Рестрикционное картирование внехромосомного элемента рСА25 Erwinia carotovora
Проведено фiзичне картування позахромосомного елемента рСА25 Erwinia carotovora i його транспозонного варiанта рСА25::Tn9. Плазмiда рСА25 належить до найбiльш поширеного серед ервiнiй розмiрного класу позахромосомних ДНК завдовжки 9,8 т. п. н. На основi отриманих даних побудовано попередню рестрикцi...
Збережено в:
| Дата: | 2009 |
|---|---|
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2009
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/19013 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Рестрикционное картирование внехромосомного элемента рСА25 Erwinia carotovora / Ж.Ю. Сергеева, Ф.И. Товкач // Доп. НАН України. — 2009. — № 11. — С. 160-164. — Бібліогр.: 6 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-19013 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-190132020-11-19T15:47:59Z Рестрикционное картирование внехромосомного элемента рСА25 Erwinia carotovora Сергеева, Ж.Ю. Товкач, Ф.И. Біологія Проведено фiзичне картування позахромосомного елемента рСА25 Erwinia carotovora i його транспозонного варiанта рСА25::Tn9. Плазмiда рСА25 належить до найбiльш поширеного серед ервiнiй розмiрного класу позахромосомних ДНК завдовжки 9,8 т. п. н. На основi отриманих даних побудовано попередню рестрикцiйну карту плазмiди i виявлено мiсце вбудовування транспозону Tn9 у плазмiдну ДНК. The restriction site mapping of Erwinia carotovora’s extrachromosomal element pCA25 and its transposon variant рСА25::Tn9 has been performed. Plasmid pCA25 belongs to the most widespread size class of erwinia’s extrachromosomal DNAs 9.8 kb. The preliminary restriction map of the plasmid has been created, and the site of the Tn9 transposon incorporation has been detected corresponding to the obtained data. 2009 Article Рестрикционное картирование внехромосомного элемента рСА25 Erwinia carotovora / Ж.Ю. Сергеева, Ф.И. Товкач // Доп. НАН України. — 2009. — № 11. — С. 160-164. — Бібліогр.: 6 назв. — рос. 1025-6415 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/19013 579.842.1/.2:579.252 ru Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Біологія Біологія |
| spellingShingle |
Біологія Біологія Сергеева, Ж.Ю. Товкач, Ф.И. Рестрикционное картирование внехромосомного элемента рСА25 Erwinia carotovora |
| description |
Проведено фiзичне картування позахромосомного елемента рСА25 Erwinia carotovora i його транспозонного варiанта рСА25::Tn9. Плазмiда рСА25 належить до найбiльш поширеного серед ервiнiй розмiрного класу позахромосомних ДНК завдовжки 9,8 т. п. н. На основi отриманих даних побудовано попередню рестрикцiйну карту плазмiди i виявлено мiсце вбудовування транспозону Tn9 у плазмiдну ДНК. |
| format |
Article |
| author |
Сергеева, Ж.Ю. Товкач, Ф.И. |
| author_facet |
Сергеева, Ж.Ю. Товкач, Ф.И. |
| author_sort |
Сергеева, Ж.Ю. |
| title |
Рестрикционное картирование внехромосомного элемента рСА25 Erwinia carotovora |
| title_short |
Рестрикционное картирование внехромосомного элемента рСА25 Erwinia carotovora |
| title_full |
Рестрикционное картирование внехромосомного элемента рСА25 Erwinia carotovora |
| title_fullStr |
Рестрикционное картирование внехромосомного элемента рСА25 Erwinia carotovora |
| title_full_unstemmed |
Рестрикционное картирование внехромосомного элемента рСА25 Erwinia carotovora |
| title_sort |
рестрикционное картирование внехромосомного элемента рса25 erwinia carotovora |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| publishDate |
2009 |
| topic_facet |
Біологія |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/19013 |
| citation_txt |
Рестрикционное картирование внехромосомного элемента рСА25 Erwinia carotovora / Ж.Ю. Сергеева, Ф.И. Товкач // Доп. НАН України. — 2009. — № 11. — С. 160-164. — Бібліогр.: 6 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT sergeevažû restrikcionnoekartirovanievnehromosomnogoélementarsa25erwiniacarotovora AT tovkačfi restrikcionnoekartirovanievnehromosomnogoélementarsa25erwiniacarotovora |
| first_indexed |
2025-07-02T19:54:21Z |
| last_indexed |
2025-07-02T19:54:21Z |
| _version_ |
1836566249168961536 |
| fulltext |
УДК 579.842.1/.2:579.252
© 2009
Ж.Ю. Сергеева, Ф. И. Товкач
Рестрикционное картирование внехромосомного
элемента рСА25 Erwinia carotovora
(Представлено членом-корреспондентом НАН Украины И. Г. Скрипалем)
Проведено фiзичне картування позахромосомного елемента рСА25 Erwinia carotovora
i його транспозонного варiанта рСА25::Tn9. Плазмiда рСА25 належить до найбiльш
поширеного серед ервiнiй розмiрного класу позахромосомних ДНК завдовжки 9,8 т. п. н.
