Анализ микотоксинов: подготовка проб

Рассмотрены основные принципы отбора проб и их подготовки для анализа содержания микотоксинов в различных объектах окружающей среды. Главное внимание уделено трихотеценовым микотоксинам, а также зеараленону, афлатоксину и фумонизинам....

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2008
Автори:	Стародуб, Н.Ф., Пилипенко, Л.Н., Егорова, А.В., Пилипенко, И.В., Гойстер, О.С., Хмельницкий, Г.О.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України 2008
Теми:	Нові методи
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/4069
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Анализ микотоксинов: подготовка проб / Н. Ф. Стародуб, Л. Н. Пилипенко, А. В. Егорова, И. В. Пилипенко, О. С. Гойстер, Г. О. Хмельницкий, // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 1. — С. 106-115. — Бібліогр.: 60 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-4069
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-40692013-02-13T02:11:10Z Анализ микотоксинов: подготовка проб Стародуб, Н.Ф. Пилипенко, Л.Н. Егорова, А.В. Пилипенко, И.В. Гойстер, О.С. Хмельницкий, Г.О. Нові методи Рассмотрены основные принципы отбора проб и их подготовки для анализа содержания микотоксинов в различных объектах окружающей среды. Главное внимание уделено трихотеценовым микотоксинам, а также зеараленону, афлатоксину и фумонизинам. Розглянуто основні принципи відбору проб та підготовки їх для аналізу вмісту мікотоксинів у різних об’єктах навколишнього середовища. Головну увагу приділено трихотеценовим мікотоксинам, а також зеараленону, Analysis of main principles of selection of samples and their preparation for the determination of mycotoxins content in different environment objects is presented. The main attention was addresed to trichothecenes mycotoxins and zearalenone, aflatoxin and fumonisins. 2008 Article Анализ микотоксинов: подготовка проб / Н. Ф. Стародуб, Л. Н. Пилипенко, А. В. Егорова, И. В. Пилипенко, О. С. Гойстер, Г. О. Хмельницкий, // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 1. — С. 106-115. — Бібліогр.: 60 назв. — рос. http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/4069 612.017:543.05 ru Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Нові методи Нові методи
spellingShingle	Нові методи Нові методи Стародуб, Н.Ф. Пилипенко, Л.Н. Егорова, А.В. Пилипенко, И.В. Гойстер, О.С. Хмельницкий, Г.О. Анализ микотоксинов: подготовка проб
description	Рассмотрены основные принципы отбора проб и их подготовки для анализа содержания микотоксинов в различных объектах окружающей среды. Главное внимание уделено трихотеценовым микотоксинам, а также зеараленону, афлатоксину и фумонизинам.
format	Article
author	Стародуб, Н.Ф. Пилипенко, Л.Н. Егорова, А.В. Пилипенко, И.В. Гойстер, О.С. Хмельницкий, Г.О.
author_facet	Стародуб, Н.Ф. Пилипенко, Л.Н. Егорова, А.В. Пилипенко, И.В. Гойстер, О.С. Хмельницкий, Г.О.
author_sort	Стародуб, Н.Ф.
title	Анализ микотоксинов: подготовка проб
title_short	Анализ микотоксинов: подготовка проб
title_full	Анализ микотоксинов: подготовка проб
title_fullStr	Анализ микотоксинов: подготовка проб
title_full_unstemmed	Анализ микотоксинов: подготовка проб
title_sort	анализ микотоксинов: подготовка проб
publisher	Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
publishDate	2008
topic_facet	Нові методи
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/4069
citation_txt	Анализ микотоксинов: подготовка проб / Н. Ф. Стародуб, Л. Н. Пилипенко, А. В. Егорова, И. В. Пилипенко, О. С. Гойстер, Г. О. Хмельницкий, // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 1. — С. 106-115. — Бібліогр.: 60 назв. — рос.
work_keys_str_mv	AT starodubnf analizmikotoksinovpodgotovkaprob AT pilipenkoln analizmikotoksinovpodgotovkaprob AT egorovaav analizmikotoksinovpodgotovkaprob AT pilipenkoiv analizmikotoksinovpodgotovkaprob AT gojsteros analizmikotoksinovpodgotovkaprob AT hmelʹnickijgo analizmikotoksinovpodgotovkaprob
first_indexed	2025-07-02T07:18:39Z
last_indexed	2025-07-02T07:18:39Z
_version_	1836518704823664640
fulltext	106 окружающей среды. Эта группа соединений широко распространена и представляет большую опасность для живых организмов [4, 5]. Основное внимание в обзоре уделено трихотеценовым микотоксинам, хотя для выявления некоторых особенностей работы с ними в поле зрения будут находиться и другие виды микотоксинов, в частности зеараленон, афлатоксин и фумонизины. Экстракция: общие положения В последнее время усилия исследовате< лей сосредоточены на развитии способов экстракции с целью повышения ее эффек< тивности путем уменьшения объемов раст< ворителей, сокращения времени процедуры и возрастания уровня ее автоматизации [6]. Особенности выполнения техники экстрак< ции в зависимости от природы образца при< ведены ниже (рисунок). Если образец пред< ставляет собой жидкость, то процесс экстракции характеризуется следующими особенностя< ми: использованием не смешивающегося с образцом растворителя, трудностью выде< ления полярных и ионных компонентов из водных растворов и необходимостью приме< нения большого объема органического раст< ворителя. Для устранения этих недостатков предложено применять твердофазную экстракцию (ТФЭ) и твердофазную микроэ< кстракцию (ТФМЭ) [7–9]. В ТФЭ образец просачивается через твердую фазу, аккуму< лирующую интересуемое вещество, которое Ключевые слова: микотоксины, анализ, отбор и подготовка проб. НОВІ МЕТОДИ УДК 612.017:543.05 АНАНАЛИЗ МИКОТОКСИНОВ: ПОДГОТОВКА ПРОБАЛИЗ МИКОТОКСИНОВ: ПОДГОТОВКА ПРОБ Современный аналитический процесс включает ряд важных стадий [1]. Первые четыре из них — выбор анализируемого ма< териала, формирование выборки проб, отбор образцов и подготовка их для анализа — тес< но связаны между собой и во многом зависят от особенностей исследуемого объекта, его физико<химических характеристик, специ< фики определяемого вещества и т. д. После< дующие стадии этого процесса направлены на