Кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи для визначення сахарози

Охарактеризовано створений біосенсор для визначення сахарози, в якому складна триферментна мембрана виконує роль чутливого елемента, іммобілізованого на кондуктометричний перетворювач. Час визначення концентрації сахарози в розчині — 1–2 хв. Динамічний діапазон визначення може змінюватись залежно ві...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2008
Автори:	Солдаткін, О.О., Пєшкова, В.М., Дзядевич, С.В., Єльська, Г.В.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України 2008
Теми:	Нові методи
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/3901
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи для визначення сахарози / О. О. Солдаткін, В. М. Пєшкова, С. В. Дзядеви, Г. В. Єльська // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 1. — С. 116-122. — Бібліогр.: 20 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-3901
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-39012013-02-13T02:10:14Z Кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи для визначення сахарози Солдаткін, О.О. Пєшкова, В.М. Дзядевич, С.В. Єльська, Г.В. Нові методи Охарактеризовано створений біосенсор для визначення сахарози, в якому складна триферментна мембрана виконує роль чутливого елемента, іммобілізованого на кондуктометричний перетворювач. Час визначення концентрації сахарози в розчині — 1–2 хв. Динамічний діапазон визначення може змінюватись залежно від буферної ємності. Так, у 5 мМ фосфатному буферному розчині він становить 2 мкМ — 5 мМ сахарози. Досліджено залежність роботи біосенсора від рН та іонної сили розчину. Наведено дані щодо селективності сенсора та зберігання його в різних умовах. Розроблений кондуктометричний біосенсор відзначається високою операційною стабільністю та відтворюваністю сигналу і придатний для використання в реальних умовах. Приведены сведения о впервые созданном биосенсоре для определения сахарозы, в котором сложная трехферментная мембрана играет роль чувствительного элемента, иммобилизованного на кондуктометрический преобразователь. Время определения концентрации сахарозы в растворе — 1–2 мин. Динамический диапазон определения может изменяться в зависимости от буферной емкости и в 5 мМ фосфатном буферном растворе составляет 2 мкМ — 5 мМ сахарозы.Исследована зависимость работы биосенсора от рН и ионной силы раствора. Представлены также данные по селективности сенсора и хранению его в разных условиях. Разработанный кондуктометрический биосенсор характеризуется высокой операционной стабильностью и воспроизводимостью сигнала и пригоден для использования в реальных условиях. In the course of this study, a biosensor for sucrose determination, with a complex threeenzyme membrane representing a sensitivelement immobilized onto a conductometric transducer, has been created. The time of determining sucrose concentration in the solution is 1–2 minutes. The dynamic range of determination may vary depending on buffer capacity and amounts to 2 µM — 5 mM of sucrose in 5 mM of phosphate buffer solution. In this work the dependence on pH and ionic strength of the solution has been analyzed. The developed conductometric biosensor is characterized by high operational stability and repeatability of the response. The data on sensor selectivity and its storage in different conditions are presented as well. The sensor turned out to be suitable for usage in real-life environment. 2008 Article Кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи для визначення сахарози / О. О. Солдаткін, В. М. Пєшкова, С. В. Дзядеви, Г. В. Єльська // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 1. — С. 116-122. — Бібліогр.: 20 назв. — укр. http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/3901 577.15.543.555 uk Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Нові методи Нові методи
spellingShingle	Нові методи Нові методи Солдаткін, О.О. Пєшкова, В.М. Дзядевич, С.В. Єльська, Г.В. Кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи для визначення сахарози
description	Охарактеризовано створений біосенсор для визначення сахарози, в якому складна триферментна мембрана виконує роль чутливого елемента, іммобілізованого на кондуктометричний перетворювач. Час визначення концентрації сахарози в розчині — 1–2 хв. Динамічний діапазон визначення може змінюватись залежно від буферної ємності. Так, у 5 мМ фосфатному буферному розчині він становить 2 мкМ — 5 мМ сахарози. Досліджено залежність роботи біосенсора від рН та іонної сили розчину. Наведено дані щодо селективності сенсора та зберігання його в різних умовах. Розроблений кондуктометричний біосенсор відзначається високою операційною стабільністю та відтворюваністю сигналу і придатний для використання в реальних умовах.
format	Article
author	Солдаткін, О.О. Пєшкова, В.М. Дзядевич, С.В. Єльська, Г.В.
author_facet	Солдаткін, О.О. Пєшкова, В.М. Дзядевич, С.В. Єльська, Г.В.
author_sort	Солдаткін, О.О.
