Ю. |
| title |
Експресія химерних генів fbpb::gfp та fbpB(ΔTMD)::gfp в рослинах Nicotiana tabacum та Nicotiana benthamiana |
| title_short |
Експресія химерних генів fbpb::gfp та fbpB(ΔTMD)::gfp в рослинах Nicotiana tabacum та Nicotiana benthamiana |
| title_full |
Експресія химерних генів fbpb::gfp та fbpB(ΔTMD)::gfp в рослинах Nicotiana tabacum та Nicotiana benthamiana |
| title_fullStr |
Експресія химерних генів fbpb::gfp та fbpB(ΔTMD)::gfp в рослинах Nicotiana tabacum та Nicotiana benthamiana |
| title_full_unstemmed |
Експресія химерних генів fbpb::gfp та fbpB(ΔTMD)::gfp в рослинах Nicotiana tabacum та Nicotiana benthamiana |
| title_sort |
експресія химерних генів fbpb::gfp та fbpb(δtmd)::gfp в рослинах nicotiana tabacum та nicotiana benthamiana |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
2010 |
| topic_facet |
Біотехнології у медицині та сільському господарстві |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/177787 |
| citation_txt |
Експресія химерних генів fbpb::gfp
та fbpB(ΔTMD)::gfp в рослинах Nicotiana tabacum
та Nicotiana benthamiana / М.Ю. Василенко, І.О. Нітовська, М.М. Кучук, М.В. Кучук // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2010. — Т. 9. — С. 229-233. — Бібліогр.: 11 назв. — укр. |
| series |
Фактори експериментальної еволюції організмів |
| work_keys_str_mv |
AT vasilenkomû ekspresíâhimernihgenívfbpbgfptafbpbdtmdgfpvroslinahnicotianatabacumtanicotianabenthamiana AT nítovsʹkaío ekspresíâhimernihgenívfbpbgfptafbpbdtmdgfpvroslinahnicotianatabacumtanicotianabenthamiana AT kučukmm ekspresíâhimernihgenívfbpbgfptafbpbdtmdgfpvroslinahnicotianatabacumtanicotianabenthamiana AT kučukmv ekspresíâhimernihgenívfbpbgfptafbpbdtmdgfpvroslinahnicotianatabacumtanicotianabenthamiana |
| first_indexed |
2025-07-15T16:00:46Z |
| last_indexed |
2025-07-15T16:00:46Z |
| _version_ |
1837729313795866624 |
| fulltext |
229
11. Gleba Y, Klimyuk V, Marillonet S. Magnification — a new platform for expression
vaccines in plants // Vaccine.— 2005.— Vol.23.— P. 2042–2048.
12. Dorokhov Y.L., Sheveleva A.A., Frolova O.Y. et al. Superexpression of tubercu-
losis antigens in plant leaves // Tuberculosis.— 2007.— Vol.87.— P. 218–224.
13. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual.—
Gold Spring Harbor Laboratory Press.— 1989.— 2-nd ed.
14. Chaung W.Y., Hubert N., Landry B.S. A simple and rapid DNA microextraction
method for plant, animal and insect suitable for RAPD and other PCR analysis // PCR
Meths. Applics.— 1993.— Vol.3.— P. 69–70.
Резюме
Розроблено серію векторів для трансформації пластому рослин роду Nicotiana.
Дані конструкції містять гени esxA та fbpB з мікобактерії Mycobacterium tubertulosis,
що поєднані з селективним геном aadA та експресуються поліцистронно під конт-
ролем psbA гену. В результаті проведення трансформації пластому N.benthamiana
отримано понад 30 стійких до антибіотику ліній, частина з яких підтверджена як
трансгенні за допомогою ПЛР детекції.
Создана серия векторов для трансформации пластома растений рода Nicotiana.
Данные конструкции содержат гены esxA и fbpB из микобактерии Mycobacterium
tubertulosis, которые объединены с селективным геном aadA и экспрессируются
полицистронно под контролем psbA гена. В результате проведения трансформации
пластома N.benthamiana получено более 30 устойчивых к антибиотику линий, часть
из которых подтверждена как трансгенные при помощи ПЦР детекции.
Set of vectors has been created for plastome transformation of plants of Nicotiana
genera. These constructs possess esxA and fbpB genes combined with selective aadA
gene which are expressed polycistronicly under control of psbA gene. Over 30 antibiotic
resistant lines have been selected in the course of N. benthamiana plastome transformation
and a part of them have been detected as transgenic by PCR.
