Оптимізація методики визначення вмісту глюкози у виноматеріалі ензимним амперометричним біосенсором

Відпрацьовано методику визначення вмісту глюкози у вині за допомогою амперометричного біосенсора на основі платинового друкованого електрода SensLab та глюкозооксидази (ГОД). Досліджено селективність біосенсорів, розроблених із застосуванням двох різних методів іммобілізації ГОД. Показано, що датчик...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2009
Hauptverfasser:	Горюшкіна, Т.Б., Остроухова, О.В., Солдаткін, О.П., Дзядевич, С.В.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України 2009
Schriftenreihe:	Біотехнологія
Schlagworte:	Методи
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/28177
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Оптимізація методики визначення вмісту глюкози у виноматеріалі ензимним амперометричним біосенсором / Т.Б. Горюшкіна, О.В. Остроухова, О.П. Солдаткін, С.В. Дзядевич // Біотехнологія. — 2009. — Т. 2, № 1. — С. 88-98. — Бібліогр.: 24 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-28177
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-281772011-11-01T12:14:24Z Оптимізація методики визначення вмісту глюкози у виноматеріалі ензимним амперометричним біосенсором Горюшкіна, Т.Б. Остроухова, О.В. Солдаткін, О.П. Дзядевич, С.В. Методи Відпрацьовано методику визначення вмісту глюкози у вині за допомогою амперометричного біосенсора на основі платинового друкованого електрода SensLab та глюкозооксидази (ГОД). Досліджено селективність біосенсорів, розроблених із застосуванням двох різних методів іммобілізації ГОД. Показано, що датчик на основі ГОД, іммобілізованої у парах глутарового альдегіду (ГА), не дає відгуку на основні інтерферуючі речовини вина, на відміну від біосенсора з ГОД, іммобілізованою у полімері полі-(3,4-етилендіокситіофен) (ПЕДТ). Вивчено операційну стабільність створеного датчика на основі іммобілізованої у парах ГА ГОД та його стабільність під час зберігання. За допомогою розробленого біосенсора проведено аналіз концентрації глюкози у винах різного типу та в суслі. Показано високу кореляцію отриманих результатів із даними високоефективної рідинної хроматографії. Встановлено, що біосенсор з іммобілізованою у полімері ПЕДТ ГОД має надзвичайно широкий динамічний діапазон роботи і може бути успішно застосований для аналізу глюкози в середовищах, які не містять етанолу та гліцеролу, наприклад у крові. Отработана методика определения глюкозы в вине с помощью амперометрического биосенсора на основе платинового печатного электрода SensLab и глюкозооксидазы (ГОД). Исследована селективность биосенсоров, разработанных с применением двух разных методов иммобилизации ГОД. Показано, что датчик на основе ГОД, иммобилизованной в парах глутарового альдегида (ГА), не дает отклика на основные интерферирующие вещества вина, в отличие от биосенсора с ГОД, иммобилизованной в полимере поли-(3,4-этилендиокситиофен) (ПЭДТ). Изучены операционная стабильность созданного датчика на основе иммобилизованной в парах ГА ГОД и его стабильность при хранении. С помощью разработанного биосенсора проведен анализ концентрации глюкозы в винах разного типа и в сусле. Показана высокая корреляция полученных результатов с данными высокоэффективной жидкостной хроматографии. Установлено, что биосенсор с иммобилизованной в полимере ПЭДТ ГОД обладает чрезвычайно широким динамическим диапазоном работы и может быть успешно применен для анализа глюкозы в средах, не содержащих этанол и глицерол, например в крови. Отработана методика определения глюкозы в вине с помощью амперометрического биосенсора на основе платинового печатного электрода SensLab и глюкозооксидазы (ГОД). Исследована селективность биосенсоров, разработанных с применением двух разных методов иммобилизации ГОД. Показано, что датчик на основе ГОД, иммобилизованной в парах глутарового альдегида (ГА), не дает отклика на основные интерферирующие вещества вина, в отличие от биосенсора с ГОД, иммобилизованной в полимере поли-(3,4-этилендиокситиофен) (ПЭДТ). Изучены операционная стабильность созданного датчика на основе иммобилизованной в парах ГА ГОД и его стабильность при хранении. С помощью разработанного биосенсора проведен анализ концентрации глюкозы в винах разного типа и в сусле. Показана высокая корреляция полученных результатов с данными высокоэффективной жидкостной хроматографии. Установлено, что биосенсор с иммобилизованной в полимере ПЭДТ ГОД обладает чрезвычайно широким динамическим диапазоном работы и может быть успешно применен для анализа глюкозы в средах, не содержащих этанол и глицерол, например в крови. 2009 Article Оптимізація методики визначення вмісту глюкози у виноматеріалі ензимним амперометричним біосенсором / Т.Б. Горюшкіна, О.В. Остроухова, О.П. Солдаткін, С.В. Дзядевич // Біотехнологія. — 2009. — Т. 2, № 1. — С. 88-98. — Бібліогр.: 24 назв. — укр. 1995-5537 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/28177 577.15:573.6 uk Біотехнологія Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Методи Методи
spellingShingle	Методи Методи Горюшкіна, Т.Б. Остроухова, О.В. Солдаткін, О.П. Дзядевич, С.В. Оптимізація методики визначення вмісту глюкози у виноматеріалі ензимним амперометричним біосенсором Біотехнологія
description	Відпрацьовано методику визначення вмісту глюкози у вині за допомогою амперометричного біосенсора на основі платинового друкованого електрода SensLab та глюкозооксидази (ГОД). Досліджено селективність біосенсорів, розроблених із застосуванням двох різних методів іммобілізації ГОД. Показано, що датчик на основі ГОД, іммобілізованої у парах глутарового альдегіду (ГА), не дає відгуку на основні інтерферуючі речовини вина, на відміну від біосенсора з ГОД, іммобілізованою у полімері полі-(3,4-етилендіокситіофен) (ПЕДТ). Вивчено операційну стабільність створеного датчика на основі іммобілізованої у парах ГА ГОД та його стабільність під час зберігання. За допомогою розробленого біосенсора проведено аналіз концентрації глюкози у винах різного типу та в суслі. Показано високу кореляцію отриманих результатів із даними високоефективної рідинної хроматографії. Встановлено, що біосенсор з іммобілізованою у полімері ПЕДТ ГОД має надзвичайно широкий динамічний діапазон роботи і може бути успішно застосований для аналізу глюкози в середовищах, які не містять етанолу та гліцеролу, наприклад у крові.
format	Article
author	Горюшкіна, Т.Б. Остроухова, О.В. Солдаткін, О.П. Дзядевич, С.В.