На основi отриманих даних побудовано попередню рестрикцiйну карту плазмiди i вияв-
лено мiсце вбудовування транспозону Tn9 у плазмiдну ДНК.
Внехромосомные ДНК достаточно широко распространены у фитопатогенной бактерии
Erwinia carotovora. В своем большинстве плазмиды E. carotovora являются криптически-
ми из-за отсутствия данных относительно их физиологических функций и роли в экологии
этой бактерии [1]. Плазмиды размером 9,8 тысяч пар нуклеотидов (т. п. н.) и их делецион-
но-вставочные варианты представляют собой наиболее распространенную группу внехромо-
сомных элементов, выявленных у E. carotovora. Рестрикционный анализ этих внехромосом-
ных ДНК с помощью эндонуклеаз HpaI и EcoRV показал, что они гомологичны по сайтам
рестрикции. Одним из наиболее изученных генетических элементов бактерии E. carotovora,
размером 9,8 т. п. н., является плазмида рСА25 [2].
В рамках проведенного исследования с целью создания физической карты сайтов мы
осуществили рестрикционное картирование плазмиды рСА25 E. carotovora и ее транспо-
зонного варианта рСА25::Tn9 [3]. В нашу задачу входило также определение взаимного
расположения сайтов рестрикции и области встраивания транспозона Tn9 в молекулу пла-
змидной ДНК. В работе были использованы штаммы Е. carotovora subsp. carotovora 48А
(рСА25) и Е. carotovora subsp. carotovora 48А 7/4b (рСА25::Tn9 ).
Выделение плазмид из клеток E. carotovora проводили щелочным методом [4]. Полу-
ченные плазмидные ДНК осаждали этанолом и растворяли в воде или в буфере Т: 10 мМ
трис-НСl, pH 7,8. Для рестрикционного анализа использовали эндонуклеазы HpaI, BglI,
EcoRI, EcoRV и PstI. Состав рестрикционной смеси был следующий: 5 мкл плазмидного
образца, 2 мкл соответсвующего 10-кратного буфера для рестрикции, 1 мкл эндонуклеа-
зы и 12 мкл Н2О. Время рестрикции составляло 2–3 ч при 37◦С. Фрагменты разделяли
в 0,9–1,2% агарозных гелях. В качестве маркера размера использовали фрагменты ДНК
фага λ, полученные с помощью эндонуклеаз HindIII и PstI.
В результате проведения рестрикционного анализа с использованием эндонуклеаз HpaI,
BglI, EcoRI, EcoRV и PstI мы обнаружили, что ДНК нативной плазмиды рСА25 не содер-
жит сайтов для PstI и EcoRI. Для фермента BglI на ней имеется только один сайт, а для
HpaI и EcoRV — по три сайта. После рестрикции HpaI обнаруживается один большой фра-
гмент размером 9,2 т. п. н. и два небольших фрагмента — 0,4 и 0,2 т. п. н. (рис. 1, трек 3 ).