выделение, идентификацию и количест< венное определение анализируемого вещест< ва, далее следуют статистическая оценка по< лученных данных и окончательные выводы. Подготовка проб для анализа является крайне необходимой процедурой, поскольку в большинстве случаев нельзя использовать непосредственно исходный материал, иног< да еще нужно проводить очистку загрязнен< ного образца, преконцентрацию анализиру< емой субстанции. Следует отметить, что такие процедуры достаточно важны, так как в значительной степени влияют на окон< чательный результат анализа. Они имеют ряд особенностей для конкретных обследуе< мых объектов, анализируемых веществ и используемых методик. Ранее мы [2, 3] уже останавливались на специфике подго< товки проб при анализе пестицидов. Цель настоящей статьи — дать обобщенный ана< лиз сведений об особенностях подготовки проб для выявления и количественной оценки содержания микотоксинов в ряде объектов Н. Ф. Стародуб1 1Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев Л. Н. Пилипенко2 А. В. Егорова2 2Одесская национальная академия пищевых технологий И. В. Пилипенко2 О. С. Гойстер1 3Национальный аграрный университет, Киев Г. А. Хмельницкий3 Е$mail: nikstarodub@yahoo.com Рассмотрены основные принципы отбора проб и их подготовки для анализа содержания микотоксинов в различных объектах окружающей среды. Главное внимание уделено трихотеценовым микотоксинам, а также зеараленону, афлатоксину и фумонизинам. Нові методи 107 Основные варианты использования техники экстракции в зависимости от состояния образца Газовая среда Твердая фаза Жидкость Растворение в жидкости Сокслет Переме< шивание Озвучивание МВЭЖЭВДСКЖЭ ТВД ТФМЭ ТФЭ ТФЭ Жидкость — жидконосная экстракция Очистка ОчисткаСорбция на твердой фазе Сокслет затем будет с нее элюировано. Такая техни< ка открывает возможности получения экстракта с высокой избирательностью для анализируемого вещества и в случае его вы< сокой концентрации. К тому же многие твердофазные селективные системы приме< няются в виде специальных картриджей, дисков или многоячеечных плат, что способ< ствует автоматизации процесса. Вместе с тем метод ТФЭ имеет и ряд недостатков, основным из которых является то, что экстрагируемое вещество находится в среде, не соответству< ющей дальнейшим условиям анализа, а сле< довательно, требуется обязательное высу< шивание образца и его перерастворение. Этого можно избежать, применяя ТФМЭ, являющуюся в действительности техникой без растворителя. В ней волокна, покрытые полимерами, находятся между образцом и растворителем. Десорбция вещества дос< тигается легко при газово<жидкостной хро< матографии [8, 9]. Интересным вариантом этой техники является применение встря< хивания при сорбции и термического воз< действия при десорбции (ТВД) [10]. Вместе с тем обе рассмотренные техники зависят от природы сорбента и нередко не обеспечива< ют полной экстракции, что ограничивает их применение. Традиционно используемые способы экс< тракции базируются на применении ульт< развука и принципа Сокслета [6]. Их усовер< шенствование связано с развитием сверх< критической жидкостной экстракции (СКЖЭ), жидкостной экстракции при высо< ком давлении (ЖЭВД) и микроволновой экстракции (МВЭ). Поскольку при экстрак< ции важным является увеличение раствори< мости веществ, повышение их диффузии, уменьшение вязкости растворителя, а также улучшение десорбции анализируемого ве< щества с поверхности матрикса, то повыше< ние температуры при выполнении СКЖЭ, наряду с использованием суперкритических растворителей, является вполне оправдан< ным [11]. В случае ЖЭВД поддерживается оптимальное сочетание температуры и дав< ления в системе. МВЭ может сочетать все указанные выше условия в дополнение к эф< фекту микроволнового излучения [12, 13]. Одним из недостатков такой экстракции яв< ляется то, что в этом случае требуется дополнительная фильтрация конечного со< держимого образца. Несмотря на уже дос< тигнутые успехи в развитии техники экстракции, обеспечение ее высокой эффек< тивности, простоты, низкой стоимости и ми< нимальности применения растворителей, широкое использование которых может причинить вред состоянию окружающей среды, требует дальнейших исследований в этом направлении. Особенности формирования выборки при анализе объектов окружающей среды Микромицеты рода Fusarium, которые способны продуцировать опасные микоток< сины, контаминируют широкий спектр объ< ектов окружающей среды [4, 5], при этом важно то, что они очень часто встречаются БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №1, 2008 108 в кормах животных. Особую опасность представляют микотоксины, включающие такие группы токсических агентов, как три< хотецены, монилиформин, зеараленон и фу< монизины [14]. Идентифицировано более 150 трихотеценовых токсических агентов, среди которых наиболее опасными и часто встречающимися являются Т<2, дезоксини< валенол, ниваленол, вомитоксин и ангуи< дин [15]. Кроме Fusarium, трихотецены про< дуцируются такими микромицетами, как Trichoderma и Stachybotrys сephalosporium, а также рядом других [16]. Биологический эффект трихотеценов проявляется на уровне желудочно<кишечного тракта, дермато<, иммуно<, гемато< и генотоксичности [17]. Преимущественными продуцентами Т<2 мико< токсина являются F. sporotrichioides и F. poae [18]. Для большинства видов животных ЛД50 Т<2 микотоксина составляет 5 мг/кг мас< сы [19], хотя уже при дозе, равной 0,1 мг/кг, наблюдаются существенные изменения в био< химических показателях мозга [14]. В быв< шем СССР предельно допустимой дозой Т<2 микотоксина в зерне пищевого и фуражного назначения считалась доза 100 нг/г [20]. Дру< гой представитель трихотеценов — воми< токсин менее токсичен, чем Т<2, но более распространен [19]. Для него величина ЛД50 колеблется в пределах 50–70 мг/кг массы тела животного, хотя он тоже проявляет би< ологический эффект при значительно мень< ших дозах (0,001 мг/кг). Поэтому экспертами комитетов ФAO/ВОЗ по пищевым добавкам