Зміни активності каталази у Arabidopsis thaliana дикого типу та у нокаутного мутанта за геном Арх2 за дії теплового шоку

Досліджено зміни каталазної активності (САТ) за дії теплового шоку у рослин Arabidopsis thaliana дикого типу (екотип Col 0) та в нокаутного мутанта за геном аскорбат пероксидази 2 (Apx2) KO-25. У рослин A. thaliana дикого типу спостерігали підвищення активності САТ за дії помірного теплового шоку (3...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2010
Hauptverfasser:	Доліба, І.М., Волков, Р.А., Панчук, І.І.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Українське товариство генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова 2010
Schriftenreihe:	Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів
Schlagworte:	Оригінальні статті
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/18959
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Зміни активності каталази у Arabidopsis thaliana дикого типу та у нокаутного мутанта за геном Арх2 за дії теплового шоку / І.М. Доліба, Р.А. Волков, І.І. Панчук // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. — 2010. — Т. 8, № 2. — С. 211-217. — Бібліогр.: 20 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-18959
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-189592013-02-13T02:56:16Z Зміни активності каталази у Arabidopsis thaliana дикого типу та у нокаутного мутанта за геном Арх2 за дії теплового шоку Доліба, І.М. Волков, Р.А. Панчук, І.І. Оригінальні статті Досліджено зміни каталазної активності (САТ) за дії теплового шоку у рослин Arabidopsis thaliana дикого типу (екотип Col 0) та в нокаутного мутанта за геном аскорбат пероксидази 2 (Apx2) KO-25. У рослин A. thaliana дикого типу спостерігали підвищення активності САТ за дії помірного теплового шоку (37 °C) та у фазі постшокового відновлення. На відміну від цього, у рослин КО-25 такі ефекти були слабшими або взагалі відсутні. Зростання каталазної активності було більш виражене за дії жорсткого теплового шоку (44 °C). Так, каталазна активність у рослин дикого типу та нокаутного мутанту зростала, відповідно у 3,0 та 2,3 рази порівняно з контрольними пробами. У фазі постшокового відновлення каталазна активність залишалась підвищеною у дикого типу, проте знижувалась до рівня контролю у мутантних рослин. На загал, наші дані вказують, що каталаза залучена у відповідь A. thaliana на дію теплового шоку. Проте втрата активності АРХ2 у мутанта КО-25 не компенсується додатковою активацією каталази. Можна припустити, що у мутантних рослин A. thaliana знижено продукування пероксиду водню. Изучены изменения каталазной активности (САТ) под действием теплового шока у растений Arabidopsis thaliana дикого типа (экотип Col 0) и у нокаутного мутанта по гену аскорбат пероксидазы 2 (Apx2) KO-25. У растений A. thaliana дикого типа наблюдалось повышение активности САТ под действием умеренного теплового шока (37 °C) и в фазе постшокового восстановления. В отличие от этого у растений КО-25 такие эффекты были слабее или вообще отсутствували. Возрастание каталазной активности было более выражено под действием жесткого теплового шока (44 °C). Так, каталазная активность у растений дикого типа и нокаут-мутантов увеличевалась соответственно в 3,0 и 2,3 раза по сравнению с контрольными пробами. В фазе постшокового восстановления каталазная активность оставалась повышенной у дикого типа, однако снижалась до уровня контроля у мутантных растений. В целом, наши данные показывают, что каталаза участвует в ответе A. thaliana на воздействие тепловым шоком. Однако потеря активности АРХ2 у мутантных КО-25 растений не компенсируется дополнительной активацией каталазы. Можно предположить, что у мутантных растений A. thaliana снижена продукция перекиси водорода. Changes in catalase (CAT) activity upon heat shock were evaluated in wild type plants of Arabidopsis thaliana (ecotype Col 0) and in ascorbate peroxidase 2 (Apx2) knock-out mutant KO-25. In wild type A. thaliana, increase of CAT activity was found upon moderate heat stress (37°C) and in post-stress recovery phase. In contrast, the effects were less pronounced or absent in KO-25. The induction of catalase activity was more evident upon severe heat shock (44°C). After 2 hours treatment CAT activity was, respectively, 3,0 and 2,3 times higher in wild type and mutant plants comparing to the control probes incubated at room temperature. In post-stress recovery phase at room temperature CAT activity remained increased in wild type, but dropped to the control level in mutant plants. Taking together our data show that CAT appears to be involved in heat shock response in A. thaliana. However, the loss of APX2 activity in the mutant KO-25 is not compensated by additional activation of CAT. Instead, a reduced generation of hydrogen peroxide in the mutant plants can be supposed. 2010 Article Зміни активності каталази у Arabidopsis thaliana дикого типу та у нокаутного мутанта за геном Арх2 за дії теплового шоку / І.М. Доліба, Р.А. Волков, І.І. Панчук // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. — 2010. — Т. 8, № 2. — С. 211-217. — Бібліогр.: 20 назв. — укр. 1810-7834 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/18959 577.152.1:582.683.2-1522+577.218 uk Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів Українське товариство генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Оригінальні статті Оригінальні статті
spellingShingle	Оригінальні статті Оригінальні статті Доліба, І.М. Волков, Р.А. Панчук, І.І. Зміни активності каталази у Arabidopsis thaliana дикого типу та у нокаутного мутанта за геном Арх2 за дії теплового шоку Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів
description	Досліджено зміни каталазної активності (САТ) за дії теплового шоку у рослин Arabidopsis thaliana дикого типу (екотип Col 0) та в нокаутного мутанта за геном аскорбат пероксидази 2 (Apx2) KO-25. У рослин A. thaliana дикого типу спостерігали підвищення активності САТ за дії помірного теплового шоку (37 °C) та у фазі постшокового відновлення. На відміну від цього, у рослин КО-25 такі ефекти були слабшими або взагалі відсутні. Зростання каталазної активності було більш виражене за дії жорсткого теплового шоку (44 °C). Так, каталазна активність у рослин дикого типу та нокаутного мутанту зростала, відповідно у 3,0 та 2,3 рази порівняно з контрольними пробами. У фазі постшокового відновлення каталазна активність залишалась підвищеною у дикого типу, проте знижувалась до рівня контролю у мутантних рослин. На загал, наші дані вказують, що каталаза залучена у відповідь A. thaliana на дію теплового шоку. Проте втрата активності АРХ2 у мутанта КО-25 не компенсується додатковою активацією каталази. Можна припустити, що у мутантних рослин A. thaliana знижено продукування пероксиду водню.
