Глюкоамілаза мікроорганізмів. Біосинтез, властивості, механізм дії та практичне застосування

В огляді наведено дані щодо систематичного положення глюкоамілаз у сучасній класифікації. Викладено сучасні погляди на регуляцію біосинтезу мікробних глюкоамілаз, висвітлено питання щодо структури та функцій окремих доменів молекули ензиму, взаємозв’язку та ролі їх у каталізі. Детально описано фізик...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2009
Автори:	Борзова, Н.В., Гудзенко, О.В., Варбанець, Л.Д.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України 2009
Назва видання:	Біотехнологія
Теми:	Огляди
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/28170
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Глюкоамілаза мікроорганізмів. Біосинтез, властивості, механізм дії та практичне застосування / Н.В. Борзова, О.В. Гудзенко, Л.Д. Варбанець // Біотехнологія. — 2009. — Т. 2, № 1. — С. 9-23. — Бібліогр.: 87 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-28170
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-281702011-11-01T12:17:30Z Глюкоамілаза мікроорганізмів. Біосинтез, властивості, механізм дії та практичне застосування Борзова, Н.В. Гудзенко, О.В. Варбанець, Л.Д. Огляди В огляді наведено дані щодо систематичного положення глюкоамілаз у сучасній класифікації. Викладено сучасні погляди на регуляцію біосинтезу мікробних глюкоамілаз, висвітлено питання щодо структури та функцій окремих доменів молекули ензиму, взаємозв’язку та ролі їх у каталізі. Детально описано фізико-хімічні властивості глюкоамілаз грибного походження, показана можливість ефективної іммобілізації ензимів на різних носіях для використання їх у різних технологічних процесах. В обзоре представлены данные по систематическому положению глюкоамилаз в современной классификации. Изложены современные взгляды на регуляцию биосинтеза микробных глюкоамилаз, освещены вопросы, касающиеся структуры и функций отдельных доменов молекулы энзима, их взаимосвязи и роли в катализе. Детально описаны физико-химические свойства глюкоамилаз грибного происхождения, показана возможность эффективной иммобилизации энзимов на различных носителях с целью использования последних в различных технологических процессах. Data on regular position of glucoamylase in modern classification are given in the review. Current views on regulation of microbial glucoamylases biosynthesis are stated, the issues concerning structure and functions of individual domains of enzyme molecule, their interrelation and role in catalysis are discussed. Physical and chemical properties of fungal glucoamylases are detailed. Possibility of effective immobilization of enzymes on various carriers with the purpose of their using in various technological processes was shown. 2009 Article Глюкоамілаза мікроорганізмів. Біосинтез, властивості, механізм дії та практичне застосування / Н.В. Борзова, О.В. Гудзенко, Л.Д. Варбанець // Біотехнологія. — 2009. — Т. 2, № 1. — С. 9-23. — Бібліогр.: 87 назв. — укр. 1995-5537 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/28170 577.152.34 uk Біотехнологія Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Огляди Огляди
spellingShingle	Огляди Огляди Борзова, Н.В. Гудзенко, О.В. Варбанець, Л.Д. Глюкоамілаза мікроорганізмів. Біосинтез, властивості, механізм дії та практичне застосування Біотехнологія
description	В огляді наведено дані щодо систематичного положення глюкоамілаз у сучасній класифікації. Викладено сучасні погляди на регуляцію біосинтезу мікробних глюкоамілаз, висвітлено питання щодо структури та функцій окремих доменів молекули ензиму, взаємозв’язку та ролі їх у каталізі. Детально описано фізико-хімічні властивості глюкоамілаз грибного походження, показана можливість ефективної іммобілізації ензимів на різних носіях для використання їх у різних технологічних процесах.
format	Article
author	Борзова, Н.В. Гудзенко, О.В. Варбанець, Л.Д.
author_facet	Борзова, Н.В. Гудзенко, О.В. Варбанець, Л.Д.
author_sort	Борзова, Н.В.
title	Глюкоамілаза мікроорганізмів. Біосинтез, властивості, механізм дії та практичне застосування
title_short	Глюкоамілаза мікроорганізмів. Біосинтез, властивості, механізм дії та практичне застосування
title_full	Глюкоамілаза мікроорганізмів. Біосинтез, властивості, механізм дії та практичне застосування
title_fullStr	Глюкоамілаза мікроорганізмів. Біосинтез, властивості, механізм дії та практичне застосування
title_full_unstemmed	Глюкоамілаза мікроорганізмів. Біосинтез, властивості, механізм дії та практичне застосування
title_sort	глюкоамілаза мікроорганізмів. біосинтез, властивості, механізм дії та практичне застосування
publisher	Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
publishDate	2009
topic_facet	Огляди
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/28170
citation_txt	Глюкоамілаза мікроорганізмів. Біосинтез, властивості, механізм дії та практичне застосування / Н.В. Борзова, О.В. Гудзенко, Л.Д. Варбанець // Біотехнологія. — 2009. — Т. 2, № 1. — С. 9-23. — Бібліогр.: 87 назв. — укр.
series	Біотехнологія
work_keys_str_mv	AT borzovanv glûkoamílazamíkroorganízmívbíosintezvlastivostímehanízmdíítapraktičnezastosuvannâ AT gudzenkoov glûkoamílazamíkroorganízmívbíosintezvlastivostímehanízmdíítapraktičnezastosuvannâ AT varbanecʹld glûkoamílazamíkroorganízmívbíosintezvlastivostímehanízmdíítapraktičnezastosuvannâ
first_indexed	2025-07-03T08:10:56Z
last_indexed	2025-07-03T08:10:56Z
_version_	1836612590769274880
fulltext	9 Високоефективні біокаталітичні проце� си, які можуть проходити у м’яких умовах та без утворення токсичних продуктів, посідають провідне місце в сучасних техно� логіях, що використовуються у промисло� вості та сільському господарстві. Так, технічні препарати ензимів неза� мінні як кормові додатки для сільськогоспо� дарських тварин, при створенні харчових продуктів з новими властивостями і смако� вими якостями, у процесі одержання екстрак� тивних речовин, у виробництві соків і спир� ту, в пивоварінні тощо. Підвищений інтерес до амілолітичних ензимів зумовлений ши� роким використанням їх як ефективних біо� каталізаторів у медицині, харчовій і легкій промисловості . За даними статистики (The worldwide directory of market research report. Studies and surveys), обсяг продажу технічних пре� паратів ензимів на світовому ринку в 2004 р. становив майже 1,5 млрд. дол. США, при цьому найбільш уживаними препаратами ензимів були протеази (45%) і карбогідрази (понад 35%), у тому числі целюлази, аміла� зи та ін. Загальний обсяг продажу технічних ензимів у Росії в 2004 р. оцінювався у 50 млн. дол. США, з яких лише 1/10 частину сьогод� ні забезпечують російські виробники. В Ук� раїні на цей час виробляють один препарат ензимів з глюкоамілазною активністю — «Глюколад», який є досить активним, однак кількість його дуже обмежена. У зв’язку з вищевикладеним найбільш вагомими є роботи, спрямовані на створення промислових технологій одержання вітчиз� няних препаратів ензимів, що не поступа� ються за якістю світовим аналогам, а в ба� гатьох випадках і кращі за них. До них належать, зокрема, ензимні комплекси глю� коамілази (ГА), що є перспективними для широкомасштабного використання у про� цесі оцукрювання крохмалю і мальтодек� стринів [1–3]. Амілолітичні ензими, які застосовують у процесах перероблення крохмалю, становлять майже 30 % кількос� ті всіх ензимів, що використовуються для індустріальних потреб на сучасному етапі розвитку промислових технологій [4], а за� гальна вартість їх — 156 млн. дол. США за рік у світовому масштабі [5,6]. ГА належить до ензимів, які найбільш інтенсивно засто� совуються у світі, обсяг виробництва їх — декілька тисяч тон на рік. ГА використовують для отримання глюкози із крохмалю з по� дальшим виготовленням глюкозо�фруктоз� них сиропів, у виробництві рисових пластів� ців із сирого рису [7], деякі дріжджові штами застосовують в ензиматичному роз� шліхтовуванні накрохмаленого бавовняного ОГЛЯДИ УДК 577.152.34 ГЛЮКОАМІЛАЗА МІКРООРГАНІЗМІВ. ГЛЮКОАМІЛАЗА МІКРООРГАНІЗМІВ. БІОСИНТЕЗ, ВЛАСТИВОСТІ, МЕХАНІЗМ ДІЇ БІОСИНТЕЗ, ВЛАСТИВОСТІ, МЕХАНІЗМ ДІЇ ТА ПРАКТИЧНЕ ЗАСТОСУВАННЯТА ПРАКТИЧНЕ ЗАСТОСУВАННЯ Ключові слова: глюкоамілаза, біосинтез, будова активного центру, механізм дії, властивості ензиму, іммобілізація глюкоамілаз, практичне застосування. В