установлен его допустимый лимит на уровне 1 мкг/кг массы тела животных [21]. Поэто< му, учитывая приведенные выше величины токсичности и допустимые концентрации отдельных трихотеценов, следует ориенти< роваться на уровень чувствительности применяемых методов, с одной стороны, а с другой — на подбор высокоэффективных способов экстракции этих соединений из различных объектов окружающей среды, чтобы не допустить их потери в процессе подготовки проб к анализу. Безусловно, анализу на наличие этих токсинов подвергаются самые различные корма животных: зерно, фураж, корнепло< ды, сено и т. д. Что касается продуктов пита< ния человека, то в поле зрения санитарных врачей находится все, начиная от зерна, му< ки, мяса различных животных, орехов, ово< щей и заканчивая чаем, цитрусовыми и та< кими напитками, как пиво, вино и пр. Уровень указанных выше токсинов у живот< ных контролируется в крови, моче и в раз< личных тканях. Зоны загрязнения продуктов микотокси< нами часто видны визуально. Как правило, микотоксины неравномерно распределены в пищевых продуктах. При идентификации типа микотоксина достаточно отобрать об< разцы загрязнений, однако при оценке уровня загрязнения образцы должны быть тщательно перемешаны или даже гомогени< зированы. Важно и количество отбираемых образцов. Оно должно быть достаточным, с одной стороны, для осуществления анали< за, а с другой — для заключения об удель< ной интенсивности загрязнения. Для жид< костей, сыпучих веществ или компактных твердых объектов это может составлять нес< колько килограммов массы, а для неболь< ших отдельных объектов (типа орехов) — до нескольких сотен штук. В дальнейшем отоб< ранные образцы могут быть разделены на отдельные части для осуществления парал< лельных анализов [22]. Подготовка образцов для анализа Основным приемом подготовки образца для анализа является тот или иной тип экстракции, общие принципы которой изло< жены выше. Среди микотоксинов встреча< ются как растворимые в воде, так и те, что растворяются лишь в полярных или непо< лярных растворителях, и это следует учиты< вать в процессе осуществления экстрак< ции [23]. При анализе жидкостей с заранее пред< полагаемым низким содержанием микоток< синов их концентрируют с использованием вакуумного испарителя. Так, в случае ана< лиза различных метаболитов микотоксина Т<2 в моче [24] ее концентрируют испарением при низком давлении. Затем образец нано< сят сначала на колонку с aмберлитом ХAD<2 с последующей его элюцией метанолом, а за< тем на колонку с Florisil и элюируют смесью хлороформа с метанолом в различных соот< ношениях в зависимости от набора выделяе< мых метаболитов. Аналогичные процедуры предварительной очистки выполняют и при анализе фекальных масс, но предваритель< но осуществляют ряд дополнительных процедур — экстракцию образца с помощью 50%<го водного раствора метанола (в соот< ношении 1:4), смешивание с ацетоном (в со< отношении 1:2,5), далее высушивание экстракта, растворение остатка в воде и, на< конец, экстракцию хлороформом. Для ана< лиза могут быть использованы как водные образцы, так и находящиеся в хлороформе. При работе с тканями, в частности с печенью, Нові методи 109 Нові методи предлагается подобный алгоритм экстрак< ции и предварительной очистки образца пе< ред анализом [25]. Имеется сообщение [26] о выделении Т<2 микотоксина и его производ< ных из культуры фильтрованием гомогена< та через подушку целита 545, а затем пере< мешиванием фильтрата с амберлитом XAD<4 в течение 12 ч. Далее следует про< мывание сорбента водой и элюирование ми< котоксина ацетоном с последующим его высушиванием для дальнейшего перераст< ворения в метаноле и анализа соответствую< щим методом. Согласно другим авторам [27], экстракция может быть осуществлена сме< сью метанола и хлороформа с последующей обработкой продукта ацетоном. Затем экст< ракт наносится на колонку кремнезема, с которой микотоксины элюируют п<гекса< ном, смесью п<гексан–ацетон, ацетоном и ме< танолом. Полученные фракции анализиру< ют тонкопленочной хроматографией. Для экстрагирования Т<2 микотоксина из зерна предлагается использовать 40%<й водный раствор метанола, причем соотно< шение растворителя и образца должно быть 2:1 [28]. Другие исследователи используют для этих целей смесь ацетонитрила с водой (5:1) [20]. При экстракции Т<2 микотоксина и диацетоксискирпенола из листьев и вет< вей растений после ацетонитрила применя< ют эфир для обезжиривания полученного продукта. В зависимости от дальнейших це< лей основной ацетонитриловый экстракт выпаривают с помощью вакуумного испари< теля и затем растворяют осадок в смеси ме< танола и воды в соотношении 1:1 или 1:5. Следующий этап подготовки образца заключа< ется в нанесении его на колонку с амберлитом ХAD<2 и элюции микотоксинов метанолом [29]. Для экстрагирования дезоксинивале< нола также используют 10,5%<й водный раствор ацетонитрила [30]. Данный вид три< хотеценовых микотоксинов выделяли из риса и с помощью двухступенчатой экстракции: сначала 70%<м, а затем 100%<м метанолом. Затем обе фракции объединяли и, более то< го, подвергали их усушке для концентриро< вания содержимого. Далее экстракт насы< щали хлористым натрием, фильтровали и после удаления из него метанола обраба< тывали двукратным объемом этилацетата [31]. Для одновременной экстракции таких трихотеценовых микотоксинов, как дезок< синиваленол и ниваленол, Tanaka T. и соавт. [32] предлагают использовать смесь ацето< нитрила и воды в соотношении 3:1. Этот растворитель позволяет экстрагировать до 87% дезоксиниваленола и 86% ниваленола из полированного риса и пшеницы при их исходной концентрации 300 мкг/кг. Для обезжиривания авторы рекомендуют ис< пользовать н<гексан. После такой обработки образца им удавалось с помощью двухсту< пенчатой хроматографии на колонках Flo< risil и Sep<pak выявить указанные выше ми< котоксины с чувствительностью 2 мкг/кг. Из содержимого рубца жвачных живот< ных трихотецены экстрагировали с