title	Кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи для визначення сахарози
title_short	Кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи для визначення сахарози
title_full	Кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи для визначення сахарози
title_fullStr	Кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи для визначення сахарози
title_full_unstemmed	Кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи для визначення сахарози
title_sort	кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи для визначення сахарози
publisher	Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
publishDate	2008
topic_facet	Нові методи
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/3901
citation_txt	Кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи для визначення сахарози / О. О. Солдаткін, В. М. Пєшкова, С. В. Дзядеви, Г. В. Єльська // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 1. — С. 116-122. — Бібліогр.: 20 назв. — укр.
work_keys_str_mv	AT soldatkínoo konduktometričnijbíosensornaosnovítrifermentnoísistemidlâviznačennâsaharozi AT pêškovavm konduktometričnijbíosensornaosnovítrifermentnoísistemidlâviznačennâsaharozi AT dzâdevičsv konduktometričnijbíosensornaosnovítrifermentnoísistemidlâviznačennâsaharozi AT êlʹsʹkagv konduktometričnijbíosensornaosnovítrifermentnoísistemidlâviznačennâsaharozi
first_indexed	2025-07-02T07:14:28Z
last_indexed	2025-07-02T07:14:28Z
_version_	1836518441507356672
fulltext	БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №1, 2008 116 Моніторинг біотехнологічних процесів культивації та ферментації є необхідним для більш глибокого розуміння, оптимізації та контролю за їх перебігом [1]. Наприклад, у деяких процесах ферментації як живиль< не середовище часто використовують мелясу із цукрового буряка. Вона є також природ< ним джерелом для виробництва різних про< дуктів [2]. Сахароза, що є основною компо< нентою меляси, використовується як рідкий цукор у харчовій промисловості, входить до складу багатьох харчових продуктів та на< поїв. Деякі спеціальні цукри також застосо< вують у фармацевтичній та косметичній га< лузях [3, 4]. Інформація про наявність і концентрацію сахарози в деяких напоях та продуктах харчування є важливим показни< ком їхньої якості. Сучасні стандартні методи визначення сахарози потребують наявності кваліфікованого персоналу та складного й до< рогого обладнання, що, зокрема, необхідно для рідинної хроматографії, хімічних та оп< тичних методів [5, 6]. Інші методи, що ґрун< туються на визначенні густини чи рефрак< торного індексу, є простими і швидкими, однак менш точними. До того ж вони досить чутливі до присутності в розчинах різних інтерферуючих компонентів [7]. Сьогодні надзвичайно актуальним є питання створен< ня більш зручного, точного, селективного, швидкого та дешевого методу визначення вміс< ту цукру в різноманітних алкогольних і безал< когольних напоях та продуктах харчування. Розроблення та створення ферментних біосенсорів для визначення сахарози може якнайкраще усунути перераховані вище не< доліки і задовольнити всім вищезазначеним умовам. На цей час у науковій літературі є відомості щодо розроблення низки варіан< тів сахарозних біосенсорів [7–12]. Перший такий біосенсор створювали, використовую< чи іммобілізовані на поверхню кисневого електрода ферменти інвертазу, мутаротазу та глюкозооксидазу (ГОД) [11]. Однак ця си< стема виявилась дуже чутливою до рівня кис< ню в реакторі і мала низьку селективність. В інших роботах для перетворення α<глюко< зи на β<форму замість мутаротази викорис< товували іони фосфату [7, 12]. У роботі [12] автори застосовували коіммобілізовані з ГОД клітини дріжджів як джерело інвер< тази. Детектування в цьому разі також базу< валось на поглинанні кисню. Але всі ці біосен< сори були амперометричними і поряд із Ключові слова: сахароза, глюкоза, кондуктометричний біосенсор, інвертаза, мутаротаза, глюкозооксидаза. Охарактеризовано створений біосенсор для визначення сахарози, в якому складна триферментна мембрана виконує роль чутливого елемента, іммобілізованого на кондуктометричний перетворювач. Час визначення кон< центрації сахарози в розчині — 1–2 хв. Динамічний діапазон визначення може змінюватись залежно від буфер< ної ємності. Так, у 5 мМ фосфатному