author_facet	Горюшкіна, Т.Б. Остроухова, О.В. Солдаткін, О.П. Дзядевич, С.В.
author_sort	Горюшкіна, Т.Б.
title	Оптимізація методики визначення вмісту глюкози у виноматеріалі ензимним амперометричним біосенсором
title_short	Оптимізація методики визначення вмісту глюкози у виноматеріалі ензимним амперометричним біосенсором
title_full	Оптимізація методики визначення вмісту глюкози у виноматеріалі ензимним амперометричним біосенсором
title_fullStr	Оптимізація методики визначення вмісту глюкози у виноматеріалі ензимним амперометричним біосенсором
title_full_unstemmed	Оптимізація методики визначення вмісту глюкози у виноматеріалі ензимним амперометричним біосенсором
title_sort	оптимізація методики визначення вмісту глюкози у виноматеріалі ензимним амперометричним біосенсором
publisher	Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
publishDate	2009
topic_facet	Методи
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/28177
citation_txt	Оптимізація методики визначення вмісту глюкози у виноматеріалі ензимним амперометричним біосенсором / Т.Б. Горюшкіна, О.В. Остроухова, О.П. Солдаткін, С.В. Дзядевич // Біотехнологія. — 2009. — Т. 2, № 1. — С. 88-98. — Бібліогр.: 24 назв. — укр.
series	Біотехнологія
work_keys_str_mv	AT gorûškínatb optimízacíâmetodikiviznačennâvmístuglûkoziuvinomateríalíenzimnimamperometričnimbíosensorom AT ostrouhovaov optimízacíâmetodikiviznačennâvmístuglûkoziuvinomateríalíenzimnimamperometričnimbíosensorom AT soldatkínop optimízacíâmetodikiviznačennâvmístuglûkoziuvinomateríalíenzimnimamperometričnimbíosensorom AT dzâdevičsv optimízacíâmetodikiviznačennâvmístuglûkoziuvinomateríalíenzimnimamperometričnimbíosensorom
first_indexed	2025-07-03T08:11:22Z
last_indexed	2025-07-03T08:11:22Z
_version_	1836612617840361472
fulltext	88 Глюкоза — один із головних тваринних і рослинних вуглеводів. Її кількісне визна� чення є необхідним у біохімії, клінічній хімії та харчовій промисловості [1]. Особливе практичне значення має аналіз глюкози у виноробстві, адже глюкоза є дже� релом вуглецю для дріжджів, які здійсню� ють ферментацію виноматеріалу, та субстра� том, що лімітує їх ріст [2, 3]. До того ж моніторинг вмісту глюкози у суслі (бажано разом з іншими ключовими компонентами) дозволяє контролювати процес бродіння та, в разі потреби, оперативно регулювати його, запобігаючи тим самим значним економіч� ним витратам [4]. Моносахариди також відіграють важливу роль у формуванні орга� нолептичних якостей вина, пом’якшують і збагачують його смак, а вступаючи у реак� ції меланоїдоутворення, поліпшують аромат та колір вин типу мадери, портвейну, марса� ли. Окрім того, вуглеводи є джерелом утво� рення діоксиду вуглецю у процесі виробни� цтва ігристих вин [5]. Існує низка традиційних методів кіль� кісного аналізу глюкози у вині — газова та високоефективна рідинна хроматографія, спектрофотометрія, рефрактометрія, ензи� матичний аналіз, ЯМР� та мас�спектрос� копія, капілярний електрофорез [3, 6]. Про� те аналітична процедура із застосуванням більшості з перерахованих методів є довго� тривалою, трудомісткою, затратною і часто потребує значної кількості хімічних реак� тивів, деякі з яких є небезпечними для нав� колишнього середовища [3]. Окрім цього, застосування класичних методів для аналізу глюкози у вині інколи не забезпечує повної достовірності результатів [7]. Дедалі зростаюча потреба у кількісному визначенні глюкози зумовлює необхідність в більш швидкому, зручному та дешевому методі детекції такої сполуки, який можна було б упровадити безпосередньо у процес винного виробництва. Проведені останнім часом дослідження свідчать, що ефектив� ним альтернативним методом аналізу глю� кози у вині може стати застосування амперо� метричного біосенсора, який уможливлює високу селективність і чутливість визначен� ня та не потребує складного устаткування Ключові слова: амперометричний біосенсор, глюкоза, вино, сусло. Відпрацьовано методику визначення вмісту глюкози у вині за допомогою амперометричного біосенсора на основі платинового друкованого електрода SensLab та глюкозооксидази (ГОД). Досліджено селективність біосенсорів, розроблених із застосуванням двох різних методів іммобілізації ГОД. Показано, що датчик на ос� нові ГОД, іммобілізованої у парах глутарового альдегіду (ГА), не дає відгуку на основні інтерферуючі речовини вина, на відміну від біосенсора з ГОД, іммобілізованою у полімері полі�(3,4�етилендіокситіофен) (ПЕДТ). Вивче� но операційну стабільність створеного датчика на основі іммобілізованої у парах ГА ГОД та його стабільність під час зберігання. За допомогою розробленого біосенсора проведено аналіз концентрації глюкози у винах різного типу та в суслі. Показано високу кореляцію отриманих результатів із даними високоефективної рідинної хро� матографії. Встановлено, що біосенсор з іммобілізованою у полімері ПЕДТ ГОД має надзвичайно широкий ди� намічний діапазон роботи і може бути успішно застосований для аналізу глюкози в середовищах, які не містять етанолу та гліцеролу, наприклад у крові. Т. Б. Горюшкіна1, 2 1Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ О. В. Остроухова3 2Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ О. П. Солдаткін1 3Національний інститут винограду та вина «Магарач», Ялта С. В. Дзядевич 1 E:mail: tatiana_goryushkina@yahoo.com МЕТОДИ УДК 577.15:573.6 ОПТИМІЗАЦІЯ МЕТОДИКИ ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУОПТИМІЗАЦІЯ МЕТОДИКИ ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУ ГЛЮКОЗИ У ВИНОМАТЕРІАЛІ ГЛЮКОЗИ У ВИНОМАТЕРІАЛІ ЕНЗИМНИМЕНЗИМНИМ АМПЕРОМЕТРИЧНИМ БІОСЕНСОРОМАМПЕРОМЕТРИЧНИМ БІОСЕНСОРОМ 89 Методи і підготовки проби [8]. Окрім того, відгук амперометричних біосенсорів не залежить від буферної ємності та іонної сили розчину, в якому здійснюється вимірювання, а це, безперечно, є великою перевагою при прове� денні аналізів реальних зразків [7]. Амперометричні біосенсори, призначені для аналізів глюкози, найчастіше розробля� ють на основі трьох ензимів — НАД+�залеж� ної глюкозодегідрогенази (НАД+�ГД) [9], піролохінолін