Новий амперометричний біосенсор на основі гліцеролоксидази для визначення вмісту гліцеролу

Проведено порівняльний аналіз ефективності використання різних за способом одержання та характеристиками препаратів гліцеролоксидази для створення амперометричного біосенсора, призначеного для визначення вмісту гліцеролу. Вибрано препарат ферменту, після іммобілізації якого на поверхню перетворювача...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2008
Hauptverfasser:	Горюшкіна, Т.Б., Шкотова, Л.В., Гайда, Г.З., Клепач, Г.М., Гончар, М.В., Солдаткін, О.П., Дзядевич, С.В.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України 2008
Schlagworte:	Нові методи
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/4060
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Новий амперометричний біосенсор на основі гліцеролоксидази для визначення вмісту гліцеролу / Т. Б. Горюшкіна, Л. В. Шкотова, Г. З. Гайда, Г. М. Клепач, М. В. Гончар, О. П. Солдаткін, С. В. Дзядевич // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 3. — С. 64-71. — Бібліогр.: 21 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-4060
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-40602013-02-13T02:13:20Z Новий амперометричний біосенсор на основі гліцеролоксидази для визначення вмісту гліцеролу Горюшкіна, Т.Б. Шкотова, Л.В. Гайда, Г.З. Клепач, Г.М. Гончар, М.В. Солдаткін, О.П. Дзядевич, С.В. Нові методи Проведено порівняльний аналіз ефективності використання різних за способом одержання та характеристиками препаратів гліцеролоксидази для створення амперометричного біосенсора, призначеного для визначення вмісту гліцеролу. Вибрано препарат ферменту, після іммобілізації якого на поверхню перетворювача сенсор демонструє найкращі аналітичні характеристики. Визначено рН оптимум роботи амперометричного біосенсора, показано, що величина буферної ємності та концентрація фонового електроліту не впливають на його роботу. За допомогою створеного амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої гліцеролоксидази здійснено аналіз гліцеролу у модельних розчинах. Проведен сравнительный анализ эффективности использования различных по способу получения и характеристикам препаратов глицеролоксидазы для создания амперометрического биосенсора для определения содержания глицерола. Выбран препарат фермента, после иммобилизации которого на поверхность преобразователя сенсор демонстрирует лучшие аналитические характеристики. Определен рН-оптимум работы биосенсора, показано, что величина буферной емкости и концентрация фонового электролита не влияют на его работу. С помощью созданного амперометрического биосенсора на основе иммобилизированной глицеролооксидазы осуществлен анализ глицерола в модельных астворах. The paper presents comparative effectiveness analysis of glycerol oxidase preparations, used for development of amperometric biosensor for glycerol determination, which are different in method of preparation and in characteristics. Enzyme preparation, whose immobilization on transducer surface results in sensor demonstrating its best operational characteristics, was selected. PH-optimum for the operation of the developed amperometric biosensor was determined; the values of buffer volume and background electrolyte concentration in buffer were shown to have no effect on the work of glycerol biosensor. The analysis of glycerol concentration in sample solutions was carried out using the developed amperometric biosensor based on glycerol oxidase. 2008 Article Новий амперометричний біосенсор на основі гліцеролоксидази для визначення вмісту гліцеролу / Т. Б. Горюшкіна, Л. В. Шкотова, Г. З. Гайда, Г. М. Клепач, М. В. Гончар, О. П. Солдаткін, С. В. Дзядевич // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 3. — С. 64-71. — Бібліогр.: 21 назв. — укр. http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/4060 577.15 + 543.6 + 543.9 + 543.55 uk Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Нові методи Нові методи
spellingShingle	Нові методи Нові методи Горюшкіна, Т.Б. Шкотова, Л.В. Гайда, Г.З. Клепач, Г.М. Гончар, М.В. Солдаткін, О.П. Дзядевич, С.В. Новий амперометричний біосенсор на основі гліцеролоксидази для визначення вмісту гліцеролу
description	Проведено порівняльний аналіз ефективності використання різних за способом одержання та характеристиками препаратів гліцеролоксидази для створення амперометричного біосенсора, призначеного для визначення вмісту гліцеролу. Вибрано препарат ферменту, після іммобілізації якого на поверхню перетворювача сенсор демонструє найкращі аналітичні характеристики. Визначено рН оптимум роботи амперометричного біосенсора, показано, що величина буферної ємності та концентрація фонового електроліту не впливають на його роботу. За допомогою створеного амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої гліцеролоксидази здійснено аналіз гліцеролу у модельних розчинах.
format	Article
author	Горюшкіна, Т.Б. Шкотова, Л.В. Гайда, Г.З. Клепач, Г.М. Гончар, М.В. Солдаткін, О.П. Дзядевич, С.В.
author_facet	Горюшкіна, Т.Б. Шкотова, Л.В. Гайда, Г.З. Клепач, Г.М. Гончар, М.В. Солдаткін, О.П. Дзядевич, С.В.
author_sort	Горюшкіна, Т.Б.