ВАСИЛЕНКО М.Ю., НІТОВСЬКА І.О., КУЧУК М.М., КУЧУК М.В.
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України,
Україна, 03680, Київ, вул. Заболотного, 148, e-mail: mxvasylenko@gmail.com,
maxim@iicb.kiev.ua
ЕКСПРЕСІЯ ХИМЕРНИХ ГЕНІВ fbpB::gfp
ТА fbpB(ΔTMD)::gfp В РОСЛИНАХ NICOTIANA TABACUM
ТА NICOTIANA BENTHAMIANA
Сучасні методи біотехнології дають змогу використовувати вищі рос-
лини як біореактори для напрацювання гетерологічних білків (антитіл,
антигенів, гормонів) з цінними фармацевтичними властивостями. Одним з
напрямків щодо створення вакцин нового покоління лежить можливість гене-
тично змінених рослин продукувати імуногенні білки збудників інфекційних
хвороб. Так, вперше імуногенність антигену, який синтезували в рослинах,
була показана в 1992 році на прикладі трансгенних рослин тютюну, що екс-
230
пресували поверхневий антиген вірусу гепатиту В (HBsAg) [1]. На сьогодні
вже показано експресію понад 50 антигенів людини та тварин в різноманіт-
них рослинних видах, серед яких: тютюн, N.benthamiana, картопля, салат,
шпинат, томати, кукурудза, арабідопсис [2–5]. До того ж на основі трансген-
них рослин активно розробляється концепція “їстівних вакцин”. Як показано
в ряді робіт, рослини, що вживаються в їжу і водночас експресують певний
антиген, можуть викликати вироблення мукозного імунітету при контакті з
стінками кишечника у людей та тварин [6–8].
В нашій лабораторії проводяться дослідження щодо експресії тубер-
кульозних антигенів ESAT6 та Ag85B, що відповідно кодуються генами esxA
та fbpB з Mycobacterium tubertulosis. З літератури відомо, що данні білки
мають високу імуногенність і є головними кандидатами в експериментах зі
створення рекомбінантної вакцини — альтернативи до існуючої вакцини
проти туберкульозу (БЦЖ, Bacille de Calmette et de Guerin). Використовуючи
різні підходи, в своїх дослідженнях ми намагаємось створити рослини з
високими рівнями експресії туберкульозних антигенів. Для цього прово-
дяться експерименти з транзієнтної експресії антигенів, трансформації
пластому, ядерного геному із використанням послідовностей транзитних
пептидів для компартметалізації і накопичення кінцевого продукту. Метою
даної роботи є отримання об’єднаної послідовності антигену із маркерним
геном gfp для візуалізації експресії цільового білку.
Матеріали і методи
Створення генетичних конструкцій, що містять рекомбінантні послідов-
ності fbpB::gfp та fbpB(ΔTMD)::gfp, проводили в три етапи: по-перше, синте-
зували кодуючу послідовність гену gfp за допомогою ПЛР на матриці вже
існуючого вектору, але використовували при цьому праймери із модифіко-
ваними кінцевими послідовностями, що визначають сайти для гідролізу
рестриктазами EheI та XbaI, проводили гідроліз ПЛР-продукту названими
рестриктазами, виділяли та очищали отриманий фрагмент ДНК; по-друге,
проводили гідроліз вектору, що містив ген fbpB або його вкорочену версію
fbpB(ΔTMD), за допомогою рестриктаз EheI та XbaI, виділяли та очищали
отриманий фрагмент вектору; по-третє, проводили лігування вектору та ПЛР-
фрагменту, після якого проводили трансформацію бактерій (E.coli та A.tume-
faciens), відбирали штами з коректно зібраним вектором.
Генетичну трансформацію N.tabacum та N.benthamiana проводили за
допомогою агробактерій штаму GV3101 із створеними векторами, що містять
химерні послідовності fbpB::gfp та fbpB(ΔTMD)::gfp. Для отримання стабіль-
них трансгенних ліній проводили трансформацію методом “листових дисків”
[10] із подальшою регенерацією на селективних середовищах (10 мг/л
фосфінотрицину). Транзієнтну експресію проводили в тепличних рослинах
N.benthamiana методом інфільтрації суспензії агробактерії в листову плас-
тину [11]. Через 5–7 діб після інфільтрації ті сегменти листової пластини,
що контактували із суспензією агробактерії, досліджували під мікроскопом
а також екстрагували загальний білок.