хінонзалежної глюкозо� дегідрогенази (ПХХ�ГД) [2, 10–12] або глю� козооксидази (ГОД) [1, 7, 13–20]. При цьому у біосенсорів з іммобілізованою НАД+�ГД є суттєвий недолік: вони потребують наяв� ності екзогенного кофактора НАД+, а часто ще й медіатора, що ускладнює аналітичну процедуру, зменшує стабільність датчиків та підвищує витрати на їх використання [2]. На відміну від НАД+�ГД, ПХХ�ГД має у своєму складі кофактор піролохінолін хінон [2, 12], однак через його слабкий зв’язок з апоензимом біосенсори на основі цього ензиму також, як правило, не виявля� ють високої стабільності та придатні лише для одноразового використання [11, 12]. Застосування ГОД для розроблення глюкоз� ного біосенсора видається більш перспек� тивним, оскільки цей ензим має у своєму складі сильнозв’язаний природний кофак� тор (ФAД) та виявляє високу стабільність після іммобілізації у біоселективну мембра� ну [18, 19]. Створені із застосуванням НАД+� та ПХХ�залежних глюкозодегідрогеназ біосен� сори здатні детектувати від 9–10 мкМ глю� кози [2, 9, 12]. Межа визначення біосенсорів на основі ГОД є дещо вищою — 30–60 мкМ [7, 13, 14, 17, 19], і лише для описаного у ро� боті [15] датчика вона становила 4,4 мкМ. Верхня межа лінійного діапазону для біо� сенсорів з іммобілізованою ГД становить 0,8 мМ [2, 9], з ГОД — 1,5 [17], 3 [13], 8 [7] і навіть 25 мМ [16]. Датчики з іммобілізованою ГОД — висо� костабільні, вони виявляють 100% актив� ності через місяць [13, 16] та до 95% через 8 місяців зберігання [19]. Стабільність біосенсорів, створених на основі дегідроге� наз, є значно нижчою — 80% від початково� го сигналу через місяць зберігання для ПХХ�ГД [2] та 30% через 2 тижні для НАД+� ГД [9]. Операційна стабільність біосенсорів з іммобілізованою ГОД також є вищою — 100% активності через 120 год безперервної роботи [16], тимчасом як датчик з ПХХ�ГД після 20 год вимірювань зберігає 60% від по� чаткового відгуку [2]. Наведені дані свідчать про перспектив� ність розроблення глюкозного біосенсора са� ме на основі глюкозооксидази, однак його використання для контролю якості вина мо� же супроводжуватися низкою складнощів під час проведення аналізу. Передусім це пов’язано з наявністю у вині цілого спектра різноманітних речовин, що можуть вплива� ти на відгук біосенсора і спричинювати ви� никнення похибок, а іноді й унеможливлю� вати застосування біосенсорів у виноробстві. До таких інтерферуючих речовин належить, зокрема, аскорбінова кислота, яка міститься у вині та суслі у значній кількості й у проце� сі аналізу призводить до появи неспецифіч� ного сигналу, ускладнюючи інтерпретацію результатів [7]. Електрохімічно активні фе� нольні компоненти, на які особливо багаті червоні вина, також можуть істотно вплива� ти на роботу амперометричного біосенсора [18], особливо вони перешкоджають аналізу сухих вин з незначним вмістом глюкози — менше 1 г/л [20]. Наприклад, у роботі [7] повідомляється, що біосенсор на основі іммобілізованої у парах глутарового аль� дегіду (ГА) ГОД та вуглецевого електрода дає відгук близько 200 нА на внесення в електрохімічну комірку 0,25 мМ аскорбі� нової кислоти. Нанесення додаткової нафіо� нової мембрани дозволило знизити цей не� специфічний сигнал майже у 10 разів. У ще одному дослідженні [1] встановле� но, що біосенсор з іммобілізованою у парах ГА ГОД дає незначний відгук на етанол та лимонну кислоту. Проте істотний відгук спостерігався у цьому разі на внесення в електрохімічну комірку 10 мМ аскорбіно� вої кислоти або 20 мМ фруктози — він був еквівалентним відгуку на 0,138 мМ глюко� зи. Іншою групою дослідників [19] встанов� лено, що іммобілізована у парах ГА ГОД не реагує на етанол та фруктозу, проте на вне� сення 10 мМ аскорбінової кислоти дає від� гук, рівний відгукові на 0,36 мМ глюкози. Дослідження селективності біосенсора на основі іммобілізованої ПХХ�ГД показало, що він не реагує на внесення в електрохіміч� ну комірку етанолу та гліцеролу [2]. Аналіз впливу інших інтерферуючих речовин на ро� боту створеного глюкозного біосенсора не проводився. Таким чином, залежність роботи глюкоз� них датчиків від інтерферуючих речовин ускладнює, а іноді й унеможливлює визна� чення за їх допомогою вмісту глюкози у реаль� них зразках виноматеріалів. Тому в разі ви� користання глюкозних біосенсорів для аналізу вина та виноматеріалів їхня селективність БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 90 має бути поліпшена, а неспецифічний відгук — мінімізований. Метою даної роботи була оптимізація ме� тодики визначення глюкози амперометрич� ним біосенсором на основі іммобілізованої глюкозооксидази та платинового друковано� го електрода SensLab для проведення її аналізу у винах та виноматеріалах. Матеріали і методи У роботі використовували ензим глюко� зооксидазу з Penicillium vitale виробництва фірми КНПО «Діагностикум» (Львів, Ук� раїна) з активністю 130 од. акт./мг. Для електрохімічної полімеризації ензи� му застосовували мономер 3,4�етилендіок� ситіофен (ЕДТ) виробництва фірми Baytron M (Німеччина) та полі(етиленгліколь) 1450 фірми Sigma (Швейцарія). Для іммобілізації ензиму використовували бичачий сироват� ковий альбумін (БСА) виробництва фірми Sigma�Aldrich Chimie S.a.r.l. (Франція) та глутаровий альдегід виробництва фірми Fluka (Швейцарія). Також у роботі застосовували реагенти Na2HPO4·7H2O, KH2PO4, глюкозу та L�ас� корбінову кислоту виробництва фірми Sigma�Aldrich Chimie S.a.r.l. (Франція), пе� роксид водню виробництва фірми «Фарго� мед» (Україна), лактат натрію виробництва фірми Sigma (США), етанол виробництва фірми Fluka (Німеччина) і гліцерол вироб� ництва України. Усі реактиви, як вітчизня� ного, так й імпортного виробництва були кваліфікації «ос. ч.» і «х. ч.». Вимірювання. Усі електрохімічні експе� рименти було виконано за допомогою тра� диційної триелектродної системи, в якій друкований електрод SensLab (SensLab GmbH, Leipzig, Німеччина) поєднав у собі всі три електроди: платиновий робочий, до� поміжний та електрод порівняння [21]. Платинові друковані електроди