Вікові зміни метилування ДНК сім'ядольних листків Linum usitatissimum за умови УФ-В опромінення
Досліджували вікові зміни метилування ДНК сім'ядольних листків Linum usitatissimum, що зазнали впливу УФ-В опромінення в діапазоні доз 4,23–12,69 кДж/м². Рівень метилування визначали за допомогою рестриктного аналізу. Ознак дозової залежності не виявлено, проте встановлені зміни спектра метилув...
Gespeichert in:
| Datum: | 2011 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainian |
| Veröffentlicht: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2011
|
| Schriftenreihe: | Доповіді НАН України |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/38144 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Вікові зміни метилування ДНК сім'ядольних листків Linum usitatissimum за умови УФ-В опромінення / А.М. Берестяна, Д.М. Гродзинський, Г.В. Кріпка // Доп. НАН України. — 2011. — № 7. — С. 143-147. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-38144 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-381442012-11-01T12:10:44Z Вікові зміни метилування ДНК сім'ядольних листків Linum usitatissimum за умови УФ-В опромінення Берестяна, А.М. Гродзинський, Д.М. Кріпка, Г.В. Біологія Досліджували вікові зміни метилування ДНК сім'ядольних листків Linum usitatissimum, що зазнали впливу УФ-В опромінення в діапазоні доз 4,23–12,69 кДж/м². Рівень метилування визначали за допомогою рестриктного аналізу. Ознак дозової залежності не виявлено, проте встановлені зміни спектра метилування в процесі старіння сім'ядольних листків Linum usitatissimum. The age-related changes of DNA methylation in cotyledonous leaves of Linum usitatissimum subjected to UV-B radiation in the interval 4.23–12.69 kJ/m² have been studied. The level of methylation is determined by the restriction analysis. Although the study showed no dose-dependence, some methylation spectrum changes in the process of aging of the Linum usitatissimum cotyledonous leaves occurred. 2011 Article Вікові зміни метилування ДНК сім'ядольних листків Linum usitatissimum за умови УФ-В опромінення / А.М. Берестяна, Д.М. Гродзинський, Г.В. Кріпка // Доп. НАН України. — 2011. — № 7. — С. 143-147. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. 1025-6415 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/38144 577.24:575.224:581.1 uk Доповіді НАН України Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Біологія Біологія |
| spellingShingle |
Біологія Біологія Берестяна, А.М. Гродзинський, Д.М. Кріпка, Г.В. Вікові зміни метилування ДНК сім'ядольних листків Linum usitatissimum за умови УФ-В опромінення Доповіді НАН України |
| description |
Досліджували вікові зміни метилування ДНК сім'ядольних листків Linum usitatissimum, що зазнали впливу УФ-В опромінення в діапазоні доз 4,23–12,69 кДж/м². Рівень метилування визначали за допомогою рестриктного аналізу. Ознак дозової залежності не виявлено, проте встановлені зміни спектра метилування в процесі старіння сім'ядольних листків Linum usitatissimum. |
| format |
Article |
| author |
Берестяна, А.М. Гродзинський, Д.М. Кріпка, Г.В. |
| author_facet |
Берестяна, А.М. Гродзинський, Д.М. Кріпка, Г.В. |
| author_sort |
Берестяна, А.М. |
| title |
Вікові зміни метилування ДНК сім'ядольних листків Linum usitatissimum за умови УФ-В опромінення |
| title_short |
Вікові зміни метилування ДНК сім'ядольних листків Linum usitatissimum за умови УФ-В опромінення |
| title_full |
Вікові зміни метилування ДНК сім'ядольних листків Linum usitatissimum за умови УФ-В опромінення |
| title_fullStr |
Вікові зміни метилування ДНК сім'ядольних листків Linum usitatissimum за умови УФ-В опромінення |
| title_full_unstemmed |
Вікові зміни метилування ДНК сім'ядольних листків Linum usitatissimum за умови УФ-В опромінення |
| title_sort |