При гидролизе ДНК эндонуклеазой EcoRV обнаруживается два близких по размеру фра-
гмента — 4,7 и 4,5 т. п. н. и один небольшой фрагмент — 0,65 т. п. н.
160 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2009, №11
Рис. 1. Электрофореграмма фрагментов рестрикции плазмиды рСА25 Е. carotovora subsp. carotovora
и транспозонного варианта рСА25::Tn9 : 1 — рСА25/Bgl I + EcoRI; 2 — рСА25::Tn9/Bgl I + EcoRI; 3 —
рСА25/EcoRI + HpaI; 4 — λ/PstI; 5 — рСА25::Tn9/EcoRI + HpaI; 6 — рСА25/HpaI + Bgl I; 7 —
рСА25::Tn9/HpaI + Bgl I; 8 — рСА25/Bgl I + PstI; 9 — λ/HindIII; 10 — рСА25::Tn9/Bgl I + PstI; 11 —
рСА25/EcoRI + PstI; 12 — рСА25::Tn9/EcoRI + PstI
Рис. 2. Электрофореграмма фрагментов рестрикции плазмиды рСА25 Е. carotovora subsp. carotovora
и транспозонного варианта рСА25::Tn9: 1 — рСА25/HpaI + PstI; 2 — рСА25::Tn9/HpaI + PstI; 3 —
рСА25/Bgl I + EcoRI + PstI; 4 — λ/PstI; 5 — рСА25::Tn9/Bgl I + EcoRI + PstI; 6 — рСА25/EcoRV + Bgl I;
7 — рСА25::Tn9/EcoRV+Bgl I; 8 — рСА25/EcoRV+HpaI; 9 — λ/HindIII; 10 — рСА25::Tn9/EcoRV+HpaI;
11 — рСА25/EcoRV + EcoRI; 12 — рСА25::Tn9/EcoRV + EcoRI
Анализ продуктов совместного гидролиза плазмидной ДНК рестриктазами HpaI и BglI
показал, что сайт для BglI расположен в пределах фрагмента В (0,4 т. п. н.) HpaI (см. рис. 1,
трек 6 ). При этом вместо фрагмента В обнаруживается два фрагмента — 0,25 и 0,15 т. п. н.
Картина совместного гидролиза EcoRV + BglI дает основание предполагать, что сайт для
BglI расположен в пределах фрагмента А (4,7 т. п. н.) EcoRV (рис. 2, трек 6 ). Вследствие
этой рестрикции размер фрагмента А уменьшается до 4,55 т. п. н. и должен обнаруживаться
четвертый фрагмент D — 0,15 т. п. н. (табл. 1). Но фрагмент с такой низкой молекулярной
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2009, №11 161
массой при использованных нами условиях проведения электрофореза выходит за пределы
геля. При двойном гидролизе ДНК эндонуклеазами EcoRV и HpaI должны образовываться
шесть фрагментов, так как для каждой из двух эндонуклеаз на плазмиде имеется по три
сайта. При этом размер фрагмента В EcoRV (4,5 т. п. н.) не изменяется (см. рис. 2, трек 8 ),
а размеры фрагментов А и С уменьшаются до 4,55 и 0,45 т. п. н. соответственно (см. табл. 1).
Три других фрагмента не могут быть обнаружены на данном геле по тем же причинам,
что и фрагмент D EcoRV + BglI.
Рестрикционный анализ ДНК плазмиды рСА25::Tn9 тем же набором рестриктаз, что
и плазмиды рСА25, позволил выявить область встраивания транспозона Tn9 в плазмидную
ДНК и уточнить положение сайтов рестрикции для плазмиды рСА25. Установлено, что
транспозон Tn9 встраивается в ДНК плазмиды рСА25 в фрагмент В EcoRV [2], при этом
его размер увеличивается до 6,7 т. п. н., а также в фрагмент А HpaI, размер которого
увеличивается примерно до 11,4 т. п. н.