SensLab досліджували на відтворюваність та праце� здатність у діапазоні потенціалу від 0 до +600 мВ (швидкість розгортання потенціалу 20 мВ/с). Циклічну вольтамперометрію бу� ло виконано на потенціостаті PalmSens (Palm Instruments BV, Нідерланди). На рис. 1 наведено циклічну вольтамперогра� му, отриману на промисловому платиновому електроді SensLab у робочому буфері з дода� ванням 50 мкМ пероксиду водню. Встановлено, що з додаванням у робочу комірку пероксиду водню спостерігається поява окиснювального струму та підвищен� ня сигналу датчика. Як компроміс між чут� ливістю біосенсора та зменшенням впливу на його відгук інтерферуючих частинок (які зазвичай окиснюються при більш високих потенціалах) потенціал +200 мВ було обрано нами як робочий. Амперометричне вимірювання за по� стійного потенціалу проводили в елект� рохімічній комірці об’ємом 5 мл за допомо� гою потенціостата PalmSens. Іммобілізація ГОД електрохімічною полімеризацією у полімері ЕДТ. Процес електрохімічної полімеризації становить особливий інтерес, тому що є технологічно зручним. Він дозволяє обирати й підтриму� вати розмір, форму і товщину матриці та за� безпечує чіткий контроль за процесом осад� ження ензиму і носія [22, 23]. Окрім того, одержані із застосуванням цього методу напівпроникні полімерні плівки можуть виступати селективним бар’єром для елект� рохімічно активних інтерферуючих части� нок, таких як аскорбінова кислота [16, 23]. Для електрохімічної полімеризації у ро� боті використовували суміш компонентів, приготованих у 20 мМ фосфатному буфері, рН 6,2, яка складалася з 10–2 М 3,4�ети� лендіокситіофену, 10–3 М поліетиленгліко� лю та 30 мг/мл розчину ГОД. Полімеризацію ЕДТ здійснювали, прик� ладаючи потенціал від +0,2 В до +1,5 В зі швидкістю 0,1 В/с протягом 15 циклів. Іммобілізація ГОД у парах глутарово? го альдегіду. Для утворення біоселективних мембран готували суміш, що містила 30 мг/мл ГОД та 5 мг/мл БСА в 10 мМ фос� фатному буфері, рН 7,2. У суміш додавали 1 Потенціал, В 2 С и л а ст р у м у , м к А Рис. 1. Циклічна вольтамперограма, отримана на промислових платинових друкованих електродах SensLab у фосфатному буфері (1) та з додаванням 50 мкМ пероксиду водню (2) 91 Методи гліцерол до кінцевої концентрації 10% для стабілізації іммобілізованого ензиму, а та� кож для запобігання передчасному висиханню суміші, нанесеної на поверхню перетворюва� ча. Для полімеризації мембран датчики вміщували в атмосферу насичених парів глутарового альдегіду на 10 хв, після чого підсушували на повітрі. Визначення вмісту глюкози у модель? них розчинах. Вимірювання проводили при кімнатній температурі у відкритому об’ємі за інтенсивного перемішування. Як робочий буфер використовували розчин 20 мМ KH2PO4 — Na2HPO4, рН 7,2, оскільки, як було встановлено [8, 19], саме такий рН є оп� тимальним для функціонування іммобілізо� ваної ГОД. Концентрацію субстратів змінювали, до� даючи певні аліквоти концентрованих роз� чинів. Після отримання кожного відгуку сенсор відмивали робочим буферним розчи� ном до стабілізації базового сигналу. Визначення вмісту глюкози у вині та в суслі. Аналіз глюкози проводили у 12 зраз� ках вин різного типу, а також у 2 зразках білих та червоних виноматеріалів, виробле� них в умовах мікровиноробства в Інституті винограду та вина «Магарач». Вимірювання вмісту глюкози у вині та в суслі за допомогою амперометричного біо� сенсора проводили у 20 мМ фосфатному буферному розчині, рН 7,2, при кімнатній температурі у відкритому об’ємі за інтенсив� ного перемішування. Визначення концент� рації глюкози здійснювали за допомогою ме� тоду стандартних додавань. Для проведення аналізу пробу розводили у 250–1 000 разів. Після отримання кожного відгуку сенсор відмивали буферним розчином до стабіліза� ції базового сигналу. Контрольне визначення глюкози у суслі та в готових винах проводили за допомогою методу високоефективної рідинної хрома� тографії (ВЕРХ) на хроматографі Agilent з використанням рефрактометричного де� тектора. Результати та обговорення Робота амперометричних біосенсорів на основі ГОД базується на такій ензиматичній реакції: ГОД Глюкоза + О2 ——→Глюконолактон + Н2О2. Процес ензиматичного перетворення глюкози супроводжується виділенням електрохімічно активної речовини — перок� сиду водню, що окиснюється з утворенням електронів, які реєструються амперомет� ричним перетворювачем: Н2О2 ——→О2 + 2Н+ + 2 e–. На перших етапах роботи для іммобіліза� ції ГОД застосовували метод електро� хімічної полімеризації у полімері ПЕДТ, що довів свою ефективність під час розроблення амперометричного біосенсора для визначен� ня лактату [24]. Калібрувальну криву ампе� рометричного біосенсора на основі іммобілі� зованої у ПЕДТ глюкозооксидази подано на рис. 2. Мінімальна концентрація глюкози, що визначається розробленим біосенсором, становить 0,04 мМ, діапазон визначення вмісту глюкози в межах 0,04 — 50 мМ. Такий діапазон роботи біосенсора вия� вився неочікуваним, оскільки він був знач� но ширшим за визначений для біосенсорів з іммобілізованою іншими методами ГОД, описаних у роботах [1, 7, 13, 14, 17]. Було зроблено припущення, що глюкоза може окиснюватись на електродах без викорис� тання ензиму. Для дослідження цього фено� мену на поверхню амперометричного пере� творювача замість ГОД було іммобілізовано бичачий сироватковий альбумін у ПЕДТ і отримано відгуки на внесення в елект� рохімічну комірку глюкози та інших основ� них компонентів вина (рис. 3,а). Як видно з рисунка, полімерна мембрана з ПЕДТ без ензиму дає відгуки на етанол та гліцерол, проте практично не реагує на глюкозу у ме� жах концентрацій, в яких реєструється Концентрація глюкози, мМ С и л а ст р у м у , н А Рис. 2. Калібрувальна крива амперометричного біосенсора на основі платинового друкованого електрода SensLab та іммобілізованої у ПЕДТ глюкозооксидази. Вимірювання проводили у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, потенціал +200 мВ відносно внутрішнього електрода порівняння БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 