Ідентифікація патологічного пріона при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби

Наведено результати порівняльного дослідження молекулярних характеристик губчастоподібної енцефалопатії та губчастоподібної амілоїдної енцефалопатії великої рогатої худоби. Окрім загальновизнаних відмінностей, характерних для губчастоподібної амілоїдної енцефалопатії великої рогатої худоби, таких як...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2008
Hauptverfasser:	Влізло, В.В., Стадник, В.В., Майор, Х.Я., Вербицький, П.І., Стойка, Р.С.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України 2008
Schlagworte:	Експериментальні статті
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/4066
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Ідентифікація патологічного пріона при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби / В. В. Влізло, В. В. Стадник, Х. Я. Майор, П. І. Вербицький, Р. С. Стойка // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 2. — С. 75-80. — Бібліогр.: 21 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-4066
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-40662013-02-13T02:12:12Z Ідентифікація патологічного пріона при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби Влізло, В.В. Стадник, В.В. Майор, Х.Я. Вербицький, П.І. Стойка, Р.С. Експериментальні статті Наведено результати порівняльного дослідження молекулярних характеристик губчастоподібної енцефалопатії та губчастоподібної амілоїдної енцефалопатії великої рогатої худоби. Окрім загальновизнаних відмінностей, характерних для губчастоподібної амілоїдної енцефалопатії великої рогатої худоби, таких як зміна молекулярної маси ізоформ патологічного пріона (PrPSC) та творення амілоїдоподібних фібрил, виявлено ряд нових ознак на клітинному та субклітинному рівнях. До цих ознак слід віднести накопичення PrPSC у нейронах оливного ядра засувки довгастого мозку та зміну характеру депонування PrPSC із дифузного на гранулярний. Сукупність вищенаведених ознак, специфічних для губчастоподібної амілоїдної енцефалопатії великої рогатої худоби, спрощує процедуру диференційної діагностики трансмісивних спонгіформних енцефалопатій великої рогатої худоби. Приведены результаты сравнительного исследования молекулярных характеристик губчатоподобной энцефалопатии и губчатой амилоидной энцефалопатии крyпного рогатого скота. Кроме общепринятых отличий, характерных для губчатой амилоидной энцефалопатии крупного рогатого скота, таких как изменение молекулярной массы изоформ патологического приона и образования амилои-доподобных фибрилл, обнаружен ряд новых признаков на клеточном и субклеточном уровнях. К этим признакам следует отнести накопление патологического приона (PrPSC) в нейронах оливарного ядра продолговатого мозга и изменение характера аккумуляции PrPSC с диффузного на гранулярный. Совокупность этих признаков, специфических для губчатой амилоидной энцефалопатии крпного рогатого скота, упрощает процедуру дифференциальной диагностики трансмиссивных спонгиформных энцефалопатий крупного рогатого скота. The article presents a comparative study of the molecular characteristics of spongiform cattle ncephalopathy and spongiform amyloidal cattle encephalopathy. Except general differences typical to spongiform myloidal cattle encephalopathy, such as change in the molecular mass of pathological prion isoform and amyloid-like fibrils formation, several new characteristics on celluar and subcellular level were discovered. These characteristics are as following: accumulation of the pathological prion (PrPSC) in olivary nucleus neurons of the medulla oblongata and change in deposition nature of PrPSC from diffuse to granular. All these characteristics specific for spongiform amyloidal cattle encephalopathy simplifies a procedure of differential diagnostics of the transmissible spongiform cattle encephalopathy. 2008 Article Ідентифікація патологічного пріона при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби / В. В. Влізло, В. В. Стадник, Х. Я. Майор, П. І. Вербицький, Р. С. Стойка // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 2. — С. 75-80. — Бібліогр.: 21 назв. — укр. http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/4066 616-003.811:619:636.2 uk Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Експериментальні статті Експериментальні статті
spellingShingle	Експериментальні статті Експериментальні статті Влізло, В.В. Стадник, В.В. Майор, Х.Я. Вербицький, П.І. Стойка, Р.С. Ідентифікація патологічного пріона при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби
description	Наведено результати порівняльного дослідження молекулярних характеристик губчастоподібної енцефалопатії та губчастоподібної амілоїдної енцефалопатії великої рогатої худоби. Окрім загальновизнаних відмінностей, характерних для губчастоподібної амілоїдної енцефалопатії великої рогатої худоби, таких як зміна молекулярної маси ізоформ патологічного пріона (PrPSC) та творення амілоїдоподібних фібрил, виявлено ряд нових ознак на клітинному та субклітинному рівнях. До цих ознак слід віднести накопичення PrPSC у нейронах оливного ядра засувки довгастого мозку та зміну характеру депонування PrPSC із дифузного на гранулярний. Сукупність вищенаведених ознак, специфічних для губчастоподібної амілоїдної енцефалопатії великої рогатої худоби, спрощує процедуру диференційної діагностики трансмісивних спонгіформних енцефалопатій великої рогатої худоби.