буферному розчині він становить 2 мкМ — 5 мМ сахарози. Досліджено за< лежність роботи біосенсора від рН та іонної сили розчину. Наведено дані щодо селективності сенсора та зберігання його в різних умовах. Розроблений кондуктометричний біосенсор відзначається високою опе< раційною стабільністю та відтворюваністю сигналу і придатний для використання в реальних умовах. О. О. Солдаткін1, В. М. Пєшкова1,2, 1Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ С. В. Дзядевич1, 2Київський національний університет імені Тараса Шевченка Г. В. Єльська1 E$mail: alex_sold@yahoo.com УДК.577.15.543.555 КОНДУКТОМЕТРИЧНИЙ БІОСЕНСОР КОНДУКТОМЕТРИЧНИЙ БІОСЕНСОР ННА ОСНОВІ ТРИФЕРМЕНТНОЇ СИСТЕМИ А ОСНОВІ ТРИФЕРМЕНТНОЇ СИСТЕМИ ДЛЯ ВИЗНДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ САХАРОЗИАЧЕННЯ САХАРОЗИ Нові методи 117 перевагами мали низку суттєвих недоліків. Передусім це вимірювання з використан< ням високого потенціалу, що призводить до похибок через присутність у розчинах інших електроокисних компонентів, таких, наприклад, як аскорбінова кислота. Силу інтерферуючого струму можна зменшити, використовуючи додаткові мембрани [13] чи полімерні плівки [14], однак це ускладнює процедуру виготовлення біосенсорів і, відповідно, збільшує загальну вартість аналізу. Досить перспективним, на наш погляд, є кондуктометричний метод вимірювання вмісту сахарози, який досі ще не застосову< вався. Кондуктометричні методи аналізу є достатньо прості, зручні й точні і дозволяють вирішити ряд важли< вих науково<дослідних та виробни< чих завдань [15]. До того ж кондук< тометричні датчики мають суттєві переваги порівняно з іншими електрохімічними перетворювача< ми [16], а саме: нема потреби в тех< нологічно складному електроді порівняння; можливість викорис< тання під час роботи змінної напруги ма< лої амплітуди, що дозволяє уникнути фарадеївських про< цесів на електродах; відсутність світло< чутливості, на відміну від іонселективних польових транзис< торів; здатність до мініатюризації та до великого ступеня інтеграції в разі ви< користання недорогої тонкоплівкової стан< дартної технології; дешевизна за умов масо< вого виробництва. Як відомо, типовим недоліком кондуктометричного методу ви< мірювання є залежність сигналу від загаль< ної провідності розчинів, але у випадку фер< ментних кондуктометричних біосенсорів цього можна уникнути, застосовуючи дифе< ренційний режим вимірювань [15]. Саме наявність зазначених переваг ро< бить перспективним створення кондуктомет< ричного сахарозного біосенсора з викорис< танням каскаду реакцій триферментної системи. Матеріали і методи У дослідженнях використовували препа< рати ліофілізованих ферментів: ГОД із Peni$ cillium vitale (ЕС 1.1.3.4.) з активністю 130 U/мг фірми «Діагностикум»; інвертазу (β<фруктофуранозидазу, ЕС 3.2.1.26) із пекар< ських дріжджів з активністю 355 U/мг фірми Sigma<Aldrich Chеmie (Німеччина); мутарота< зу (ЕС 5.1.3.3.) з активністю 100 U/мг фірми Biozyme Laborаtories Ltd (Великобританія). Бичачий сироватковий альбумін (БСА, фракція V) та 50%<й водний розчин глута< рового альдегіду (ГА) було отримано від фір< ми Sigma<Aldrich Chеmie (Німеччина). Як субстрат і речовину для аналізів використо< вували цукрозу. Робочим буфером був калій< фосфатний розчин (КН2Р04<NаОН), рН 7,2, фірми Меrck (Німеччина). Інші неорганічні сполуки, що їх за< стосовували в роботі, були вітчизня< ного виробництва зі ступенем чистоти «х.ч.» та «ч.д.а.». Використовували також вимірювальну установку та перетворювачі, детально описані в попередніх роботах [16, 17]. Виготовлення біоселективних мембран. Для виготовлення робо< чої мембрани готували розчин зі вмістом ферментів: інвертаза — 4%, мутаротаза — 3%, глюкозоок< сидаза — 3% (далі — триферментний розчин) у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, з 10%<м гліцерол. Суміш для приготування рефере< нтної мембрани готували так само, але замість ферментів брали тільки БСА. Перед нанесенням на поверхню перетворювача розчини для референтної і робочої мембран змішували з 2%<м водним розчином глута< рового альдегіду у співвідношенні 1:1 і на< носили суміші на робочі поверхні гребінчас< тих електродів. Обидві мембрани мали однаковий вміст білка. Потім сенсори вису< шували протягом 20 хв на повітрі при кімнатній