92 надзвичайно широкий динамічний діапазон роботи біосенсора з іммобілізованою ГОД. Окрім того, у роботі [24] було показано, що біосенсор на основі лактатоксидази, елект� рохімічно іммобілізованої на поверхню ам� перометричного електрода SensLab у ПЕДТ, також не давав сигналу на глюкозу. При цьо� му нами встановлено, що платиновий друко� ваний електрод SensLab сам по собі, без будь�якої ензимної мембрани, практично не дає відгуку на основні інтерферуючі речови� ни вина (рис. 3, б). Усе це свідчить про те, що такий нетипово широкий динамічний діапазон створеного датчика не є результа� том неспецифічного окиснення глюкози, а зумовлений конформаційними змінами глюкозооксидази під час електрохімічної іммобілізації в ПЕДТ. Варто також зазначи� ти, що у роботі [16], в якій ГОД було іммобілізовано на поверхню платинового електрода також шляхом електрохімічної полімеризації у полімері полі�(о�феніленді� амін), верхня межа динамічного діапазону визначення біосенсора теж була досить висо� кою — 25 мМ. Після одержання таких перспективних результатів біосенсор з іммобілізованою в ПЕДТ ГОД досліджували на селективність. Було отримано калібрувальні криві розроб� леного датчика за етанолом (у межах концен� трацій від 1 до 160 мМ), гліцеролом (0,05–51 мМ), лактатом (0,5–40 мМ) та аскорбіновою кислотою (0,001–0,5 мМ). З рис. 4 можна зробити висновок, що іммобілізована у ПЕДТ ГОД майже не реагує на лактат та аскорбінову кислоту, проте дає істотні відгу� ки на внесення в електрохімічну комірку гліцеролу та етанолу, причому величина сигналу біосенсора на етанол становить близько 50% від величини відгуку на екві� валентну концентрацію глюкози. Оскільки вміст етанолу у винах є великим (до 20% за об’ємом [3]), очевидно, що аналіз вина за до� помогою такого біосенсора супроводжувати� меться значною похибкою. Платиновий дру� кований електрод SensLab без ензимної мембрани, як видно з рис. 3, б, дає дуже малі неспецифічні відгуки на етанол та гліцерол (15 нА та 12 нА на додавання 100 мМ етанолу і гліцеролу відповідно). Тобто поява неспецифічного сигналу глю� козного біосенсора на етанол та гліцерол зу� мовлена реакцією останніх не з поверхнею голого електрода, а з електродом, модифіко� ваним ПЕДТ (рис. 3, а), і цей метод іммобі� лізації ГОД є непридатним у разі створення біосенсора для аналізу глюкози у вині. Тому з метою зниження неспецифічного сигналу глюкозного біосенсора нами було використа� но інший метод іммобілізації ГОД на поверх� ню платинового друкованого електрода SensLab, а саме — іммобілізацію в парах глутарового альдегіду в БСА мембрані. На рис. 5 наведено калібрувальну криву амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої у парах ГА глюкозооксида� зи. Мінімальна концентрація глюкози, що визначається, становить 0,04 мМ, як і у ви� падку електрохімічної полімеризації у ПЕДТ. Лінійний діапазон цього біосенсора є значно вужчим 0,04–2,5 мМ, що повністю узго� джується з попередніми роботами [1, 17], 1 5 4 3 2 Концентрація субстрату, мМ Концентрація аскорбінової кислоти, мМ С и л а ст р у м у , н А 1 5 4 3 2 Концентрація субстрату, мМ Концентрація аскорбінової кислоти, мМ С и л а ст р у м у , н А Рис. 3. Відгуки платинового друкованого електрода SensLab з іммобілізованим у ПЕДТ бичачим сироватковим альбуміном (а) та без ензимної мембрани (б) на внесення в електрохімічну комірку різних концентрацій: етанолу (1); гліцеролу (2); глюкози (3); лактату (4); аскорбінової кислоти (5). Вимірювання проводили у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, потенціал +200 мВ відносно внутрішнього електрода порівняння б а Методи 93 в яких показано, що обмеження за верх� ньою межею визначення глюкози (близько 2 мМ) пов’язано саме з браком у розчині кисню — косубстрату ензиматичної реакції. Аналіз селективності розробленого біо� сенсора показав, що іммобілізована у парах ГА ГОД зовсім не реагує на лактат та гліце� рол, дає мінімальний негативний сигнал на аскорбінову кислоту та незначний відгук на етанол у концентраціях понад 10 мМ (рис. 6). Таким чином, створений на основі ГОД, іммобілізованої у парах ГА, амперо� метричний біосенсор демонструє кращу, порівняно з біосенсором на основі ГОД у ПЕДТ, селективність, і його відгук на глю� козу значно перевищує величину неспе� цифічних сигналів на основні компоненти вина. З метою встановлення впливу на роботу створеного датчика інших компонентів вина (наприклад, фенольних сполук), нами було проведено такий дослід. До проби вина Ка� ра�Даг було додано препарат ГОД у кількості 1 мг і проведено інкубацію з ензимом для розщеплення глюкози (згідно з даними ВЕРХ, концентрація глюкози у цьому вині становить 83 г/л). Потім було отримано відгуки біосенсора на внесення 10 мкл цієї суміші, відібраної через певні проміжки ча� су після змішування проби та ензиму. Пока� зано, що вже через годину інкубації суміші величина відгуку біосенсора зменшилась у 2 рази, а через 24 год інкубації, коли глю� козу було повністю розщеплено ензимом, біосенсор не реагує на внесення проби вина в електрохімічну комірку. Цей експеримент свідчить, що нами було розроблено дійсно високоспецифічний та селективний біосен� сор для аналізу глюкози у вині. Дослідження чутливості та селективно� сті глюкозного амперометричного біосенсора 1 54 3 2 Концентрація субстрату, мМ Концентрація аскорбінової кислоти, мМ С и л а ст р у м у , н А Рис. 4. Відгуки амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої в ПЕДТ глюкозооксидази на внесення в електрохімічну комірку різних концентрацій: глюкози (1); етанолу (2); гліцеролу (3); лактату (4); аскорбінової кислоти (5). Вимірювання проводили у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, потенціал +200 мВ відносно внутрішнього електрода порівняння Концентрація глюкози, мМ С и л а ст р у м у , н А Рис. 5. Калібрувальна крива амперометричного біосенсора на основі платинового друкованого електрода SensLab та іммобілізованої у ГА глюкозооксидази. Вимірювання проводили у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, потенціал +200 мВ відносно внутрішнього електрода порівняння 1 54 3 2 Концентрація субстрату, мМ Концентрація аскорбінової кислоти, мМ С и л а ст р у м у , н А Рис. 6. Відгуки амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої в ГА глюкозооксидази на внесення в електрохімічну комірку різних концентрацій: глюкози (1); етанолу (2); гліцеролу (3); лактату (4); аскорбінової кислоти (5). Вимірювання проводили у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, потенціал +200 мВ відносно внутрішнього електрода порівняння БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 94 на основі іммобілізованої у парах ГА ГОД уможливило проведення за його допомогою аналізу глюкози у реальних зразках. На першому етапі роботи з винома� теріалами визначали оптимальне розведен� ня проб вина для аналізу їх за допомогою розробленого амперометричного біосенсора. На рис. 7 зображено відгуки біосенсора на основі іммобілізованої ГОД на внесення в електрохімічну комірку різних аліквот сусла та трьох типів вин з різним вмістом глюкози, що відповідало розведенню у 5 000, 1 000, 500, 250, 100 та 50 разів. Для дослідження було використано проби вина аліготе (вміст глюкози, згідно з методом ВЕРХ 0,12 г/л, що становить 0,67 мМ), ма� дера (7 г/л, або 39 мМ глюкози), портвейн білий (33 г/л, або 183 мМ глюкози), а також сусло біле (125 г/л або 694,4 мМ глюкози). З рисунка видно, що для сухого вина аліготе розведення більш ніж у 500 разів є непри� датним через дуже низький вміст глюкози у пробі. Сусло, навпаки, не має сенсу розводити менше, ніж у 250 разів, оскільки у діапазоні розведень 50–250 відгук біосенсора на пробу майже не змінюється через насичення ензиму субстратом. Для двох інших проб вина чітка прямолінійна залежність між об’ємом вне� сеної проби та відгуком біосенсора спос� терігається при розведенні у 100–500 разів. Враховуючи одержані результати, для подальшої роботи нами було обрано таке розведення проб: для сусла — у 1 000 разів, для сухих вин — у 250 разів, для всіх інших використаних вин — у 500 разів. Варто за� значити, що максимально можливий вміст основних інтерферуючих речовин у суслі та вині, розведених у 500 разів, такий [3]: ета� нол — до 7 мМ, гліцерол — до 0,25 мМ, лак� тат — до 0,1 мМ, аскорбінова кислота — до 0,005 мМ, а, як свідчать результати, наве� дені на рис. 5, біосенсор на основі ГОД, іммобілізованої в ГА, є зовсім не чутливим до цих речовин у наведених концентраціях. Для визначення вмісту глюкози у винах за допомогою амперометричного біосенсора застосовували метод стандартних додавань. Для цього спочатку отримували відгук біосенсора на внесення в електрохімічну комірку проби вина, що аналізується. Потім до ідентичних об’ємів вина додавали стан� дартні розчини глюкози з певними концент� раціями та реєстрували сигнали датчика на внесення цих сумішей. Після здійснення серії послідовних аналізів (з використанням стандартних розчинів з різною концент� рацією глюкози) отримували набір точок — пряму лінію, яка після екстраполяції на вісь абсцис відсікала на ній значення концент� рації глюкози у пробі аналізованого вина. З рис. 8 видно, що вміст глюкози в комірці в разі внесення розведеної у 250 разів проби вина аліготе становив 9,6 мкМ, розведених у 500 разів проб вин мадера та портвейн бі� лий — 84 та 351 мкМ відповідно, розведеної у 1 000 разів проби сусла білого — 694 мкМ. Це означає, що в цих винах та виноматеріалі концентрація глюкози така: 0,43 г/л (2,4 мМ) для аліготе, 7,56 г/л (42 мМ) для мадери, 31,6 г/л (176 мМ) для портвейну білого та 124,9 г/л (694 мМ) для сусла білого. Ступінь розведення вина С и л а ст р у м у , н А 1 2 4 3 Рис. 7. Відгуки амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої в парах ГА глюкозооксида> зи на внесення в електрохімічну комірку різних аліквот сусла білого (крива 1, 125 г/л глюкози) та вина: портвейн білий (крива 2, 33 г/л глюкози), мадера (крива 3, 7 г/л глюкози), аліготе (крива 4, 0,12 г/л глюкози). Вимірювання проводили у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, потенціал +200 мВ відносно внутрішнього електрода порівняння Рис. 8. Визначення концентрації глюкози в білому суслі (1) та у зразках вина портвейн білий (2), мадера (3) та аліготе (4) за допомогою методу стандартних додавань. Вимірювання проводили у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, потенціал +200 мВ відносно внутрішнього електрода порівняння Концентрація глюкози, що додається до проби, мМ С и л а ст р у м у , н А 1 2 4 3 Методи 95 Наступним етапом роботи було порівнян� ня результатів аналізу глюкози у винома� теріалі, одержаних за допомогою біосенсора, із даними традиційного методу аналізу — високоефективної рідинної хроматографії. Як об’єкт дослідження було використано 12 проб вина різного типу та 2 проби білого й червоного сусла. Отримані дані наведено в таблиці. Слід відзначити високу коре� ляцію між результатами, одержаними із ви� користанням амперометричного біосенсора та класичного хроматографічного методу визначення глюкози. Деяка розбіжність між даними ВЕРХ та біосенсора спостерігає� ться лише в разі аналізу сухих вин, концент� рація глюкози в яких є надто малою. Урешті�решт, було досліджено відтворю� ваність відгуків та операційну стабільність створеного глюкозного біосенсора та показа� но, що через 8 год безперервної роботи біосенсор демонструє дещо більші, порівня� но з початковими відгуками, сигнали на до� давання розчину глюкози (рис. 9). Зростан� ня відгуку біосенсора протягом першої доби після іммобілізації ГОД у парах ГА можна пояснити тим, що молекули ензиму посту� пово набувають найбільш оптимальної для їх функціонування конформації у мембрані [10]. А з додаванням у комірку проби вина відгук зменшився на 13% від початкового через 8 год безперервної роботи сенсора. Також було вивчено стабільність глюкоз� ного амперометричного біосенсора під час зберігання його в сухому стані при + 4 0С. Наведені на рис. 10 дані свідчать, що через 2 місяці після іммобілізації ГОД залишається близько 100% від