format	Article
author	Влізло, В.В. Стадник, В.В. Майор, Х.Я. Вербицький, П.І. Стойка, Р.С.
author_facet	Влізло, В.В. Стадник, В.В. Майор, Х.Я. Вербицький, П.І. Стойка, Р.С.
author_sort	Влізло, В.В.
title	Ідентифікація патологічного пріона при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби
title_short	Ідентифікація патологічного пріона при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби
title_full	Ідентифікація патологічного пріона при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби
title_fullStr	Ідентифікація патологічного пріона при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби
title_full_unstemmed	Ідентифікація патологічного пріона при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби
title_sort	ідентифікація патологічного пріона при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби
publisher	Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
publishDate	2008
topic_facet	Експериментальні статті
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/4066
citation_txt	Ідентифікація патологічного пріона при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби / В. В. Влізло, В. В. Стадник, Х. Я. Майор, П. І. Вербицький, Р. С. Стойка // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 2. — С. 75-80. — Бібліогр.: 21 назв. — укр.
work_keys_str_mv	AT vlízlovv ídentifíkacíâpatologíčnogopríonaprigubčastopodíbníjencefalopatíívelikoírogatoíhudobi AT stadnikvv ídentifíkacíâpatologíčnogopríonaprigubčastopodíbníjencefalopatíívelikoírogatoíhudobi AT majorhâ ídentifíkacíâpatologíčnogopríonaprigubčastopodíbníjencefalopatíívelikoírogatoíhudobi AT verbicʹkijpí ídentifíkacíâpatologíčnogopríonaprigubčastopodíbníjencefalopatíívelikoírogatoíhudobi AT stojkars ídentifíkacíâpatologíčnogopríonaprigubčastopodíbníjencefalopatíívelikoírogatoíhudobi
first_indexed	2025-07-02T07:18:30Z
last_indexed	2025-07-02T07:18:30Z
_version_	1836518695522795520
fulltext	Експериментальні статті 75 PrPSC, що локалізуються в ділянці ураження довгастого мозку [9–13]. Дотепер вважали, що існує один штам патологічного пріона, який зумовлює губ� частоподібну енцефалопатію великої рога� тої худоби (ГЕ ВРХ). Однак на цей час є дані, що велика рогата худоба хворіє на ГЕ ВРХ та губчастоподібну амілоїдну енцефалопа� тію (ГАЕ ВРХ) [14]. Ці хвороби дуже схожі за клінічним перебігом і симптоматикою, але відрізняються за біохімічними характе� ристиками та локалізацією патологічного пріона. Так, у разі ГЕ ВРХ накопичення PrPSC відбувається переважно у довгастому мозку, гіпоталамусі й таламусі, а при ГАЕ ВРХ — у нюховій бульбі, нюховому кор� тексі та гіпокампі [14]. Для ГАЕ ВРХ описа� но декілька мутацій у гені PrP, тоді як для ГЕ ВРХ ще не детектовано жодної мутації у відповідному гені [15]. Також для ГАЕ ВРХ є характерним утворення амілоїдоподібних фібрил, що зближує це захворювання із хво� робою Крейцфельдта–Якоба (КЯХ) у люди� ни [14,16,17]. Незважаючи на вищезазначені відмін� ності, диференційна діагностика цих хвороб є доволі складною, оскільки в деяких випад� ках (автоліз, ушкодження мозкової тканини) Трансмісивні спонгіформні енцефало� патії (ТСЕ), або пріонні інфекції, — це група нейродегенеративних захворювань, які трап� ляються в жуйних, норок, оленів, котячих та людей [1, 2]. Спричинює ТСЕ ураження організму патологічним пріоном (PrPSC), який накопичується переважно в централь� ній нервовій системі (ЦНС) [1–4], трансфор� муючись із клітинного пріона (PrPC). PrPC експресується в багатьох органах та ткани� нах організму. Найвищий його рівень спос� терігається