огляді наведено дані щодо систематичного положення глюкоамілаз у сучасній класифікації. Викладено сучасні погляди на регуляцію біосинтезу мікробних глюкоамілаз, висвітлено питання щодо структури та функцій окремих доменів молекули ензиму, взаємозв’язку та ролі їх у каталізі. Детально описа� но фізико�хімічні властивості глюкоамілаз грибного походження, показана можливість ефективної іммобілізації ензимів на різних носіях для використання їх у різних технологічних процесах. Н. В. БОРЗОВА, О. В. ГУДЗЕНКО, Л. Д. ВАРБАНЕЦЬ Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ E:mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 10 полотна в текстильній промисловості [8]. Шляхом ензиматичного синтезу за допомо� гою амілоглюкозидази Rhizopus та β�глюко� зидази із солодкого мигдалю можна одержати глікозильні сполуки: N�ваніліл�нонанамід, глікозиди з D�глюкозою, D�галактозою, D� манозою, D�рибозою, мальтозою та лакто� зою, для подальшого використання їх у хар� човій промисловості [9]. Фізіологічне значення ГА для вищих тварин полягає передусім у забезпеченні ефективного гідролізу крохмалевмісних ре� човин. Відомо, що нестача ГА в організмі спричинює розвиток серйозних захворю� вань. Так, хвороба накопичення глікогену (хвороба Pompe) — це спадкова мускульна дистрофія, причиною якої є дефіцит лізосо� мальної альфа�глюкозидази, що призводить до накопичення глікогену у скелетній та серцевій мускулатурі, а іноді й у нервовій тканині [10, 11]. У цьому разі ензимна заміс� на терапія на ранніх стадіях може бути дуже ефективною [12]. Зважаючи на значний практичний інтерес до ГА метою нашого огляду є висвітлення су� часних уявлень щодо систематичного поло� ження цього ензиму, окреслення можливих шляхів керування його біосинтезом у мікроб� них продуцентах для подальшого практичного використання, а також узагальнення наявних даних щодо взаємозв’язку між структурою молекули та механізмом дії ензиму. Класифікація ГА (α�1,4�глюкан глюкогідролаза, КФ 3.2.1.3.), відома також як екзо�1,4�α�глюко� зидаза або γ�амілаза, амілоглюкозидаза, лізосомальна α�глюкозидаза, кисла мальтаза, матулаза, розщеплює сирий та розчинний крохмаль з утворенням переважно глюкози і невеликої кількості декстринів. ГА каталі� зує послідовне відщеплення α�1,4�зв’язаних кінцевих залишків D�глюкози з нередукую� чих кінців субстрату, що супроводжується інверсією аномерної конфігурації і утворен� ням β�глюкози. Більшість глюкоамілаз ма� ють здатність також гідролізувати α�1,6�глі� козидні зв’язки, проте з меншою швидкістю, ніж α�1,4�зв’язок [13]. Специфічна актив� ність (kcat/Km) ГА щодо α�1,6�зв’язку стано� вить 0,2% від активності щодо α�1,4�зв’язку [14, 15]. Однак це відбувається лише в тому разі, коли за α�1,6�зв’язком іде α�1,4� зв’язок, тому декстрини ними не гідролізу� ються. Характерною особливістю ГА є здат� ність у десятки разів швидше гідролізувати високополімеризований субстрат, ніж оліго� та дисахариди [16]. Збільшення виходу глюкози у процесах цукрофікації за межу 96% може бути досяг� нено саме за рахунок гідролізу ГА α�1,6� зв’язків, присутніх у крохмалевмісній сиро� вині [17]. ГА входять до 15�ї родини глікозидгідро� лаз і на цей час виявлено 23 первинні струк� тури ГА нитчастих грибів, дріжджів, еубак� терій та архей. Встановлено тривимірну структуру каталітичного домену ГА Asper: gillus awamori var. X100 як для нативного протеїну, так і для його лігандзв’язаних форм [18–20]. Також було визначено струк� тури дикого типу та мутантів A. niger [21], які показали на 94% подібність послідов� ності амінокислот у порівнянні з A. awamori var. X100. Крім того, є повідомлення про подібність до них і крохмальзв’язувального домену дріжджової ГА Saccharomycopsis fibuligera [22]. Продуценти ГА ГА — широко розповсюджений у приро� ді ензим, він присутній як в організмі ви� щих тварин, так і серед мікроорганізмів різних таксономічних груп. Але безперечно найбільш дослідженою і найчисленнішою групою є грибні продуценти ГА. Багато видів мікроміцетів здатні до продукування ГА у різноманітних ензиматичних умовах і виробництвах. Практичну цінність мають продуценти, ГА яких гідролізують сирий крохмаль при підвищених температурах. Такі термостабільні ГА характерні для A. awamori, A. foetidus, A. niger, A. oryzae, A. terreus, Mucor rouxians, M. javanicus, Neurospora crassa, Rhizopus delmar, R. oryzae, R. fonkinensis, R. neveus, R. tonnen: sis, R. japonicum, R. javanicus, R. topnineus [13] та Arthrobotrys amerospora [23, 24]. Про� те увагу дослідників сфокусовано передусім на A. niger та R. oryzae. Використання ГА із цих джерел у крохмальдеградуючих вироб� ництвах пояснюється їх досить високою тер� мостабільністю та активністю за нейтраль� них значень рН [25, 26]. Для комерційного виробництва ГА вико� ристовують представників Aspergillus, Rhi: zopus, Endomyces. Усі три типи ГА здатні до повного гідролізу крохмалю до глюкози. Ен� зими із Rhizopus і Endomyces менш термо� стабільні, ніж ензими з Аspergillus. Опти� мальна температура гідролізу крохмалю для ГА Aspergillus — 60 0С, а для інших двох 55 0С, рН 4,2–4,5. Ця різниця має важливе значення, оскільки при температурах ниж� че 60 0С важко запобігти мікробному зара� женню у процесі гідролізу. Тому ГА Огляди 11 Aspergillus, в основному штамам A. niger, віддають перевагу перед ензимами з Rhizo: pus і Endomyces. Активні продуценти ГА виявлено серед грибних штамів Coniophora cerebella, M. rouxianus, Cephalosporium charticola Lindow, Penicillium oxalicum. Продуцентами ГА є і культури дріжджів — Endomyces, Saccharomyces diostaticus, Candida pellicu: losa [27]. У процесі культивування продуцентів утворюється низка супутніх ензимів: проте� ази, целюлази, β�галактозидази, α�амілази і трансглюкозидази. Присутність трансглю� козидази у препаратах ГА, що використову� ються для гідролізу крохмалю, є небажаною. Трансглюкозидаза каталізує утворення ізо� мальтози та олігосахаридів із глюкози, зни� жуючи тим самим вихід глюкози під час оцукрювання крохмалю. Також було знай� дено іншу трансферазу, що каталізує утво� рення α�1,3�зв’язаних олігосахаридів із мальтози [28]. Уникнути присутності неба� жаних ензимів дозволяє використання му� тантів, які продукують ці ензими в незнач� них кількостях. Цінним штамом, який продукує дуже малу кількість трансглюко� зидази, є A. awamori NRRL 3112 [29]. Для більшості штамів — продуцентів ГА вида� лення трансглюкозидази є серйозною проб� лемою. Розроблено ряд методів очищення, але багато з них пов’язані зі втратою глюко� амілазної активності. Майже всі без винят� ку препарати ГА надходять у продаж у рід� кій формі. Завдяки низькому значенню рН (близько 4,5) і високій концентрації сухої речовини, а також присутності спирту й ор� ганічних кислот забезпечується висока стабільність препаратів. Спирти справляють стабілізуючий вплив на активність препара� ту під час його зберігання [13]. Біосинтез ензимів ГА одержують глибинною, твердофаз� ною або напіврідкою ферментацією, застосо� вуючи качалкові колби, барбатуючі реактори або ростові камери з кюветами. Продукуван� ня ГА залежить як від вибору біореактора, так і від умов вирощування. Як біореактори для вивчення умов біосинтезу ГА можуть бу� ти використані колби, кювети, ротаційні ре� актори, колонкові біореактори (вертикальні або горизонтальні) [30]. J. Bo зі співавт. [31] вивчали умови продукування ензиму куль� турою R. oligosporus в умовах барбатуючого реактора. Досліджено продукування ГА ре� комбінантним штамом A. niger в умовах хе� мостату з лімітом глюкози та додаванням різних джерел органічного азоту [32]. Було показано, що додавання у середовище куль� тивування різних органічних джерел азоту, в тому числі аланіну, метіоніну, казаміно� вих кислот або пептону, призводить до зни� ження специфічної активності ГА. 46 штамів Rhizopus з різних джерел було перевірено за здатністю росту і активністю біосинтезу ГА як на твердому середовищі з нативним крохмалем і пшеничними висів� ками, так і в рідкому середовищі, в якому змінювалась концентрація іонів Са2+ і Zn2+ [33]. Максимальне накопичення біомаси та максимальний вихід ензиму спостерігали у штаму Rhizopus sp. A:11 у зануреній куль� турі за вмісту цинку 7·10–5%. Подальше збільшення вмісту цинку супроводжувалось пригніченням росту міцелію. У досліджен� нях, які проводили