вікові зміни метилування днк сім'ядольних листків linum usitatissimum за умови уф-в опромінення |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| publishDate |
2011 |
| topic_facet |
Біологія |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/38144 |
| citation_txt |
Вікові зміни метилування ДНК сім'ядольних листків Linum usitatissimum за умови УФ-В опромінення / А.М. Берестяна, Д.М. Гродзинський, Г.В. Кріпка // Доп. НАН України. — 2011. — № 7. — С. 143-147. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. |
| series |
Доповіді НАН України |
| work_keys_str_mv |
AT berestânaam víkovízmínimetiluvannâdnksímâdolʹnihlistkívlinumusitatissimumzaumoviufvopromínennâ AT grodzinsʹkijdm víkovízmínimetiluvannâdnksímâdolʹnihlistkívlinumusitatissimumzaumoviufvopromínennâ AT krípkagv víkovízmínimetiluvannâdnksímâdolʹnihlistkívlinumusitatissimumzaumoviufvopromínennâ |
| first_indexed |
2025-07-03T20:01:44Z |
| last_indexed |
2025-07-03T20:01:44Z |
| _version_ |
1836657310417551360 |
| fulltext |
оповiдi
НАЦIОНАЛЬНОЇ
АКАДЕМIЇ НАУК
УКРАЇНИ
7 • 2011
БIОЛОГIЯ
УДК 577.24:575.224:581.1
© 2011
А.М. Берестяна, академiк НАН України Д.М. Гродзинський,
Г.В. Крiпка
Вiковi змiни метилування ДНК сiм’ядольних листкiв
Linum usitatissimum за умови УФ-В опромiнення
Дослiджували вiковi змiни метилування ДНК сiм’ядольних листкiв Linum usitatissi-
mum, що зазнали впливу УФ-В опромiнення в дiапазонi доз 4,23–12,69 кДж/м2. Рiвень
метилування визначали за допомогою рестриктного аналiзу. Ознак дозової залежностi
не виявлено, проте встановленi змiни спектра метилування в процесi старiння сiм’я-
дольних листкiв Linum usitatissimum.
Дослiдження епiгенетичної складової процесу старiння залишається на сьогоднi однiєю
з актуальних проблем. Рослиннi та твариннi органiзми на пiзнiх стадiях онтогенезу за-
знають ряд змiн епiгеному, зокрема рiвня метилування. За однiєю з гiпотез, старiння су-
проводжується зменшенням рiвня метилування ДНК, за iншою — його збiльшенням. Вiд-
бувається це на фонi активацiї гiдролiтичних процесiв у клiтинi [1, 2].
Вiдомо, що на онтогенез монокарпiчних рослин впливає УФ-радiацiя, яка залежно вiд
доз, способiв опромiнення, виду рослини спричиняє як прискорення, так i уповiльнення
темпiв старiння, яке реєструється за змiнами гiдролiтичної активностi. Шляхи трансдук-
цiї сигналiв на даний момент ще не вивченi детально [3]. За оцiнками експертiв, зниження
озонового шару, яке на сьогоднi досягло 0,5% на рiк, та пiдсилення короткохвильових випро-
мiнювань може призвести до послаблення сформованих у ходi еволюцiї захисних механiзмiв
та порушення бiохiмiчних i фiзiологiчних процесiв [4, 5]. У зв’язку з цим виникає необхiд-
нiсть дослiдження впливу УФ-В радiацiї на механiзми епiгенетичної iнiцiацiї гiдролiтичних
процесiв, якi визначають темпи старiння рослинного органiзму.
Ми ставили за мету дослiдження змiн рiвня метилування ДНК в процесi старiння сiм’я-
дольних листкiв Linum usitatissimum, а саме: визначення рiвня метилування окремих генiв
на рiзних стадiях онтогенезу, встановлення епiгенетичних механiзмiв iнiцiацiї старiння та
ступеня впливу радiацiї на цей процес. Епiгеномнi змiни оцiнювали шляхом аналiзу спектра
метилування ДНК.
Матерiали та методи. Об’єктом дослiдження були сiм’ядольнi листки монокарпiчної
рослини Linum usitatissimum. Сiм’ядольнi листки є зручними для дослiдження, оскiльки
являють собою орган, який першим зазнає деградацiйних змiн у процесi старiння [6]. На ста-
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №7 143
дiї 15-денного паростка рослини опромiнювали джерелом УФ-В опромiнення (лампа ДБ-30)
у трьох дозах: 4,23, 8,46, 12,69 кДж/м2 протягом 1,5 год. Видiлення ДНК проводили на кож-
нiй стадiї онтогенезу, якi умовно позначили як: стадiя юностi (1 доба пiсля опромiнення),
стадiя зрiлостi (15 дiб пiсля опромiнення), стадiя передстарiння (30 дiб пiсля опромiнення),
стадiя старiння (45 дiб пiсля опромiнення).