початкової активності ен� зиму, а потім величина відгуку починає пос� тупово зменшуватися. Такий ефект можна пояснити тим, що зниження активності ГОД протягом перших двох місяців зберігання не призводить до зменшення величини відгуку біосенсора, оскільки ензим у чутливій мемб� рані перебуває в надлишку і на каталіз ензима� тичної реакції вистачає навіть його зменшеної активності. Подальше ж падіння активності ГОД нижче того рівня, який забезпечував пов� не розщеплення субстрату, спричинює посту� пове падіння активності біосенсора. Концентрація глюкози у 12 зразках вина та у 2 зразках виноградного сусла, визначена за допомогою біосенсора та методу високоефективної рідинної хроматографії Проба Тип Концентрація глюкози, г/л Біосенсор ВЕРХ Ркацителі «Коктебель» Біле, столове, сухе 0,63±0,1 0,29 Аліготе «Коктебель» Біле, столове, сухе 0,47±0,05 0,12 Мерло «Коблево» Червоне, столове, сухе 0,84±0,05 0,51 Каберне «Коктебель» Червоне, столове, сухе 0,70±0,05 0,32 Монте Блан «Коктебель» Біле, столове, напівсолодке 16,70±0,3 16,40 Портвейн 777 червоний Червоне, міцне 32,76±0,2 34,54 Портвейн 777 рожевий Рожеве, міцне 32,22±0,2 33,24 Портвейн білий Біле, міцне 31,50±0,1 32,78 Мадера «Масандра» Біле, міцне 7,56±0,15 7,15 Кокур «Коктебель» Біле, десертне 87,18±0,3 87,12 Кара�Даг «Коктебель» Червоне, десертне 85,32±0,6 83,05 Кагор український Червоне, десертне 87,30±0,4 87,18 Сусло біле – 125,28±0,25 124,99 Сусло червоне – 131,31±0,6 134,54 Час, год В ід гу к , н А 1 2 Рис. 9. Дослідження відтворюваності відгуків та операційної стабільності амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої у парах ГА глюкозооксидази. Концентрація глюкози, що додається в електрохімічну комірку, — 1,3 мМ (1), проба вина — 10 мкл (2). Вимірювання проводили в 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, потенціал +200 мВ відносно внутрішнього електрода порівняння БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 96 Таким чином, у ході роботи відпрацьова� но методику визначення вмісту глюкози у вині за допомогою амперометричного біосен� сора на основі платинового друкованого електрода SensLab та глюкозооксидази. Досліджено селективність амперометрич� них біосенсорів, розроблених із застосуван� ням двох різних методів іммобілізації глю� козооксидази. Показано, що датчик на основі ГОД, іммобілізованої у парах глута� рового альдегіду, є селективним і не демон� струє неспецифічного відгуку на основні компоненти вина, на відміну від біосенсора з ГОД, іммобілізованою у полімері ПЕДТ. Вивчено відтворюваність відгуків та опе� раційну стабільність створеного датчика на основі іммобілізованої у парах глутарового альдегіду ГОД та досліджено його стабіль� ність під час зберігання. За допомогою роз� робленого біосенсора проведено аналіз кон� центрації глюкози у винах різного типу та в суслі. Показано високу кореляцію резуль� татів, отриманих за допомогою глюкозного амперометричного біосенсора, із даними традиційного методу аналізу глюкози — ви� сокоефективної рідинної хроматографії. Крім того, у ході роботи встановлено, що біосенсор з іммобілізованою у полімері ПЕДТ ГОД виявляє надзвичайно широкий динамічний діапазон роботи (до 50 мМ глюко� зи) і може бути успішно застосований для аналізу глюкози в середовищах, що не містять етанолу та гліцеролу, наприклад у крові. Частину цієї роботи було виконано за фінансової підтримки НАН України в рамках комплексної науково�технічної програми «Сенсорні системи для медико�екологічних та промислово�технічних потреб». Час, доба В ід гу к , % Рис. 10. Залежність величини відгуку амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої у парах ГА глюкозооксидази від часу зберігання при + 4 0С у сухому стані. Концентрація глюкози, що додається в електрохімічну комірку, — 5 мМ. Вимірювання проводили у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, потенціал +200 мВ відносно внутрішнього електрода порівняння ЛІТЕРАТУРА 1. Wu B., Zhang G., Shuang S. Biosensors for determination of glucose with glucose oxidase immobilized on an eggshell membrane // Talanta. — 2004. — V. 64. — P. 546–553. 2. Niculescu M., Mieliauskiene R., Laurinavicius V., Csooregi E. Simultaneous detection of ethanol, glucose and glycerol in wines using pyrrolo� quinoline quinone�dependent dehydrogenases based biosensors // Food Chemistry. — 2003. — V. 82. — Р. 481–489. 3. Горюшкіна Т. Б., Дзядевич С. В. Виноградні вина. Хімічний склад та методи визначення // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, №2. — С. 24–38. 4. Niculescu M., Erichsen T., Sukharev V. et al. Quinohemoprotein alcohol dehydrogenase� based reagentless amperometric biosensor for ethanol monitoring during wine fermentation // Anal. Chim. Acta. — 2002. — V. 463, №1. — P. 39–51. 5. Шольц Е. П., Пономарев В. Ф. Технология переработки винограда. — М.: Агропромиз� дат, 1990. — 447 с. 6. Office International de la Vigne et du Vin (OIV). Recueil des methods internationles d’analyse des vine et des mouts. — Paris: OIV, 2006. — 321 p. 7. Горюшкіна Т. Б., Дзядевич С. В. Ферментні біосенсори для кількісного аналізу компо� нентів вина // СЕМСТ. — 2008, №1. — С. 49–67. 8. Шкотова Л. В., Солдаткин А. П., Дзяде: вич С. В. Адаптация амперометрического ферментного биосенсора для анализа глюко� зы в винах // Укр. біохім. журн. — 2004. — Т. 76, № 3. — С. 114–121. Методи 97 9. Antiochia R., Gorton L. Development of a car� bon nanotube paste electrode osmium poly� mer�mediated biosensor for determination of glucose in alcoholic beverages // Biosens. and Bioelectr. — 2007. — V. 22. — P. 2611–2617. 10. Razumiene J., Vilkanauskyte A., Gureviciene V. et al. New bioorganometallic ferrocene derivatives as efficient mediators for glucose and ethanol biosensors based on PQQ�depen� dent dehydrogenases // J. of Organomet. Chem. — 2003. — V. 668. — P. 83–90. 11. Laurinavicius V., Razumiene J., Kurtinai: tiene B. et al. Bioelectrochemical application of some PQQ�dependent enzymes // Вioelec� trochemistry. — 2002. — V. 55. — P. 29–32. 