зі штамом А�11, показа� но, що в рідкому живильному середовищі загальна активність ГА вища в 4,4 раза, а питома активність ГА щодо нативного крохмалю — у 3 рази порівняно з відповід� ними показниками під час твердофазного культивування, тимчасом як для кислої і нейтральної протеаз спостерігається зво� ротна залежність, а рівень α�амілази одна� ковий у культурах обох типів. Вивчено здатність двох штамів R. oryzae (MUCL 28627 і MUCL 28168) і одного штаму R. delemar (АТСС 34612) продукувати глю� коамілазу, яка діє на гранульований крох� маль. Як субстрат для твердофазної фермен� тації використовували багасу (жом) рослини касави (Manhioc esculenta, Crantz) [34]. Було досліджено вплив джерел вуглецю й азоту на утворення ГА A. niger, що бере участь у розщепленні неочищеного крохма� лю. Утворення ензиму змінювалось залежно від джерел вуглецю. Рівень ГА був мінімаль� ним навіть за низьких концентрацій глюко� зи, натомість інші вуглеводи стимулювали її утворення. Пшеничні висівки і целюлоза, а також дещо меншою мірою рисові висівки були найефективнішими індукторами ак� тивності ГА. Екзогенна глюкоза пригнічува� ла синтез ензиму в культурах A. niger, що ростуть на пшеничних висівках. У A. niger синтез ГА значно активізували мальтоза, целодекстрин, целюлоза або целюлозо� і геміцелюлозовмісні субстрати. У період росту A. niger на пшеничних висівках мак� симальна продуктивність ГА становила 274 МЕ/л/год, тобто значно перевищувала величини, про які повідомляли дослідники для деяких інших грибів. Додавання акти� номіцину Д (репресор транскрипції) і цикло� гексиміду (репресор трансляції) повністю БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 12 пригнічувало біосинтез ГА, що у свою чергу вказує на те, що регуляція синтезу ГА у цьо� му організмі відбувається і на транскрипцій� ному, і на трансляційному рівні. Термоди� намічні дослідження показали, що культура «захищається» від термальної інактивації за дії різних температур у період фермента� ції [35]. Безпосереднього ефективного синтезу етанолу у процесі ферментації сирого куку� рудзяного крохмалю було досягнено з вико� ристанням рекомбінантних дріжджів Saс: charomyces cerevisiaе. На поверхні клітин дріжджів відбувається накопичення ГА R. oryzae і α�амілази Streptocoсcus bovis за рахунок якірних протеїнів С�кінцевої поло� вини α�аглютиніну і функціонального доме� ну флокуляції протеїну Flo 1 p відповідно. У разі 72�годинної ферментації штам синте� зував 61,8 г/л етанолу, що становить 86,5% від теоретичного виходу за крохмалем [36]. Для підсиленого продукування ГА про� водили твердофазне культивування Fusa: rium solani, використовуючи різні субстрати, у тому числі пшеничні, рисові, кукурудзяні висівки, а також висівки зеленого та чорно� го гороху. Найбільшу ензиматичну ак� тивність спостерігали у випадку викорис� тання пшеничних висівок. Максимальної ензиматичної активності (61,35±3,69 Од/г сухих пшеничних висівок) було досягнено за оптимізованих умов росту F. solani, а са� ме: фруктоза (1%) — джерело вуглецю й енергії, сечовина (1%) — джерело азоту, вихідна вологість твердого субстрату — 70%, період інкубації — 96 год, об’єм іноку� ляту — 15% (106–107 спор/мл), температура інкубації 35±1 0С, рН 5,0. Показано, що до� давання поверхнево�активних речовин зу� мовлює послаблення біосинтезу ензимів у F. solani під час твердофазної фермента� ції [37]. Було проведено порівняння ефектив� ності використання крохмалів сорго, кар� топлі, кукурудзи і касави, а також мальтози для одночасного культивування і продуку� вання позаклітинних α�амілази і ГА новим ізолятом Trichoderma sp. Встановлено, що мальтоза є кращим субстратом для активно� сті та продуктивності α�амілази (~2800 Од/л та ~390 Од/л·год відповідно), а крохмаль ка� сави і кукурудзи забезпечує вищу актив� ність ГА (17000–18000 Од/л) за показників продуктивності, близьких до таких, як у ра� зі використання мальтози (~100 Од/л·год). У зв’язку з тим, що штам Trichoderma sp. здатен продукувати або α�амілазу, або глю� коамілазу, доцільно використовувати його у прямих процесах оцукрювання сирого крохмалю без попередньої желатинізації [38]. Вивчення впливу джерел азоту на проду� кування позаклітинних амілолітичних ен� зимів Trichoderma sp. показало, що із засто� суванням суміші сечовини і сульфату амонію культура була здатна ефективно де� градувати нежелатинований розчинний крохмаль з утворенням α�амілази і ГА. Досліджуючи різні джерела азоту, в тому числі цитрат амонію, дріжджовий екстракт, сечовину, сульфат амонію, суміш сульфату амонію і сечовини, пептон і кукурудзяний екстракт, з’ясували, що кукурудзяний екстракт був найкращим джерелом азоту для активності й продуктивності як α�аміла� зи, так і ГА [39]. Було встановлено оптимальні умови для глибинного культивування екстремального термофільного гриба Thermomucor indicae: seudaticae: сахароза — 2%; MgSO4 · 7H2O — 0,13%; дріжджовий екстракт — 0,1%; об’єм інокулюма — 5·106 спор у 50 мл середовища; час інкубації 48 год, температура 40 0С, рН 7,0, що дозволяє досягти глюкоамілазної ак� тивності на рівні 34,2 Од/мл [40]. Також для цього продуцента було показано, що цукро� во�дріжджовий бульйон з успіхом може бу� ти замінений на очеретяну мелясу (7%) та нітрат амонію (0,25%) [41]. Такої самої думки щодо суворої залеж� ності синтезу ГА грибного походження від природи та співвідношення джерел азоту і вуглецю дотримується більшість авторів. Так, для A. awamorі спостерігалося 100% зростання активності із заміною сечовини на сульфат амонію, співвідношення C/N бу� ло 4,8, як додаткове джерело вуглецю вико� ристовували мальтозу. Співвідношення C/P у діапазоні 5,1–28,7 не впливало на проду� кування ГА за цих умов [42]. Також є результати, що свідчать про можливість збільшення виходу ГА у разі ви� користання під час культивування синього світла [43]. Характеристика мікробних ГА Найповніше на цей час досліджено влас� тивості грибних ГА, оскільки саме ензими із цих джерел використовують у промисло� вості. ГА грибного походження зазвичай ма� ють множинні форми [27]. Але ця мно� жинність найімовірніше виникає внаслідок дії протеаз, які синтезуються одночасно з ГА, або, як зазначає Svensson зі співавт. [44], утворюються внаслідок різних вторин� них процесів. Було доведено [45], що ГА A. awamori синтезується як одна форма — Огляди 13 основна ГА. У результаті обмеженого проте� олізу цієї форми, що відбувається у культу� ральній рідині, утворюються гомогенні мінорні форми через відщеплення пептиду, який містить додатковий субстратзв’язу� вальний центр. ГА складається з двох доме� нів — каталітичного та крохмальзв’язуваль� ного, які зв’язані О�глікозильованим поліпептидним ланцюгом, розташованим з N�кінця (рис. 1). Крохмальзв’язувальний домен відіграє головну роль у гідролізі крох� малю та забезпечує адсорбцію ензиму до клітинної стінки, місцево збільшуючи кон� центрацію ензиму, що зумовлює зростання виходу глюкози в середовище [46, 47]. Част� кове або повне видалення крохмальзв’язу� вального домену протеолітичним оброблен� ням призводить до утворення ГА, здатної до гідролізу виключно розчинного крохмалю [48]. Тому цілком очевидно, що позбавлення від протеаз у процесі ферментації дозволяє одержувати ГА, що здатні до гідролізу сиро� го крохмалю. Це завдання може бути успішно вирішено: а) іммобілізацією клітин [49]; б) відбором морфологічних форм [50]; в) контролем рН [42]; г) варіюванням жи� вильного середовища [51]; д) будовою біоре� актора [30]; е) використанням інгібіторів протеаз [52]. Молекулярна маса та структура ГА. Молекулярна маса ГА грибного походження зазвичай лежить у діапазоні від 48 до 90 кДа (табл.), винятком є ензим з A. niger, який має масу 125 кДа [59]. Вуглеводний компо� нент становить близько 10–20% від молеку� лярної маси. Наприклад, вуглеводний фраг� мент ГА С та D R. niveus дорівнює 14,9% та 12,7% відповідно [60], тоді як у N. crassa — лише 5,1% [61]. Для двох форм ГА, які виділено з культуральної рідини Monascus purpureus, встановлено [56], що вуглеводні компоненти становили 15,0% та 16,2%. Полісахаридний залишок не впливає не тре� тинну структуру молекули ензиму, однак його усунення знижує секрецію ГА з кліти� ни та зменшує термостабільність. Низька щільність глікозильних залишків біля ката� літичного домену може бути причиною його жорсткості. До