Для видiлення сумарної ДНК використовували стандартний метод. Листковi пластин-
ки гомогенiзували в рiдкому азотi з додаванням лiзуючого буфера (СТАВ буфера), що
складався з 0,1 М трис-HCl (pH 9), 1,4 M NaCl, 20 мМ EDTA, 0,2% меркаптоетанолу, 2%
цетилтриамонiум бромiду. Пiсля одержання гомогенної суспензiї ї ї закладали в пробiрки
об’ємом 1,5 мл та iнкубували 1 год в термостатi при 65 ◦С, пiсля цього центрифугували
протягом 10 хв при 13 000 об/хв. Надосадову рiдину переносили в iншi пробiрки, додавали
рiвний об’єм сумiшi хлороформ : iзоамiловий спирт (24 : 1), ретельно перемiшували та зно-
ву центрифугували протягом 10 хв. Пiсля цього отриманий супернатант промивали рiвним
об’ємом хлороформу та знову центрифугували 5 хв при 13000 об/хв [7].
З метою очищення отриманої ДНК вiд рибонуклеїнових кислот до розчину ДНК до-
давали РНКазу (100 мкл/мл) та iнкубували в термостатi при 37 ◦С протягом 1 год, пiсля
чого до сумiшi додавали 1,5 об’єму iзопропанолу, перемiшували та iнкубували щонайменше
1 год при −20
◦С. Сумiш центрифугували протягом 10 хв (13000 об/хв при 4 ◦С). Осад
ДНК вiдмивали у 200 мкл 70% етанолу, залишаючи зразки висихати на повiтрi. Розчиняли
ДНК у 100 мкл ТЕ буфера (10 мМ трис-НCl, pH 9, 1 мМ EDTA, pH 8). Зразки зберiгали
в морозильнiй камерi при −20
◦С [7, 8].
Препарати видiленої тотальної ДНК використовували в подальшому для проведення
ПЛР. Амплiфiкацiю здiйснювали в сумiшi (25 мкл), що мiстила 50 нг ДНК, по 0,2 мкл
розчину кожного з праймерiв ITS1, ITS4, 2,0 од. акт. Taq ДНК полiмерази (“Sigma”, США),
2,5 мкл 10-кратного буфера для полiмерази (“Promega”, США), 0,1 мМ кожного з dNTP
(“Perkin Elmer”, США) та 2,5 мМ MgCl2 (“Promega”, США). Амплiфiкацiю проводили на ам-
плiфiкаторi “Терцик” (Росiя). Режим амплiфiкацiї: денатурацiю ДНК здiйснювали при 94 ◦С
протягом 1,5 хв, пiсля чого виконували 5 циклiв амплiфiкацiї в режимi 94 ◦С — 10 с, 68 ◦С —
10 с, 72 ◦С — 20 с, 40 циклiв амплiфiкацiї в режимi 94 ◦С — 5 с, 68 ◦С — 5 с, 72 ◦С — 5 с,
завершували амплiфiкацiю при 72 ◦С протягом 5 хв [9].
Структура використаних праймерiв:
ITS1 — TCCGTAGGTGAACCTGCGG;
ITS4 — TCCTCCGCTTATTGATATGC.
Цi праймери є комплементарними до генiв рДНК, а саме до дiлянок рибосомального
внутрiшнього транскрибуючого спейсера (ITS). Регiони ITS є консервативними послiдов-
ностями з високою видоспецифiчнiстю. Завдяки високiй багатокопiйностi їх зручно вико-
ристовувати для амплiфiкацiї поодинокого гена [10].
Результати ПЛР аналiзували за допомогою електрофорезу. Електрофорез проводили
в 1,7% агарозному гелi (“Chemapol”, Чехiя) з додаванням етидiум бромiду при 45 В/199 мА
протягом 40 хв. Як електродний буфер використовували 0,089 М трис-боратний (ТВЕ)
буфер. Розмiри амплiфiкованих фрагментiв визначали за допомогою набору маркерiв мо-
лекулярної маси вiд 100 до 3000 п. н. (Gene Ruler 100 bp DNA Ladder plus, MBI Fermentas,
Литва). Виявлялася присутнiсть продуктiв розмiром 500–600 п. н., якi є специфiчними для
Linum [11].