title	Новий амперометричний біосенсор на основі гліцеролоксидази для визначення вмісту гліцеролу
title_short	Новий амперометричний біосенсор на основі гліцеролоксидази для визначення вмісту гліцеролу
title_full	Новий амперометричний біосенсор на основі гліцеролоксидази для визначення вмісту гліцеролу
title_fullStr	Новий амперометричний біосенсор на основі гліцеролоксидази для визначення вмісту гліцеролу
title_full_unstemmed	Новий амперометричний біосенсор на основі гліцеролоксидази для визначення вмісту гліцеролу
title_sort	новий амперометричний біосенсор на основі гліцеролоксидази для визначення вмісту гліцеролу
publisher	Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
publishDate	2008
topic_facet	Нові методи
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/4060
citation_txt	Новий амперометричний біосенсор на основі гліцеролоксидази для визначення вмісту гліцеролу / Т. Б. Горюшкіна, Л. В. Шкотова, Г. З. Гайда, Г. М. Клепач, М. В. Гончар, О. П. Солдаткін, С. В. Дзядевич // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 3. — С. 64-71. — Бібліогр.: 21 назв. — укр.
work_keys_str_mv	AT gorûškínatb novijamperometričnijbíosensornaosnovíglíceroloksidazidlâviznačennâvmístuglícerolu AT škotovalv novijamperometričnijbíosensornaosnovíglíceroloksidazidlâviznačennâvmístuglícerolu AT gajdagz novijamperometričnijbíosensornaosnovíglíceroloksidazidlâviznačennâvmístuglícerolu AT klepačgm novijamperometričnijbíosensornaosnovíglíceroloksidazidlâviznačennâvmístuglícerolu AT gončarmv novijamperometričnijbíosensornaosnovíglíceroloksidazidlâviznačennâvmístuglícerolu AT soldatkínop novijamperometričnijbíosensornaosnovíglíceroloksidazidlâviznačennâvmístuglícerolu AT dzâdevičsv novijamperometričnijbíosensornaosnovíglíceroloksidazidlâviznačennâvmístuglícerolu
first_indexed	2025-07-02T07:18:12Z
last_indexed	2025-07-02T07:18:12Z
_version_	1836518676449198080
fulltext	64 Визначення концентрації гліцеролу має особливо велике значення у виноробстві. Необхідність і важливість детекції цього продукту бродіння можна пояснити тим, що з усіх компонентів вина кількісно він посту� пається лише етиловому спирту. Загальна кількість гліцеролу, яка формується упро� довж процесу ферментації сусла, становить від 1:10 до 1:15 кількості спирту з кінцевою концентрацією від 1 до 10 г/л [2]. Вагому роль гліцерол відіграє у формуванні смаку вин, наданні їм маслянистості та м’якості [2–4]. Саме тому точні відомості про наяв� ність та концентрацію гліцеролу в алкоголь� них напоях є важливим показником їхньої якості. Визначення вмісту гліцеролу є також важливим у клінічній діагностиці для конт� ролю рівня триацилгліцеридів у крові, оскільки моніторинг цих сполук має прог� ностичне значення для зменшення ризику захворювань серцево�судинної системи [5]. Сучасні стандартні методи визначення глі� церолу, такі як рідинна хроматографія та спект� рофотометричні підходи на основі хімічних і ферментативних реакцій, зокрема оксидаз� но�пероксидазний метод [6, 7], потребують Гліцерол є одним із метаболітів спирто� вого бродіння, його широко використовують у виробництві та фармакології. Ще в 1857 ро� ці Л. Пастер у своїх класичних досліджен� нях алкогольного бродіння показав, що крім головних продуктів бродіння — спирту та вуглекислоти — утворюються побічні продукти, у тому числі й гліцерол (2,5–3,6 г на 100 г збродженого цукру) [1]. Велика кількість гліцеролу утворюється у процесі бродіння сусла в присутності бісульфіту натрію. У цьому разі оцтовий альдегід, який зазвичай є акцептором водню, зв’язується бісульфітом, а його місце у ланцюгу пере� творень займають діоксіацетофосфат та 3�фос� фогліцероловий альдегід; вони отримують водень від відновленого коферменту НАД·Н2, утворюючи 1�гліцерофосфат, який у резуль� таті дефосфорилювання перетворюється на гліцерол. Таке бродіння називається гліце� ропіруватним і має найбільшу інтенсивність у перші фази процесу бродіння. Воно віді� грає важливу роль у синтезі багатьох вто� ринних продуктів, які впливають на якість вина [1]. Гліцерол також утворюється в тому разі, якщо бродіння сусла відбувається в лужному середовищі. НОВІ МЕТОДИ Проведено порівняльний аналіз ефективності використання різних за способом одержання та характеристи� ками препаратів гліцеролоксидази для створення амперометричного біосенсора, призначеного для визначення вмісту гліцеролу. Вибрано препарат ферменту, після іммобілізації якого на поверхню перетворювача сенсор де� монструє найкращі аналітичні характеристики. Визначено рН�оптимум роботи амперометричного біосенсора, показано, що величина буферної ємності та концентрація