того ж вуглеводні фрагменти беруть участь у зв’язуванні молекул субстрату та його аналогів і локалізації мо� лекул води, які визначають взаємодію по� одиноких ланок вуглеводу між собою та сприяють збільшенню стабільності ензиму. Показано, що вуглеводний компонент за� побігає розгортанню та частково агрегації протеїнів. Також важливу роль відіграє цей компонент у захисті ГА від протеолізу. З’ясовано, що малоглікозильовані ГА біль� ше піддаються впливу протеаз [62]. Експериментальним шляхом було дослі� джено вплив різних фізико�хімічних фак� торів на конформацію макромолекули ГА із A. awamori та зв’язаних з нею механізмів ак� тивації й інактивації цього ензиму; вивчено кінетико�термодинамічні аспекти реакції гідролізу крохмалю [63–65]. Методом гель�хроматографії визначили молекулярну масу ГА — 106 кДа. Дослі� дження амінокислотного складу показало, що молекула ГА містить 26,8% амінокис� лотних залишків з алкільними боковими ланцюгами (Ala, Val, Leu, Met,Ile), що виз� начають високий вміст у молекулі ГА Ser і Thr. Результати експериментів і аналіз да� них літератури стосовно секвенування ГА [20] дозволяють зробити висновок про те, що молекула ензиму має 6 SH�груп і 4 ди� сульфідних зв’язки, що стабілізують його третинну структуру. Вивчення надмолеку� лярного рівня організації ГА показало на� явність четвертинної структури, представ� леної двома ідентичними субодиницями з молекулярною масою 53,6 кДа, що відпо� відають за каталітичну активність. Її ста� більність визначається водневими зв’язками і гідрофобною взаємодією і може залежати від незначних змін у просторовій структурі кожної із субодиниць, які взаємодіють [45]. Результати дослідження впливу n�мер� курібензоату на каталітичну активність ГА дозволяють зробити висновок про те, що до складу активного центру такого ензиму не входить імідазольна група гістидину, а та� кож SH�групи, а в гідролізі крохмалю бе� руть участь карбоксильні групи аспарагіно� вої і глютамінової кислот (групи Asp�55, Glu�179, Glu�400 (рис. 1). Активний центр ензиму міститься у щі� лині, прикритій двома кластерами молекул Рис. 1. Модель ГА [http://www.ifr.ac.uk/spm/aboutus.html] БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 14 Н2О: перший — у ділянці Leu�58 (12 моле� кул Н2О), другий — у заглибленні активного центру (7 молекул). Встановлено, що з одно� го боку щілини активного центру сконцент� ровані Asp�55 і Glu�179, а з протилежного — Glu�400 та Trp�120 (рис. 2) [19]. Результати рентгеноструктурного аналі� зу [18, 20] показали, що поверхня молекули ГА глікозильована: до 10 амінокислотних залишків серину і треоніну приєднана мано� за (Ser�453, Ser�455, Ser�459,Thr�457 та ін). Цей ензим характеризується наявністю N� термінального каталітичного домену, який складається із 440 амінокислотних залишків, О�глікозильованої ділянки, яка має 70 аміно� кислот, і С�термінального крохмальзвязу� вального домену (100 амінокислот). Каталі� тичний домен має 2 N�глікозильні ділянки, причому контакт між N�глікозильними лан� цюгами і поліпептидом стабілізується залиш� ком манози за допомогою водневого зв’язку або іонізованими молекулами води, чим і виз� начається стабільність ензиму і можливість утворення надмолекулярних структур. О�глі� козильований домен має залишки Gly перед і після С�кінця, які являють собою вигини, що визначають взаємодію крохмальзв’язу� вального домену з каталітичним, та відповід� ну орієнтацію молекули субстрату. Глікози� лювання запобігає скупченню молекул субстрату в зв’язувальних центрах і забезпе� чує стехіометричне зв’язування. Крохмаль� зв’язувальний домен визначає зв’язування розчинних ліганд (β�циклодекстринів). Методом комп’ютерного моделювання встановлено, що для молекул ГА є характер� ним щільне упакування гідрофобного ядра у вигляді 13 α�спіральних ділянок (рис. 3), а також антипаралельних β�структур, що утворюють 11 петель (рис. 4). Деякі фізико>хімічні властивості грибних ГА Продуцент Термо� оптимум Термостабільність рН�опти� мум рН� стабільність Мr Специфічність Thermoplasma acidophilum [53] 75 оС 40–90 оС 5 mM CaCl2 стабілізує 5,0 pH 3,5–7,0 66 кДа Глікоген, амілоза, амілопектин Chaetomium ther� mophilum [54] 65 оС 60 оС, 80% актив� ності 60 хв при 70 оС. 50% активності 40 і 10 хв при 80 та 90 оС 4,5–5,0 pH 4,0–7,0 66 кДа Крохмаль, глікоген Paecilomyces variotii [55] 55 оС 60 хв при 50 та 55 оС, 45 хв при 60 оС (у присутності субстрату) 5,0 pH 3,0–7,5 86,5 кДа Амілопектин, гліко� ген та крохмаль, менше мальтооліго� сахариди та амілоза Monascus purpureus (дві форми) [56] 50 та 65 оС 50–60 оС 5,0 pH 3,0–7,5 60 та 89 кДа Крохмаль Curvularia lunata [57] 50 оС 60 хв при 55 оС 4,0 3,0–6,0 66 кДа Крохмаль, рамно� зильні залишки у стероїдних сапонінах Thermomyces lanuginosus [58] 70 оС 60 хв при 80 оС 5,0 4,0–6,0 66 кДа Km 3,5 мM для роз� чинного крохмалю Рис. 2. Просторова структура макромолекули ГА A. awamori [19]. Активний центр: А) 1— Leu�58; 2 — Leu�130; 3 — Leu�177; 4 — Leu� 319; 5 — Trp�178; 6 — Trp�417; 7 — Phe�187. Б) 1 — Asp�55; 2 — Glu�179; 3 — Glu�400 А Б Огляди 15 У вторинній структурі присутні, окрім цього, 19 невпорядкованих ділянок (рис. 5). У відсотковому співвідношенні таких струк� тур за довжиною переважають аморфні ділянки, що підтверджено методом ІЧ� спектроскопії. Зараз тривають роботи щодо вивчення топології різних амілолітичних ензимів, об� говорюються питання топологічної самоор� ганізації досліджених протеїнових макро� молекул, яка визначається взаємозв’язком первинної та вторинної структур [17]. Режим оптимального функціонування. Грибні ГА активніші за кислих значень рН, однак для різних ензимів відзначаються різні рН�оптимуми (табл.). Наприклад, одна з трьох ГА Arthrobotrys amerospora мала рН�оптимум 6,0, а дві інші —5,6 [66]. Ко� мерційний препарат ГА з A. niger складаєть� ся з шести різних форм, рН�оптимум яких — у межах від 3,5 до 5,0 [67]. Spinelli зі співавт.[61] показали, що ГА, одержана з мутантного штаму N. crassa, виявляла максимальну активність за рН 5,4, а ГА зі Monascus kaofieng nov�sp. F�1 мала дві ак� тивні форми з рН�оптимумами 4,5 та 4,7. Стабільність ГА також залежить від концен� трації водневих іонів, але зазвичай вони цілком стабільні у діапазоні рН від 3,0 до 7,0. Температурні оптимуми дії ГА в основно� му перебувають у межах 50 — 60 0С. Ензими з A. niger NRRL 330 та A. awamori var. kawachi були найбільш активні при 50 0С та 60 0С відповідно, а з A. amerospora — при 55 0С [61, 66, 68]. Однак для деяких грибів встановлено вищі значення термооптиму� мів, зокрема у ГА з T. reseiе та Scytalidium thermophilium 70 0С [69, 70]. У багатьох грибних ГА термостабільність спос� терігається за високих значень, але протя� гом нетривалого часу [71]. Механізм дії ГА ГА — екзоензим кінцевої дії, що розщеп� лює у крохмалі як α�1,4, так і α�1,6�зв’язки. Послідовно відщеплюючи від нередукуючих кінців ланцюгів один глікозидний залишок за іншим, ГА уможливлює практично пов� ний гідроліз полі� і олігосахаридів до β�глю� кози. Повнота і швидкість гідролізу в різних ГА відрізняються. Суттєва різниця гідролізу полі� і олігосаха� ридів ендоамілазами порівняно з гідролізом Рис. 3. Топологія α>спіралей у макромолекулі ГА [19] Рис. 4. Топологія β>шарів у макромолекулі ГА [19] Рис. 5. Топологія невпорядкованих ділянок у макромолекулі ГА [19] БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 16 екзоамілазами полягає в тому, що в першо� му випадку гідроліз відбувається зі збере� женням конфігурації продуктів реакції і супроводжується трансглікозилюванням, а в другому — з обертанням конфігурації, окрім того, ензими цього типу не мають трансглікозилювальної активності. Транс� глікозилювання, тобто негідролітичне пере� творення олігосахаридів, є характерною особливістю ендоамілаз і проходить пара� лельно або слідом за гідролітичною реак� цією. Вивчення механізму дії амілолітичних ензимів супроводжується певними складно� щами, передусім вони полягають у тому, що субстрат — крохмаль — неоднорідний і має різні характеристики за ступенем полімери� зації глікозидного ланцюга та кількості роз� галужень. Субстратами для дії амілолітичних ен� зимів є крохмаль — рослинний полісахарид, який складається з 13–30% амілози і 70–85% амілопектину, продуктів часткового гідро� лізу крохмалю та глікогену. Обидва компо� ненти