помо< щью этилацетата, а афлатоксин, охратоксин и зеараленон — с применением CHCl3 [33]. Этилацетат используют для выделения то< тального набора трихотеценов [34]. Этот же растворитель применяли и для экстрагиро< вания Т<2 микотоксина и его производных из испражнений животных [35]. Далее экст< ракт обрабатывали эфиром, высушивали и перерастворяли в метаноле, а после добав< ления пятикратного объема воды наносили на колонку с амберлитом XAD<2 с последую< щим элюированием микотоксинов 90%<м водным раствором метанола. С помощью ТФЭ экстрагировали зеара< ленон и охратоксин А из почвы [36]. Для этой цели использовали колонки, наполнен< ные сорбентом С8. Предварительно обраба< тывали образцы из почвы в течение 30 мин смесью метанол — вода (9:1), содержащей аскорбиновую кислоту (1,7%), с последую< щей нейтрализацией содержимого выпари< ванием его в потоке азота и растворением в фосфорной кислоте. Таким способом уда< ется экстрагировать 85,8 и 93,4% охраток< сина и зеараленона при воспроизведении ре< зультатов 5,1 и 12,8% соответственно. Воспроизводимость анализов составляет 8,5 и 15% при концентрациях 0,2–30 мкг/кг охратоксина и 1–100 мкг/кг зеараленона. Сообщается [37], что экстракция охратокси< на А более интенсивно осуществляется сме< сью водного раствора бикарбоната натрия с метанолом, чем в случае применения сме< си водного раствора фосфорной кислоты и метанола. Для экстрагирования зеараленона из зерен пшеницы и крупы была успешно применена техника МВЭ [38]. Подобраны растворите< ли, установлены оптимальные показатели для времени и температуры. В частности по< казано, что при использовании смеси мета< нола с ацетонитрилом в соотношении 1:1 (по объему) при 80 0С в течение 5 мин удается экстрагировать до 92% данного микотокси< на из заранее приготовленного образца. При этом стандартное отклонение результатов от опыта к опыту было в пределах 12%, что со< гласуется с требованиями законодательства БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №1, 2008 110 ЕС. Иной подход для элюирования общего зеараленона и его α<производного из зерна пшеницы основан на использовании усиленной жидкостной экстракции [39]. Стационарная фаза колонки представлена С18<полимером, а в качестве растворителя используется смесь ацетонитрил–метанол–вода, содержа< щая 15 ммоль ацетата аммония в соотноше< нии 10:55:35 со скоростью протекания 1 мл в минуту через объем 11 мл при давлении, равном 1500 psi, и температуре 50 0С. В диа< пазоне концентраций 50–200 нг/г зерна уда< ется экстрагировать около 96% зеараленона и 98,4% его α<производного. При этом стан< дартное отклонение результатов не превы< шает 4,6%. Испытания этого способа экст< рагирования показали его пригодность для анализа загрязнения данными микотокси< нами овса, ржи и дерти. Однако в случае ри< са экстрагирование α<зеараленона не было столь успешным. ТФЭ сочетали с последующей иммуноаф< финной хроматографией для подготовки об< разцов пшеницы, ржи, ячменя и овса перед определением в них охратоксина А и зеара< ленона с помощью жидкостной хроматогра< фии высокого давления с флуоресцентной регистрацией [40]. Таким способом удается экстрагировать не менее 68 и 78% соответ< ственно охратоксина А (0,6 и 2,5 мкг/кг) и зеараленона (9 и 25 мкг/кг), предвари< тельно добавленных в указанные выше образ< цы. Стандартное отклонение результатов от опыта к опыту для этих микотоксинов ко< леблется в пределах 2–15 и 2–19%. Для экстрагирования и очистки зеараленона из зерна пшеницы и риса были испытаны три типа ТФЭ (С<18, кремниевые и Florisil<карт< риджи), а также иммуноаффинная хрома< тография [41]. Оказалось, что картриджи с Florisil<сорбентом обеспечивают большую степень экстракции этого микотоксина, чем картриджи, наполненные С<18 и, особенно, кремниевыми сорбентами, которые вообще малоэффективны. При этом смесь метанола с 1%<м водным раствором хлористого нат< рия в соотношении 8:2 или 6:4 оказалась наи< более подходящей в сравнении с другими ис< пытанными системами. Осуществлен поиск новых растворителей для экстрагирования ох< ратоксина А из продуктов питания и, в част< ности, из виноградного вина [42]. Показано, что экстракция смесью раствора карбоната натрия и полиэтиленгликоля (5% NaHCO3 и 1% полиэтиленгликоля 8000) с последую< щей иммуноаффинной хроматографией обеспечивают высвобождение около 76% данного токсина при исходной его концент< рации 0,05–1 мкг/кг массы, с уровнем вос< производимости результатов 8 и 12% соот< ветственно. Такая экстракция происходит более интенсивно, чем в случае использова< ния смесей на основе метанола. Предпринята попытка объединить экстра< гирование фумонизинов из образцов куку< рузы и очистку полученного продукта в еди< ный процесс с помощью ионообменной хроматографии [43]. Для этого колонку предварительно промывали метанолом и смесью метанола и воды (3:1). Затем неболь< шую порцию кукурузы помещали в специ< альную верхнюю часть колонки и вносили туда аликвоту смеси метанола и воды (3:1). Экстрагирование продолжалось в течение 1 ч, после чего колонку промывали метано< лом и 4 раза смесью метанола с уксусной кислотой (95,5:0,5). Собранные фракции объединяли, высушивали в потоке азота при 60 0С и растворяли в метаноле для последу< ющего анализа. Проведено сравнительное изучение эф< фективности способов подготовки образцов при экстрагирования фумонизинов из куку< рузы и ее продуктов с помощью различных растворителей, а также при очистке полу< ченных экстрактов [44]. Оказалось, что экстракция фумонизинов смесью ацетонит< рила с водой в соотношении 1:1 и последую< щая иммуноаффинная хроматография более эффективны при подготовке указанных вы< ше образцов для анализа, чем использова< ние для этих целей смеси метанола с водой (1:1) и затем проведение анионобменной хро< матографии. Хотя отмечено, что первая сис< тема может вносить и некоторые погрешности в результаты анализа. В этой связи предс< тавляют интерес данные о том, что с помощью смеси