температурі. Перед початком ро< боти для вимивання надлишку ГА сенсор за< нурювали у буферний розчин, в якому і про< водили подальші досліди. Методика вимірювання. Вимірювання проводили у 5мМ фосфатному буфері та уні< версальному буфері з різним рН при кімнатній температурі у відкритій комірці за інтенсив< ного перемішування. Концентрацію субстра< тів у комірці задавали, додаючи до робочого буфера порціями стандартні концентровані вихідні розчини субстрату. Дослідження здійснювали щонайменше у трьох серіях. Нові методи БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №1, 2008 118 Рис.1. Залежність величини відгуку біосенсора від іонної сили розчину. Вимірювання проводили в 5 мМ фосфатному буфері, рН 7,5 Рис. 2. Залежність відгуку сенсора від концентрації сахарози при різних концентраціях буфера. Вимірювання проводили у 2,5 мМ (1), 5мМ (2), 10 мМ(3) і 20 мМ (4) фосфатних буферах, рН 7,2 ра, є іонна сила. Щоб дослідити цей вплив, було проведено вимірювання величини сиг< налу на одну концентрацію субстрату (1 мМ сахарози) із додаванням у розчин KCl у різних концентраціях (від 1 мМ до 100 мМ) (рис. 1). Із побудованого на основі одержаних даних графіка видно, що зі збільшенням іонної си< ли відгук на концентрацію субстрату змен< шується за експонентою: спочатку спос< терігається значне зменшення величини відгуків біосенсора, при концентрації 50 мМ KCl величина сигналу падає до 5%, а за по< дальшого додавання KCl сигнал залишаєть< ся стабільним. Одна з головних причин такої залежності пов’язана зі зростанням фонової провідності розчину. Тому під час проведен< ня вимірювань за допомогою кондуктомет< ричного біосенсора дуже важливим є конт< роль іонної сили аналізованих зразків. На рис.2 подано калібрувальні графіки залежності величини відгуку біосенсора від концентрації сахарози в буферному розчині для різних буферних ємностей. Видно, що зі зміною концентрації буферного розчину певною мірою змінюються величини відгу< ків біосенсора та лінійний діапазон визначен< ня. Чутливість кондуктометричного біосен< сора щодо наявності цукрози виявилася найбільшою у 2,5 мМ фосфатному буфері, рН 7,2. Але в даному разі лінійний діапазон роботи біосенсора був зсунутий у бік низь< ких концентрацій. Біосенсор визначав лі< нійну залежність величини відгуку від кон< центрації сахарози в діапазоні 0,001–2,5 мМ. Під час роботи біосенсора в 5 мМ фосфатно< му буфері лінійний діапазон визначення са< харози дещо ширший — 0,002–5 мМ (рис. 2). У разі роботи біосенсора в 10 та 20 мМ фос< Неспецифічні зміни вихідного сигналу, пов’язані з коливанням температури, рН се< редовища, електричними наводками, при< гнічували, застосовуючи диференційний ре< жим вимірювань. Результати та обговорення В основі роботи кондуктометричного біосенсора для визначення вмісту сахарози лежить каскад ферментативних реакцій: інвертаза цукроза + Н2О ————→ β<D<фруктоза + + α<D<глюкоза; (1) мутаротазаα< D<глюкоза ————→ β<D<глюкоза; (2) ГОДβ<D<глюкоза + О2 ——→ D<глюконолактон + + Н2О2; (3) ⇓ D<глюконова кислота + Н2О залишок кислоти + Н+. (4) Інвертаза, мутаротаза і глюкозооксидаза поступово розщеплюють цукрозу до перок< сиду водню та D<глюконолактону. Глюконо< лактон, у свою чергу, спонтанно гідролізує< ться до глюконової кислоти, яка дисоціює на залишок кислоти і протон. За таких умов змінюється провідність розчину, яку можна реєструвати за допомогою кондуктометрич< ного перетворювача [18]. Зміна провідності може залежати як від самої ферментативної реакції, так і від ха< рактеристик розчину, в якому ця реакція відбувається. Тому насамперед було дослі< джено вплив параметрів розчину на величи< ну відгуку створеного нами сенсора. Важливою характеристикою буфера, яка може негативно впливати на вимірювання за допомогою кондуктометричного біосенсо< Сахароза,Сахароза, Нові методи 119 Нові методи Рис. 3. Залежність відгуку біосенсора від рН розчину. Вимірювання проводили в універсальному буфері, концентрація сахарози становила 1мМ Рис. 4. Відтворюваність сигналу протягом одного робочого дня. Вимірювання проводили у 5мМ фосфатному буфері, рН 7,2 Рис. 5. Операційна стабільність кондуктометричного біосенсора для визначення сахарози. Вимірювання проводили у 5мМ фосфатному буфері, рН 7,2 фатному буфері чутливість його щодо саха< рози