фонового електроліту не впливають на його роботу. За допомогою створеного амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої гліцеролоксидази здійснено аналіз гліцеролу у модельних розчинах. Горюшкіна Т. Б.1, 2 Шкотова Л. В.1 1Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ Гайда Г. З.3 2Київський національний університет імені Тараса Шевченка Клепач Г. М.3, 4 3Інститут біології клітини НАН України, Львів Гончар М. В.3 4Дрогобицький державний педагогічний університет ім. Івана Франка Солдаткін О. П.1 Е/mail: dzyad@yahoo.com Дзядевич С. В.1 УДК 577.15 + 543.6 + 543.9 + 543.55 НОВИЙ АМПЕРОМЕТРИЧНИЙ БІОСЕНСОР НОВИЙ АМПЕРОМЕТРИЧНИЙ БІОСЕНСОР НА ОСНОВІ ГЛІЦЕРОЛОКСИДАЗИ НА ОСНОВІ ГЛІЦЕРОЛОКСИДАЗИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУ ГЛІЦЕРОЛУДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУ ГЛІЦЕРОЛУ Ключові слова: амперометричний біосенсор, гліцеролоксидаза, гліцерол, іммобілізація, електрохімічна полімеризація. Нові методи 65 наявності кваліфікованого персоналу, склад� ного й дорогого обладнання, необхідного для проведення рідинної хроматографії та спект� рофотометрії. Ще одним недоліком зазначе� них методів є потреба у досить складній по� передній підготовці проб для аналізу. Відомі фірми Boehringer Mannheim (Ні� меччина) та Sigma (США) пропонують тест�на� бори для ферментативного аналізу гліцеролу. Висока вартість наборів часто зумовлена не� обхідністю використання кількох ферментів та коферментів або косубстратів. Наприклад, мультиферментна система [8] включає три ферменти — гліцеролкіназу, піруваткіназу та лактатдегідрогеназу, а також потребує при� сутності коферменту — NADH і двох косуб� стратів — ATP та фосфоенолпірувату: гліцеролкіназа Гліцерол + ATP ——→Гліцеролфосфат + ADP; піруваткіназа Фосфоенолпіруват + ADP → Піруват + ATP; лактатдегідрогеназа Піруват + NADН(Н+) ——→ Лактат + NAD+. За цим методом концентрацію гліцеролу визначають за зменшенням кількості спо� житого NADH, який реєструють фотомет� рично при довжині хвилі 340 нм. Іншим методом для визначення вмісту гліцеролу є двоферментний, у першому ва� ріанті якого використовують гліцеролкіна� зу і гліцерол�3�фосфатдегідрогеназу, а моні� торинг реакції здійснюють за утворенням NADH(Н+) при 340 нм: гліцеролкіназа Гліцерол + ATP ——→ Гліцерол�3�фосфат + + ADP гліцерол�3Р�дегідрогеназа Гліцерол�3�фосфат + NAD+ ——→ Дигідроксі� ацетонфосфат + + NADН(Н+). У другому варіанті двоферментного мето� ду гліцерол�3�фосфатдегідрогеназна реакція замінена на гліцерол�3�фосфатоксидазну, що покладено в основу діагностичного набо� ру для визначення гліцеролу: гліцерол�3Р�оксидаза Гліцерол�3�фосфат + О2 ——→ Дигідроксі� ацетонфосфат + Н2О2 пероксидаза Н2О2 + хромоген (�2Н) ——→ Барвник + 2Н2О. Третій метод для визначення вмісту глі� церолу — дегідрогеназний — ґрунтується на визначенні кількості NADH(Н+), генерова� ного в результаті ферментативної реакції, каталізованої гліцеролдегідрогеназою: гліцеролдегідрогеназа Гліцерол + NAD+ ——→ Гліцеральдегід + NADН(Н+). Використання цього методу в аналітичній практиці є ускладненим, оскільки реакція окиснення гліцеролу гліцеролдегідрогена� зою є оборотною, а фермент — недостатньо селективний. Традиційні ферментативні підходи для визначення гліцеролу недостатньо селек� тивні, як і в разі дегідрогеназних реакцій, або неекономічні у повсякденному викорис� танні їх в лабораторії. З огляду на це сьогод� ні є актуальним питання створення більш зручного, точного, селективного, швидкого та дешевого методу визначення вмісту гліце� ролу в різноманітних харчових продуктах. Розроблення та створення ферментних біосенсорів для визначення вмісту гліцеро� лу може вирішити проблеми, пов’язані з пе� реліченими вище недоліками, та задоволь� нити усім вищезазначеним вимогам. Головна перевага біосенсорів — висока спе� цифічність, швидкість отримання резуль� татів, легкість оброблення даних та низька собівартість аналізу. На цей час розроблено й досліджено чи� мало біосенсорів, призначених для детекції гліцеролу. Їх було створено на основі фер� ментів гліцеролдегідрогенази [4, 9] та гліце� ролкінази, коіммобілізованої з гліцерол�3� фосфатоксидазою [2]. В останньому випадку головним недоліком створеного біосенсора була його низька стабільність: після трьох днів зберігання в робочому буфері залиша� лось 10% активності ферментів. У разі вико� ристання гліцеролдегідрогенази істотним недоліком біосенсора, який суттєво підви� щує собівартість аналізу, є те, що цей фер� мент не містить у своєму складі кофактору (НАД), а тому його потрібно вводити в систе� му додатково. При цьому НАД може легко дифундувати з