неоднорідні, їхня молекулярна маса лежить у широких межах і залежить від природи крохмалю. Амілоза — це нерозга� лужений полімер, у якому залишки глюко� зи з’єднані α�1,4�глікозидним зв’язком, зі ступенем полімеризації близько 2 000, мо� лекулярною масою від 50 000 до 160 000. В «аномальних» амілозах з одним�двома α� 1,6�зв’язками полімеризація може зрости до 6 000. Амілоза практично не має відновлю� вальної здатності, оскільки в кожній молекулі амілози є лише одна вільна альдегідна група. Молекула амілози має вигляд розтягне� ної спіралі, крок якої становить 10,6 , і в кожний виток входить 3 залишки глюко� зи. Максимальна довжина молекули аміло� зи досягає 7 000 . У розчині спіраль стис� кається за рахунок збільшення витка, в якому беруть участь вже 6 залишків глю� кози. Зі входженням молекул йоду в спіраль амілози виникає характерне синє забарвлен� ня. Точно говорити про величину молекули амілози не можна, оскільки навіть із одного зразка крохмалю виділяється амілоза з ве� личиною молекули від 500 до 2 000 залиш� ків глюкози. Амілопектин має більшу молекулярну масу (до 1000 000), ніж амілоза, і складнішу будову. Це полісахарид, який складається з розгалужених ланцюгів молекул глюкози, що зв’язані як між 1�м та 4�м, так і між 1�м та 6�м вуглецевими атомами. Існує дві гіпотези щодо механізму дії ек� зоамілаз на субстрат. Перша гіпотеза при� пускає, що, діючи на субстрат за одноланцю� говим або «блискавичним» механізмом, ек� зоамілаза утворює ензимсубстратний комп� лекс із захопленням нередукуючого кінця ланцюга. Подальший рух ензиму по цьому ланцюгу відбувається до повного його гідро� лізу. За другою гіпотезою ГА діє на субстрат шляхом множинної атаки, тобто ензим утво� рює комплекс з молекулою субстрату, потім через декілька етапів цей комплекс розпа� дається і ензим зв’язується з новою молеку� лою субстрату. Іншими словами, у разі мно� жинної атаки відбувається дещо середнє між невпорядкованим механізмом і одно� ланцюговою, «блискавичною» атакою. Для повного гідролізу за даним механізмом одна молекула субстрату має утворювати багато разів ензимсубстратні комплекси. При цьо� му можливий гідроліз декількох зв’язків в одному каталітичному акті. Механізм дії амілолітичних ензимів на субстрат може бути розглянутий з декількох позицій: 1. Вид зв’язку, що розривається (α�1,4 або α�1,6). 2. Тип дії на субстрат (ендо� або екзо�). 3. Вплив на швидкість гідролізу ступеня полімеризації субстрату. 4. Можливість гідролізу олігосахаридів. Наявність ознак амілаз, відображених у 3�й і 4�й позиціях, за дії на лінійні субстра� ти може свідчити про існування в цих ензи� мах підцентрової структури. Ймовірно, ак� тивний центр амілази може складатися із декількох підцентрів, кожен з яких може вступати в контакти із глюкозним залиш� ком. Вільна енергія взаємодії (ΔG, кДж/моль) визначає підцентрову подібність ензиму до субстрату. Ця подібність індивідуальна і мо� же бути як «позитивною», так і «негатив� ною». Імовірність існування підцентрових структур амілолітичних ензимів допомагає встановити будову активного центру, дає більш чітке пояснення субстратної специ� фічності, але не пояснює механізм гідролізу розгалужених субстратів. На основі кіне� тичних досліджень ГА A. saitoti, A. oryzae, A. niger та Arthrobotrys amerospora встанов� лено, що в молекулі ГА є 7 підцентрів зв’язування субстрату [66, 72–75]. Гліко� зильне зв’язування мальтоолігомерів відбу� вається між підцентрами 1 та 2. Різні під� центри мають різну спорідненість до субстрату. Афінність першого підцентру ду� же низька, а другий підцентр має найвищу спорідненість до субстрату, спорідненість інших підцентрів зменшується від третього до сьомого. Ключову роль у стабілізації o A o A Огляди 17 центрів зв’язування відіграє Trp�120 [75]. Взаємодія з підцентрами 1 та 2 сприяє зміні конформації ензиму. Здатність глобулярних протеїнів утворю� вати якісні монокристали, в яких всі атоми ідентичні й орієнтовані однаковим чином, дозволила вивчати їх за допомогою методу кристалографії. Відомо, що дані рентгено� структурного аналізу завжди правильно відоб� ражають укладку протеїнового ланцюга, а в переважній більшості випадків букваль� но відтворюють активну конформацію ензи� му. Відповідно, вони є надійною і поки що єдиною основою для кількісного опису ме� ханізму каталітичного акту на атомно�моле� кулярному рівні. Метод кристалографії доз� воляє розшифрувати тривимірні структури комплексів ензимів з інгібіторами, які тією чи іншою мірою відповідають хімічним стадіям каталізу. Наявність рентгеноструктурних да� них, одна частина яких відповідає реальному вихідному стану ензиму, а інша — ензимінгібі� торним комплексам, уможливлює відтворен� ня механізму каталітичного акту і, відповід� но, дає змогу простежити за динамікою поведінки протеїнової макромолекули [76]. На цей час існує таке припущення щодо механізму розриву α�1,4�глікозидного зв’яз� ку у молекулі крохмалю під дією ГА [45]. З утворенням ензимсубстратного комплексу за участю Trp�120 та О�глікозильованих ділянок крохмальзв’язувального домену відбувається іонізація Asp�55 та Glu�179, причому акцептором протонів є ОН�група нередукуючого кінця молекули крохмалю. Можливо, що Glu�179 протонована вже на початку реакції. Фізико�хімічні параметри мікрооточення активного центру сприяють зменшенню рКа цього амінокислотного залишку, причому мо� лекула ензиму не піддається структурним змінам. Протонування зумовлює збурювальну дію на електронну конфігурацію α�1,4�зв’язку та спричиняє утворення термодинамічно більш вигідної конформації «напівкрісла». Ензимсубстратні комплекси можуть бу� ти продуктивними та непродуктивними, і в першому випадку молекула субстрату займає перший підцентр, а зв’язок, що роз� щеплюється, розташовується між ка� талітичними групами активного центру. Гідрофобні амінокислотні залишки сприя� ють більш жорсткій фіксації субстрату. Визначення активності ГА Глюкоамілазна активність (ГлАк) харак� теризує здатність ензимних матеріалів ка� талізувати розщеплення розчинного крох� малю до глюкози і виражається числом оди� ниць активності в 1 г досліджуваного твер� дого матеріалу або в 100 мл (чи в 1 мл) рідко� го продукту. Глюкозу визначають шляхом окиснення її киснем повітря в глюконову кислоту за допомогою глюкозооксидази. Продукти реакції визначають колоримет� ричними методами. Активність глюкоамілазних ензимів визначається в очищених і технічних препа� ратах, у культурах, одержаних з використан� ням продуцентів мікробного походження. Визначення ГлАк у зразках крові прово� дять при pH 3,8–4,0 за допомогою 2 мМ син� тетичного субстрату 4�метилумбеліферил�α� глюкозиду або глікогену (50 мг/мл) у присутності акарбози (39 мМ), яку вико� ристовують для інактивації ізоферменту мальтози — глюкоамілази [77]. Практичне застосування іммобілізованих ГА У другій половині ХХ ст. почали широко використовувати здатність до зв’язування окремих ензимів певними речовинами�но� сіями, що їх застосовували з метою очищен� ня цих ензимів, для створення іммобілізова� них ензиматичних систем. Іммобілізовані ензими відзначаються низкою переваг перед вільнорозчинними формами. По�перше, їх можна багаторазово використовувати, що значно здешевлює ензиматичні процеси в промислових технологіях і підвищує якість контролю за ензиматичними цикла� ми. По�друге, іммобілізація вибіркових мо� лекул ензимів на підібраних носіях дає змо� гу очищувати ензими [78]. По�третє, під час іммобілізації утворюються просторові кон� формації ензиму і субстрату, які забезпечу� ють кращий контакт між ними. По�четвер� те, беззаперечною перевагою використання іммобілізованих ензимів для індустріально� го використання є можливість іммобілізації кількох амілолітичних ензимів на одному носії. І, врешті�решт, іммобілізація стабілі� зує структуру ензимів [79]. Відомо, що тер� мостабільність ГА, іммобілізованої на по� ристому склі, збільшується в 15 разів (при 75 0С) у присутності субстрату (мальтоза, декстрини) [80]. Іммобілізація ензимів у присутності субстрату забезпечує його ви� соку ензиматичну активність завдяки пра� вильній орієнтації молекули ензиму на по� верхні носія. На основі ГА і вуглецевмісних носіїв одержано гетерогенні біокаталізатори про� цесу оцукрювання крохмалю і досліджено БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 