знижувалась. Отже, використовуючи для проведення аналізу буферні розчини різної концентрації, можна одержувати різні діапазони роботи створеного нами сенсора з різною чутливістю, що дає змогу адаптува< ти його до конкретних прикладних завдань. Як відомо, кожен фермент має певний рН<оптимум для своєї роботи. Деякі фер< менти після їх іммобілізації здатні змінюва< ти свій рН<оптимум, зсуваючи його або в луж< ну, або в кислу зону. В нашому випадку маємо суміш трьох іммобілізованих на пове< рхню сенсора ферментів з різними рН<опти< мумами. Тому наступним нашим завданням було знайти оптимальний рН буфера для ро< боти всіх ферментів та, відповідно, кондук< тометричного біосенсора для визначення вмісту сахарози. Відомо, що однокомпонент< ний буфер змінює буферну ємність у разі зміни його рН. Щоб уникнути впливу бу< ферної ємності на величину відгуку, було досліджено залежність відгуку сенсора від рН універсального багатокомпонентного бу< фера, який характеризується однаковою бу< ферною ємністю в широкому діапазоні зна< чень рН. Він складається із суміші різних буферних розчинів (фосфорна, оцтова, бор< на кислоти з концентрацією 0,04 М) у діапа< зоні рН від 3,5 до 8,5 [18]. Графік залеж< ності величини сигналу на внесення 1 мМ сахарози від рН мав дзвоникоподібну форму з максимумом при рН 6 (рис. 3). Однією з найважливіших характеристик біосенсорів є операційна стабільність та від< творюваність сигналу. Протягом кожного з чотирьох робочих днів з інтервалом 30 хв одержували відгуки біосенсора на одну й ту саму концентрацію сахарози — 0,5 мМ, при цьому сенсор весь час між вимірюваннями за< лишався в буфері під постійним перемішуван< ням. У той час, коли біосенсори не використо< вувались в аналізах, їх зберігали в сухому стані при кімнатній температурі. Вибрана для досліджень концентрація сахарози знаходилась на лінійному відрізку калібрувальної кривої біосенсора. Як видно з рис. 4, сенсор упродовж усіх днів дослідження характеризувався висо< кою відтворюваністю, а протягом тижня — високою операційною стабільністю (рис. 5). З метою можливої подальшої комерціалі< зації розробленого біосенсора було проведено низку дослідів з вивчення стабільності біо< сенсорів за певних умов їх зберігання (рис. 6). Біосенсори зберігали в 5 мМ фосфатному БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №1, 2008 120 буферному розчині, рН 6,0, при температурі +20 0С та +4 0С, а також у сухих умовах при температурі +20 0С, +4 0С та –4 0С. На третій день після створення сахарозних біосенсорів одержали відгук на внесення 1 мМ сахарози в модельний розчин, величину якого було прийнято за 100%. Подальші виміри прово< дили через певний проміжок часу (5–8 днів). Активність біосенсорів, які зберігали в сухих умовах при температурі –4 0С та +4 0С, залишалась майже стабільною упродовж міся< ця. Однак протягом 4 місяців зберігання їхня активність знизилась у 10 разів. Сахарозні біосен< сори, що зберігались у фосфатному буфері при +4 0С та в сухих умовах при +20 0С, втрачали свою активність протягом місяця, тимчасом як біосенсори, що містились у фосфатному буфері при +20 0С, не давали відгуку на додавання сахарози вже на 20<й день. До втрати активності розробленого три< ферментного біосенсора може призвести де< натурація чи дезактивація хоча б одного ферменту в складі мембрани. Відомо, що ім< мобілізована глюкозооксидаза є високоста< більною [9, 19], тому основними факторами, які можуть знизити активність біосенсора, є дезактивація мута< ротази або інвертази. Однією з причин втра< ти активності мута< ротази може бути окис< нення пероксидом водню, який генерує< ться під час гідролізу глюкози глюкозоок< сидазою [20]. Також у роботі [19] було по< казано, що стабільність саме інвертази є лі< мітуючим фактором стабільності всього біо< сенсора. Але в будь<якому разі створений на< ми сахарозний біосенсор при низьких температурах та в сухих умовах зберігання залишається у стабільному робочому стані довше, ніж при вищих температурах та збе< ріганні в буферному розчині, що й плануєть< ся використати надалі. Для виконання робіт із реальними зраз< ками потрібно було також перевірити селек< тивність розробленого сахарозного біосенсора. Було проведено низку дослідів із досліджен< ня впливу інтерферуючих компонентів на відгук