у клітинах ЦНС. Вважають, що фізіологічний пріон бере участь у процесах транспортування міді і є компонентом декількох сигнальних шляхів, зокрема Fyn� кіназного та MAP�кіназного, а також залу� чений до передавання сигналу при клітин� ній адгезії [5–8]. На сьогодні відомі штами PrPSC, які вик� ликають ТСЕ у тварин та людей. Наприк� лад, існує понад 20 штамів скрейпі овець, 2 — трансмісивної енцефалопатії норок. Уражу� ючи організм, вони, після різної тривалості інкубаційного періоду, спричинюють розвиток специфічних клінічних симптомів. Водно� час ці пріони мають різний ступінь стійкості до оброблення протеїназами, характеризу� ються певним співвідношенням глікоформ УДК 616�003.811:619:636.2 ІДЕНТИФІКАЦІЯ ІДЕНТИФІКАЦІЯ ПАТОЛОГІЧНОГО ПРІОНА ПАТОЛОГІЧНОГО ПРІОНА ПРИ ГУБЧАСТОПОДІБНІЙ ЕНЦЕФАЛОПАТІЇПРИ ГУБЧАСТОПОДІБНІЙ ЕНЦЕФАЛОПАТІЇ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ В. В. Влізло1 В. В. Стадник1 1 Інститут біології тварин УААН, Львів Х. Я. Майор1 П. І. Вербицький1 2 Інститут біології клітини НАН України, Львів Р. С. Стойка2 E)mail: stadnyk@inenbiol.com.ua Ключові слова: губчастоподібна амілоїдна енцефалопатія великої рогатої худоби, пріонні інфекції, пато� логічний пріон, діагностика. Наведено результати порівняльного дослідження молекулярних характеристик губчастоподібної енцефало� патії та губчастоподібної амілоїдної енцефалопатії великої рогатої худоби. Окрім загальновизнаних відміннос� тей, характерних для губчастоподібної амілоїдної енцефалопатії великої рогатої худоби, таких як зміна молеку� лярної маси ізоформ патологічного пріона (PrPSC) та утворення амілоїдоподібних фібрил, виявлено ряд нових ознак на клітинному та субклітинному рівнях. До цих ознак слід віднести накопичення PrPSC у нейронах оливно� го ядра засувки довгастого мозку та зміну характеру депонування PrPSC із дифузного на гранулярний. Сукупність вищенаведених ознак, специфічних для губчастоподібної амілоїдної енцефалопатії великої рогатої худоби, спро� щує процедуру диференційної діагностики трансмісивних спонгіформних енцефалопатій великої рогатої худоби. БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №2, 2008 76 у 5%�му знежиреному молоці на ЗФРТ (0,01%�й Твін�20 на забуференому фізіоло� гічному розчині) протягом 60 хв. Далі мемб� рану інкубували з моноклональними анти� PrPSC антитілами 6Н4 (Prionics,Швеція) — 1:2 000 у ЗФРТ упродовж 90 хв, полікло� нальними козячими антимишиними антиті� лами, кон’югованими з лужною фосфатазою (Sigma, СШA), — 1:5 000 у ЗФРТ протягом 30 хв. Детекцію імунних комплексів здійс� нювали, використовуючи комерційний роз� чин субстрату для лужної фосфатази — CDP�Star (Tropix, Велика Британія). Візуалі� зацію проводили за допомогою рентгенів� ської плівки ECL HyperFilm (Amersham, СШA) та набору для проявлення плівок (Kodak, Німеччина). Імуноблот+аналіз глікоформ PrPSC [20]. Після розморожування тканину лізували в десятикратному об’ємі спеціального буфе� ра (10%�й N�лаурилсаркозин, 10 мкМ феніл� метилсульфонілфторид, 10 мкМ N�етилма� леїмід в 0,01 М Na�фосфатному буфері, рН 7,4). Далі зразки центрифугували при 5 200 g і 4 0С протягом 5 хв. До очищених лізатів додавали однаковий об’єм 2%�го сар� козилу в забуференому фізіологічному роз� чині (ЗФР), після чого лізати інкубували 10 хв при 37 0С. Бензоназу (Sigma, Poole, Велика Британія) та MgCl2 додавали в кінцевій кон� центрації 50 Од/мл та 1 ммоль/л відповідно, після чого зразки інкубували 30 хв при 37 0С. До лізатів додавали розчин натрієвої солі фосфорновольфрамової кислоти (Sigma, Німеччина) у 170 ммоль/л MgCl2, до кінце� вої концентрації 0,3%, після чого проводи� ли преципітацію упродовж 30 хв при 37 0С. Зразки центрифугували при 20 800 g і 37 0С 30 хв. Осад ресуспендували в 0,1%�му роз� чині саркозилу в ЗФР та розщеплювали про� теїназою К у концентрації 50 г/мл протягом 30 хв. Розщеплення зупиняли, додаючи 1 ммоль/л PefaBloc SC (Roche, Lewes, Вели� ка Британія). Далі зразки розчиняли в бу� фері Леммлі [19] і проводили електрофорез з наступним імуноблот�аналізом та ECL�де� текцією, як було описано вище. Імуногістохімічна детекція PrPSC [18]. Залиті в парафін зрізи тканин укладали на предметні скельця, депарафінізували в о�кси� лолі та спиртах зі спадною концентрацією від 100 до 50%. Знешкоджували PrPSC інку� бацією зрізів у формаліні протягом 15 хв. Далі зрізи обробляли 0,004%�м розчином протеїнази К у забуференому фізіологічно� му розчині 15 хв, 37 0С. Потім зразки інку� бували з моноклональними анти�PrPSC ан� титілами L42 [21] — 1:200, 90 хв при 37 0С; окремі частини мозку, необхідні для типу� вання ГАЕ ВРХ як різновиду ГЕ ВРХ, важ� ко піддаються виділенню. Визначення штамів пріона в кожному конкретному випадку захворювання є вкрай актуальним не лише для великої рогатої ху� доби. Такий моніторинг дає змогу виявити нові штами PrPSC, які можуть бути потенцій� но небезпечні для людини. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ Забір та оброблення тканин. Досліджен� ня проводили на довгастому мозку великої рогатої худоби, віком 5–8 років. Як негатив� ний контроль використовували довгастий мозок здорових тварин. Позитивним конт� ролем слугувала тканина довгастого мозку тварин, хворих на ГЕ ВРХ, що її було нада� но Інститутом контролю за ветеринарними хворобами (Moedling, Австрія). Дослідний зразок від тварини, яка хворіла на ГАЕ ВРХ, одержали з Європейської референс�лабора� торії з діагностики ТСЕ (Weybridge, Велика Британія). Діагностику ГЕ ВРХ здійснюва� ли за допомогою люмінесцентно�імунного аналізу (Prionics LIA®). Позитивний резуль� тат підтверджувався референс�методом Prionics ChekWestern®. Після підтверджен� ня діагнозу тканину мозку зберігали до нас� тупних досліджень при –80 0С. Імуноблот+аналіз амілоїдоподібних фібрил PrPSC [18]. Після розморожування тканину лізували у спеціальному буфері (10%�й N�лаурилсаркозин, 10 мкМ феніл� метилсульфонілфторид, 10 мкМ N�етилма� леїмід в 0,01 М Na�фосфатному буфері, рН 7,4). Центрифугували лізат при 20 000 g та 10 0С 30 хв. Супернатант переносили в нові пробірки та центрифугували при 177 000 g і 10 0С 135 хв. Осад розчиняли у KI�HSB�роз� чині (1,5%�й Na�тіосульфат, 1%�й N�лау� рилсаркозин, 15%�й йодид калію в 10 мМ трис�HCl, рН 7,4). Далі зразки обробляли протеїназою К у кінцевій концентрації 1 мкг/мл, 60 хв при 37 0С. Зразок нашарову� вали на 20%�ну сахарозу та центрифугували протягом 60 хв при 189 000 g та 10 0C. Осад ресуспендували у 40 мкл буфера Леммлі [19] (Sigma, Німеччина), після чого проводили електрофорез у 12%�му ПААГ (Invitrogen, США) та електротрансфер білків на PVDF� мембрану (Millipor, СШA). Для контролю трансферу та визначення відносних молеку� лярних мас досліджуваних білків викорис� товували набір білкових маркерів SeaBlue Plus2 (Invitrogen, СШA). Після електротранс� феру мембрану блокували інкубуванням Експериментальні статті 77 Дослідження експресії ізоформ пато� логічного пріона показали, що, порівняно з ГЕ ВРХ, де три основні форми PrPSC мали молекулярну масу 29, 25 та 19 kDa відповід� но, у дослідної тварини спостерігається збільшення електрофоретичної