18 їхні біокаталітичні властивості в реакції ен� зиматичного гідролізу кукурудзяних декст� ринів. Показано, що морфологія поверхне� вого вуглецевого шару носіїв справляє суттєвий вплив на властивості одержаних біокаталізаторів. ГА, іммобілізована адсорб� цією на поверхні носіїв із шаром каталітич� ного волокнистого або піролітичного вугле� цю, виявляла максимальну ензиматичну активність і стабільність, тимчасом як біо� каталізатори, виготовлені на основі носіїв без вуглецевого шару або з графітоподібним поверхневим вуглецем, відзначались низь� кою активністю і стабільністю [81]. Базуючись на експериментальних даних із дослідження властивостей отриманих біокаталізаторів вуглецевмісних носіїв з оп� тимальною морфологією вуглецю, можна вибудувати такий ряд: керамзит/ КВВ (ка� талітичний волокнистий вуглець) (20 Е/г) > піноскло/КВВ (60 Е/г) ≈ сапропель (50 Е/г) > γ�оксид алюмінію/КВВ, піровуглець (70–90 Е/г) ≈ масивний КВВ (80 Е/г) > си� буніт (90–100 Е/г). Носії, які не містять вуглецевого шару або із синтезованим графітоподібним шаром, як адсорбенти для іммобілізаціі ГА використовувати недоцільно. Одержані таким чином біокаталізатори мають високу біокаталітичну активність че� рез 1,5 року зберігання, лімітувальною ста� дією процесу гідролізу декстринів є зовнішня і внутрішня дифузія субстрату до іммобілі� зації на пористих носіях ензиму [82]. Іммобілізацію ГА на твердих носіях по� кладено в основу розроблення й упрова� дження в промисловому масштабі гетероген� ного (багатофазного) процесу оцукрювання крохмалю для виробництва цукристих речо� вин різного складу і призначення — крохма� левих паток і глюкозних сиропів. Для успішної комерціалізації цього процесу потрібно, щоб активність біокаталізатора за� безпечувала 45%�ну конверсію субстрату за 15–20 хв, а час напівактивації біокаталіза� тора становив 30–120 діб, що відповідало ро� боті реактора упродовж 312 місяців без пере� навантаження [83]. Для промисловості також бажано, щоб біокаталізатор мав висо� ку термостабільність при температурі пасте� ризації 60 0С і вище. Раніше Г. А. Коваленко зі співавт. [84] вивчили біокаталітичні влас� тивості ГА, іммобілізованої на макрострук� турованих вуглецевмісних керамічних носіях, які розрізняються за морфологією поверхневого вуглецевого шару. Автори з’ясували, що термостабільність ГА, іммобі� лізованої на алюмосилікатному сотовому моноліті, на поверхні якого було синтезова� но шар КВВ, підвищується майже в 20 разів порівняно з ензимом у розчині. Час напівак� тивації такого гетерогенного біокаталізато� ра при 65 0С у буферному розчині з рН 4,6 — 0,4 доби. У роботі [85] було показано, що в разі іммобілізації ГА у складі препарату глюко� аваморин на вуглецевому носії сибуніті де� які кінетичні характеристики ензиму, у то� му числі константа спорідненості ензиму до субстрату (декстрин зі ступенем полімери� зації n = 2124) і температурний оптимум ен� зиматичної реакції, практично не зміню� ються, водночас термостабільність ензиму значно підвищується порівняно з ензимом у розчині. Було виявлено, що на термо� стабільність іммобілізованого ензиму суттє� вий вплив має субстрат, причому зі збіль� шенням концентрації декстринів від 1 до 40% термостабільність іммобілізованої ГА ліній� но зростає. Показано, що термостабільність ензимсубстратного комплексу, виміряна в 53%�х розчинах декстринів, у 105 разів пе� ревищує термостабільність ензиму в розчині без субстрату. Операційна стабільність біо� каталізатора, створеного на основі іммобілі� зованого на сибуніті глюкоаваморину, є до� статньо високою, і час напівактивації в модельних технологічних умовах гідролі� зу декстринів у концентрації 32% при 60 0іС становить більше 250 год (30 робочих днів), що цілком відповідає вимогам до біока� талізаторів промислового призначення [86]. Зроблено успішну спробу ковалентно іммобілізувати ГА на целюлозному носії Granocel. Дослідники застосовували оп� тимізацію на основі заміни якірних груп та методів активації. Показано, що найбільш ефективним є зв’язування ензиму через глу� таральдегід на NH2�Granocel, який має вели� кий розмір пор та значну кількість функціо� нальних груп. Іммобілізований ензим був стабільним протягом часу зберігання та більш термостабільним [87]. Детальні дослідження структури гліко� зидаз дають конкретні практичні результа� ти при конструюванні нових форм ензимів для подальшого використання у промисло� вих технологіях. Можна виділити основні напрями удосконалення амілолітичних ен� зимів і ГА зокрема: зміни модульної струк� тури; збільшення каталітичної активності ензимів шляхом заміни окремих амінокис� лот; зміни характеру дії та субстратної специфічності ензимів; збільшення стабіль� ності ензиму. Об’єднання методів протеїно� вої інженерії з даними щодо структури та механізму дії ГА дозволяє поліпшити влас� Огляди 19 тивості ензимів природних штамів, а генна інженерія дає змогу одержувати ензими в потрібній кількості та без супутніх актив� ностей у разі використання рекомбінантних грибних та бактеріальних продуцентів. Таким чином, на цей час накопичено значний теоретичний і практичний матеріал щодо умов синтезу та одержання мікробних ГА, досліджено їхні властивості та встанов� лено структури деяких ензимів. Усе це доз� воляє поглибити знання про механізм дії амілолітичних ензимів, що у свою чергу значно розширює можливості практичного застосування цих ензимів у різних галузях народного господарства. ЛІТЕРАТУРА 1. Синицын А. П., Марков А. В., Семенова М. В. Микробные биокатализаторы и перспекти� вы развития ферментных технологий в пе� рерабатывающих отраслях АПК. — М., 2004. — С. 95. 2. Галич И. П. Амилазы микроорганизмов. — К.: Наук. думка, 1987. — 192 с. 3. Sinitsyn A. P., Gusakov A. V., Grishutin S. G. et al. Application of microassays for investiga� tion of cellulase abrasive activity and back� staining // J. Biotechnol. — 2001. — V. 89, N2–3. — P. 233–238. 4. Van der Maarel M., van der Veen B., Uitderhaag H. et al. Properties and applica� tions of starch–converting enzymes of the α� amylase family // Ibid. — 2002. — V. 94. — P. 137–155. 5. Crab W., Mitchinson C. Enzymes involved in the processing of starch to sugars // Trends Biotechnol. — 1997. — N15. — P. 349–352. 6. Emmanuel L., Stefan J., Bernard H., Abdel B. Thermophilic archaeal amylolytic enzymes // Enzyme and Microbiol. Technol. — 2000. — V. 26. — P. 3–14. 7. Anto H., Trivedi U. B., Patel K. C. Glucoamy� lase production by solid�state fermentation using rice flake manufacturing waste products as substrate // Bioresour Technol. — 2006. — V. 97, N10. — P. 1161–1166. 8. Fukuda T., Kato:Murai M., Kuroda K. et al. Improvement in enzymatic desizing of starched cotton cloth using yeast codisplaying glucoamylase and cellulose�binding domain // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2008. — V. 77, N6. — P. 1225–32. 9. Sivakumar R., Divakar S. Syntheses of N–vanil� lyl–nonanamide glycosides using amylo� glucosidase from Rhizopus and beta–glucosi� dase from sweet almond. // Biotechnol. Lett. — 2007. — V. 29, N10. — P. 1537–1548. 10. Sun B., Zhang H., Benjamin D. K. Jr. et al. Enhanced efficacy of an AAV vector enco� ding chimeric, highly secreted acid alpha� glucosidase in glycogen storage disease type II. // Mol. Ther. — 2006. — V. 14, N6. — P. 822–830. 11. Chien Y. H., Lee N. C , Peng S. F., Hwu W. L. Brain development in infantile–onset Pompe disease treated by enzyme replacement the� rapy // Pediatr Res. — 2006. — V. 60, N3. — P. 349–352. 12. Van der Beek N. A., Hagemans M. L., van der Ploeg A. T. et al. Pompe disease (glycogen storage disease type II): clinical features and enzyme replacement therapy. // Acta Neurol. Belg. — 2006. — V. 106, N2. — P. 82–86. 13. Pandey A., Nigam P., Soccol C.R. et al. Advances in microbial amylases // Biotechnol. Appl. Biochem. — 2000. — V. 31. — P. 135–152. 14. Frandsen T. P., Christensen T., Stoffer B. et al. Mutational analysis of the roles in cataly� sis and substrate recognition of arginines 54 and 305, aspartic acid 309 and trypto� phan 317 located at subsite 1 and 2 in glu� coamylase from Aspergillus niger // Biochemistry. — 1995. — V. 34, N32 — P. 10162–10169. 