format	Article
author	Доліба, І.М. Волков, Р.А. Панчук, І.І.
author_facet	Доліба, І.М. Волков, Р.А. Панчук, І.І.
author_sort	Доліба, І.М.
title	Зміни активності каталази у Arabidopsis thaliana дикого типу та у нокаутного мутанта за геном Арх2 за дії теплового шоку
title_short	Зміни активності каталази у Arabidopsis thaliana дикого типу та у нокаутного мутанта за геном Арх2 за дії теплового шоку
title_full	Зміни активності каталази у Arabidopsis thaliana дикого типу та у нокаутного мутанта за геном Арх2 за дії теплового шоку
title_fullStr	Зміни активності каталази у Arabidopsis thaliana дикого типу та у нокаутного мутанта за геном Арх2 за дії теплового шоку
title_full_unstemmed	Зміни активності каталази у Arabidopsis thaliana дикого типу та у нокаутного мутанта за геном Арх2 за дії теплового шоку
title_sort	зміни активності каталази у arabidopsis thaliana дикого типу та у нокаутного мутанта за геном арх2 за дії теплового шоку
publisher	Українське товариство генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова
publishDate	2010
topic_facet	Оригінальні статті
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/18959
citation_txt	Зміни активності каталази у Arabidopsis thaliana дикого типу та у нокаутного мутанта за геном Арх2 за дії теплового шоку / І.М. Доліба, Р.А. Волков, І.І. Панчук // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. — 2010. — Т. 8, № 2. — С. 211-217. — Бібліогр.: 20 назв. — укр.
series	Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів
work_keys_str_mv	AT dolíbaím zmíniaktivnostíkatalaziuarabidopsisthalianadikogotiputaunokautnogomutantazagenomarh2zadííteplovogošoku AT volkovra zmíniaktivnostíkatalaziuarabidopsisthalianadikogotiputaunokautnogomutantazagenomarh2zadííteplovogošoku AT pančukíí zmíniaktivnostíkatalaziuarabidopsisthalianadikogotiputaunokautnogomutantazagenomarh2zadííteplovogošoku
first_indexed	2025-07-02T19:52:10Z
last_indexed	2025-07-02T19:52:10Z
_version_	1836566111932383232
fulltext	ISSN 1810-7834. Вісн. Óкр. тов-ва генетиків і селекціонерів. 2010, том 8, № 2 211 © І.ì. äîëІБà, ð.à. âîëêîâ, І.І. ПàÍ×óê, 2010 óäê 577.152.1:582.683.2-1522+577.218 ÇÌ²НИ АКÒИВНÎÑÒ² КАÒАЛАÇИ У ARABIDOPSIS THALIANA ДИКÎГÎ ÒИПУ ÒА У НÎКАУÒНÎГÎ ÌУÒАНÒА ÇА ГЕНÎÌ АРХ2 ÇА Д²Ї ÒЕПЛÎВÎГÎ ШÎКУ І.ì. äîëІБà, ð.à. âîëêîâ, І.І. ПàÍ×óê êафедра ìолекулярної генетики та б³отехнолог³ї, ×ерн³вецький нац³ональний ун³верситет ³ìен³ Юр³я Федьковича óкраїна, 58012, ì. ×ерн³вц³, вул. êоцюбинського, 2 e-mail: irina.panchuk@gmail.com Досліджено зміни каталазної активності (САТ) за дії теплового шоку у рослин Arabidopsis thaliana дикого типу (екотип Col 0) та в нокаутного мутанта за геном аскорбат перокси- дази 2 (Apx2) KO-25. Ó рослин A. thaliana дикого типу спостерігали підвищення актив- ності САТ за дії помірного теплового шоку (37 °C) та у фазі постшокового відновлення. На відміну від цього, у рослин КО-25 такі ефекти були слабшими або взагалі відсутні. Зростання каталазної активності було більш виражене за дії жорсткого теплового шоку (44 °C). Так, каталазна активність у рослин дикого типу та нокаутного мутанта зростала відповідно у 3,0 та 2,3 рази порівняно з контрольними пробами. Ó фазі постшокового відновлення каталазна активність залишалася підвищеною у дикого типу, проте знижу- валася до рівня контролю у мутантних рослин. На загал, наші дані вказують, що каталаза залучена у відповідь A. thaliana на дію теплового шоку. Проте втрата активності АРХ2 у мутанта КО-25 не компенсується додатковою активацією каталази. Можна припустити, що у мутантних рослин A. thaliana знижено продукування пероксиду водню. Ключові слова: Arabidopsis thaliana, каталаза, пероксид водню, тепловий шок, нокаут- мутанти. Вñòуп. îсновниì ìехан³зìоì шк³дливої д³ї теплового шоку є