231
Стабільно трансформовані лінії N.tabacum та N.benthamiana перевіряли
за допомогою ПЛР при цьому використовували праймери специфічні до
селективного гену nptII, цільового гену fbpB та зшитого з ним гену gfp. ПЛР
здійснювали за умовами стандартної програми: 94 °С — 2 хв., (94 °С —
30 сек., 58–65 °С — 30 сек., 72 °С — 30–60 сек.), 72 °С — 2 хв., де темпера-
тура гібридизації праймеру та час синтезу фрагменту варіювали в залежності
типу праймерів та розміру фрагменту, що аналізувався.
Екстрагування препаратів загального білка трансформованих рослин
проводили в двократному буфері для нанесення зразків (200 мМ Трис-НСl
pH 8.8, 4% ДСН, 400 мМ 2-ME, 40% гліцерин, 0,01% бромфеноловий синій)
при цьому препарати не прогрівали. Розділення білків екстракту проводили
в 12% ПААГ в трис-гліциновій буферній системі.
Цитологічні дослідження проводили за допомогою мікроскопу Axiop-
hot-35 із застосуванням фільтрів з каналами детекції 405 нм (DAPI), 488 нм
(GFP), 543 нм (хлорофіл). Також використовували УФ-лампу для візуалізації
флуоресценції GFP в зонах транзієнтної експресії в листках рослин та в
ПААГ при розділенні загального білку інфільтрованих рослин.
Результати та обговорення
В результаті клонування послідовності гену gfp із заданими сайтами
рестрикції в вектори рСВ065 та рСВ068 було отримано дві нові векторні
конструкції, в яких ген gfp було розташовано в одній рамці читання разом із
генами fbpB та fbpB(ΔTMD), відповідно. Такі векторні конструкції викорис-
товували для трансформації N.tabacum та N.benthamiana. Агробактеріальну
трансформацію здійснювали методом ко-культивування листових експлантів
з відповідною лінією агробактерії, після чого проводили елімінацію бактерії
з подальшою селекцією стійких до фосфінотрицину пагонів, які утворю-
валися на регенераційних середовищах. Таким чином було відібрано по 20–
30 незалежно утворених пагонів для кожного виду, які далі вкорінювали на
живильному середовищі також з додаванням селективного агенту в концен-
трації 10 мг/л. Для підтвердження трансгенної природи вкорінених ліній
проводили ПЛР-детекцію трансгенів (bar, fbpB, gfp) в ДНК зразках. Серед
аналізованих ліній понад 80% було таких, що мали позитивний сигнал по
трьох ділянках Т-ДНК. Проте аналіз трансгенних ліній за допомогою ультра-
фіолетового опромінення не виявив характерної для GFP флуоресценції, що
може бути викликано наднизьким рівнем експресії химерного білка Ag85B-
GFP, можливо внаслідок процесу сайленсінгу, або в наслідок неправильного
формування флуорофору в молекулі GFP за умов з’єднання його з тубер-
кульозним антигеном Ag85B чи Ag85B(ΔTMD).
Також нами було проведено серію експериментів з тимчасової експресії
створених химерних конструкцій в клітинах N.benthamiana. Як позитивний
контроль в даних дослідах ми використали вектор з геном gfp, що знахо-
диться так само під контролем 35S промотора як і в тестових векторах. Через
5–7 діб після інфільтрації агробактерії, коли експресія GFP в контрольних
ділянках листків була максимальною, детекція флуоресценції проводилась
232
і в експериментальних ділянках листків. За попередніми даними мікроско-
пічного дослідження флуоресценції GFP було виявлено ознаки концентрації
химерного продукту Ag85B(ΔTMD)::GFP в клітинних стінках клітин епідер-
мального шару листка, а також дифузне накопичення в цитоплазмі мезофіль-
них клітин, інколи асоційоване з хлоропластами. Порівнюючи інтенсивність
флуоресценції підчас експресії контрольного гену (GFP) та химерного
(Ag85B::GFP), можна зазначити, що яскравість для експериментальних
зразків була значно (в кілька разів) нижча за контроль. Це, звичайно, може
свідчити про нижчий рівень накопичення в клітині саме химерного білка
проти вільного GFP, що в свою чергу може бути обумовлено якимось нега-
тивним впливом антигену на рослинну клітину.