рухливості ди�, моно� та деглікозильованої форм PrPSC, яка відповідала молекулярній масі 27 kDa для диглікозильованої, 23 kDa для моноглі� козильованої та 17 kDa для деглікозильова� ної форм (рис. 1). Такий розподіл глікоформ за молекулярною масою є характерним для ГАЕ ВРХ [4]. Відомо, що характерною ознакою ГАЕ ВРХ є утворення та накопичення амілоїдо� подібних фібрил патологічного пріона, що не властиво для ГЕ ВРХ [15]. Тому для пе� ревірки припущення про присутність у до� сліджуваному зразку штаму PrPSC, здатного спричинити ГАЕ ВРХ, нами проведено до� слідження вмісту амілоїдоподібних фібрил у довгастому мозку дослідної тварини. Для цього було застосовано метод ультрацентри� фугування у градієнті сахарози з наступною імуноблот�детекцією. У результаті проведених досліджень встановлено, що в дослідному зразку вияв� лено високу концентрацію амілоїдоподіб� них фібрил, тоді як у мозку тварин, хворих на ГЕ ВРХ, були тільки сліди фібрилярного PrPSC (рис. 2). Отже, можна зробити висно� вок, що дослідна тварина хворіла на ГАЕ ВРХ, нетипову форму ГЕ ВРХ. Особливістю штаму PrPSC, який зумовлює ГАЕ ВРХ, є підвищена біотинільованими поліклональними козя� чими антимишиними антитілами — 1:100, протягом 30 хв при 37 0С. Наступним етапом була інкубація з АВС�комплексом (Vector, Австрія) — протягом 30 хв та хромогенним субстратом (DAKO Cytomation, Данія). Після цього зразки фарбували гематоксиліном та аналізували за допомогою світлового мікрос� копа Axioskop 40 (Carl Zeiss, Німеччина). РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ Для всіх штамів патологічного пріона PrPSC характерним є наявність трьох гліко� форм (ди�, моно� та деглікозильованої), мо� лекулярні маси яких можуть коливатися в межах від 30 до 15 kDa залежно від типу захворювання. Електрофоретична рухливість глікоформ PrPSC штамоспецифічна. Харак� терною ознакою при ідентифікації штаму патологічного пріона є також співвідношен� ня між трьома глікоформами — PrPSC, ди�, моно� та деглікозильованою, яке залежно від типу хвороби може варіювати від 70:20:10 до 20:20:60. Під час екстракції PrPSC фоcфотунгісти� ковою кислотою з наступним імуноблот� аналізом було виявлено, що співвідношення глікоформ у позитивному контролі та дослі� ді практично не змінюється, лише відзна� чається деяке зростання рівня деглікозильо� ваної форми PrPSC у дослідному зразку, що свідчить про присутність у ньому штаму па� тологічного пріона, відмінного від того, який спричинює ГЕ ВРХ (рис. 1). Сам по собі цей результат не дає змоги встановити кінце� вий діагноз, але свідчить про необхідність проведення додаткових досліджень. Рис. 1. Імуноблот+аналіз глікоформ патологічного пріона у довгастому мозку: РК — протеїназа К; негативний контроль — здорові тварини; позитивний контроль — тварини, хворі на ГЕ ВРХ; дослід — дослідна тварина Рис. 2. Імуноблот+аналіз амілоїдоподібних фібрил PrPSC у довгастому мозку (позначення аналогічно рис. 1). 30 kDa 12 kDa PK 19 kDa 25 kDa 29 kDa Н ег ат . к он тр ол ь Д ос л ід Д ос л ід П оз и т. к он тр ол ь П оз и т. к он тр ол ь П оз и т. к он тр ол ь Н ег ат . к он тр ол ьД ос л ід П оз и т. к он тр ол ь Н ег ат . к он тр ол ь PK БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №2, 2008 78 утворення амілоїдоподібних структур усере� дині клітини та є ще одним підтвердженням того, що даний випадок слід віднести до ГАЕ ВРХ. Спираючись не вищенаведені результати, ми пропонуємо для диференційної діагности� ки штамів патологічного пріона використову� вати наведені в таблиці молекулярні ознаки, що