денатурац³я б³лк³в ³ спричинене циì порушення ìетабол³чних процес³в у рослинн³й кл³- тин³. êр³ì того, за д³ї високих теìператур спостер³гається зростання внутр³ш- ньокл³тинного р³вня продукц³ї активних форì кисню (àФê), зокреìа пероксиду водню. öе ìоже призводити до окислення б³лк³в, нуклеїнових кислот ³ ìеìб- ранних л³п³д³в. â³дпов³дно, норìал³зац³я р³вня Í2î2 є одниì з елеìент³в шокової в³дпов³д³, як це було доведено у попередн³х досл³дженнях [1, 2]. àФê ìожуть не т³льки спричиняти пошкодження, але й функц³онувати як сиг- нальн³ ìолекули, що необх³дн³ для ³ндукц³ї в³дпов³д³ кл³тини на д³ю р³зних стре- сових чинник³в [3, 4]. Зокреìа, попередн³ìи роботаìи нашої лаборатор³ї вста- новлено, що Í2î2 є необх³дниì для ефективної транскрипц³ї ген³в б³лк³в тепло- вого шоку у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh [5]. îтже, з’ясування ìехан³зì³в генерац³ї та розщеплення Í2î2 в уìовах теплового шоку потр³бне для розуì³н- ня ìехан³зì³в кл³тинної в³дпов³д³ та адаптац³ї. ðослини ìають ферìентативн³ та неферìентативн³ систеìи антиоксидант- ного захисту, як³ контролюють внутр³шньокл³тинний р³вень àФê. ãени, що коду- ють антиоксидантн³ ферìенти р³зняться за р³внеì та характероì експрес³ї, а ISSN 1810-7834. Вісн. Óкр. тов-ва генетиків і селекціонерів. 2010, том 8, № 2212 І.М. Доë³бà, Р.А Воëков., І.І. Пàíчук в³дпов³дн³ б³лки ìають р³зну субстратну специф³чн³сть, тканинну та субкл³тинну ло- кал³зац³ю. Завдяки цьоìу вони ìожуть ефективно та специф³чно контролювати продукц³ю та знешкодження àФê [6]. ó рослинн³й кл³тин³ Í2î2 утворюється у хлоропластах, ì³тохондр³ях, ì³кросоìах та кл³тинн³й ìеìбран³. З ³ншого боку, розщеп- лення Í2î2 забезпечують дек³лька фер- ìент³в, з яких основниìи вважають ката- лазу (CAT), аскорбат (àðõ) та гваякол (POD) пероксидази [4, 7]. ö³ ферìенти р³зняться специф³чн³стю до субстрату ³ ло- кал³зац³єю у кл³тин³. CAT дисìутує ìолеку- лу Í2î2 до води та кисню, використовуючи для цього дв³ ìолекули Í2î2, одна з яких є донороì, а ³нша – акцептороì водню. âс³ ³зофорìи àðõ як субстрату для утил³зац³ї Í2î2 використовують аскорбат, тод³ як POD ìають дуже широку субстратну спе- циф³чн³сть [8]. âс³ три ферìенти пред- ставлен³ в рослинн³й кл³тин³ дек³лькоìа ³зофорìаìи, як³ кодуються ìультигенниìи родинаìи. ó A. thaliana знайдено 3 гени, що кодують CAT [9], 9 ген³в – àðõ [7, 10] та 73 – POD [11]. Ізофорìи CAT знаходяться в ì³кросоìах [9], тод³ як àðõ локал³зован³ у цитозол³, хлоропластах, ì³тохондр³ях та ì³кросоìах [10], а POD – у вакуолях, цито- зол³, апопласт³ та кл³тинн³й ст³нц³ [11]. êр³ì того, гени згаданих ферìент³в р³зняться характероì експрес³ї в уìовах стресу. Зок- реìа, ген, що кодує цитозольну АРХ2 у A. thaliana, за оптиìальних уìов вирощу- вання транскрибується на дуже низькоìу р³вн³, але р³вень в³дпов³дної ìðÍê зростає у 1000 раз³в за д³ї теплового шоку [10]. ãен цитозольної àðõ1 є навпаки високотранс- крибованиì за оптиìальних уìов, тод³ як за д³ї теплового шоку р³вень його транс- крипц³ї додатково зростає лише у 2–3 рази [10]. Зростання активност³ POD у в³дпов³дь на тепловий шок було знайдено наìи у A. thaliana, кукурудзи та тютюну [12–14]. Проте ìожлива участь CAT у в³дпов³д³ на тепловий шок все ще залишається недо- сл³дженою. âисоке р³зноìан³ття ³зоферìент³в та ген³в, що їх кодують, п³двищує над³йн³сть роботи антиоксидантної систеìи та наво- дить на дуìку про ìожливе дублювання функц³й антиоксидантних ферìент³в. Íе- щодавно ìи показали, що втрата àðõ2 у A. thaliana ìоже бути коìпенсована зрос- танняì активност³ POD за д³ї жорсткого теплового шоку [12]. äля подальшого ро- зуì³ння явища функц³онального дублю- вання антиоксидантних ферìент³в ìетою даного досл³дження було вивчення рол³ CAT у A. thaliana дикого типу та у нокаут- ìутант³в за геноì