ферментативної мембрани, спричинюючи значне зниження чутливості біосенсора [9]. Створення амперометричного біосенсора на основі гліцеролоксидази (ГО) може стати гідною уваги альтернативою вищезазначе� ним датчикам, адже цей фермент уже містить у своїй структурі природний кофак� тор — ФАД. БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008 66 Схема А — фракціонування ацетоном. До БЕ (питома активність ГО — 0,16–0,2 мкмоль·хв–1·мг–1 білка) додавали охолоджений (–25 0С) ацетон до 10 %, інку� бували 30 хв при –10 0С, центрифугували (15 000 об/хв, rсер = 8 см, 30 хв, –10 0С). Осад відкидали, до супернатанту додавали порцію (1:1) ацетону — до 55 %, інкубували 30 хв при –10 0С, осад збирали центрифугу� ванням, суспендували у ББ. Суспензію освітлювали центрифугуванням, осад відки� дали. Екстракт 55%�го осаду містив ГО. Схема К — колонкова хроматографія. БЕ наносили на колонку з бацитрацин�си� лохромом, зрівноважену ББ, з інгібіторами протеаз, промивали сорбент 3�кратним об’ємом буфера ББ. Проскок і промивні роз� чини містили ГО. Хроматографічне очищення ферменту на аніонообмінному сорбенті. Розчини, що містили первинноочищені препарати ГО з питомою активністю 0,25–0,5 мкмоль·хв–1·мг–1 білка, наносили на колонку з аніонітним сорбентом целюлозної природи — DЕАЕ� Toyopearl 650 M (TSK�Gel, Японія), зрівно� важену ББ. ГО елюювали 0,2–1М NaCl або 20%�м (від насичення, при 0 0С) розчином сульфату амонію у вихідному ББ, у кожній фракції визначали питому активність ГО. Фракції елюатів, у яких активність ГО була вищою за 1,5 мкмоль·хв–1·мг–1 білка, об’єд� нували. Фермент концентрували і додатко� во очищували осадженням сульфатом амонію до 70% (від насичення, при 0 0С). Осад збирали центрифугуванням, розчиня� ли в мінімальному об’ємі ББ, визначали ак� тивність ГО і каталази [15]. До препаратів ГО додавали різні стабілізувальні додатки і зберігали при 0 0С. Як полімерну матрицю для електрохі� мічного нанесення ферменту використову� вали мономер 3,4�етилендіокситіофен (ЕДТ) виробництва фірми Baytron M (Німеччина) та поліетиленгліколь ММ=1450 фірми Sig� ma (США). Також у роботі застосовували реагенти: Na2HPO4 · 7H2O, KH2PO4, KCl, NaOH та гліцерол вітчизняного виробництва. Усі ре� активи, як вітчизняного, так й імпортного виробництва, були кваліфікації «ос. ч.» і «х. ч.». Вимірювання. Усі електрохімічні експе� рименти було виконано за допомогою тра� диційної триелектродної системи, в якій друкований електрод SensLab (SensLab GmbH, Leipzig, Німеччина) об’єднував у собі всі три електроди: платиновий робочий, до� поміжний та електрод порівняння [16]. На сьогодні на ринку ферментів ГО від� сутня, а відтак актуальною проблемою зали� шається пошук продуцентів ГО і розроблен� ня ефективних методів очищення цього ферменту. ГО виявлена у низки плісеневих грибів роду Aspergillus, Penicillium [10], Neurospora [11], Botrytis [12], а також акти� номіцетів. У високоочищеному стані фер� мент виділено тільки із трьох видів — Asper/ gillus japonicus [5], Penicillium sp. [13] і Botrytis allii [14]. У попередніх досліджен� нях нами було проведено скринінг серед по� тенційних продуцентів ГО — штамів плісе� невих грибів, обрано джерело ферменту — гриб B. allii 100(5), визначено оптимальні умови культивування клітин продуцента для забезпечення максимального синтезу ГО [15], розроблено методи отримання безклітинних екстрактів і схеми виділення та очищення ферменту, запропоновано спо� соби стабілізації препаратів ГО та показано можливість біоаналітичного використання ферменту [20]. Метою даної роботи було розроблення амперометричного біосенсора на основі пла� тинового друкованого електрода SensLab (SensLab GmbH, Leipzig, Німеччина) з іммо� білізованою ГО та оптимізація його робочих характеристик. Матеріали і методи У роботі використовували препарати ГО, одержані з плісеневого гриба B. аllii, штам 100 (5) [15]. Клітини гриба вирощували 3 до� би в колбах об’ємом 500 мл при 28 0С на шей� кері за постійної аерації (200 об/хв) на сере� довищі з рН 3,0–3,5 такого складу, г/л: КNO3 — 3,5, KH2PO4 — 3, NaCl — 0,5, MgSO4·7H2O — 0,5, СаCl2 — 0,03, CuSO4 · 5H2O — 0,001, гліцерол 60, меляса — 2 (компоненти середовища розчиняли у водопровідній во� ді); клітини гриба відмивали водою, ресус� пендували у 50 мМ боратному буфері (ББ), рН 9,18, заморожували і зберігали при –20 0С. Для отримання безклітинного екст� ракту (БЕ) міцелій гриба руйнували меха� нічним розтиранням у ступці, з охолоджен� ням, у присутності інгібіторів протеаз — 2 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА), 0,5 мМ фенілметилсульфонілфто� риду, 0,1 мМ м�амінофенілборної