Отриманi ITS амплiфiканти дослiджували шляхом рестриктного аналiзу. Для рестрик-
цiї нами були використанi ферменти: HpaII, MspI, Sau3A, DpnI, EoRV (MBI Fermentas).
144 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №7
Рис. 1. Аналiз продуктiв амплiфiкацiї ДНК сiм’ядольних листкiв льону на стадiї молодостi (а) i старiння (б )
з праймерами ITS1 та ITS4 рестриктазами МspI, HpaII.
1 — неопромiнений контроль; 2 — опромiнення 4,23 кДж/м2; 3 — опромiнення 8,46 кДж/м2; 4 — опромi-
нення 12,69 кДж/м2
Рестриктний аналiз проводили в сумiшi (10 мкл), що мiстила 8 мкл ПЛР-продукту, 1 мкл
рестриктного буфера, 1 мкл ферменту, в такому режимi: з ферментами HpaII, MspI, Sau3A,
DpnI, EoRV — 37 ◦С 1 год; потiм 65 ◦С — 5 хв [12]. Результати рестрикцiї аналiзували
методом електрофорезу.
Результати та обговорення. У зв’язку з тим, що передбачається можлива участь
метильованого цитозину в утвореннi неактивних дiлянок хроматину, що призводить до iн-
активацiї генiв пiд час старiння, а для рослин частка метильованих залишкiв цитозину
в ДНК в онтогенезi майже не вiдома, проводили дослiдження ферментативної модифiкацiї
цитозину в складi амплiфiкантiв ДНК сiм’ядольних листкiв рiзного вiку та рiзних варiантiв
опромiнення чутливими до метилування рестриктазами.
За допомогою рестриктного аналiзу визначали рiвень метилування амплiфiкантiв ДНК
сiм’ядольних листкiв Linum usitatissimum на стадiї молодостi та старiння. Ступiнь мети-
лування цитозину оцiнювали за допомогою рестриктаз HpaII та MspI. Це iзошизомери, що
розрiзають одну й ту саму послiдовнiсть ДНК, але по-рiзному реагують на її метилуван-
ня. Рестриктуючий фермент MspI розрiзає усi послiдовностi CCGG незалежно вiд того,
метильованi вони чи нi, a HpaII розрiзає тiльки неметильованi CCGG-тетрамери [10].
Рестриктний аналiз проводили на кожнiй з чотирьох стадiй онтогенезу, для трьох доз
та контролю. На рис. 1 наведено результати рестриктного аналiзу продуктiв амплiфiкацiї
ДНК за допомогою праймерiв MspI та HpaII. Змiн виявлено не було. Це може свiдчити про
вiдсутнiсть варiабельностi метилування за даною послiдовнiстю.
Метилування залишкiв аденiну в ДНК виявляли за допомогою iзошизомерiв: Sau3A
(розщеплює як метильованi, так i неметильованi послiдовностi GATC); DpnI (розщеплює
лише метильованi послiдовностi GMeATC); EcoRV (розщеплює лише неметильованi послi-
довностi GATˆATG) [12]. При використаннi для рестриктного аналiзу продуктiв амплiфi-
кацiї ДНК праймерiв Sau3A та DpnI були зафiксованi такi змiни (рис. 2). З’явились новi
сайти для рестриктази, яка впiзнає метильований аденiн. Рiвень метилування даного гена
збiльшився у старих рослин по вiдношенню до молодих. Це може свiдчити про вимикання
певних послiдовностей у процесi старiння рослини (див. рис. 2).
Таким чином, згiдно з одержаними результатами, старiння листкiв льону супровод-
жується змiнами характеру метилування ДНК, якi виявляються на етапi старiння i по-
в’язанi з вибiрковим метилуванням чи деметилуванням залишкiв аденiну в рибосомних
внутрiшнiх транскрибуючих спейсерах. Поряд з варiабельним метилуванням у процесi ста-
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №7 145
Рис. 2. Аналiз продуктiв амплiфiкацiї ДНК сiм’ядольних листкiв льону на стадiї молодостi (а) i старiння (б )
з праймерами ITS1 та ITS4 рестриктазами Sau3A, DpnI.