гена Аpx2 за д³ї теплово- го шоку. Ìàòåð³àëè ³ ìåòодè äосл³дження проводили на рослинах A. thaliana екотипу Columbia 0 та нокаутн³й ìутантн³й л³н³ї êî-25 A. thaliana, в якої по- рушена експрес³я гена Аpx2 (At3g09640). ë³н³я êî-25, яка ì³стить вставку ò-äÍê у третьоìу екзон³ гена Apx2, була в³д³брана у наш³й лаборатор³ї ран³ше [15] з вико- ристанняì нас³ння, отриìаного з колекц³ї NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Cen- tre, University of Nottingham, âеликобри- тан³я). ðослини вирощували у ґрунт³ в культи- вац³йн³й к³ìнат³ при стал³й теìператур³ +20 °ñ, осв³тленн³ 2,5 кëк в уìовах 16-го- динного св³тлового дня. ðослини 7-тижневого в³ку (фаза 10–12 листк³в) п³ддавали тепловоìу шоку. òепло- ву обробку проводили в 1 ìì ê-фосфатно- ìу буфер³ (рÍ 6,0). îбробку зд³йснювали в теìряв³ протягоì 1, 2 та 4 год за 20, 37 та 44 °ñ. äля вивчення процес³в, що в³дбува- ються у фаз³ постшокової репарац³ї, через 1 або 2 год п³сля початку шокової обробки зразки переносили в каìеру, де п³дтриìу- вали теìпературу 20 °ñ, ³ продовжували ³н- кубац³ю протягоì 1 або 2 год в³дпов³дно. ISSN 1810-7834. Вісн. Óкр. тов-ва генетиків і селекціонерів. 2010, том 8, № 2 213 Зм³íè àкòèвíоñò³ кàòàëàзè у Arabidopsis thaliana дèкоãо òèпу òà у íокàуòíоãо муòàíòà ... П³сля завершення обробки рослини заìо- рожували в р³дкоìу азот³ та збер³гали в ìо- розильн³й каìер³ за теìператури –70 °ñ для подальших досл³джень. äля екстракц³ї б³лк³в використовували буфер, що ì³стив 0,1 ì трис-HCl (рÍ=6,8), 20 % гл³церин та 30 ìì дит³отрейтол. ãо- ìоген³зований в присутност³ р³дкого азоту рослинний ìатер³ал заливали екстракц³й- ниì буфероì та центрифугували 15 хв за 14000 g та теìператури + 4 °ñ. П³сля цент- рифугування в³дбирали супернатант та збер³гали його на льоду для подальших до- сл³джень. âизначення каталазної активност³ про- водили за ìетодикою, описаною наìи ран³ше [16]. âì³ст б³лка в екстракт³ визна- чали спектрофотоìетрично за ìетодоì Бредфорда [17]. àктивн³сть ферìенту ви- ражали в ì³кроìоль Í2î2, що розкладався за 1 хв на 1 ìкг б³лка. îтриìан³ результати перераховували у в³дсотки, прийìаючи за 100 % питоìу активн³сть ферìенту в лист- ках ³нтактних рослин. âиì³рювання прово- дилися в трьох паралелях та чотирьох б³о- лог³чних повторностях. ñтатистичну об- робку даних проводили за критер³єì ñт’юдента [18]. Ізоферìентний спектр каталази визна- чали у нативноìу 6,5 % пол³акрилаì³дноìу гел³ [19]. ó кожну лунку гелю вносили по 10 ìкг б³лка. åлектрофорез проводили при напруженост³ 12 â/сì протягоì 6 год. äля в³зуал³зац³ї ³зофорì каталази п³сля зак³н- чення електрофорезу гель ³нкубували про- тягоì 5 хв у 0,01 % розчин³ пероксиду вод- ню, проìивали дистильованою водою та вносили на 5 хв у суì³ш, що складалася з 1 % FeCl3 та 1 % K3Fe(CN)6. ó ì³сцях ло- кал³зац³ї ³зофорì каталази на гел³ спос- тер³гали появу св³тлих сìуг на теìноìу фон³, що пов’язано ³з розщепленняì пе- роксиду водню за д³ї ферìенту. ðеакц³ю зупиняли шляхоì проìивання гелю во- дою. Рåзуëüòàòè òà обãовоðåííя îтриìан³ наìи результати показують, що поì³рний тепловий шок (37 °ñ) викли- кав п³двищення каталазної активност³ в листках рослин A. thaliana дикого типу (рис. 1). Íайб³льш виражений ефект спос- тер³гали п³сля 2-годинного шоку. ó цьоìу випадку каталазна активн³сть достов³рно зростала удв³ч³ пор³вняно з контрольниìи зразкаìи, що ³нкубувалися протягоì 2 год за к³ìнатної теìператури. ó фаз³ постшо- кової репарац³ї (2 год 37 °ñ + 2 год 20 °ñ) виявлено додаткове зростання активност³ на 12 %. П³двищення каталазної активност³ спостер³гали також ³ через 1 год. д³ї шоку, проте воно було достов³рниì лише з 0,05<p<0,1 та не такиì високиì (на 28 % пор³вняно ³з контролеì), як у випадку 2-го- динного шоку. äодаткове зростання ката- лазної активност³ у фаз³ постшокової репа- рац³ї у цьоìу випадку (1 год 37 °ñ + 1 год 20 °ñ, див. рис. 1) становило 7%. П³сля 4-годинного шоку р³зниця пор³вняно з кон- тролеì становила лише 16 % ³ була статис- тично недостов³рною. ðан³ше у наш³й лаборатор³ї було вста- новлено, що у кл³тинах араб³допсису за д³ї поì³рного теплового шоку протягоì пер- ших 15 хв в³дбувається двократне зростан- ня внутр³шньокл³тинного р³вня Í2î2. Про- тягоì першої години д³ї шоку цей р³вень додатково зростає приблизно на 40%, тод³ як протягоì другої-четвертої години в³д- бувається поступове зниження концентра- ц³ї Í2î2 до контрольних значень [5]. ìа- лойìов³рно, що так³ зì³ни р³вня Í2î2 ìо- жуть бути пов’язан³ з àðõ, адже активн³сть цього ферìенту у листках A. thaliana зали- шалась незì³нною протягоì 4-годинної обробки за 37 °ñ [10]. Íаш³ нов³ дан³ св³д- чать, що зростання р³вня Í2î2 безпосе- редньо п³сля початку шокової обробки ìоже ³ндукувати зростання активност³ ка- талази, що в свою чергу призводить до пад³ння концентрац³ї Í2î2 протягоì дру- ISSN 1810-7834. Вісн. Óкр. тов-ва генетиків і селекціонерів. 2010, том 8, № 2214 І.М. Доë³бà, Р.А Воëков., І.І. Пàíчук гої-четвертої години поì³рного теплового шоку. При цьоìу зниження р³вня Í2î2 до контрольних значень супроводжується зниженняì каталазної активност³. Інший характер зì³н каталазної актив- ност³ встановлено для нокаутних рослин êî-25, у яких спостер³гали зб³льшення каталазної активност³ на 16% лише у випадку 1-годинної обробки за 37 °ñ (0,05<p<0,1). П³сля 2- та 4-годинної об- робки р³зниц³ ì³ж поì³рниì тепловиì шо- коì та к³ìнатною теìпературою не спос- тер³гали. êр³ì того, достов³рну р³зницю ì³ж рослинаìи дикого типу та êî-25 було виявлено у фаз³ постшокової репарац³ї (1 год 37 °ñ + 1 год 20 °ñ та 2 год 37 °ñ + + 2 год 20 °ñ), де у êî-25 в³дì³чено зни- ження активност³ до контрольних значень. Íагадаєìо, що у ìутант³в êî-25 в³дсутня ³ндукц³я Аpx2 у в³дпов³дь на тепловий шок. â³дпов³дно, ìожна було оч³кувати, що це ìоже коìпенсуватися зростанняì актив- ност³ ³нших ферìент³в, що розщеплюють Í2î2, зокреìа каталази. âт³ì, у наших до- сл³дах за д³ї шоку та у постшоков³й фаз³ у л³н³ї êî-25, пор³вняно з рослинаìи дикого типу, ìи спостер³гали не п³двищення, а зниження каталазної активност³. äля пояс- нення цього ìожна припустити, що втрата експрес³ї АРХ2 у ìутант³в коìпенсується не за рахунок активац³ї каталази, а завдяки зниженню генерац³ї пероксиду водню. àналог³чний ìехан³зì було описано для подв³йних антисенсових по àðõ та CAT рослин тютюну, у яких спостер³гались ак- тивац³я хлоропластної альтернативної ок- сидази та пентозофосфатного ìетабол³ч- ного шляху на фон³ зниження ³нтенсивност³ фотосинтезу в уìовах оксидативного стресу [20]. За д³ї жорсткого теплового шоку (44 °ñ) також виявлено зì³ни каталазної актив- ност³, яка зб³льшувалась через 1 год, сяга- ла ìаксиìуìу через 2 год та частково зни- жувалась через 4 год в³д початку обробки (рис. 1). òак, через 2 години каталазна ак- тивн³сть у рослин дикого типу та у êî-25 зростала у 3,0 та 2,3 рази в³дпов³дно, тод³ як через 4 години – у 1,6 та 1,7 рази пор³в- няно з контрольниìи зразкаìи, що ³нкубу- вались за к³ìнатної теìператури. ìаксиìальн³ значення каталазної ак- тивност³, як³ спостер³гали за д³ї жорсткого шоку, у 1,5–2,0 рази перевищували в³д- пов³дн³ показники за поì³рної шокової об- робки. öе спостереження добре узгод- жується ³з нашиìи даниìи про високу тер- ìочутлив³сть àðõ [10]. Зокреìа було показано, що за д³ї жорсткого теплового шоку активн³сть àðõ у A. thaliana (екотип ñ24) через 1 год. знижується до 30% Рèñ. 1. â³дносна активн³сть CAT у рослинах Arabidopsis thaliana дикого типу (äò) та в нокаутно- го ìутанта за геноì Apx2 (êî-25) за д³ї поì³рного (37 °C) та жорсткого (44 °C) теплового стресу: – äò; – êî-25; 1* – р³зниця ì³ж ³нтактниìи та конт- рольниìи рослинаìи достов³рна; 2* – р³зниця ì³ж конт рольниìи та стресованиìи рослинаìи досто- в³рна; 3* – р³зниця ì³ж стресованиìи рослинаìи та рослинаìи у фаз³ репарац³ї достов³рна; 4* – р³зниця ì³ж рослинаìи дикого типу та ìутантоì достов³рна (p<0,05) ISSN 1810-7834. Вісн. Óкр. тов-ва генетиків і селекціонерів. 