Тимчасову експресію рекомбінантного білка також досліджували за
допомогою розділення білкової фракції в поліакриламідному гелі (ПААГ)
з подальшою детекцією при УФ опромінені. Білкові екстракти, зроблені з
інфільтрованих ділянок листя, наносили в ПААГ і розділяли в м’яких денату-
руючи умовах, після чого в гелі при опроміненні УФ-світлом спостерігали
смуги характерної зеленої флуоресценції GFP, які відповідали вільному GFP
(30 кДа) та химерному продукту Ag85B(ΔTMD)::GFP (>50кДа). Експеримен-
тальні зразки також мали в кілька разів менш яскраву флуоресценцію в порів-
нянні зі смугами контрольного GFP. Отримані дані вказують, що за умов
швидкої транзієнтної експресії вдається детектувати більші рівні накопи-
чення рекомбінантного білка. Цей факт можливо обумовлений тим, що
процеси сайленсінгу, притаманні рослинній клітині підчас експресії чужо-
рідної генетичної інформації, не встигають досягти рівнів, достатніх для
блокування трансгенів.
Висновки
Отже, в процесі виконання даної роботи було створено вектори для
трансформації рослин, які містять химерні послідовності генів fbpB::gfp та
fbpB(ΔTMD)::gfp. Поєднання туберкульозного антигену Ag85B та його ва-
ріанту Ag85B(ΔTMD) з маркерним білком GFP дало змогу виявити експресію
деяких кількостей цільового білку в клітинах N.benthamiana за умов тран-
зієнтної експресії, частково локалізувати місця його накопичення та порів-
няти із експресією власне GFP. Також отримано ряд стабільно трансфор-
мованих ліній N.tabacum та N.benthamiana, методом ПЛР-детекції доведено
присутність трансгенів в даних лініях. Проведена робота є частиною вели-
кого дослідження щодо експресії та накопичення туберкульозних антигенів
в рослинних клітинах, результати цієї роботи мають бути продовжені і роз-
винуті в наступних дослідженнях для з’ясування можливостей ефективної
продукції антигенів в рослинних системах.
Литература
1. Mason H.S., Lam D.M.K., Arntzen C.J. Expression of hepatitis B surface antigen
in transgenic plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.— 1992.— Vol.89.— P. 11745–11749.
2. Yusibov V., Hooper D., Spitsin S. et al. Expression in plants and immunogenicity of
plant virus-based experimental rabies vaccine // Vaccine.— 2002.— Vol.20.— P. 3155–3164.
233
3. Chikwamba R.K., Scott M.P., Mejıa L.B. et al. Localization of a bacterial protein
in starch granules of transgenic maize kernels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.— 2003.—
Vol.100.— P. 11127–11132.
4. Rigano M.M., Alvarez M.L., Pinkhasov J. et al. Production of a fusion protein
consisting of the enterotoxigenic Escherichia coli heat-labile toxin B subunit and a tuber-
culosis antigen in Arabidopsis thaliana // Plant Cell Rep. 2004.— Vol.22.— P. 502–508.
5. Pogrebnyak N., Golovkin M., Andrianov V. et al. Severe acute respiratory syndrome
(SARS) S protein production in plants: Development of recombinant vaccine // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA.— 2005.— Vol.102.— P. 9062–9067.
6. Tacket C.O., Mason H.S., Losonsky G. et al. Human immune responses to a novel
norwalk virus vaccine delivered in transgenic potatoes // J. Infect. Dis.— 2000.— Vol.182.—
P. 302–305.
7. Thanavala Y., Mahoney M., Pal S. et al. Immunogenicity in humans of an edible
vaccine for hepatitis B // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.— 2005.— Vol.102.— P. 3378–
3382.
8. Warzecha H., Mason H.S., Lane C. et al. Oral immunogenicity of human papillo-
mavirus-like particles expressed in potato // J. Virol.— 2003.— Vol.77.— P. 8702–8711.
9. Rigano M.M., Dreitz S., Kipnis A.-P. et al. Oral immunogenicity of a plant-made,
subunit, tuberculosis vaccine // Vaccine.— 2006.— Vol.24.— P. 691–695.
10. Ian S. Curtis, Michael R. Davey, J. Brian Power. Leaf Disk Transformation //
Methods in Molecular Biology.— 1995.— Vol.44.— P. 59–70.
11. Gleba Y, Klimyuk V, Marillonet S (2005) Magnification — a new platform for
expression vaccines in plants // Vaccine.— 2005.— Vol.23.— P. 2042–2048.