15. Fierobe H. P., Stoffer B. B., Frandsen T. P., Svensson B. Mutational modulation of sub� strate bond type specificity and thermosta� bility of glucoamylase from Aspergillus awamori by replacement with short homo� logue active site sequence and thiol disulfide engineering // Ibid. — 1996. — V. 35, N26. — P. 8696–8704. 16. Грачева И. М., Кривова А. Ю. Технология ферментних препаратов. — 3�е изд., пере� раб. и доп. — М.: Элевар, 2000. — 512 с. 17. Sauer J., Siguroskjold B. W., Christensen U. et al. Glucoamylase: structure/function rela� tionship and protein engineering // Biochim. Biophys. Acta. — 2000. —V. 1543. — P. 275–293. 18. Aleshin A., Golubev A., Firsov L., Honzatko R. Crystal structure of glucoamylase from Aspergillus awamori var. X100 to 2.2– resolution. // J. Biol. Chem. — 1992. — V. 267, N27. — P. 19291–19298. 19. Harris E., Aleshin A., Firsov L., Honzatko R. Refined structure for the complex of 1–deoxynojirimycin with glucoamylase from Aspergillus awamori var. X 100 to 2,4 angstrom resolution // Biochemistry. — 1993. — V. 32. — P. 1618–1825. o A БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 20 20. Aleshin A., Hoffman C., Firsov L., Honzatko R. B. Refined crystal structures of glucoamy� lase from Aspergillus awamori var. X100. // J. Mol. Biol. — 1994. — V. 238, N4. — P. 575–591. 21. Stoffer B., Frandsen T., Svensson B., Gajhede M. X–ray structure of an active site mutant glucoamylase, Tyr48CTrp, from Aspergillus niger. // The Carbohydrate Bioengineering Meeting. — Elsinore, Denmark, 1995, Abstracts. — P. 16. 22. Sevcik J., Solovicova A., Hostinova E. et al. Structure of glucoamylase from Saccharo� mycopsis fibuligera at 1.7 AA resolution // Acta Crystallogr. — 1998. — V. 54. — P. 854–866. 23. Jaffar M. B., Bharat R. P., Norouzian D. et al. Production of glucoamylase by nematoph� agus fungi Arthrobotrys species // Ind. J. Exp. Biol. — 1993. — V. 31 — P. 87–89. 24. Norouzian D., Jaffar M. B. Іmmobilization of glucoamylase produced by fungus Arthrobotrys amerospor // Ibid. — 1993. — V. 31 — P. 680–681. 25. Frandsen T. P., Fierobe H. P., Svensson B. / Ed. Alberghin L. — Engineering specificity and stability in glucoamylase from Asper: gillus niger in protein engineering in indus� trial biotechnology. — Amsterdam: Harwood Academic, 1999. — Р. 189–206. 26. Reilly P. J. Protein engineering of glucoamy� lase to improve industrial properties; a review // Starch. — 1999. — V. 51. — P. 269–74. 27. Manjunath P., Shenoy B. C., Raghavendra Rao M. R. Fungal glucoamylases // J. Appl. Biochem. — 1983. — V. 5, N4–5. — Р. 235–260. 28. Outtrup H. Commercial Enzymes. A Micro� biologist role in industry: lecture held at the 15th International Congress of Genetics. — New Delhi, India, Dec.12–21, 1983. 29. Smiley K.–US Patent No.3301768, 1967. 30. Pandy A., Radhakrishna S. Packed bed co� lumn for production of enzymes // Enzyme Microb. Technol. — 1992. — V. 14. — P. 486–495. 31. Bo J., Hans J., Patel B. et al. Production of fungal protein and glucoamylase by Rhizopus oligosporus from starch processing waste water //Process. Biochem. — 1999. — V. 34. — P. 59–65. 32. Richard J. S., Atul K., Alison M. G. et al. The effect of organic nitrogen sources on recom� binant glucoamylase production by Aspergillus niger in chemostat culture // Fungal. Genet. Biol. — 2000. — V. 31. — P. 125–130. 33. Morita H., Matsunaga M., Mizuno K., Fujio Y. A comparison of raw strarch–digesting glu� coamylase production in liquid and solid cul� tures of Rhizopus strains // J. Gen and Appl. Microbiol. — 1998. — V. 44, N3. — P. 211–216. 34. Chiarello M. D., Soecol C. R., Stertz S. C. et al. Biodegradation of cassava crude starch gran� ules during solid state fermentation by Rhizopus glucoamylase // Arq. biol. tecnol. — 1997.–V. 40, N3.–P. 771–785. 35. Rajoka M., Yasmeen A. Induction and pro� duction studies of a novel glucoamylase of Aspergillus niger // World J. Microbiol. and Biotechnol. — 2005. — V. 21, N2. — P. 179–187. 36. Shigechi H., Koh J., Fujita Y. et al. Direct production of ethanol from raw com starch via fermentation by use of a novel surface engineered yeast strain codisplaying gly� coamylase and α�amylase // Appl. and Environ Microbiol. — 2004. — V. 70, N8. — P. 5037–5040. 37. Bhatti H. H., Rashid M. H., Hawaz R. et al. Optimization of media for fermentation by Fusarium solani. // Food Technol. and Biotechnol. — 2007. — V.45, N1 — Р. 51–56. 38. Chavez R. A., Carvalho J. C. M., Converti A. et al. Production of α�amylase and glucoamy� lase from different starches by a new Trichoderma sp. isolate // Appl. Micro� biol. — 2004. — V. 54, N2. — Р. 169–180. 39. Chavez R. A., Carvalho J. C. M., Converti A. et al. Infuence of the nitrogen source on the production of α�amylase and glucoamylase by a new Trichoderma sp. from soluble starch //Chem. and Biochem. Eng. Quart. — 2004. — V.18, N4. — P. 403–407. 40. Kumar S., Kumar P., Satyanarayana T. Production of raw starch–saccharifying thermostable and neutral glucoamylase by the thermophilic mold Thermomucor indi: cae–seudaticae in submerged fermentation. // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2007. — V. 142, N3. — P. 221–230. 41. Kumar P., Satyanarayana T. Economical glucoamylase production by alginate–immo� bilized Thermomucor indicae–seudaticae in cane molasses medium. // Lett. Appl. Micro� biol. — 2007. — V. 45, N4. — P. 392–397. 42. Bertolin T. E., Schmidell W., Maiorano A. E. et al. Influence of carbon, nitrogen and рhos� phorous sources on glucoamylase production by Aspergillus awamori in solid state fer� mentation // Z. Naturforsch [C]. — 2003. — V. 58, N9–10. — P. 708–712. 43. Zhu J. C., Wang X. J., Zhang G. et al. Glucoamylase enhancement regulated by blue light in Aspergillus niger // Wei Sheng Wu Xue Bao. — 2006. — V. 46, N5. — P. 734–739. 44. Svensson B., Larsen K., Gunnarsson A. Characterization of glucoamylase G2 from Aspergillus niger // Eur. J. Biochem. — 1986. — V. 154. — P. 497–502. Огляди 21 45. Ковалева Т. А. О механизме действия и строении активного центра глюкоамила� зы // Вестник ВГУ. Серия химия, биоло� гия. — 2000. — С. 104–107. 46. Kaneko A., Sudo S. Molecular cloning and determination of nucleotide sequence of a gene encoding an acid stable α–amylase from Aspergillus kawachi // Ferment. Bioeng. — 1996. — V. 81. — P. 292–298. 47. Neustroev K. N., Valter S. N., Timchenko M. V. et al. Adsorption of glucoamylase from Aspergillus awamori X–100/D27 on cell wall // Biochem. Mol. Biol. Int. — 1993. — V. 30. — P .115–120. 48. Cutinho M. P., Reilly P. J. Glucoamylase: structural, functional and evolutionary rela� tionship// Proteins. — 1997. — V. 29. — P. 334–347. 49. Liu F., Li W., Ridgway D. et al. Inhibition of extracellular protease secretion by Aspergillus niger using immobilization // Biotechnol. Lett. — 1998. — V. 29, N6. — P. 536–542. 50. Gregg L. F. W., Richard J. S., Robert A. et al. The effect of pH on glucoamylase production glycosylation and chemostat evolution of Aspergillus niger // Biochim. Biophys. Acta. — 2001. — V. 1527. — P. 112–22. 51. Pedersen H., Beyer M., Nielson J. Gluco� amylase production in batch, chemostat and fed batch cultivation by an industrial strain of Aspergillus niger // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2000. — V. 53. — P. 272–277. 52. Xu J., Wang L., Ridgway D., Gu T. et al. Increased heterologous protein production in Aspergillus niger fermentation through extracellular protease inhibition by pelleted growth. // Biotechnol. Prog. — 2000. — V. 16. — P. 222–227. 53. Dock C., Hess M., Antranikian G. A. Thermo� active glucoamylase with biotechnological relevance from the thermoacidophilic Eury� archaeon Thermoplasma acidophilum // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2008. — V. 78, N1. — P. 105–514. 54. Chen J., Zhang Y.Q., Zhao C.Q. et al. Cloning of a gene encoding thermostable glucoamy� lase from Chaetomium thermophilum and its expression in Pichia pastoris // J. Appl. Micro� biol. — 2007. — V.103, N6. — P. 2277–2284. 55. Michelin M., Ruller R., Ward R. J. et al. Purification and biochemical characterization of a thermostable extracellular glucoamylase produced by the thermotolerant fungus Paecilomyces variotii //J. Ind. Microbiol. Biotechnol. — 2008. — V. 35, N1. — P. 17–25. 