12. Alkasrawi M., Popescu I.C., Laurinavicius V. et al. A redox hydrogel integrated PQQ�glu� cose dehydrogenase based glucose electrode // Anal. Commun. — 1999. — V. 36. — P. 395–398. 13. Miertus S., Katrliik J., Pizzariello A. et al. Amperometric biosensors based on solid binding matrices applied in food quality mo� nitoring // Biosens. and Bioelectr. — 1998. — V. 13, N7–8. — Р. 911–923. 14. Guzman:Vaazquez de Prada A., Penna N., Parrado C. et al. Amperometric multidetec� tion with composite enzyme electrodes // Talanta. — 2004. — V. 62. — P. 896–903. 15. Gonzalo:Ruiz J., Alonso:Lomillo M. A., Munnoz F. J. Screen�printed biosensors for glucose determination in grape juice // Biosens. and Bioelectr. — 2007. — V. 22. — P. 1517–1521. 16. De Corcuera J. I. R. Cavalieri R. P., Powers J. R. Improved platinization conditions produce a 60�fold increase in sensitivity of amperomet� ric biosensors using glucose oxidase immobi� lized in poly�o�phenylenediamine // J. of Electroanal.Chem. — 2005. — V. 575. — P. 229–241. 17. Florescua M., Bretta C. M. A. Development and evaluation of electrochemical glucose enzyme biosensors based on carbon film elec� trodes // Talanta. — 2005. — V. 65. — P. 306–312. 18. Zhao M., Hibbert D. B., Gooding J. J. An oxy� gen�rich fill�and�flow channel biosensor // Biosens. and Bioelectron. — 2003. — V. 18. — P. 827–833. 19. Yang X. Zhou Z., Xiao D, Choi M. M. F. A flu� orescent glucose biosensor based on immobilized glucose oxidase on bamboo inner shell membrane // Ibid. — 2006. — V. 21. — P. 1613–1620. 20. De Luca S., Florescu M., Ghica M. E. et al. Carbon film electrodes for oxidase�based enzyme sensors in food analysis // Talanta. — 2005. — V. 68. — P. 171–178. 21. Бережецький А. Л., Щувайло О. М., Архипо: ва В. М. та ін. Дослідження та оптимізація різних перетворювачів для створення ампе� рометричних біосенсорів // Sens. Electron. and Microsyst. Technol. — 2005. — №2. — С. 55–62. 22. Шкотова Л. В., Горюшкіна Т. Б., Сла: стья Є. А. та ін. Амперометричний біосен� сор для аналізу лактату у вині та у виног� радному суслі у процесі його ферментації // Укр. біохім. журн. — 2005. — Т. 77, №5. — C. 123–130. 23. Azevedo A. M., Prazeres M. F., Cabral J. M. S., Fonseca L. P. Ethanol biosensors based on alcohol oxidase // Biosens. and Bioelectron. — 2005. — V. 21. — P. 235–247. 24. Горюшкіна Т. Б., Шкотова Л. В., Сла: стья Є. А. та ін. Оптимізація методики визначення лактату у виноматеріалі ампе� рометричним ферментним біосенсором // СЕМСТ. — 2008, №2. — С. 39–47. БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 98 ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГЛЮКОЗЫ В ВИНОМАТЕРИАЛЕ ЭНЗИМНЫМ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ БИОСЕНСОРОМ Т. Б. Горюшкина1, 2, Е. В. Остроухова3, А. П. Солдаткин1, С. В. Дзядевич1 1Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев 2Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко 3Национальный институт винограда и вина «Магарач», Ялта Е:mail: tatiana_goryushkina@yahoo.com Отработана методика определения глюко� зы в вине с помощью амперометрического био� сенсора на основе платинового печатного электрода SensLab и глюкозооксидазы (ГОД). Исследована селективность биосенсоров, раз� работанных с применением двух разных мето� дов иммобилизации ГОД. Показано, что дат� чик на основе ГОД, иммобилизованной в парах глутарового альдегида (ГА), не дает отклика на основные интерферирующие вещества ви� на, в отличие от биосенсора с ГОД, иммобили� зованной в полимере поли�(3,4�этилендиокси� тиофен) (ПЭДТ). Изучены операционная стабильность созданного датчика на основе иммобилизованной в парах ГА ГОД и его ста� бильность при хранении. С помощью разрабо� танного биосенсора проведен анализ концент� рации глюкозы в винах разного типа и в сусле. Показана высокая корреляция полученных результатов с данными высокоэффективной жидкостной хроматографии. Установлено, что биосенсор с иммобилизованной в полимере ПЭДТ ГОД обладает чрезвычайно широким ди� намическим диапазоном работы и может быть успешно применен для анализа глюкозы в сре� дах, не содержащих этанол и глицерол, напри� мер в крови. Ключевые слова: амперометрический биосенсор, глюкоза, вино, сусло. OPTIMIZATION OF METHODS OF GLUCOSE CONTENT DETERMINATION IN WINE BY ENZYME AMPEROMETRIC BIOSENSOR T. B. Goriushkina1, 2, О. V. Ostroukhova3, О. P. Soldatkin1, S. V. Dzyadevych1 1Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv 2 Taras Shevchenko National University, Kyiv 3 Institute for Vine and Wine «Magarach», Yalta Е:mail: tatiana_goryushkina@yahoo.com A method of glucose determination in wine by an amperometric biosensor on the basis of platinum printed electrode SensLab and glucose oxidase was optimized. Selectivity of glucose biosensors created on the basis of two different methods of glucose oxidase immobilization was investigated. Main wine interferents were demonstrated to have no effect on work of the biosensor with glucose oxidase immobilised in glutaraldehyde vapor, but they influenced on work of the biosensor with glucose oxidase immobilised in PEDT polymer. Reproducibility, operational and storage stability of the created biosensor on the basis of glucose oxidase immo� bilised in glutaraldehyde vapor were investiga� ted. Glucose concentration in several types of wine and must was determined with the created biosensor, and the results were compared with those obtained by traditional analytical method — HPLC. Good correlation between data obtained by the biosensor method and HPLC was shown. It was also determined that biosensor with glucose oxidase in PEDT polymer is charac� terized by extremely wide dynamic range of work and it can be successfully used for glucose analy� sis in the liquids without ethanol and glycerol — for example, in blood. Key words: amperometric biosensor, glucose, wine, must.

Оптимізація методики визначення вмісту глюкози у виноматеріалі ензимним амперометричним біосенсором

Institution

Ähnliche Einträge