є характерними для ГЕ ВРХ та ГАЕ ВРХ. Окрім загальновідомих ознак ГАЕ ВРХ, таких як зміна співвідношення глікоформ патологічного пріона, підвищення електро� форетичної рухливості трьох основних глікоформ PrPSC та утворення амілоїдоподіб� них фібрил, нами було виявлено ряд нових ознак, зокрема акумуляцію патологічного пріона в оливному ядрі довгастого мозку, інтранейрональний тип накопичення PrPSC в оливному ядрі та переважну грану� лярність агрегатів патологічного пріона. Су� купність цих ознак дозволяє визначити штам патологічного пріона та диференцію� вати ГЕ ВРХ від ГАЕ ВРХ. Таким чином, підтверджено існування нетипової форми ГЕ ВРХ — губчастоподіб� ної амілоїдної енцефалопатії великої рогатої худоби (ГАЕ ВРХ). Встановлено ряд молеку� лярних та морфологічних ознак, за якими можна проводити діагностику ГАЕ ВРХ. На основі даних ознак запропоновано спрощену процедуру діагностики ГАЕ ВРХ. Колектив авторів висловлює щиру вдяч� ність Dr. Joachim Weikel, Dr. Hermann Schildorfer та Dr. Zoltan Bago (Institute for Veterinary Disease Control, Moedling, Авст� рія) за всебічну допомогу у виконанні робо� ти. Робота здійснювалася за фінансової під� тримки ROTARY�Club (Moedling, Австрія). електрофоретична рухливість основних ізо� форм патологічного пріона та утворення амілоїдоподібних фібрил у довгастому мозку. Для більш детального вивчення молеку� лярних ознак даного клінічного випадку ТСЕ було проведено імуногістохімічний аналіз довгастого мозку дослідної тварини. Встановлено, що акумуляція патологічного пріона спостерігається тільки в зоні засувки довгастого мозку, каудальніше і краніальні� ше від цієї зони PrPSC був відсутній. Така об� межена локалізація PrPSC є характерною практично для всіх пріонних хвороб жуй� них [18], тому вона не може слугувати кри� терієм для диференційної діагностики ТСЕ та детекції окремих штамів патологічного пріона. Докладніший імуногістохімічний аналіз зональної локалізації PrPSC дослідного зраз� ка дав змогу детектувати його високий рівень в оливному ядрі, водночас у мозку тварин, хворих на ГЕ ВРХ, PrPSC виявляєть� ся тільки в дорзальному ядрі блукаючого нерва та солітарному тракті (рис. 3, А, Б), що є характерною діагностичною ознакою ГЕ ВРХ. Існують відмінності в субклітинній лока� лізації PrPSC. Так, при ГЕ ВРХ він детектує� ться переважно в нейрофілі (позаклітинно� му середовищі), тимчасом як у дослідному зразку спостерігається транслокація PrPSC у середину нейронів оливного ядра (рис. 3, В, Г). Окрім цього, змінюється характер де� понування патологічного пріона з дифузно� го на гранулярний (рис. 4). Це свідчить про Рис. 3. Імуногістохімічний аналіз локалізації патологічного пріона в зоні засувки довгастого мозку: А — позитивний контроль — тварина, хвора на ГЕ ВРХ, показано зону дорзального ядра блукаю� чого нерва та солітарний тракт. ×25; Б — дослідна тварина, зона оливного ядра. ×40; В — позитивний контроль, зона дорзального ядра блукаючого нерва. ×200; Г — дослідна тварина, зона оливного ядра. ×400 Рис. 4. Імуногістохімічний аналіз характеру депонування PrPSC у нейронах оливного ядра довгастого мозку дослідної тварини. ×1000 (стрілками позначено типові гранули PrPSC, характерні для амілоїдоподібних фібрил) Експериментальні статті 79 10. Bessen R., Marsh R. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain varia� tion in transmissible mink encephalopathy // Ibid. — 1994. — N 68. — P. 7859–7868. 11. Collinge J., Sidle K., Meads J. et al. Molecular analysis of prion strain variation and the aetiology of ‘new variant’ CJD // Nature. — 1996. — N 383. — P.685–690. 