56. Tachibana S., Yasuda M. Purification and characterization of heterogeneous glucoamy� lases from Monascus purpureus // Biosci. Biotechnol. Biochem. — 2007. — V. 71, N10. — P. 2573–2576. 57. Feng B., Hu W. et al. Purification, charac� terization, and substrate specificity of a glu� coamylase with steroidal saponin–rhamnosi� dase activity from Curvularia lunata // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2007. — V. 76, N6. — P. 1329–1338. 58. Thorsen T. S., Johnsen A. H., Josefsen K., Jensen B. Identification and characterization of glucoamylase from the fungus Thermo� myces lanuginosus // Biochim. Biophys. Acta. — 2006. — V. 1764, N4. — P. 671–676. 59. Suresh C., Dubey A. K., Srikanta S., Kumar U. S. Characterization of starch hydrolyzing enzyme of Aspergillus niger // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 1999. — V. 51. — P. 673–675. 60. Ueda S. Fungal glucoamylase and raw starch digestion // TIBS Mar. — 1981. — P. 89–90. 61. Spinelli B. B. L., Lourdes M., Polizeli T. M. et al. Biochemical characterization of glu� coamylase from the hyper producer exo–1 mutant strain of Neurospora crassa // FEMS Microbiol. Lett. — 1996. — V. 138. — P. 173–177. 62. Le Gal:Gоefer, Jack M. F., Sorimachi A. J. et al. Expression Aspergillus niger of the starch binding domain of glucoamylase, Comparison with the proteolitically produced starch binding domain // Eur. J. Biochem. — 1995. — V. 233. — P. 561–567. 63. Ковалева Т. А., Селеменев В. Ф., Гречкина В. Р. Некоторые свойства глюкоамилазы // Тру� ды ІІІ Всесоюз. межуниверситет. конфе� ренции по физ.�хим. биологии. — Тбили� си, 1982. — С. 240–241. 64. Ковалева Т. А., Селеменев В. Ф., Плохих А. М. Изучение некоторых свойств глюкоамилазы сорбционными и спектральными методами // Теория и практика сорбционных процессов. — Воронеж, 1985. — Вып. 17. — С. 58–61. 65. Ковалева Т. А., Башарина О. В., Селеменев В. Ф. Исследование структуры глюкоамилазы методом ИК спектроскопии // Тезисы док� ладов VІІ Всесоюз. конференции по спект� роскопии биополимеров. — Харьков, 1991. — С. 134–135. 66. Norouzian D., Rostami K., Nouri I. D., Saleh M. Subsite mapping of purified glucoamylases I, II, III produced by Arthrobotrys amerospora ATCC 34468 // World J. Microbiol. Biotechnol. — 2000. — V. 16. — P. 155–161. 67. Ono K., Shintani K., Shikata S. Competitive studies of various molecular species in Aspergillus niger glucoamylase // Agric. Biol. Chem. — 1988. — V. 52, N7. — P. 1699–1706. 68. Venkatatramu K., Manjunath P., Rao M. R. R. Glucoamylase of Aspergillus niger NRRL 330 // Ind. J. Biochem. Biophys. — 1975. — N12. — P 107–114. 69. Fagerstom R., Kalkkinen N. Characteriza� tion, subsite mapping and partial amino acid БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 22 sequence of glucoamylase from the filamen� tous fungus Trichoderma reesei // Biotechnol. Appl. Biochem. — 1995. — V. 21, Pt. 2. — P. 223–231. 70. Aquino A. C., Jorge J. A., Terenzi H. F., Polizeli M. L. Thermostable glucose�tolerant glucoamylase produced by the thermophilic fungus Scytalidium thermophilium // Folia Microbiol. (Praha). — 2001. — V. 46, N1. — P. 11–16. 71. Okolo B. N., Ire F. S., Ezeogu L. I. et al. Purification and some properties of a novel raw starch–digesting amylase from Aspergillus carbonarius // J. Sci. Food. Agric. — 2001. — V. 81, N3. — P. 329–336. 72. Hiromi K., Nitta Y., Ono S. Subsite affinities of glucoamylase:examination of the validity of the subsite theory // Biochim. Biophys. Acta. — 1973. — V. 362. — P. 362–375. 73. Meagher M. M., Nikolov Z. I., Reilly P. J. Sub� site mapping of Aspergillus niger glucoamy� lases I and II with maltooligosaccharides // Biotechnol. Bioeng. — 1989. — V. 34 — P. 681–688. 74. Kazuhisa O., Sieko S., Satoru O. Effective purification of glucoamylase in koji, a solid culture of Aspergillus oryzae on steamed rice by affinity chromatography using an immo� bilized acarbose (BAYg–5421) // Agric. Biol. Chem. — 1988. — V. 52. — P. 1707–1714. 75. Christensen T., Stoffer B. B., Svensson B., Christensen U. Some details of the reaction mechanism of glucoamylase from Aspergillus niger. Kinetics and structural studies on Trp52YPhe and Trp317Yphe mutant // Eur. J. Biochem. — 1997. — V. 250, N3. — P. 638–645. 76. Попов Е. М. Структурно�функциональная организация белков.–М.: Наука, 1992. — 358 с. 77. Winchester B., Bali D., Bodamer O. A. et al. Methods for a prompt and reliable laboratory diagnosis of Pompe disease: Report from an international consensus meeting // Mol. Genet. Metab. — 2008. — V. 93, N3. — P. 275–281. 78. Cao L. Immobilized enzymes: science or art? // Curr. Opin. Chem. Biol. — 2005. — N9. — P. 217–226. 79. Roy I., Gupta M. N. Hydrolysis of starch by a mixture of glucoamylases and pullulanase entrapped in calcium alginate beads // Enzyme and Microbiol. Technol. — 2004. — V. 34. — P. 26–32. 80. Введение в прикладную энзимологию/ Ред. И. В. Березин, В. К. Антонов, К. Мар� тинек.– М.: Изд–во МГУ, 1982. — 383 с. 81. Коваленко Г. А., Перминова Л. В., Плак: син Г. В. и др. Иммобилизованая глюкоами� лаза — биокатализатор процесса гидроли� за декстринов // Прикл. биохим. и микробиол. — 2006. — Т. 42, №2. — С. 163–158. 82. Перминова Л. В., Коваленко Г. А., Чуен: ко Т. В. и др. Иммобилизованная глюкоа� милаза — гетерогенный биокатализатор гидролиза декстринов // 3�й Моск. между� нар. конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». — М., 2005. — С. 205. 83. Daniels M. J. Process Eng. Aspects Immobi� lized Cell Systems, 1986. — Р. 218–224. 84. Коваленко Г. А., Комова О. В., Симаков А. В. и др. Углеродосодержащие макрострукту� рированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов. 2. Биокаталитические свойства адсорбированной глюкоамилазы // Биотехнология. — 2002. — №5. — С. 81–93. 85. Коваленко Г. А., Перминова Л. В., Теренть: ева Т. Г., Плаксин Г. В. Каталитические свойства глюкоамилазы, иммобилизова� ной на углеводном носителе сибуните // Прикл. биохим. и микробиол. — 2007. — Т. 43, №4. — С. 412–418. 86. Коваленко Г. А., Комарова О. В., Боровцо: ва О. Ю., Рудина Н. А. Биокаталитические свойства адсорбированной глюкоамилазы // Биотехнология. — 2002. — №5. — С. 81–93. 87. Bryjak J., Aniulyte J., Liesiene J. Evaluation of man–tailored cellulose–based carriers in glucoamylase immobilization // Carbohydr. Res. — 2007. — V. 342, N8. — P. 1105–1109. Огляди 23 ГЛЮКОАМИЛАЗА МИКРООРГАНИЗМОВ. БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ Н. В. Борзова, О. В. Гудзенко, Л. Д. Варбанец Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев Е:mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua В обзоре представлены данные по система� тическому положению глюкоамилаз в совре� менной классификации. Изложены современ� ные взгляды на регуляцию биосинтеза микробных глюкоамилаз, освещены вопросы, касающиеся структуры и функций отдельных доменов молекулы энзима, их взаимосвязи и роли в катализе. Детально описаны физико� химические свойства глюкоамилаз грибного происхождения, показана возможность эффек� тивной иммобилизации энзимов на различных носителях с целью использования последних в различных технологических процессах. Ключевые слова: глюкоамилаза, биосинтез, строе� ние активного центра, механизм действия, свойства энзима, иммо� билизация глюкоамилаз, практи� ческое использование. GLUCOAMYLASE OF MICROORGANISMS. BIOSYNTHESIS, PROPERTIES, MECHANISM OF ACTION AND APPLICATION N. V. Borzova, O. V. Gudzenko, L. D. Varbanets Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv E:mail:varbanets@serv.imv.kiev.ua Data on regular position of glucoamylase in modern classification are given in the review. Current views on regulation of microbial glu� coamylases biosynthesis are stated, the issues concerning structure and functions of individual domains of enzyme molecule, their interrelation and role in catalysis are discussed. Physical and chemical properties of fungal glucoamylases are detailed. Possibility of effective immobilization of enzymes on various carriers with the purpose of their using in various technological processes was shown. Key words: glucoamylase, biosynthesis, active centre structure, mechanism of action, enzyme properties, glucoamylase immobilization, practical use.

Глюкоамілаза мікроорганізмів. Біосинтез, властивості, механізм дії та практичне застосування

Репозитарії

Схожі ресурси