2010, том 8, № 2 215 Зм³íè àкòèвíоñò³ кàòàëàзè у Arabidopsis thaliana дèкоãо òèпу òà у íокàуòíоãо муòàíòà ... пор³вняно з контролеì, а через 4 год – до 12%. â³дпов³дно, п³дсилене пор³вняно з поì³рниì шокоì зростання активност³ ка- талази в уìовах жорсткого теплового шоку ìоже бути спряìованиì на коìпенсац³ю втрати загальної активност³ àðõ. За жорсткого шоку (як ³ за поì³рного), було знайдено р³зницю ì³ж рослинаìи ди- кого типу та êî-25 у фаз³ постшокової ре- парац³ї. Зокреìа, у точц³ 2 год 44 °ñ + 2 год 20 °ñ (рис. 1) у рослин дикого типу ката- лазна активн³сть залишалась на тоìу ж р³в- н³, що й п³сля 2 год ³нкубац³ї за 44 °ñ, тод³ як у êî-25 спостер³галось зниження актив- ност³ у 1,9 рази, тобто практично до р³вня, заф³ксованого у контрольноìу зразку. ðан³ше ìи продеìонстрували, що за д³ї 2-годинного жорсткого теплового шоку у A. thaliana дикого типу активн³сть POD зростає на 16 %, а у êî-25 – на 77 % [5]. îтже, п³двищена активн³сть POD в уìовах жорсткого теплового шоку ìоже пояснити прискорене зниження каталазної актив- ност³ до контрольних значень, яке спос- тер³гали у фаз³ постшокової репарац³ї у ìу- танта êî-25. Іншиì поясненняì, як ³ у ви- падку з поì³рниì шокоì, ìоже бути зниження генерац³ї Í2î2 у êî-25, що доз- воляє рослин³ у постшоков³й фаз³ швидше повернутися до норìального ф³з³олог³чно- го стану. Проте перев³рка такої г³потези потребує додаткових досл³джень. ó геноì³ A. thaliana присутн³ три гени, що кодують р³зн³ ³зофорìи каталази, як³ по-р³зноìу експресуються у р³зних ткани- нах [9]. Зокреìа, в³доìо, що на ранн³х стад³ях розвитку у листках експресуються лише гени САТ2 та САТ3, причоìу основна каталазна активн³сть припадає на САТ2. åкспрес³я САТ1 спостер³гається лише на 9,5–10,5 тижнях розвитку, коли рослини входять у стад³ю стар³ння (фазу сенесцен- су) [19]. äля перев³рки ìожливост³, що тепло- вий шок ìоже по-р³зноìу впливати на ак- тивн³сть окреìих ³зофорì, ìи досл³дили зì³ни у ³зоферìентних спектрах за д³ї по- ì³рного та жорсткого теплового шоку. â результат³ електрофоретичного розд³лен- ня на гел³ було виявлено ³зофорìи катала- зи високої, середньої та низької рухливост³ (рис. 2). âраховуючи, що для експериìен- т³в ìи використовували 7-тижнев³ росли- ни, виявлен³ наìи ³зофорìи являють со- бою ñàò2 ³ ñàò3. Зг³дно з л³тературниìи даниìи [19], найб³льшу рухлив³сть ìає ñàò2, а найнижчу – ñàò3. Із середньою швидк³стю рухаються гетеротетраìери ка- талази, що складаються з коìб³нац³ї ìоно- ìер³в ñàò2 та ñàò3. ó наших експериìен- тах як ñàò2, так ³ ñàò3 було виявлено у вс³х вар³антах досл³ду, хоча ³нтенсивн³сть сìуг на гелях в³др³знялась у р³зних вар³антах об- робки. â ц³лоìу ³нтенсивн³сть забарвлення ³зофорì корелювала ³з даниìи виì³рю- вання загальної каталазної активност³. îтже, зростання або зниження загальної активност³ каталази було зуìовлено зì³на- ìи активност³ обох ³зофорì – ñàò2 ³ ñàò3. Вèñíовкè â ц³лоìу отриìан³ наìи результати св³дчать, що зростання активност³ ñàò2 ³ Рèñ. 2. Ізоферìентн³ спектри каталази у листках рослин Arabidopsis thaliana дикого типу (а) та в но- каутного ìутанта за геноì Apx2 (б) за д³ї жорсткого (44 °C) теплового шоку ISSN 1810-7834. Вісн. Óкр. тов-ва генетиків і селекціонерів. 2010, том 8, № 2216 І.М. Доë³бà, Р.А Воëков., І.