Резюме
Cтворено дві векторні конструкції для агробактеріальної трансформації рослин,
які містять химерні послідовності генів fbpB та fbpB(ΔTMD) туберкульозної
мікобактерії, поєднаних з маркерним геном gfp. Проведено генетичну трансфор-
мацію N.tabacum та N.benthamiana за допомогою агробактерії, в наслідок якої
отримано ряд стабільних трансгенних ліній. Також детектовано транзієнтну екс-
пресію химерного білку Ag85B(ΔTMD)::GFP в інфільтрованих листах N.bentha-
miana, яку частково охарактеризовано за допомогою цитологічних та біохімічних
методів.
Создано две векторные конструкции для агробактериальной трансформации
растений, которые содержат последовательности генов fbpB и fbpB(ΔTMD) туберку-
лезной микобактерии, соединенных с маркерным геном gfp. Проведена генетическая
трансформация N.tabacum та N.benthamiana при помощи агробактерии, в результате
которой получено ряд стабильных трансгенных линий. Также детектирована тран-
зиентная экспрессия химерного белка Ag85B(ΔTMD)::GFP в инфильтрированных
листьях N.benthamiana, которую частично охарактеризовали при помощи цитологи-
ческих и биохимических методов.
Two vector constructs have been created for agrobacterial transformation. Vectors
are possessed chimerical sequences of fbpB and fbpB(ΔTMD) genes which fused with
marker gfp gene. Genetic transformation of N.tabacum and N.benthamiana has been
performed by agrobacterium-mediated method. Stable transgenic lines were selected and
transient expression of chimerical Ag85B(ΔTMD)::GFP protein was observed and partially
characterized by cytological and biochemical methods.
234
ВОЛЧОК Н.М., МИХАЙЛОВА М.Е., БЕЛАЯ Е.В., КАМЫШ Н.А.,
ТИХАНОВИЧ Н.И., МЕДВЕДЕВА Ю.В.
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси,
Республика Беларусь, 220072, Минск, ул. Академическая,27,
e-mail: natavolchok@yandex.ru
(–1689) ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА АЛЬФА-ЛАКТАЛЬБУМИНА
(α-LA) И ЕГО ВЗАИМОСВЯЗЬ С ПРИЗНАКАМИ МОЛОЧНОЙ
ПРОДУКТИВНОСТИ КРС
Известно, что количество белков в молоке и их структура имеют боль-
шое экономическое значение для перерабатывающей промышленности и в
значительной степени определяют количество и технологические свойства
молока. Одним из таких биологически значимых протеинов является много-
функциональный белок — α-лактальбумин (α-LA), входящий в состав мо-
лочной сыворотки, наличие которого является важным признаком качества
молока, характеризующим его полезные свойства.
α-LA — небольшой глобулярный протеин, состоящий из 123 аминокис-
лот и имеющий молекулярную массу 14 кД, играет важную роль в биосинтезе
лактозы. При участии эпителиальных клеток молочной железы, α-LA в
комплексе с галактозилтрансферазой участвует в формировании фермента
лактозсинтазы, который, в свою очередь, синтезирует лактозу в аппарате
Гольджи, а лактоза, затем, в комплексе с α-LA секретируется в молоко. Содер-
жание α-LA и лактозы в коровьем молоке составляет около 1,5 г/л, что
соответствует 5%. Лактоза, содержащаяся в секреторных везикулах эпители-
альных клеток молочных желез, создает внутри клетки повышенное осмоти-
ческое давление, благодаря которому внутрь везикул поступает вода. Таким
образом, повышение концентрации α−LA, являющегося ключевым регулято-
ром синтеза лактозы, вызывает пропорциональное увеличение выхода мо-
лока [1].
Ген, кодирующий бычий α-лактальбумин (α-LA), локализован у КРС в
5 хромосоме и состоит из 2023 п.н., включая 4 экзона и 3 интрона. α-LA
характеризуется наличием нескольких полиморфных вариантов: в позициях
+15, +21, +54 [2] и –1689 [3], относительно точки старта транскрипции
5 фланкирующего региона. Вариабельность в этом регионе может приво-
дить к различной способности связывания РНК-полимеразы и факторов
транскрипции, участвующих в регуляции экспрессии гена. Теоретически,
замены в последовательности генетических регуляторных элементов в
данном участке могут изменять степень экспрессии мРНК, кодируемой этим
геном [1].
Данные полиморфизмы являются следствием точковых мутаций, в
частности в позиции –1689, замена аденина на гуанин приводит к образова-
нию двух аллельных вариантов гена. Аденин в этой позиции был обозначен
как А-аллель, а гуанин — как В-аллель [2, 3]. Lundén A. c соавт. была пока-
зана взаимосвязь между (–1689) полиморфизмом и концентрацией лактозы
|