метанол–ацетонитрил–вода (в соот< ношении 1:1:2) удается выделить менее 5% фумонизинов В1 и В2, добавленных к рисо< вой муке из расчета 500 нг/г [45]. При повы< шении температуры до 40–50 0С, снижении рН смеси до 3,3 с помощью 0,1 М натрийцит< ратного буфера повышается эффективность экстракции обоих фумонизинов до уровня 20–25%. Однако это наблюдается лишь в уз< ком диапазоне варьирования указанных вы< ше условий. Так, повышение температуры до 60 0С или доведение рН смеси до значений 4–6 резко снижает интенсивность экстрак< ции фумонизинов. Вместе с тем применение 0,1 М раствора натриевой соли ЭДТА обеспе< чивает за три этапа экстракции почти 50%<е их извлечение. Обращает на себя внимание тот факт, что устойчивость обоих фумонизи< нов существенно изменяется в отдельных об< Нові методи 111 Нові методи разцах и в присутствии различных ингреди< ентов. При внесении в образец глюкозы че< рез 24 ч сохраняется лишь 25% фумонизинов. Что касается Т<2 микотоксина, то следу< ет отметить его достаточно высокую устой< чивость в водных растворах [46]. При темпе< ратуре от 4 до 37 0С он сохраняется на протяжении трех недель. При дальнейшем увеличении температуры его стабильность снижается. В среде для культуры ткани как в присутствии белков, так и без них он со< храняет более высокую стабильность, чем в среде Хенкса. Особенности стабильности микотоксинов следует учитывать при подго< товке образцов для анализа, чтобы избежать потери их в течение этого процесса. Вместе с тем важно знать и способы инактивации микотоксинов для предотвращения опас< ности их влияния на исследователя и окру< жающую среду. Так, Т<2 микотоксин инак< тивируется в течение 30 мин раствором, содержащим 2,5% гипохлорита натрия и 0,25 н. едкого натрия [47]. Важные сведе< ния получены при изучении стабильности некоторых трихотеценов в различных сре< дах. Установлено [48], что ацетонитрил яв< ляется наиболее подходящим растворите< лем для сохранения этих видов токсинов. Так, дезоксиваленол и ниваленол в этом ра< створителе остаются стабильными в течение 24 месяцев при температуре –18 0С. Однако они в значительной степени разлагаются по истечении этого срока, а также через 12 ме< сяцев в случае сохранения при температуре 25 0С. Несомненно, эти сведения важны для того, чтобы ориентироваться, при каких ус< ловиях и в каких растворителях должны сохраняться подготовленные для анализа образцы, во избежание потери содержимого в процессе хранения. В процессе исследования эффективности различных веществ для извлечения афла< токсина В1 из отдельных продуктов и кор< мов было установлено [49], что экстрагиру< ющие растворы на основе метанола более приемлемы по сравнению с теми, которые включают ацетонитрил. Последний раство< ритель способен более интенсивно взаимо< действовать с основным матриксом анализи< руемого объекта и более активно поглощает воду, что препятствует экстрагированию данного микотоксина. Известно, что афла< токсины растворимы в слегка полярных и нерастворимы в полностью неполярных растворителях. Для их экстрагирования ис< пользуют такие органические растворители, как ацетон, хлороформ и метанол [50]. Вмес< те с тем небольшое количество воды в них способствует проникновению органических веществ в образец и повышает эффектив< ность экстракции. Обработка полученного продукта гексаном позволяет его обезжи< рить [51]. Считается [50, 51], что для выде< ления и очистки этих микотоксинов наибо< лее подходящими являются картриджи для ТФЭ и иммуноаффинной хроматографии. Причем связывающая фаза может быть по< лярной (кремниевые картриджи) или непо< лярной (С2, С8, С18, циклогексиловые либо фениловые картриджи). Предложены и муль< тифункциональные колонки с иммуноаф< финной хроматографией, а также ряд прис< пособлений для очистки экстрагированных фумонизинов [50]. Международная федера< ция производства молока, Международный союз чистой и прикладной химии и Между< народный союз атомной энергии совместно с Организацией ООН по вопросам продоволь< ствия и сельского хозяйства (ФАО) осуществи< ли проверку метода определения афлатоксина М1 в молоке путем иммуноафинной очистки с последующей тонкослойной хроматографи< ей [52]. Было показано, что при концентра< ции этого токсина, равной 0,5 мкг/л, воспро< изводимость результатов составляет 34–53%. Следует обратить внимание на необходи< мость проведения дополнительной очистки полученных экстрактов при анализе мико< токсинов с целью удаления приобретенной ими окраски за счет самого образца. Во мно< гих случаях такая процедура не является строго обязательной, особенно при последу< ющем анализе содержания микотоксинов иммуно<химическими методами. Однако при осуществлении различных хроматогра< фических процедур прибегают к предвари< тельной хроматографии экстрактов с по< мощью сорбентов С18 или амберлит XAD<2 (XAD<4), колонок типа SAX или Florisil [26, 29, 35, 36, 43, 44]. Кроме того, на этапе уда< ления жира также достигается снижение уровня окраски экстракта [20, 25, 27, 32]. Выявление и количественное определе< ние содержания микотоксинов в объектах окружающей среды является чрезвычайно важным, при этом необходимо обеспечить объективность анализа, его воспроизводи< мость и адекватность конкретным ситуаци< ям. Ввиду этого еще в 1995 г. Европейская комиссия обсуждала возможность стандар< тизации всех этапов осуществления анализа [53, 54]. Исходя из приведенных выше све< дений для микотоксинов, растворимых в ор< ганических средах (типа Т<2, охратоксина, цитринина, фузариевой кислоты), наиболее приемлемой является процедура подготовки БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №1, 2008 112 образца, которая включает экстрагирование их с помощью смесей хлороформа, метанола и этилацетата с применением эфира или п< гексана для обезжиривания полученного продукта. Как правило, для дальнейшего анализа необходимо его высушивание в по< токе азота и растворение в метаноле. В слу< чае использования иммунных методов ана< лиза