Совместный гидролиз плазмиды рСА25::Tn9 рестриктазами BglI и EcoRI (см. рис. 1,
трек 2 ) дает два фрагмента — 10,3 и 2,5 т. п. н. (см. табл. 1). Так как на транспозоне Tn9
имеется один сайт для рестриктазы EcoRI (расположенный в гене хлорамфениколацетил-
трансферазы), то в результате рестрикции рСА25::Tn9 эндонуклеазами EcoRI+HpaI обра-
зуются четыре фрагмента. При сравнении их с фрагментами HpaI для плазмиды рСА25
(см. табл. 1) обнаруживается, что размер фрагмента А HpaI стал 8,9 т. п. н. и появился че-
твертый фрагмент D размером 3,0 т. п. н. То же происходит и при рестрикции рСА25::Tn9
рестриктазами HpaI+BglI: размер фрагмента А увеличивается на размер транспозона, что
составляет примерно 2,2 т. п. н. (см. табл. 1).
Кроме сайта для рестриктазы EcoRI, на траспозоне Tn9 имеются также два сайта
для рестриктазы PstI, расположенные в пределах IS1 последовательностей. Поэтому при
двойном гидролизе ДНК BglI и PstI обнаруживаются три фрагмента плазмидной ДНК
(см. рис. 1, трек 10 ). Их размеры составляют 8,3, 2,7 и 1,7 т. п. н. соответственно (см. табл. 1).
При обработке плазмиды рСА25::Tn9 одновременно рестриктазами EcoRI и PstI (см.
рис. 1, трек 12 ) происходит вырезание транспозона Tn9 из плазмиды рСА25 по сайтам PstI,
а также разрезание самого транспозона по сайту EcoRI. Размер плазмиды после вырезания
транспозона отличается от исходного (9,8 т. п. н.) и составляет приблизительно 10,5 т. п. н.
Мы объясняем это следующим образом. Транспозон Tn9 в ДНК фага Р1 состоит из двух
копий, расположенных в тандемной ориентации [5, 6]. Целостность этой структуры сохра-
Таблица 1. Размеры фрагментов A, B, C, D рестрикции ДНК, полученные при гидролизе плазмид рСА25
и рСА25::Tn9
Вариант
гидролиза
Плазмида рСА25 Плазмида рСА25::Tn9
A B C D A B C D
Bgl I + EcoRI 9,8 — — — 10,3 2,5 — —
EcoRI + HpaI 9,2 0,4 0,2 — 8,9 0,4 0,2 3,0
HpaI + Bgl I 9,2 0,25 0,2 0,15 11,4 0,35 0,2 0,15
Bgl I + PstI 9,8 — — — 8,3 2,7 1,7 —
EcoRI + PstI — — — — 10,5 — — —
HpaI + PstI 9,2 0,4 0,2 — 8,8 6,8 4,3 —
Bgl I + EcoRI + PstI 9,8 — — — 7,9 2,7 1,9 —
EcoRV + Bgl I 4,55 4,5 0,65 0,15 4,5 7,1 0,65 0,15
EcoRV + HpaI 3,2 4,5 0,45 — 3,2 7,1 0,45 —
EcoRV + EcoRI 4,7 4,5 0,65 — 4,7 5,3 0,65 1,85
162 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2009, №11
Рис. 3. Рестрикционная карта плазмиды рСА25::Tn9
няется после ее транспозиции в плазмиду рСА25 [2]. Размер вставки в составе плазмиды
рСА25::Tn9, определенный на основе рестрикционного анализа, в среднем составляет от 2,2
до 3,8 т. п. н. Таким образом, изменение размера плазмиды рСА25 мы объясняем неполным
вырезанием тандемной структуры транспозона Tn9 из ее ДНК.
После совместной рестрикции плазмиды рСА25::Tn9 эндонуклеазами HpaI и PstI (см.