12. Hill A., Sidle K., Joiner S. et al. Molecular screening of sheep for bovine spongiform en� cephalopathy // Neurosci. Lett. — 1998. — N 255. — P.159–162. 13. Parchi P., Castellani R., Capellari S. et al. Molecular basis of phenotypic variability in sporadic Creutzfeldt�Jakob disease // Ann. Neurol. — 1996. — N 39. — P.767–778. 14. Casalone C., Zanusso G., Acutis P. et al. Identification of a second bovine amyloidot� ic spongiform encephalopathy: Molecular similarities with sporadic Creutzfeld�Jakob disease // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 2004. — N 101. — P.3065–3070. 15. Capobianco R., Casalone C., Suardi S. et al. Conversion of the BASE Prion Strain into the BSE Strain: The Origin of BSE? // PLoS Pathog.— 2007. — V.3, N 3. — P. 0001–0008. 16. Biacabe A., Laplanche J., Ryder S. et al. Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases // EMBO J. — 2004. — N 5. — P.10–14. 17. Watts J., Balachandran A., Westaway D. The expanding universe of prion diseases // PLoS Pathog. — 2006. — V. 2, N 3. — P. 0152–0163. 1. Prusiner S. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie // Science. — 1982. — N 216. — P.136–144. 2. Prusiner S. Prions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1998. — N 95. — P.13363–13383. 3. Castilla J., Saa P., Hetz C. et al. In vitro gen� eration of infectious scrapie prions // Cell. — 2005. — N 121. — P.195–206. 4. Kocisko D., Come J., Priola S. et al. Cell�free formation of protease�resistant prion protein // Nature. — 1994. — N 370. — P.419–420. 5. Gaeta A., Hider R. The crucial role of metal ions in neurodegeneration: the basis for a pro� mising therapeutic strategy // Br. J. Phar� macol. — 2005. — N 146. — P. 1041–1059. 6. Martinsa V., Lindenb R., Pradoc M. et al. Cellular prion protein: on the road for functions // FEBS Letters. — 2002. — N 512. — P. 25–28. 7. Milhavet O., McMahon H., Rachidi W. et al. Prion infection impairs the cellular response to oxidative stress // Proc. Natl. Acad. Sci. USA — 2000. — V.97, N 25. — P. 13937–13942. 8. Shyng S., Lehmann S., Moulder K. et al. Sulfated Glycans Stimulate Endocytosis of the Cellular Isoform of the Prion Protein, PrPC, in Cultured Cells // J. of Biol. Chem. — 1995. — V.270. — N 50. — P. 30221–30229. 9. Bessen R., Marsh R. Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalo� pathy agent // J. Virol. — 1992. — N 66. — P. 2096–2101. Молекулярні ознаки, які можна використовувати для диференційної діагностики ГЕ ВРХ та ГАЕ ВРХ Ознака ГЕ ВРХ ГАЕ ВРХ Cпіввідношення глікоформ PrPSC* Переважає диглікозильована форма, моно� і деглікозильо� вана форми — у мінімальній кількості Зростання частки деглікозильованої форми Електрофоретична рухливість глікоформ PrPSC* Стандартна (29, 25 та 19 kDa) Підвищена (27, 23 та 17 kDa) Кількість ізоформ PrPSC* Три основні (29, 25 та 19 kDa) Три основні (27, 23 та 17 kDa) Наявність амілоїдоподібних фібрил у довгастому мозку Відсутні або слідові кількості Велика кількість Акумуляція PrPSC у довгастому мозку Переважно у дорзальному ядрі блукаючого нерва та в солітарному тракті Значна концентрація PrPSC в оливному ядрі Локалізація PrPSC у тканині довгастого мозку Нейрофілярна (позаклітинна) локалізація Інтранейрональна (внутрішньоклітинна) локалізація Тип депонування PrPSC Переважно дифузний Гранулярний ЛІТЕРАТУРАЛІТЕРАТУРА * На підставі характеристик, наведених у [4]. БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №2, 2008 80 20. Peden A., Ritchie D., Head M. et al. Detection and Localization of PrPSc in the Skeletal Muscle of Patients with Variant, Iatrogenic, and Sporadic Forms of Creutzfeldt�Jakob Disease // Amer. J. Pathol. — 2006. — V. 168, N 3. — P.927–935. 