цукрозного біосенсора. Дослідження проводили в 10 мМ фосфатному буфері, рН 7,0. В експериментальну комірку вноси< ли розчин з 1 мМ можливої інтерферуючої речовини (таблиця). Відгук сенсора розра< ховували у відсотках. Загалом, сахарозний біосенсор виявився селективним стосовно інтерферуючих речо< вин, які можуть бути присутні в соках, за винятком глюкози. Величина відгуку саха< розного біосенсора на 1 мМ глюкози стано< вила 165% порівняно з величиною відгуку на цукрозу тієї самої концентрації. Це ціл< ком зрозуміло, оскільки до складу фермент< ної мембрани сахарозного біосенсора вхо< дить глюкозооксидаза. Таким чином, уперше створено кондук< тометричний біосенсор для визначення саха< рози, в якому складна триферментна мемб< рана відіграє роль чутливого елемента, й оптимізовано його аналітичні характерис< тики для роботи з модельними розчинами. Розроблений кондуктометричний біосенсор характеризується високою операційною стабільністю та відтворюваністю сигналу. Наступний етап роботи передбачає відпра< цювання методики визначення сахарози в ре< альних зразках (сік, вино, мед тощо). Рис. 6. Залежність відгуку біосенсорів, які зберігали в 5 мМ буфері при+4 0С (1) та +20 0С (2), у сухому стані при +20 0С (3), –4 0С (4) та +4 0С (5), від часу їхньої роботи Субстанції, 1 мМ Відносний відгук сахарозного сенсора, % Сахароза 100 Мальтоза 10 Лактоза 0 Глюкоза 165 Фруктоза 1 Сорбіт 0 Рамноза 0 Маніт 0 Арабіноза 0 Аскорбінова кислота 0 Селективність сахарозного біосенсора Нові методи 121 Нові методи 1. Schmid D. R., Scheller F. Biosensors. Application in medicine, environmental protection and process control. — Weinheim: VCH, 1990. 2. Tsao J.C.Y. New by<products from molasses // Sugar y Azucar. — 1964. — V. 59, N. 9. — P. 98–99. 3. Schiweck H. Zusammensetzung von Zu< ckerrubenmelassen // Zuckerindustrie. — 1994. — V. 119, N. 4. — P. 272–282. 4. Thielecke K. Zur Zusammensetzung von Rubenmelassen // Branntweinwirtschaft. — 1987. — V. 127, N. 13. — P. 193–195. 5. Herbreteau B., Lafosse M., Morin$Allory L., Dreux M. Automatic sugar analysis in the beet industry. Part I // High Res. Chro< matogr. — 1990. — V. 13. — P. 239–243. 6. Vercelotti S. V., Clarke M. A. Comparison of modern and traditional methods of sugar analysis // Int. Sugar J. — 1994. — V. 96. — P. 437–445. 7. Lima Filho J. L., Pandey P. C., Weetall H. H. An amperometric flow injection analysis enzyme sensor for sucrose using a tetra< cyanoquinodimethane modifies graphite paste electrode // Biosensors Bioelectro< nics. — 1996. — V. 11. — P. 719–723. 8. Filipiak M., Fludra K. Gosciminska E. Enzymatic membranes for determination of some disaccharides by means of an oxy< gen electrode // Ibid. — 1996. — V. 11. — Р.355–364. 9. Gouda M. D, Kumar M. A, Thakur M. S., Karanth N. G. Enhancement of opera< tional stability of an enzyme biosensor for glucose and sucrose using protein based stabilizing agents // Ibid. — 2002. — V. 17. — Р. 503–507. 10. Guemas Y., Boujtita M., el Murr N. Biosen< sor for determination of glucose and suc< rose in fruit juices by flow injection analy< sis // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2000. — V. 89. — P. 81–89. 11. Enfors S.O. Oxygen<stabilized enzyme electrode for d<glucose in fermentation broths // Enzym. Microbiol. Technol. — 1981. — V. 3. — P. 29–34. 12. Barlikova A., Svorc J., Miertus S. Hybrid biosensor for the determination of sucrose // Anal. Chim. Acta. — 1991. — V. 247. — P. 83–89. 13. Шкотова Л. В., Солдаткин А. П., Дзяде$ вич С. В. Адаптация амперометрическо< го биосенсора для анализа глюкозы в ви< нах // Укр. біохім. журн. — 2004. — Т. 76, №3 — C. 114–121. 14. Van Os P. J. H. J., Bult A., van Bennekom W. P. A glucose sensor, interference free for ascorbic acid // Anal. Chim. Acta. — 1995. — V.305. — P. 18–28. 15. Дзядевич С. В. Кондуктометричні фер< ментні біосенсори: теорія, технологія, застосування // Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, №2 — C. 91–106. 16. Дзядевич С. В., Шульга А. А., Пацковс$ кий С. В. и др. Тонкопленочные кондук< тометрические датчики для фермента< тивных биосенсоров // Электрохимия. — 1994. — Т. 30, № 8. — С. 982 — 987. 17. Солдаткін О. О., Сосовська О. Ф., Беніло$ ва І. В. та ін. // Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, №5. — C. 425–432. 