рис. 2, трек 2 ) на треке должны быть видны пять фрагментов. Однако обнаруживаются
только три, что объясняется частичными недоварами плазмидной ДНК при данной ре-
стрикции. По той же причине при тройной рестрикции эндонуклеазами BglI+EcoRI+ PstI
вместо четырех фрагментов имеются три (см. рис. 2, трек 5 ). Можно предположить, что
в данном варианте гидролиза рестриктаза PstI один из двух сайтов на плазмидной ДНК
расщепляет не полностью.
Рестрикции EcoRV+BglI и EcoRV+HpaI плазмиды рСА25::Tn9 (см. рис. 2, треки 7 и 10 )
отличаются от рестрикции плазмиды рСА25 (см. рис. 2, треки 6 и 8 ) только изменением
размера фрагмента В на размер транспозона Tn9 (см. табл. 1).
Анализ рестрикции плазмиды рСА25::Tn9 эндонуклеазами EcoRV + EcoRI (см. рис. 2,
трек 12 ) показывает, что фрагмент В, в который встраивается транспозон Tn9, уменьшился
на размер появившегося четвертого фрагмента (см. табл. 1), образовавшегося вследствие
наличия на транспозоне сайта для рестриктазы EcoRI.
Таким образом, в результате физического картирования плазмид рСА25 и рСА25::Tn9
нами предложена рестрикционная карта криптической плазмиды E. сarotovora (рис. 3), яв-
ляющейся представителем наиболее распространенного размерного класса внехромосомных
ДНК для данной бактерии. Благодаря наличию транспозонной метки в плазмиде стало во-
зможным уточнение взаимного расположения сайтов рестрикции, а также местоположения
транспозона Tn9 в плазмидной ДНК.
Работа выполнена при финансовой поддержке Государственного фонда фундаментальных ис-
следований НДР Ф25/637-2007.
1. Товкач Ф.И. Выделение и предварительная характеристика криптических плазмид Erwinia caroto-
vora // Микробиология. – 2001. – 70, № 6. – С. 804–810.
2. Бурова Л.М., Горб Т.Е., Товкач Ф.И. Природа криптической плазмиды рСА25 Erwinia carotovora
subsp. carotovora 48A // Мiкробiол. журн. – 2007. – 69, № 2. – С. 23–28.
3. Сергеева Ж.Ю., Бурова Л.М., Товкач Ф.И. Внесение транспозона Tn9 в эндогенные плазмиды Erwi-
nia carotovora при лизогенизации клеток колифагом Р1 // Там само. – 2006. – 68, № 4. – С. 34–39.
4. Kado C. J., Liu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids // J. Bacte-
riol. – 1981. – 145, No 3. – P. 1365–1373.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2009, №11 163
5. Pühler A., Krishnapillai V., Heilmann H. Transposition of Tn1 to the phage P1 genome: isolation of
restriction deficient mutants // Advanced Molecular Genetics / Eds. A. Pühler, K.N. Timmis. – Berlin:
Springer, 1984. – P. 111–124.
6. Rosner J. L., Gottesman M.M. Transposition and deletion of Tn9 : a transposable element carrying the
gene for chloramphenicol resistance // DNA insertion elements, plasmids and episomes / Eds. A. I. Bukhari,
J. A. Shapiro, S. L. Adhya. – Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory, 1977. – P. 213–218.
Поступило в редакцию 06.04.2009Институт микробиологии и вирусологии
им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев
Zh.U. Sergeeva, F. I. Tovkach
Restriction site mapping of Erwinia carotovora’s extrachromosomal
element pCA25
The restriction site mapping of Erwinia carotovora’s extrachromosomal element pCA25 and its
transposon variant рСА25::Tn9 has been performed. Plasmid pCA25 belongs to the most widespread
size class of erwinia’s extrachromosomal DNAs 9.8 kb. The preliminary restriction map of the
plasmid has been created, and the site of the Tn9 transposon incorporation has been detected
corresponding to the obtained data.
164 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2009, №11
|