микотоксина Т<2 целесообразным является применение смеси ацетонитрила с водой в соотношении 5:1, которая обеспе< чивает и более эффективную экстракцию водорастворимых микотоксинов (типа фу< монизинов В1 и В2), чем смесь метанола и во< ды или одной воды, хотя в этом отношении весьма перспективными оказались водные растворы Na2ЭДТА. Следует отметить, что смесь ацетонитрила и воды (3:1) признана эффективной и для одновременной экстрак< ции дезоксиниваленола и ниваленола [32]. Современный уровень развития техники экстрагирования базируется на использова< нии специальных картриджей с различны< ми наполнителями, которые подобраны для того или иного вида микотоксинов. Кроме того, предложен целый ряд иммуноаффин< ных методов выделения и очистки групп этих токсинов и их отдельных представителей. В частности, в последнее время появились сообщения о разработке автоматизирован< ной системы для ТЭФ, иммуноэкстракции и иммунофильтрации [55–57] для многих соединений. Описан вариант микроэкстрак< ции, когда можно использовать буквально микролитры таких растворителей, как бен< зол, толуол, этилбензол, октанол, ксилен и др. [58]. Имеется сообщение и о возможности практического применения тонкопленоч< ной микроэкстракции [59]. Дальнейшее раз< витие техники иммуноэкстракции предпо< лагает применение импринтинг<вариантов, когда полимер моделирует специфические сайты связывания микотоксина, как это предложено для направленного выделения охратоксина А [60]. 1. Jinno K. Modern sample preparation tech< niques // Anal. Bioanal. Chem. — 2002. — V. 373. — P. 1–2. 2. Стародуб Н. Ф., Стародуб В. M. Биосенсо< ры и контроль пестицидов в воде и продук< тах // Химия и технология воды. — 2001. — V. 23, №6. — С. 612–638. 3. Стародуб Н.Ф., Стародуб В.M. Биосенсор< ный контроль загрязнения воды некото< рыми органическими веществами // Там же. — 2002. — T. 24, № 5. — С. 447–472. 4. Артюх В. П., Гойстер О. С., Хмельницкий Г. А., Стародуб Н. Ф. Трихотеценовые микоток< сины: определение в объектах окружающей среды // Биополимеры и клетка. — 2003. — T. 19, №3. — С. 1–8. 5. Артюх В. П., Гойстер О. С., Хмельниц$ кий Г. О., Стародуб М. Ф. Трихотеценовые микотоксины: природа, биотрансформа< ция, биологические эффекты // Совр. проб< л. токсикол. — 2002. — №4. — С. 19–26. 6. Camel V. Extraction techniques // Anal. Bioanal. Chem. — 2002. — V. 372. — P. 39–40. 7. Dean J.R. Extraction methods for environ< mental analysis. — Chichester: John Wiley and Sons, 1998. — 371 p. 8. Thurman E. M., Mills M. S. Solid phase extraction: principles and practice. — New York: John Wiley and Sons, 1998. — 344 p. 9. Pawliszyn J. Solid phase microextraction: Theory and practice. — New York: John Wiley and Sons, 1997. — 264 p. 10. Baltussen E., Sandra P., David F., Cramers C. Stir bar sorptive extraction (SBSE), a novel extraction technique for aqueous samples: Theory and principles // J. Microcolumn Sep. — 1999. — V. 11, N10. — P. 737–747. 11. Ramsey E.D. Analytical supercritical fluid extraction techniques. — Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1998. 12. Richter B. E., Jones B. A., Ezzell J. L. et al. Technique for Sample Preparation // Anal. Chem. — 1996. — V. 68. — P.1033–1039. 13. Camel V. Microwave<assisted solvent extrac< tion of environmental samples //Trends Anal. Chem. — 2000. — V. 19. — P. 229–248. 14. Сonkova E., Laciakova A., Kovac G., Seidel H. Fusarial toxins and their role in animal dis< eases // Vet. J. — 2003. — V. 165. — P. 214–220. 15. Pittet A. Natural occurrence of mycotoxins in foods and feeds — an updated review // Rev. de Med. Veter. — 1998. — V. 149. — P. 479–492. 16. Ticha J., Kaisrova A., Lucny M. Toxinogenic moulds and their metabolites in cereals // Mlynsko<pekarensky prumysl. — 1984. — V. 4. — P. 113–114. ЛИТЕРАТУРА Нові методи 113 17. Ostry V. Filamentous microscopic fungi (moulds), mycotoxins and human health. — Praha: SZU, 1998. — 20 p. 18. Moss M. O. Mycotoxins // Mycolog. Res. — 1996. — V. 100. — P. 513–523. 19. Moss M. O. Fusarial toxins: are they a cause for concern? // Vet. J. — 2003. — V. 165. — P. 184–185. 20. Кононенко Г. П., Буркин А. А., Соболева Н. А., Зотова Е. В. Иммуноферментный метод определения Т<2 токсина в контаминиро< ванном зерне // Приклад. биохим. и мик< робиол. — 1999. — T. 35, №4. — С. 457–462. 21. WHO. Evaluation of Certain Mycotoxins in Food. 56th report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives // WHO Technical Report Series 906. — Geneva, 2002. 22. Jaimez J., Fente C. A., Vazquez B. I. et al. Application of the assay of aflatoxins by liq< uid chromatography with fluorescence detection in food analysis // J. Chromatogr. — 2000. — V. 882. — P. 1–10. 23. Steyn P. S. Mycotoxins, general view, chem< istry and structure // Toxicol. Let. — 1995. — V. 82/83. — P. 843–851. 24. Yoshizawa T., Sakamoto T., Kuwamura K. Structures of deepoxytrichotecene metabo< lites from 3’<hydroxy HT<2 toxin and T<2 tetraol in rats // Appl. Environ. Microbiol. — 1985. — V. 50, N 3. — P. 676–679. 25. Yoshizawa T., Sakamoto T., Okamoto K. In vitro formation of 3’<hydroxy T<2 and 3’< hydroxy HT<2 Toxins from T<2 by liver homogenates from mice and monkeys // Ibid. — 1984. — V. 47, N 1. — P. 130–134. 26. Swanson S. P., Rood H. D., Behrens J. C., Sanders P. E. Preparation and characteriza< tion of the deepoxy trichothecenes: deepoxy HT<2, deepoxy T<2 triol, deepoxy T<2 tetraol. Deepoxy 15<monoacetoxyscirpenol and deepoxy scierpentiol // Ibid. — 1987. — V. 53, N 12. — P. 2821–2826. 27. Ishii K., Ueno V. Isolation and characteriza< tion of two new trichothecenes from Fusa< rium sportrichioides strain M<1<1 // Ibid. — 1981. — V. 42, N 3. — P. 541–543. 28. Vesonder R. F., Ciegler A., Burmeister H. R., Jensen A. H. Acceptance by swine and rats corn amended with trichothecenes // Ibid. — 1979. — V. 38, N 2. — P. 344–346. 29. Mirocha C. J., Abbas H. K., Treeful L. Bean G. T<2 toxin and diacetoxyscirpenol metabo< lism by Baccharis spp // Ibid. — 1988. — V. 54, N 9. — P. 2277–2280. 