І. Пàíчук ñàò3 є коìпонентоì ранньої в³дпов³д³ кл³- тин листк³в A. thaliana на поì³рний та жорс- ткий тепловий шок. Б³льш сильне зростан- ня каталазної активност³ за д³ї жорсткого шоку, ³ìов³рно, пов’язано з необх³дн³стю коìпенсувати зниження загальної актив- ност³ àðõ за цих уìов. Проте каталаза не бере участ³ у коìпенсац³ї втрати експрес³ї àðõ2 у нокаут-ìутант³в по цьоìу гену. Пåðåë³к ë³òåðàòуðè 1. Alscher R.G., Donahue J.L., Cramer C.L. Reactive oxygen species and antioxidants: Relationships in green cells // Phisiol. Plantarum. – 1997. – Vol. 100. – P. 224–233. 2. Panchuk I., Pyrizhok R., Volkov R. Engineering of new plants cultivars with improved abiotic stress tolerance // Ann. Suceava University. – 2007. – Vol. 6. – P. 25–35. 3. Desikan R., Cheung M-K., Bright J., Henson D., Hancock J.T., Neill S.J. ABA, hydrogen and nitric oxide signalling in stomatal guard сells // J. Exp. Bot. – 2004. – Vol. 55. – ð. 205–212. 4. Hung S.-H., Yu C.-W., Hung S.-H., Lin C.H. Hydro- gen peroxide functions as a stress signal in plants // Bot. Bull. Acad. Sin. – 2005. – Vol. 46. – P. 1–10. 5. Panchuk I.I., Volkov R.A., Schöffl F. Heat stress- induced H2O2 is required for effective expression of heat shock genes in Arabidopsis // Plant Mol. Biol. – 2006 – Vol. 61 – P. 733–746. 6. Vranová E., Inze D., Breusegem F.V. Signal trans- duction during oxidative stress // J. Exp. Bot. – 2002. – Vol. 53. – ð. 1227–1236. 7. Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M., Breuse- gem F. Reactive oxygen gene network of plants // Trends Plant Sci. – 2004. – Vol. 9. – P. 490–498. 8. Газарян И.Г., Хушпульян Д.М., Тишков В.И. îсо- бенности структуры и ìеханизìа действия пе- роксидаз растений // óспехи биол. хиìии. – 2006. – ò. 46. – ñ. 303–322. 9. Frugoli J.A., Zhong H.H., Nuccio M.L., McCourt P.M., McPeek A., Thomas T.L., McClung C.R. Catalase is encoded by a multigene family in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh // Plant Physiol. – 1996. – Vol. 112. – P. 327–336. 10. Panchuk I.I., Volkov R.A., Schöffl F. Heat stress- and heat shock transcription factor-dependent expression and activity of APX in Arabidopsis // Plant Physiol. – 2002. – Vol. 129. P. 838–853. 11. Tognolli M., Penel C., Greppin H., Simon P. Analy- sis and expression of the class III peroxidase large gene family in Arabidopsis thaliana // Gene. – 2002. – Vol. 288. – P. 129–138. 12. Пиріжок Р.Ю., Волков Р.А., Панчук І.І. òеìпера- турозалежна активн³сть гваякол пероксидази у Аpx2 нокаут-ìутант³в араб³допсису // â³сник óкр. товар. генет. селекц³онер³в. – 2008. – ò. 6. – ñ. 275–280. 13. Пиріжок Р.Ю., Волков Р.А., Панчук І.І. àктивн³сть пероксидази проростк³в кукурудзи в уìовах те- плового стресу // Физиол. биохиì. культ. расте- ний – 2009. – ò. 41, № 1. – C. 44–49. 14. Пиріжок Р.Ю., Панчук І.І. àктивн³сть пероксидази Nicotiana tabacum L. в уìовах теплового стресу // Íаук. в³сник ×ерн³вецького нац. ун-ту. – âип. 455: Б³олог³я. – ×ерн³вц³: ðута, 2009. – ñ. 116– 119. 15. Панчук І.І., Пиріжок Р.Ю. Ідентиф³кац³я Арх2 нокаут-ìутант³в араб³допсису // Б³ол. систеìи. – 2009. – ò. 1, № 1. – ñ. 11–15. 16. Доліба І.М., Волков Р.А., Панчук І.І. ìетод визна- чення каталазної активност³ у рослинноìу ìате- р³ал³ // Физиол. биохиì. культ. растений. – 2010. – ò. 42, № 6 – с. 497–503. 17. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analyt. Biochem. – 1976. – Vol. 72. – P. 248–254. 18. Лакин Г.Ф. Биоìетрия: óчеб. пособие для биол. спец. вузов – 4-е изд., перераб. и доп. – ì.: âысш. шк., 1990. – 352 с. 19. Orendi G. Expression von Katalasen wảhrend der Blattseneszens und unter verschiedenen Stress- bedingungen in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. / Dissertation Verlag Grauer. – 2001. – 135 s. 20. Rizhsky L., Hallak-Herr E., Van Breusegem F., Rachmilevitch S., Barr J.E., Rodermel S., Inzé D., Mittler R. Double antisense plants lacking ascor- bate peroxidase and catalase are less sensitive to oxidative stress than single antisense plants lack- ing ascorbate peroxidase or catalase // Plant J. – 2002. – Vol. 32. – P. 329–342. Представлено О.