кислоти та 10 мкМ лейпептину. БЕ відокремлювали від уламків клітин центрифугуванням (15 000 об/хв, rсер=8 см, 30 хв, 4 0С), визначали активність [15] та концентрацію білка за Лоурі. Первинне очищення ГО із БЕ проводили за схемами А або К. Нові методи 67 Платинові друковані електроди SensLab досліджували на відтворюваність та працез� датність у діапазоні потенціалу від 0 до +300 мВ (швидкість розгортання потенціа� лу становила 20 мВ/с). Циклічну вольтам� перометрію було виконано на потенціостаті ПІ�50�11 (Україна). Амперометричне вимірювання при постійному потенціалі проводили в елект� рохімічній комірці об’ємом 5 мл за допомо� гою потенціостата ПІ�50�11(Україна) та програматора ПР�8 (Україна). Іммобілізація ГО електрохімічною поліK меризацією у поліK(3,4KетилендіокситіофеK ні) (ПЕДТ). Процес електрохімічної поліме� ризації становить особливий інтерес, оскільки є технологічно зручним. Він дозво� ляє вибирати і підтримувати розмір, форму й товщину матриці та забезпечує чіткий контроль за процесом осадження [17]. ПЕДТ належить до родини політіофенів — електропровідних полімерів з відносно но� вими та досить цікавими властивостями. Виконані з ними дослідження [18] демон� стрували слабку провідність, невелику змі� ну заряду, підвищену стабільність і дуже добру здатність до формування плівки. EДT є комерційним продуктом фірми Baytron, який нещодавно надійшов на ринок від фірми Bayer AG (Німеччина). Гомогенна плівка ПEДT фіксується на поверхні робочого електрода, заполімеризо� ваного електрохімічно ЕДТ, за умов нейт� рального рН та температури. Формування плівки відбувається краще у водних та, як� що є можливість, гідрофільних полімерах типу полівінілпіролідон (ПВП) чи поліети� ленгліколь (ПЕГ), розчинених у воді з елект� рополімеризуючим розчином. При цьому підвищується гідрофільність полімеру, що наноситься. Окиснення та відновлення зале� жать від прикладеного потенціалу, який контролює формування позитивного заряду в структурі полімеру. Для ПEДT є докази, що поліаніони як олігонуклеотиди можуть бути ефективно утримані у полімерній сітці, що працює за слабкої іонної сили [19]. Для електрохімічної полімеризації в ро� боті використовували суміш компонентів, приготованих у 20 мМ фосфатному буфері з рН 6,2, яка складалася з 10–2 М 3,4�ети� лендіокситіофену, 10–3 М поліетиленгліко� лю та розчину ГО. Полімеризацію ЕДТ здійснювали, при� кладаючи потенціал від +0,2 В до +1,5 В зі швидкістю 0,1 В/с протягом 15 циклів. Визначення гліцеролу у модельних розK чинах. Вимірювання проводили у 100 мМ К, Na�фосфатному буферному розчині, рН 7,2, при кімнатній температурі у відкритій місткості за інтенсивного перемішування. Концентрації субстратів змінювали, додаю� чи певні аліквоти концентрованих розчинів. Після отримання кожного відгуку сен� сор відмивали буферним розчином до стабілізації базового сигналу. Результати та обговорення В основі роботи амперометричної систе� ми для визначення вмісту гліцеролу лежить ферментативна реакція: гліцеролоксидаза Гліцерол + О2 ——→ Гліцеральдегід + Н2О2. Процес ферментативного перетворення гліцеролу супроводжується утворенням електрохімічно активної речовини — перок� сиду водню, який окиснюється з утворен� ням електронів, які, у свою чергу, можна реєструвати за допомогою амперометрично� го перетворювача: Н2О2 ——→О2 + 2Н+ + 2е–. Відсутність комерційного препарату ферменту спонукала виділити ГО з обраного штаму�продуцента плісеневого гриба B. allii [штам 100(5)] [15]). Запропоновані схеми ви� ділення та очищення ферменту із безклітин� ного екстракту гриба, які включали стадію первинного очищення ГО за схемами А (фракціонування ацетоном) або К (колонко� ва хроматографія) з наступним хромато� графічним очищенням ферменту на аніоно� обмінному сорбенті, дозволили одержати препарати ГО з питомою активністю до 5,7 мкмоль·хв–1·мг–1 білка, тобто очистити фермент у 30 разів [20]. Було доведено стабі� лізувальний вплив іонів Mn2+ (5–10 мМ), Са2+ (1–2 мМ),сульфату амонію (20–70% від насичення при 0 0С), 1 мМ EДTA, сахарози (50%) та поліетиленіміну (ПEI) (0,05%) на активність ГО у розчині, тому саме ці сполу� ки додавали до очищених препаратів ГО, які було використано для іммобілізації на електродах у процесі створення гліцеролсе� лективного біосенсора (табл. 1). На першому етапі роботи з конструюван� ня біосенсора на поверхню амперометричного перетворювача було іммобілізовано всі одер� жані препарати ГО. У ході порівняльного аналізу біосенсорів досліджували їхні діапа� зони роботи, граничні концентрації гліцеро� лу, що визначаються сенсором, а також їхню стабільність під час зберігання (табл. 2). БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008 68 гліцеролу в експериментальну комірку. Форма відгуків була типовою для фермент� них біосенсорів. Окрім того, з рисунка видно, що величини відгуків на додавання однакових кількостей гліцеролу були теж однакові. На подальшому етапі роботи було визна� чено рН�оптимум роботи амперометричного біосенсора з іммобілізованою ГО №1. Опти� мум роботи амперометричного біосенсора з ГО, іммобілізованою у ПЕДТ, спостерігає� ться при рН 7,2 (рис. 3). Отримані результа� ти добре корелюють з даними літератури, згідно з якими рН�оптимум роботи ГО у роз� чині становить близько 7,0 [13, 21]. На рис. 1 наведено калібрувальні криві лабораторних прототипів амперометричних біосенсорів, одержаних на основі різних препаратів ГО. Виходячи з отриманих результатів, для подальшої роботи було обрано препарат ГО №1, який характеризувався лінійною залеж� ністю величини відгуку біосенсора від кон� центрації гліцеролу в діапазоні 0,05–25,6 мМ, мінімальною концентрацією гліцеролу, що визначається, — 0,05 мМ та кращою ста� більністю порівняно з іншими препаратами. На рис. 2 зображено відгуки амперомет� ричного біосенсора на послідовне внесення Таблиця 1. Характеристика препаратів гліцеролоксидази, які було досліджено у процесі створення біосенсорів для визначення гліцеролу № пре� па� рату Cхема первин� ного очи� щення Характеристика препаратів ГО Кількість ГО у біомембрані Активність Стабілізувальні додатки у 50 мМ ББ, рН 9,18 Домішки каталази мкг од. 10–3 відносна, од./мл питома, од./мг 1 А 1,4 1,4 70% СА; 5 мМ MnCl2; 1 мМ EДTA; 0,05%ПEI – 0,84 4,2 2 А 0,8 5,7 70% СА; 1мM CaCl2; 1 мМ EДTA; 0,05%ПEI – 0,42 2,4 3 А 1,0 2,0 70% СА; 1 мM CaCl2; 0,05%ПEI + 1,5 3,0 4 К 1,5 1,7 1 М NaCl; 1 мM MnCl2 – 2,7 4,6 5 К 1,0 2,0 0,3 М NaCl; 1 мM CaCl2; 0,05%ПEI – 1,5 3,0 6 А 0,3 3,0 1М NaCl; 1 мM MnCl2 ;50% сахароза – 0,3 0,9 7 К 1,6 2,5 70% СА; 5 мМ MnCl2; 0,05%ПEI – 2,0 4,9 8 К 0,9 1,5 70% СА; 5 мМ MnCl2; 0,05%ПEI + 1,8 2,7 9 К 1,3 1,8 70% СА; 5мМ MnCl2; 0,05%ПEI + 2,2 3,9 Примітка. СА — сульфат амонію; ПЕІ — поліетиленімін; ЕДТА — етилендіамінтетраоцтова кислота. Таблиця 2. Порівняльний аналіз лабораторних прототипів амперометричних біосенсорів, створених на основі різних препаратів гліцеролоксидази № препа� рату ГО Активність при іммобілізації у чутливу мембрану Мінімальна детектована концентрація гліцеролу Лінійний діапазон роботи сенсора Стабільність сенсора під час зберігання 1 + 0,05 мМ 0,05–25,6 мМ 75% активності через 15 діб, 14% — через 40 діб 2 – – – – 3 + 0,002 мМ 0,002–6,4 мМ 30% активності через 4 доби 4 + Низький сигнал 0,002 мМ 0,002–0,05 мМ 10% активності через 3 доби 5 – – – – 6 – – – – 7 – – – – 8 + 0,2 мМ, з часом 0,8 мМ 0,2–25,6 мМ 10% активності через 5 діб 9 + 0,2 мМ 0,2–25,6 мМ 10% активності через одну добу Нові методи 69 сенсора знижується в середньому на 2,5% за до� бу, а після 50 днів зберігання сенсора відгук на додавання гліцеролу був майже відсутній(рис. 6). Таким чином, здійснено порівняльний аналіз ефективності використання різних за способом одержання та характеристиками препаратів ГО з метою створення амперо� метричного біосенсора для визначення вміс� ту гліцеролу. Встановлено, що біосенсор на основі препарату ГО №1 (схема первинного очищення А, питома активність — 5 од./мг, стабілізувальні додатки — 70%�й сульфат амонію; 5 мМ MnCl2; 1 мM EДTA; 0,05%�й поліетиленімін у 50 мМ боратному буфері, рН 9,18) демонструє найкращі робочі харак� теристики — лінійний діапазон у межах Дослідження впливу концентрації фоново� го електроліту в буфері та буферної ємності на роботу амперометричного біосенсора показа� ло, що їх зміна істотно не впливає на величину відгуку (рис. 4, 5). Це є типовою ситуацією для ферментних амперометричних біосенсорів. Було вивчено стабільність амперометрично� го біосенсора на основі іммобілізованої гліцеро� локсидази і встановлено, що величина відгуку Рис. 3. Залежність величини відгуку амперометK ричного біосенсора на основі гліцеролоксидази, іммобілізованої у ПЕДТ електрохімічним нанесенням, від рН розчину. Вимірювання проводили у 100 мМ фосфатному бу� фері, потенціал +300 мВ відносно електроду порівняння. Концентрація гліцеролу в комірці: 3,2 мМ (1); 1,6 мМ (2); 0,8 мМ (3); 0,4 мМ (4) Рис. 1. Калібрувальні криві лабораторних протоK типів амперометричних біосенсорів, одержаних електрохімічною полімеризацією у ПEДT на осK нові різних препаратів гліцеролоксидази. Вимірювання проводили у 100 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, потенціал +300 мВ відносно внутрішнього електроду порівняння Рис. 5. Залежність