30. Schneider L., Pichler H., Krska R. An enzyme linked immunoassay for the determination of deoxynivalenol in wheat based on chicken egg yolk antibodies // Frasenius J. Anal. Chem. — 2000. — V. 367. — P. 98–100. 31. Clifford L. J., Jia Q., Pestka J. J. An improved method for the purification of the trichothecene deoxynivalenol (vomitoxin) from Fusarium graminearum culture // J. Agric. Food Chem. — 2003. — V. 51. — P. 521–523. 32. Tanaka T., Yoneda A. et al. Simultaneous determination of trichothecene mycotoxins and zearalenone in cereals by gas chromatog< raphy<mass spectrometry // J. Chromatogr. — 2000. — V. 882, N1–2. — P. 23–28. 33. Kiessling K.H., Pettersson H., Sandholm K., Olsen M. Metabolism of aflatoxin. Ochra< toxin, zearalenone and three trichotecenes by intact rumen fluid, rumen protozoa and rumen bacteria // Appl. Environ. Microbiol. — 1984. — V. 47, N 5. — P. 1070–1073. 34. Plattner R. D., Tjarks L. W., Beremand M. N. Trichothecenes accumulated in liquid cul< ture of a mutant of Fusarium sporotri$ chioides NRRL 3299 // Ibid. — 1989. — V. 55, N 9. — P. 2190–2194. 35. Visconti A., Mirocha C. J. Identification of various T<2 toxin metabolites in chicken exc< reta and tissues // Ibid. — 1985. — V. 49, N 5. — P. 1246–1250. 36. Mortensen G. K., Strobel B.W., Hansen H. Ch. B. Determination of zearalenone and ochratox< in A in soil // Anal. Bioanal. Chem. — 2003. — V. 376 — P. 98–101. 37. Moller T. E., Nyberg M. Ochratoxin A in raisins and currants: basic extraction proce< dure used in two small marketing surveys of the occurrence and control of the hetero< geneity of the toxins in samples // Food Addit. Contamin. — 2003. — V. 20, N11. — P. 1072–1076. 38. Pallaroni L., Von Holst Ch., Eskilsson C. S., Bjorklund E. Microwave<assisted extraction of zearalenone from wheat and corn // Anal. Bio< anal. Chem. — 2002. — V. 374 — P. 161–166. 39. Urraca J. L., Marazuela M. D., Moreno$ Bond M. C. Analysis for zearalenone and α<zearalenone in cereals and swine feed using accelerated solvent extraction and liq< uid chromatography with fluorescence detection // Anal. Chem. Acta — 2004. — V. 524, N1–2. — P. 175–183. 40. Eskola M., Kokkonen M., Rizzo A. Applica< tion of manual and automated systems for purification of ochratoxin A and zearale< none in cereals with immunoaffinity columns // Agricult. Food Chem. — 2002. — V. 50. — P. 41–47. 41. Llorens A., Mateo R., Mateo J. J., Jimenez M. Comparison of extraction and clean<up pro< cedures for analysis of zearalenone in corn, rice and wheat grains by high<performance liquid chromatography with photodiode array and fluorescence detection // Food БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №1, 2008 114 Additiv. Contamin. — 2002. — V. 19, N 3. — P. 271–281. 42. Serra R., Mendonca C., Abrunhosa L. et al. Determinantion of ochratoxin A in vine gropes: comparison of extraction procedures and method validation // Anal. Chem. Acta. — 2004. — V. 513. — P. 41–47. 43. Valazques C., Llovera M., Pena E. et al. Linking extraction and purification of maize samples for fumonisin analysis // Food Addit. Contam. — 1999. — V. 18, N 3. — P. 125–128. 44. De Girolamo A., Solfrizzo M., von Holst Ch., Visconti A. Comparison of different extrac< tion and clean<up procedures for the deter< mination of fumonisins in maize and maize< based food products //Ibid. — 2001. — V. 18, N 1. — P. 59–67. 45. Kim E. K., Scott P. M., Lau B. P.$Y., Lewis D. A. Extraction of fumonisins B1 and B2 from white rice flour and their stability in white rice flour, cornstarch, cornmeal and glucose // J. Agric. Food Chem. — 2002. — V. 50. — P. 3614–3620. 46. Trusal L.R. Stability of T<2 mycotoxin in aque< ous media // Appl. Environ. Microbiol. — 1985. — V. 50, N 5. — P. 1311–1312. 47. Department of Defense<Department of Army, 32 CFR, part 627. The biological defense safe< ty program (Technical safety requirements). DA pamphlet 385<69. Final Rule. 48. Widestrand J., Pettersson H. Effect of time, temperature and solvent on the stability of T<2<toxin, HT<2 toxin, deoxynivalenol and nivalenol calibrants // Food Additiv. Contamin. — 2001. — V. 18, N 11. — P. 987–992. 49. Stroka J., Petz M., Joerissen U., Anklam E. Investigation of various extractants for the analysis of aflatoxin B1 in different food and feed matrices // Ibid. — 1999. — V. 16, N8. — P. 331–338. 50. Jaimes J., Fente C.A., Vazquez B.I.et al. Application of the assay of aflatoxins by liq< uid chromatography with fluorescence detection in food analysis // J. Chroma< togr. — 2000. — V. 882. — P. 1–10. 51. Moss M. O., Smith J. E. Mycotoxins: Forma< tion, analysis and significance. — Choiche< ster: John Wiley and Sons, 1979. 52. Grasso F., Fremy J. M., Bevis S., Dragassi S. Joint IDF<IUPAC<IAEA (FAD) interlabora< tory validation for determining aflatoxin M1 in milk by using immunoaffinity clean<up before thin<layer chromatography // Food Additiv. Contamin. — 2004. — V. 21, N4. — P. 348–457. 53. De Koe W. J. Natural toxins // Chairman panel discussion. — 1995. — N 3. — P. 280. 54. Wilkes J. G., Sutherland J. B. Sample prepa< ration and high<resolution separation of mycotoxins possessing carboxyl groups // J. Chromatogr. — 1998. — V. 717B. — P. 135–156. 55. Banza R., Rois A., Gomes$Hens A., Valcarcel M. Supercritical fluid immunoextraction: a new approach for immunoassay automa< tion // Anal. Chem. Acta. — 2004. — V. 518. — P. 151–156. 56. Morais S., Maquieeira A., Puchades R. Immunofiltration: A new methodology for preconcentration and determination of organic pollutants // Anal. Chem. — 1999. — V. 71. — P. 1905–1909. 57. Kataoka H. Automated sample preparation using in<tube solid<phase microextraction and its application — review // Anal. Bioanal. Chem. — 2002. — V. 373. — P. 31–45. 58. Theis A. L., Waldack A. J., Hansen S. M., Jeannt M. A. Headspace solvent microex< traction // Anal. Chem. — 2001. — V. 73. — P. 5651–5654. 