18. Лурье Ю. Ю. Справочник по аналитичес< кой химии. — М.: Химия, 1967. — С. 230. 19. Haghighi B., Varma S., Alizadeh F. M. Prussian blue modified glassy carbon elec< trodes. Study on operational stability and its application as a sucrose biosensor // Talanta. — 2004. — N 64. — P. 3–12. 20. Scheller F.W., Hintsche R., Pfeiffer D. Bio< sensors: Fundamentals, applications and trends // Sens. Actuators. B. — 1991. — N 4. — P. 194–199. ЛІТЕРАТУРА БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №1, 2008 122 КОНДУКТОМЕТРИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ ТРЕХФЕРМЕНТНОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРОЗЫ А. А. Солдаткин1 В. Н. Пешкова1,2 С. В. Дзядевич1 А. В. Ельская1 1Институт молекулярной биологии и гене< тики НАН Украины, Киев 2 Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко E$mail: alex_sold@yahoo.com Приведены сведения о впервые созданном биосенсоре для определения сахарозы, в ко< тором сложная трехферментная мембрана играет роль чувствительного элемента, им< мобилизованного на кондуктометрический преобразователь. Время определения конце< нтрации сахарозы в растворе — 1–2 мин. Динамический диапазон определения мо< жет изменяться в зависимости от буферной емкости и в 5 мМ фосфатном буферном раст< воре составляет 2 мкМ — 5 мМ сахарозы. Исследована зависимость работы биосенсо< ра от рН и ионной силы раствора. Представ< лены также данные по селективности сенсо< ра и хранению его в разных условиях. Разработанный кондуктометрический био< сенсор характеризуется высокой операцион< ной стабильностью и воспроизводимостью сигнала и пригоден для использования в ре< альных условиях. Ключевые слова: сахароза, глюкоза, кондуктомет< рический биосенсор, инвертаза, мутаротаза, глюко< зооксидаза. CONDUCTOMETRIC BIOSENSOR BASED ON THE THREE6ENZYME SYSTEM FOR DETERMINATION OF SUCROSE O. O. Soldatkin1 V. M. Peshkova1,2 S. V. Dzyadevych1 H. V. Elska1 1Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv 2National Taras Shevchenko University, Kyiv E$mail: alex_sold@yahoo.com In the course of this study, a biosensor for sucrose determination, with a complex three< enzyme membrane representing a sensitive element immobilized onto a conductometric transducer, has been created. The time of determining sucrose concentration in the solu< tion is 1–2 minutes. The dynamic range of determination may vary depending on buffer capacity and amounts to 2 µM — 5 mM of sucrose in 5 mM of phosphate buffer solution. In this work the dependence on pH and ionic strength of the solution has been analyzed. The developed conductometric biosensor is characterized by high operational stability and repeatability of the response. The data on sensor selectivity and its storage in different conditions are presented as well. The sensor turned out to be suitable for usage in real<life environment. Key words: sucrose, glucose, conductometric biosen< sor, invertase, mutarotase, glucoseoxidase. << /ASCII85EncodePages false /AllowTransparency false /AutoPositionEPSFiles true /AutoRotatePages /None /Binding /Left /CalGrayProfile (Dot Gain 20%) /CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2) /sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CannotEmbedFontPolicy /Warning /CompatibilityLevel 1.4 /CompressObjects /Tags /CompressPages true /ConvertImagesToIndexed true /PassThroughJPEGImages true /CreateJDFFile false /CreateJobTicket false /DefaultRenderingIntent /Default /DetectBlends true /ColorConversionStrategy /LeaveColorUnchanged /DoThumbnails false /EmbedAllFonts true /EmbedJobOptions true /DSCReportingLevel 0 /EmitDSCWarnings false /EndPage -1 /ImageMemory 1048576 /LockDistillerParams false /MaxSubsetPct 100 /Optimize true /OPM 1 /ParseDSCComments true /ParseDSCCommentsForDocInfo true /PreserveCopyPage false /PreserveEPSInfo true /PreserveHalftoneInfo false /PreserveOPIComments false /PreserveOverprintSettings true /StartPage 1 /SubsetFonts false /TransferFunctionInfo /Apply /UCRandBGInfo /Preserve /UsePrologue false /ColorSettingsFile () /AlwaysEmbed [ true ] /NeverEmbed [ true ] /AntiAliasColorImages false /DownsampleColorImages true /ColorImageDownsampleType /Bicubic /ColorImageResolution 300 /ColorImageDepth -1 /ColorImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeColorImages false /ColorImageFilter /DCTEncode /AutoFilterColorImages true /ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG /ColorACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /ColorImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000ColorACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000ColorImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasGrayImages false /DownsampleGrayImages true /GrayImageDownsampleType /Bicubic /GrayImageResolution 300 /GrayImageDepth -1 /GrayImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeGrayImages false /GrayImageFilter /DCTEncode /AutoFilterGrayImages true /GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG /GrayACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /GrayImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000GrayACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000GrayImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasMonoImages false /DownsampleMonoImages false /MonoImageDownsampleType /Bicubic /MonoImageResolution 1200 /MonoImageDepth -1 /MonoImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeMonoImages true /MonoImageFilter /CCITTFaxEncode /MonoImageDict << /K -1 >> /AllowPSXObjects false /PDFX1aCheck false /PDFX3Check false /PDFXCompliantPDFOnly false /PDFXNoTrimBoxError true /PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXSetBleedBoxToMediaBox true /PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXOutputIntentProfile (None) /PDFXOutputCondition () /PDFXRegistryName (http://www.color.org) /PDFXTrapped /Unknown /Description << /JPN <FEFF3053306e8a2d5b9a306f30019ad889e350cf5ea6753b50cf3092542b308030d730ea30d730ec30b9537052377528306e00200050004400460020658766f830924f5c62103059308b3068304d306b4f7f75283057307e305930023053306e8a2d5b9a30674f5c62103057305f00200050004400460020658766f8306f0020004100630072006f0062006100740020304a30883073002000520065006100640065007200200035002e003000204ee5964d30678868793a3067304d307e305930023053306e8a2d5b9a306b306f30d530a930f330c8306e57cb30818fbc307f304c5fc59808306730593002> /FRA <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> /DEU <FEFF00560065007200770065006e00640065006e0020005300690065002000640069006500730065002000450069006e007300740065006c006c0075006e00670065006e0020007a0075006d002000450072007300740065006c006c0065006e00200076006f006e0020005000440046002d0044006f006b0075006d0065006e00740065006e0020006d00690074002000650069006e006500720020006800f60068006500720065006e002000420069006c0064006100750066006c00f600730075006e0067002c00200075006d002000650069006e00650020007100750061006c00690074006100740069007600200068006f006300680077006500720074006900670065002000410075007300670061006200650020006600fc0072002000640069006500200044007200750063006b0076006f0072007300740075006600650020007a0075002000650072007a00690065006c0065006e002e00200044006900650020005000440046002d0044006f006b0075006d0065006e007400650020006b00f6006e006e0065006e0020006d006900740020004100630072006f0062006100740020006f0064006500720020006d00690074002000640065006d002000520065006100640065007200200035002e003000200075006e00640020006800f600680065007200200067006500f600660066006e00650074002000770065007200640065006e002e00200042006500690020006400690065007300650072002000450069006e007300740065006c006c0075006e00670020006900730074002000650069006e00650020005300630068007200690066007400650069006e00620065007400740075006e00670020006500720066006f0072006400650072006c006900630068002e> /PTB <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> /DAN <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> /NLD <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> /ESP <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> /SUO <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> /ITA <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> /NOR <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> /SVE <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> /ENU <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> >> >> setdistillerparams << /HWResolution [2400 2400] /PageSize [612.000 792.000] >> setpagedevice

Кондуктометричний біосенсор на основі триферментної системи для визначення сахарози

Репозитарії

Схожі ресурси