величини відгуку амперометK ричного біосенсора на основі гліцеролоксидази, іммобілізованої у ПЕДТ електрохімічним нанесенK ням, від концентрації буферного розчину. Концентрація гліцеролу в комірці: 1,6 мМ (1); 0,8 мМ (2); 0,4 мМ (3); 0,2 мМ (4); 0,1 мМ (5) Рис. 4. Залежність величини відгуку амперометричK ного біосенсора на основі гліцеролоксидази, іммобілізованої у ПЕДТ електрохімічним нанесенK ням, від концентрації фонового електроліту в буфері. Вимірювання проводили у 100 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, потенціал +300 мВ відносно електроду порів� няння. Концентрація гліцеролу в комірці: 6,4 мМ (1); 3,2 мМ (2); 1,6 мМ (3); 0,8 мМ (4); 0,4 мМ (5) Рис. 2. Відгук амперометричного біосенсора з іммобілізованою електрохімічною полімериK зацією у ПEДT гліцеролоксидаK зою на 25,6 та 51,2 мМ гліцеролу Гліцерол, мМ Концентрація фонового електроліту, мМ Концентрація фосфатного буфера, мМ рН В ід гу к б іо се н со р а, н А В ід гу к б іо се н со р а, н А В ід гу к б іо се н со р а, н А В ід гу к б іо се н со р а, н А 1 5 4 3 2 1 4 3 2 1 5 4 3 2 БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008 70 0,05–25,6 мМ гліцеролу і мінімальну конце� нтрацію гліцеролу, що визначається, — 0,05 мМ, та зберігає 75% своєї активності через 15 діб після іммобілізації у чутливу мембрану. Визначено рН�оптимум роботи створено� го амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої електрохімічною полімери� зацією ГО у ПEДT, який становить 7,2. По� казано, що величина буферної ємності та концентрації фонового електроліту в буфері не впливає на роботу біосенсора. За допомо� гою створеного амперометричного біосенсо� ра на основі іммобілізованої ГО проведено аналіз концентрації гліцеролу в модельних розчинах. Роботу виконано за фінансової підтрим� ки НАН України в рамках комплексної нау� ково�технічної програми «Сенсорні системи для медико�екологічних та промислово�тех� нологічних потреб». Рис. 6. Стабільність амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої електрохімічною полімеK ризацією гліцеролоксидази у ПEДT. Вимірювання проводили у 100 мМ фосфатному бу� фері, рН 7,2, потенціал +300 мВ відносно внутрішнього електроду порівняння 1. Родопуло А. К. Биохимия виноделия. — М.: Пищевая промышленность, 1971. 2. Compagnone D., Esti M., Messia M. C. et al. Development of a biosensor for monitoring of glycerol during alcoholic fermentation // Biosensors Bioelectron. — 1998. — V.13. — P. 875–880. 3. Жилякова Т. А., Гержикова В. Г., Семен/ чук В. А. Исследование динамики накопления глицерина в ходе брожения виноградного сусла // Виноградарство и виноделие. — 2003. — T. 3. — С. 18–21. 4. Kiba N., Azuma N., Furusawa M. Chemilumi� nometric method for the determination of glycerol in wine by flow�injection analysis with co�immobilized glycerol dehydrogena� se/NADH oxidase // Talanta. — 1996. — V.43. — P. 1761–1766. 5. Uwajima T., Shimizu Y., Terada O. Glycerol oxidase, a novel copper hemoprotein from Aspergillus japonicus. Molecular and catalyt� ic properties of the enzyme and its application to the analysis of serum triglycerides // J. Biol. Chem. — 1984. — V. 259. — P. 2748–2753. 6. A.c. № 1636773 СССР, МКИ5 G 01 N 33/52. Способ определения пероксидазной актив� ности биологических объектов / М. В. Гончар, А. А. Сибирный (СССР). — № 4363857/14; Заявл. 13.01.88; Опубл. 23.03.91, Бюл. № 11. — 6 с. 7. Гончар М. В. Чутливий метод кількісного визначення пероксиду водню та субстратів оксидаз у біологічних об’єктах // Укр. біохім. журн. — 1998. — Т. 70, № 5. — С. 157–163. 8. West S. I. Analitical enzymes: diagnostics. — London: Macmillan Press Ltd., 1998. — P. 63–68. 9. Laurinavicius V., Kurtinaitiene B., Gureivi/ ciene V. et al. Amperometric glyceride biosensor // Anal. Chim. Acta. — 1996. — V. 330. — P. 159–166. 10. Uwajima T., Akita H., Ito K. et al. Some char� acteristics of new enzyme «Glycerol Oxidase» // Agric. Biol. Chem. — 1979. — V. 43. — P. 2633–2634. 11. Hill P., Martin S. M. Cellular proteolytic enzymes of Neurospora crassa. Purification and some properties of five intracellular proteinases // Eur. J. Biochem. — 1975. — V. 56, N1. — P. 271–281. 12. Куплетская М. Б., Лихачев А. Н. Глицери� ноксидазная активность грибов рода Botrytis micheli // Микология и фитопатология. — 1996. — Т. 30, Вып. 5–6. — С. 55–58. 13. Lin S. F., Chiou C. M., Tsai Y. C. Purification and characterization of a glycerol oxidase from Penicillum sp. TS–622 // J. Enzyme Microb. Technol. — 1996. — V. 18. — P. 383–387. 14. Пат. 2117702С1 Россия, МПК6 C12N 9/04//(C12N9/04, C12R1:645). Способ по� лучения глицеролоксидазы /ООО «Им� пакт» (Россия). — № 95115005/13; Заявл. 