М. Тищенко Надійшла 14.07.2010 ISSN 1810-7834. Вісн. Óкр. тов-ва генетиків і селекціонерів. 2010, том 8, № 2 217 Зм³íè àкòèвíоñò³ кàòàëàзè у Arabidopsis thaliana дèкоãо òèпу òà у íокàуòíоãо муòàíòà ... èЗìåÍåÍèЯ àêòèâÍîñòè êàòàëàЗЫ ó ARABIDOPSIS THALIANA äèêîãî òèПà è ó ÍîêàóòÍîãî ìóòàÍòà Пî ãåÍó АРХ2 Пîä âîЗäåЙñòâèåì òåПëîâîãî Шîêà И.Н. Долиба, Р.А. Волков, И.И. Панчук êафедра ìолекулярной генетики и биотехнологии ×ерновицкий национальный университет иìени Юрия Федьковича óкраина, 58012, г. ×ерновцы, ул. êоцюбинского, 2 e-mail: irina.panchuk@gmail.com èзучены изìенения каталазной активности (ñàò) под действиеì теплового шока у расте- ний Arabidopsis thaliana дикого типа (экотип Col 0) и у нокаутного ìутанта по гену аскор- бат пероксидазы 2 (Apx2) KO-25. ó расте- ний A. thaliana дикого типа наблюдалось повышение активности ñàò под действиеì уìеренного теплового шока (37 °C) и в фазе по- стшокового восстановления. â отличие от этого у растений êî-25 такие эффекты были слабее или вообще отсутствовали. âозрастание ката- лазной активности было более выражено под действиеì жесткого теплового шока (44 °C). òак, каталазная активность у растений дико- го типа и нокаут-ìутантов увеличивалась со- ответственно в 3,0 и 2,3 раза по сравнению с контрольныìи пробаìи. â фазе постшоко- вого восстановления каталазная активность оставалась повышенной у дикого типа, одна- ко снижалась до уровня контроля у ìутантных растений. â целоì, наши данные показывают, что каталаза участвует в ответе A. thaliana на воздействие тепловыì шокоì. îднако поте- ря активности àðõ2 у ìутантных êî-25 расте- ний не коìпенсируется дополнительной акти- вацией каталазы. ìожно предположить, что у ìутантных растений A. thaliana снижена про- дукция перекиси водорода. Ключевые слова: Arabidopsis thaliana, катала- за, перекись водорода, тепловой шок, нокаут- ìутанты. HEAT SHOCK-DEPENDENT CHANGES OF CATALASE ACTIVITY IN WILD TYPE ARABIDOPSIS THALIANA AND IN APX2 KNOCK-OUT MUTANT I.M. Doliba, R.A. Volkov, I.I. Panchuk Dept. of Molecular Genetics and Biotechnology Fedkovich National University of Chernivtsy Ukraine, 58012, Chernivtsy, Kotsubynski str. 2 e-mail: irina.panchuk@gmail.com Changes in catalase (CAT) activity upon heat shock were evaluated in wild type plants of Ara- bidopsis thaliana (ecotype Col 0) and in ascor- bate peroxidase 2 (Apx2) knock-out mutant KO- 25. In wild type A. thaliana, increase of CAT activ- ity was found upon moderate heat stress (37°C) and in post-stress recovery phase. In contrast, the effects were less pronounced or absent in KO-25. The induction of catalase activity was more evident upon severe heat shock (44°C). Af- ter 2 hours treatment CAT activity was, respec- tively, 3,0 and 2,3 times higher in wild type and mutant plants comparing to the control probes incubated at room temperature. In post-stress recovery phase at room temperature CAT activ- ity remained increased in wild type, but dropped to the control level in mutant plants. Taking to- gether our data show that CAT appears to be involved in heat shock response in A. thaliana. However, the loss of APX2 activity in the mutant KO-25 is not compensated by additional acti- vation of CAT. Instead, a reduced generation of hydrogen peroxide in the mutant plants can be supposed. Key words: Arabidopsis thaliana, catalase, hydrogen peroxide, heat shock, knock-out mutants.

Зміни активності каталази у Arabidopsis thaliana дикого типу та у нокаутного мутанта за геном Арх2 за дії теплового шоку

Institution

Ähnliche Einträge