59. Bruheim I., Lin X., Pawliszyn J. Thin<film microextraction // Ibid. — 2003. — V. 75 — P. 1002–1010. 60. Jodldauer J., Maier N.M., Linder W. To< wards ochratoxin A selective molecularly imprinted polymers for solid<phase ext< raction // J. Chromatogr. — 2002. — V. 945A. — P. 45–63. Нові методиНові методи 115 АНАЛІЗ МІКОТОКСИНІВ: ПІДГОТОВКА ПРОБ М. Ф. Стародуб1 Л. М. Пилипенко2 О. В. Єгорова2 І. В. Пилипенко2 О. С. Гойстер1 Г. О. Хмельницький3 1 Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ 2 Одеська національна академія харчових технологій 3 Національний аграрний університет, Київ Е$mail: nikstarodub@yahoo.com Розглянуто основні принципи відбору проб та підготовки їх для аналізу вмісту мікоток< синів у різних об’єктах навколишнього сере< довища. Головну увагу приділено трихотеце< новим мікотоксинам, а також зеараленону, афлатоксину та фумонізинам. Ключові слова: мікотоксини, аналіз, відбір та підготовка проб. ANALYSIS MYCOTOXINS: PREPARATION OF SAMPLES M. F. Starodub1 L. M. Pilipenko2 O. V. Egorova2 I. V. Pilipenko2 O. S. Gojster1 G. O. Chmel’nitsky3 1 Palladin Institute of Biochemistry of Nationale Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv 2 Odessa National Academy of food technologies 3 National Agricultural University, Kyiv Е$mail: nikstarodub@yahoo.com Analysis of main principles of selection of samples and their preparation for the determina< tion of mycotoxins content in different environ< ment objects is presented. The main attention was addresed to trichothecenes mycotoxins and zearalenone, aflatoxin and fumonisins. Kеy words: mycotoxins, analysis, selection and prepa< ration of samples. << /ASCII85EncodePages false /AllowTransparency false /AutoPositionEPSFiles true /AutoRotatePages /None /Binding /Left /CalGrayProfile (Dot Gain 20%) /CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2) /sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CannotEmbedFontPolicy /Warning /CompatibilityLevel 1.4 /CompressObjects /Tags /CompressPages true /ConvertImagesToIndexed true /PassThroughJPEGImages true /CreateJDFFile false /CreateJobTicket false /DefaultRenderingIntent /Default /DetectBlends true /ColorConversionStrategy /LeaveColorUnchanged /DoThumbnails false /EmbedAllFonts true /EmbedJobOptions true /DSCReportingLevel 0 /EmitDSCWarnings false /EndPage -1 /ImageMemory 1048576 /LockDistillerParams false /MaxSubsetPct 100 /Optimize true /OPM 1 /ParseDSCComments true /ParseDSCCommentsForDocInfo true /PreserveCopyPage false /PreserveEPSInfo true /PreserveHalftoneInfo false /PreserveOPIComments false /PreserveOverprintSettings true /StartPage 1 /SubsetFonts false /TransferFunctionInfo /Apply /UCRandBGInfo /Preserve /UsePrologue false /ColorSettingsFile () /AlwaysEmbed [ true ] /NeverEmbed [ true ] /AntiAliasColorImages false /DownsampleColorImages true /ColorImageDownsampleType /Bicubic /ColorImageResolution 300 /ColorImageDepth -1 /ColorImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeColorImages false /ColorImageFilter /DCTEncode /AutoFilterColorImages true /ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG /ColorACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /ColorImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000ColorACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000ColorImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasGrayImages false /DownsampleGrayImages true /GrayImageDownsampleType /Bicubic /GrayImageResolution 300 /GrayImageDepth -1 /GrayImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeGrayImages false /GrayImageFilter /DCTEncode /AutoFilterGrayImages true /GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG /GrayACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /GrayImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000GrayACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000GrayImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasMonoImages false /DownsampleMonoImages false /MonoImageDownsampleType /Bicubic /MonoImageResolution 1200 /MonoImageDepth -1 /MonoImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeMonoImages true /MonoImageFilter /CCITTFaxEncode /MonoImageDict << /K -1 >> /AllowPSXObjects false /PDFX1aCheck false /PDFX3Check false /PDFXCompliantPDFOnly false /PDFXNoTrimBoxError true /PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXSetBleedBoxToMediaBox true /PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXOutputIntentProfile (None) /PDFXOutputCondition () /PDFXRegistryName (http://www.color.org) /PDFXTrapped /Unknown /Description << /JPN <FEFF3053306e8a2d5b9a306f30019ad889e350cf5ea6753b50cf3092542b308030d730ea30d730ec30b9537052377528306e00200050004400460020658766f830924f5c62103059308b3068304d306b4f7f75283057307e305930023053306e8a2d5b9a30674f5c62103057305f00200050004400460020658766f8306f0020004100630072006f0062006100740020304a30883073002000520065006100640065007200200035002e003000204ee5964d30678868793a3067304d307e305930023053306e8a2d5b9a306b306f30d530a930f330c8306e57cb30818fbc307f304c5fc59808306730593002> /FRA <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> /DEU <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> /PTB <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> /DAN <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> /NLD <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> /ESP <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> /SUO <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> /ITA <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> /NOR <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> /SVE <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> /ENU <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> >> >> setdistillerparams << /HWResolution [2400 2400] /PageSize [612.000 792.000] >> setpagedevice

Анализ микотоксинов: подготовка проб

Репозитарії

Схожі ресурси