22.08.95; Опубл. 20.08.98. 15. Павлішко Г., Гайда Г., Гончар М. Скринінг штамів продуцентів, очищення та первин� на характеристика гліцеролоксидази із плі� сеневих грибів // Вісник Львів. ун�ту. — Сер. Біол. — 2004. — Вип. 38. — С. 67–73. 16. Шкотова Л. В., Сластья Е. А., Жиляко/ ва Т. А. та ін. Амперометричний біосенсор ЛІТЕРАТУРА Доба В ід гу к б іо се н со р а, % Нові методи 71 НОВЫЙ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ ГЛИЦЕРОЛОКK СИДАЗЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГЛИЦЕРОЛА Т. Б. Горюшкина1, 2, Л. В. Шкотова1, Г. З. Гайда3, Г. М. Клепач3, 4, М. В. Гончар3, А. П. Солдаткин1, С. В. Дзядевич1 1Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев 2Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко 3Институт биологии клетки НАН Украины, Львов 4Дрогобычский государственный педагогический университет им. Ивана Франко Е/mail: dzyad@yahoo.com Проведен сравнительный анализ эффек� тивности использования различных по спосо� бу получения и характеристикам препаратов глицеролоксидазы для создания амперометри� ческого биосенсора для определения содержа� ния глицерола. Выбран препарат фермента, после иммобилизации которого на поверх� ность преобразователя сенсор демонстрирует лучшие аналитические характеристики. Оп� ределен рН�оптимум работы биосенсора, пока� зано, что величина буферной емкости и концен� трация фонового электролита не влияют на его работу. С помощью созданного амперометри� ческого биосенсора на основе иммобилизиро� ванной глицеролооксидазы осуществлен ана� лиз глицерола в модельных растворах. Ключевые слова: амперометрический биосенсор, глицеролоксидаза, глицерол, иммобилизация, электрохимическая полимеризация. NOVEL AMPEROMETRIC BIOSENSOR BASED ON GLYCEROL OXIDASE FOR GLYCEROL DETERMINATION T. B. Goriushkina1, 2, L. V. Shkotova1, G. Z. Gayda3, H. M. Klepach3, 4, M. V. Gonchar3, O. P. Soldatkin1, S. V. Dzyadevych1 1Institute of Molecular Biology and Genetics, of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv 2Taras Shevchenko Natoinal University, Kyiv 3Institute of Cell Biology, of National Academy of Sciences of Ukraine, L’viv 4Ivan Franko State Pedagogical University, Drogobych Е/mail: dzyad@yahoo.com The paper presents comparative effectiveness analysis of glycerol oxidase preparations, used for development of amperometric biosensor for glyc� erol determination, which are different in method of preparation and in characteristics. Enzyme preparation, whose immobilization on transducer surface results in sensor demonstrating its best operational characteristics, was selected. PH� optimum for the operation of the developed amperometric biosensor was determined; the val� ues of buffer volume and background electrolyte concentration in buffer were shown to have no effect on the work of glycerol biosensor. The analysis of glycerol concentration in sample solu� tions was carried out using the developed ampero� metric biosensor based on glycerol oxidase. Key word: amperometric biosensor, glycerol oxidase, glycerol, immobilization, electrochemical polymeriza� tion. для аналізу етанолу у вині та у виноградному суслі в процесі його ферментації // Укр. біохім. журн. — 2005. — T. 77, №1. — С. 96–103. 17. Шкотова Л. В., Горюшкіна Т. Б., Сластья Е. А. та ін. Амперометричний біосенсор для аналізу лактату у вині та у виноградному суслі у процесі його ферментації // Там са� мо. — 2005. — T. 77, №5. — C.123–130. 18. Ghosh S., Rasmusson J,. Inganas O. Supra� molecular self�assembly for enhanced con� ductivity in conjugated polymer blends: ionic crosslinking in blends of Poly (3,4�ethy� lenedioxythiophene)�Poly (styrenesulfonate) and Poly (vinylpyrrolidone) // Adv. Mater. — 1998. — V. 10, N14. — P. 1097–1099. 19. Piro B., Pham M/C., Ledoan T. Electrochemi� cal method for entrapment of oligonucleoti� des in polymer�coated electrodes // J. Biom. Mat. Res. — 1999. — V. 46, N4. — P. 566–572. 20. Гайда Г. З., Павлішко Г. М., Cмуток О. В. та ін. Гліцеролоксидаза плісеневого гриба Botrуtis allii: виділення, характеристика та біоаналітичне використання // Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій / За ред. акад. Г. В. Єльської, акад. В. Д. Походенка. — К.: Ін�т. мол. біології і генетики НАН України, 2006. — С. 5–12. 21. Isobe K. Oxidation of ethylene glycol and glycolic acid by glycerol oxidase // Biosci. Biotechnol. Biochem. — 1995. — V. 59, N4. — P. 576–81.

Новий амперометричний біосенсор на основі гліцеролоксидази для визначення вмісту гліцеролу

Institution

Ähnliche Einträge