1 — неопромiнений контроль; 2 — опромiнення 4,23 кДж/м2; 3 — опромiнення 8,46 кДж/м2; 4 — опромi-
нення 12,69 кДж/м2
рiння залишкiв аденiну в сайтах специфiчних послiдовностей ДНК спостерiгається сталий
рiвень метилування при рiзних дозах опромiнення. Це свiдчить про те, що в застосовано-
му дiапазонi доз УФ-В опромiнення не впливає на характер епiгенетичних змiн у процесi
старiння сiм’ядольних листкiв льону.
На вiдмiну вiд геному тварин, для яких характерне поступове зниження рiвня метилу-
вання ДНК пiд час старiння, у складi ДНК рослин може здiйснюватись як гiпометилування,
так i гiперметилування [13]. На користь цього припущення свiдчить те, що рiвень метилу-
вання ITS вищий у бiльш старих листках.
Результати дослiдження показали, що в онтогенезi сiм’ядольних листкiв льону вiдбу-
вається змiна спектра метилування ДНК, яка виявляється на етапi старiння i пов’язана
з вибiрковим метилуванням залишкiв аденiну в дiлянках рибосомального внутрiшнього
транскрибуючого спейсера. Впливу рiзних доз УФ-В опромiнення на епiгеном монокар-
пiчної рослини не виявлено.
1. Осивац Х.Д., Хаманн А.П. Реорганизация ДНК и биологическое старение // Биохимия. – 1997. –
№ 11. – С. 1491–1502.
2. Гвоздев В.А. Регуляция активности генов, обусловленная химической модификацией (метилирова-
нием) ДНК. – Москва: Наука, 1999. – 260 с.
3. Гродзинський Д.М., Шилiна Ю.В., Мiхеєв О.М. Механiзми регуляцiї монокарпiчного старiння рос-
лин // Физиология и биохимия культ. растений. – 2003. – 35, № 3. – С. 187–199.
4. Costas A.V. Global total ozone dynamics // Environ. Sci. and Pollut. Res. – 2000. – 3, No 3. – P. 153–157.
5. Кузнецов В. В., Дмитриева Г.А. Физиология растений. – Москва: Высш. шк., 2005. – 736 с.
6. Гродзинский Д.М. Старение у растений // Надежность и элементарные события процессов старения
биологических объектов: Сб. науч. тр. – Киев: Наук. думка, 1986. – 208 с.
7. Dellaporta S., Wood J. A plant DNA minipreparation // Plant Mol. Biol. Rep. – 1983. – 1. – P. 19–21.
8. Varma A. Mycorrhiza manual. – Berlin; Heildelberg; New York: Springer, 1998. – 412 p.
9. White T., Bruns T., Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for
phylogenetics // PSR Protocols. A guide to methods and applications / Eds. M.A. Innis, D.H. Gelfard,
J. J. Sninsky. – San Diego: Academic Press, 1990. – P. 315–322.
10. Bruns T., Taylor J. Fungal molecular systematics // Annu Rev. Ecol. Syst. – 1991. – 22. – P. 525–564.
11. Маниатис Т., Фрич Э. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. – Москва:
Мир, 1984. – 480 с.
12. Redecker D., Thierfelder H., Walker C. Restriction analysis of PCR – Amplified Internal Transcribed
Spacers of Ribosomal DNA as a Tool for Species Identification in Different Genera of the Order Glomales //
Appl. and Environ. Microbiol. – 1997. – 63, No 5. – P. 1756–1761.
146 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №7
13. Strid A., Chow W.S., Anderson J.M. UV-B damage and protection at the molecular level in plants //
Photosynth. Res. – 1994. – 39. – P. 475–489.
Надiйшло до редакцiї 04.11.2010Iнститут клiтинної бiологiї
та генетичної iнженерiї НАН України, Київ
A.M. Berestyana, Academician of the NAS of Ukraine D.M. Grodzinsky,
G.V. Kripka
Age-related changes of DNA methylation in cotyledonous leaves of
Linum usitatissimum under UV-B radiation
The age-related changes of DNA methylation in cotyledonous leaves of Linum usitatissimum subjec-
ted to UV-B radiation in the interval 4.23–12.69 kJ/m2 have been studied. The level of methylation
is determined by the restriction analysis. Although the study showed no dose-dependence, some
methylation spectrum changes in the process of aging of the Linum usitatissimum cotyledonous
leaves occurred.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №7 147
|