21. Vorberg I., Buschmann A., Harmeyer S. et al. A Novel Epitope for the Specific Detection of Exogenous Prion Proteins in Transgenic Mice and Transfected Murine Cell Lines Source // Virology. — 1999. — V.255, N 1. — P.26–31. IDENTIFICATION OF PATHOLOGICAL PRION IN CATTLE WITH BOVINE SPONGIFORM ENCEPHALOPATHY V. V. Vlizlo1 V. V. Stadnyk1 Kh. Ya. Mayor1 P. I. Verbytskii1 R. S. Stoika2 1 Institute of Animal Biology, UAAS, Lviv 2 Institute of Cell Biology of National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv E)mail: stadnyk@inenbiol.com.ua The article presents a comparative study of the molecular characteristics of spongiform cat� tle encephalopathy and spongiform amyloidal cattle encephalopathy. Except general differ� ences typical to spongiform amyloidal cattle encephalopathy, such as change in the molecular mass of pathological prion isoform and amyloid� like fibrils formation, several new characteris� tics on celluar and subcellular level were discov� ered. These characteristics are as following: accumulation of the pathological prion (PrPSC) in olivary nucleus neurons of the medulla oblonga� ta and change in deposition nature of PrPSC from diffuse to granular. All these characteristics specific for spongiform amyloidal cattle ence� phalopathy simplifies a procedure of differential diagnostics of the transmissible spongiform cat� tle encephalopathy. Кey words: spongiform cattle encephalopathy, prion infections, patological prion, diagnostics. 18. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vacci� nes for Terrestrial Animals (Mammals, Birds and Bees). — 5th Ed. — V. 1, 2. — World Or� ganization for Animal Health, 2004. — 498 p. 19. Laemmly U., Beguin F., Gujer)Kellenberg G. A factor preventing the major head protein of bacteriophage T4 from random aggregation // J. Mol. Biol. — 1970. — V.47, N1. — P. 69–85. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРИОНА ПРИ ГУБЧАТООБРАЗНОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В. В. Влизло1 В. В. Стадник1 Х. Я. Майор1 П. И. Вербицкий1 Р. С. Стойка2 1 Институт биологии животных УААН, Львов 2 Институт биологии клетки НАН Украины, Львов E)mail: stadnyk@inenbiol.com.ua Приведены результаты сравнительного ис� следования молекулярных характеристик губчатоподобной энцефалопатии и губчатой амилоидной энцефалопатии крyпного рогато� го скота. Кроме общепринятых отличий, ха� рактерных для губчатой амилоидной энцефа� лопатии крупного рогатого скота, таких как изменение молекулярной массы изоформ па� тологического приона и образования амилои� доподобных фибрилл, обнаружен ряд новых признаков на клеточном и субклеточном уров� нях. К этим признакам следует отнести накоп� ление патологического приона (PrPSC) в нейро� нах оливарного ядра продолговатого мозга и изменение характера аккумуляции PrPSC с диффузного на гранулярный. Совокупность этих признаков, специфических для губчатой амилоидной энцефалопатии крпного рогатого скота, упрощает процедуру дифференциаль� ной диагностики трансмиссивных спонгиформ� ных энцефалопатий крупного рогатого скота. Ключевые слова: губчатоподобная энцефалопатия крупного рогатого скота, прионные инфекции, па� тологический прион, диагностика.

Ідентифікація патологічного пріона при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби

Institution

Ähnliche Einträge